CN117106656A

CN117106656A - 一株三嗪类除草剂扑草净降解菌及其应用

Info

Publication number: CN117106656A
Application number: CN202311106530.XA
Authority: CN
Inventors: 王金华; 姚丽; 刘子畅
Original assignee: Southwest Forestry University
Current assignee: Southwest Forestry University
Priority date: 2023-08-30
Filing date: 2023-08-30
Publication date: 2023-11-24

Abstract

本发明公开了一株三嗪类除草剂扑草净的降解菌株及其应用，所用菌株为革兰氏染色反应阴性的SWFU‑DH02菌株，经鉴定为微小杆菌(Exiguobacteruim sp.)。并于2021年11月22日寄存中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.23948。本发明首次公开了一种微小杆菌（Exiguobacteruim sp.）对三嗪类除草剂扑草净的降解作用，并筛选得到了一株微小杆菌属的高效降解菌SWFU‑DH02，其对扑草净的降解效率可达75.08%，在pH7.0，温度28℃，盐浓度1%的条件下该菌株生长情况最优。降解菌株SWFU‑DH02具有培养简单，生长快速，降解高效等特点。可解决土壤中或水体中三嗪类除草剂扑草净的污染问题，防止除草剂残留对后茬作物的药害，生产出无毒无公害的绿色农产品。为现代治理农药污染问题提供了生物新途径。

Description

一株三嗪类除草剂扑草净降解菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物降解技术领域，具体涉及一株微小杆菌及其在降解三嗪类除草剂扑草净的应用。

背景技术

三嗪类除草剂在土壤中持效期长且有较长的半衰期，容易在土壤中残留，不容易被降解，并且通过雨水冲刷进入河流湖泊污染水体。扑草净是一类低毒的均三嗪类除草剂，是此类除草剂最具有代表性的农药之一。因其具有高效的除草效果被广泛用于小麦、蔬菜、水稻、棉花、玉米等作物田间的禾本科和宽叶绿色杂草的去除。扑草净是一种非离子、弱极性疏水化合物，在水中具有平均溶解度，它在微酸性、微碱性、中性环境中是稳定的。扑草净在好氧和厌氧土壤中的生物降解半衰期为1-3个月，在长期施用扑草净的田间可稳定存在12～18个月。其生产和作为除草剂使用会被释放到环境中，通过食物链对人类造成直接危害。因此，扑草净已被美国环境保护署列为一种生殖发育毒素，并被欧盟优先名单列为内分泌干扰物。然而，由于其控制杂草的广谱性和高效效价，在中国的水稻、甘蔗和大豆产区仍然被大量使用。因此，降解扑草净是生态修复的一个重要方面。

已有研究表明，光降解、除草剂佐剂、物理吸附剂和分子印迹聚合物等方法可以去除扑草净。光降解可以降低土壤中扑草净的含量，但这个过程耗时较长。使用除草剂佐剂可能会影响顽固性化合物的生物降解。物理吸附剂可以去除水中的扑草净，分子印迹聚合物已被用于分析培养基中痕量的除草剂; 然而，这些方法都不能解决扑草净在土壤中残留的问题。

微生物降解是除草剂在环境中衰减的关键过程之一。这一过程因其成本低、效率高、无二次污染等优点逐渐成为研究热点。尽管已在几个国家被禁用，扑草净在中国仍是一种广泛使用的除草剂。生物降解可能是一种降解土壤扑草净残留的理想方法。目前，关于扑草净生物降解途径的报道很少。因此筛选可有效降解扑草净残留的环境友好型菌株，开发可应用于环境修复的微生态制剂，不仅可以丰富扑草净降解菌群，而且可为其在自然环境中生物修复的应用提供理论依据。

发明内容

为了解决降解残留扑草净的现有技术存在的上述问题，本发明的第一个目的是提供微小杆菌(Exiguobacteruim sp.)在降解三嗪类除草剂扑草净的应用。

本发明的第二个目的是提供一株可高效降解三嗪类除草剂扑草净的微小杆菌菌株SWFU-DH02。

本发明的另一目的是提供所述微小杆菌菌株SWFU-DH02在降解三嗪类除草剂扑草净的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明通过富集培养法从云南省德宏州盈江县长期施用扑草净的甘蔗农田中分离得到一株扑草净降解菌菌株，命名为微小杆菌SWFU-DH02，于2021年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23948，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

该菌株能够利用扑草净为唯一碳源生长，并且在24h内能将无机盐培养基中50mg/L的扑草净降解，用气相色谱质谱联用仪( GC-MS)进行降解效率测定，降解效率达75.08%，降解效果明显。通过对温度、pH、盐浓度单一变量的改变，并测量菌体生长的OD₆₀₀值，确定微小杆菌SWFU-DH02的最适生长温度为28℃，最适pH为7.0，最适NaCl浓度为1%。

实验结果显示，微小杆菌SWFU-DH02对扑草净降解效果良好，降解率达75.08%，可以有效应用到残留扑草净降解中。

因此，以下应用均应在本发明的保护范围内：

微小杆菌在降解三嗪类除草剂扑草净或制备降解菌剂方面的应用。

所述微小杆菌SWFU-DH02在降解三嗪类除草剂扑草净或制备降解菌剂方面的应用。

一种含有微小杆菌的高效降解三嗪类除草剂扑草净的菌剂，也应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次公开了微小杆菌(Exiguobacteruim sp.)对三嗪类除草剂扑草净的降解作用。

同时本发明筛选得到一株高效快速降解扑草净的微小杆菌SWFU-DH02，丰富了农药降解菌的种质资源库，在修复三嗪类除草剂残留的水体和土壤中有重大应用价值，为治理三嗪类除草剂残留提供新途径。

附图说明

图1为降解菌SWFU-DH02的菌落形态。

图2为菌株SWFU-DH02的16S rDNA扩增产物电泳图。

图3为基于16S rDNA序列构建降解菌SWFU-DH02系统发育树。

图4为SWFU-DH02扫描电镜图。

图5为扑草净标准曲线。

图6为扑草净降解菌SWFU-DH02的降解曲线。

图7为扑草净降解菌SWFU-DH02生长曲线。

图8为pH浓度对降解菌SWFU-DH02生长的影响。

图9为NaCl浓度对降解菌SWFU-DH02生长的影响。

图10为温度对降解菌SWFU-DH02生长的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

本发明中所用到的培养基配方：

基础盐培养基（MSM）：K₂HPO₄ 1g ，KH₂PO₄ 1g ，(NH₄)₂SO₄ 0.5g ， MgS0₄·7H₂O0.3g，NaCl 1g ,去离子水1.0L。PH调为 7.2，高温高压灭菌121℃，20min

LB固体培养基：琼脂粉13g，氯化钠10g，去离子水1.0L，酵母粉5g，胰蛋白胨10g。pH调为7.0。高温高压灭菌121℃，20min

LB液体培养基：氯化钠10g，去离子水1.0L，酵母粉5g，胰蛋白胨10g。PH调为7.0，高温高压灭菌121℃，20min。

实施例1 降解菌的分离纯化及鉴定。

1、扑草净降解菌的富集培养

取5g活性土样加到已灭菌的含扑草净30mg/L的100mL 基础盐培养基的锥形瓶中，于28℃、160r/min恒温震荡摇床中避光进行富集培养，以5d为一个培养周期，将培养液以5%的体积分数接种到同样新配制的灭菌基础盐培养基中（操作均在超净工作台中进行），不断提高扑草净浓度，至培养基中扑草净的浓度为150mg/L。

2、扑草净降解菌筛选

通过上述方法培养5周后，采用梯度稀释纯化培养法，取1mL培养液进行梯度纯化与稀释,分别稀释10^-1，10^-2，10^-3，10^-4、10^-5、10^-6、10^-7倍,，后每个梯度取0.1ml菌液涂布于添加扑草净(150mg/L)的培养基上，将培养基放进恒温培养箱中28℃培养2～3d，此过程常观察菌的生长情况，不同稀释倍数下，菌落的大小，数目及分布情况有一定规律。选取生长好，无污染的单菌落，采用平板划线法进行菌株纯化，置于28℃培养箱中培养2-3d，重复3-4次。（根据污染情况调整实验过程中的操作方法与注意事项，减少菌株污染），最后得到纯化的扑草净降解菌株，编号为SWFU-DH02。

3、菌株SWFU-DH02的鉴定

（1）形态学鉴定

将菌株SWFU-DH02接种于LB固体平板上28℃倒置培养3天，观察其菌落形态。将纯化好的菌株用平板划线法接种于LB固体培养基中28℃培养2-3d，进行菌落形态观察，如图1降解菌的菌落形态所示：菌落为淡黄色圆饼状，表面光滑，边缘规则，中部微微隆起

（2）生理生化鉴定

菌株SWFU-DH02生理生化特性鉴定结果：该菌株为革兰氏阴性细菌，明胶液化试验反应阴性，硝酸盐还原实验为阴性，其生理生化测试结果如表1所示。

表1 降解菌Y-1生理生化鉴定

检测指标	检测结果
		革兰氏染色	－
葡萄糖酵解检测	－
		乳糖糖酵解检测	－
蔗糖糖酵解检测	－
		明胶液化检测	－
硝酸盐还原检测	－
		葡萄糖产气检测	－

注： “+”代表反应结果阳性； “-”代表反应结果阴性

（3）16S rDNA分子生物学鉴定

按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书上的方法对降解菌SWFU-DH02进行总DNA提取，然后采用由硕擎生物科技公司提供的16S rDNA细菌通用引物(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1429R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增，PCR扩增产物混合10X上样缓冲液后通过1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图2所示。可以看出扩增效果较好，将其PCR扩增产物送生工生物工程有限公司测序。测序结果提交GenBank数据库并进行注册，其注册号为：OL588221。同时，将菌株测得的16S rDNA序列在GenBank数据库中利用BLAST进行比对分析，并选择同源性较高的相关序列利用MAGE 7.0软件构建系统进化树及分析进化关系(16S rDNA的系统发育树如图3所示)。

本发明分离纯化得到的菌株SWFU-DH02与(微小杆菌Exiguobacteruim sp.)进化距离最近，扫描电镜观察特征如图4所示，其培养特征与微小杆菌(Exiguobacteruim sp.)也最为相似，因此综上鉴定结果，本发明筛选获得的降解菌SWFU-DH02鉴定为微小杆菌(Exiguobacteruim sp.)，于2021年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23948，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2菌株SWFU-DH02在以扑草净为唯一碳源的基础盐培养基中的生长与降解曲线测定

1、实施方法

（1）菌悬液的制备

将纯化菌株接种到100mL扑草净浓度达到50 mg/L 的 LB 液体培养基中，在条件为28℃、150 r/min的摇床上避光震荡培养 24 h，然后用离心机4000 r/min，10 min，离心后去上清，用灭菌水洗涤后重悬、再次离心，连续洗涤2次，最后加入灭菌水让菌液浓度达到OD₆₀₀=1.0，制成菌悬液备用

（2）扑草净的液体降解实验

用移液枪吸取 1 mL菌悬液，接种到含99 mL扑草净浓度为50 mg/L做过灭菌处理的基础盐培养基中，并设对照处理（接1 mL无菌水），于28℃、150 r/min 摇床避光接连培养5d，于第1d，3d，5d同一时间点采样5mL，每组设置三个重复，然后测定培养基中残余扑草净的含量

（3）扑草净的提取

用离心管取上述培养液5mL同时加入乙酸乙酯5mL，剧烈震荡5min后用离心机4000r/min，离心10min，然后在室温静置10min。将其缓慢倒入分液漏斗中，再加乙酸乙酯10mL充分震荡。分液后将有机相通过上层是无水硫酸钠底部脱脂棉花吸收水分并过滤。过滤好的有机相通过旋蒸仪在50℃，80r/min水浴条件下旋蒸到干。最后加入3.0mL的正己烷（色谱纯）溶解扑草净后，用注射器吸取正己烷（色谱纯），然后通过0.45μm的有机相滤膜过滤，将有机相转入2.0mL的安捷伦进样瓶，待测

（4）气相色谱质谱联用仪( GC-MS)检测

将进样瓶上样，用气相色谱质谱联用仪( GC-MS)对扑草净进行检测，检测条件如表2所示。

表2 气相色谱质谱联用仪检测条件

项目	条件
		色谱柱	HP-5MS（30m×0.32mm i.d×0.25μm）
进样口温度	260℃
		柱温	程序升温至280摄氏度
流速	0.8 mL/min
		分流比	2∶1
进样量	1μL

（5）绘制扑草净标准曲线

标准扑草净溶液（10.0mg/L）：用电子天平精准称取干燥恒重的扑草净1 mg于容量瓶中，然后加入正己烷（色谱纯）充分震荡并定容至100mL，然后保存在冰箱4℃中备用。取7支15mL试管，按表3加入10.0mg/mL扑草净标准液和正己烷（色谱纯）混匀。取各浓度的扑草净溶液转入到安捷伦进样瓶，待测。最后以扑草净浓度为横坐标，与之对应的峰面积为纵坐标绘制扑草净（GC-MS）标准曲线。

表3 扑草净标准液和正己烷配比

标准曲线样品液编号	1	2	3	4	5	6	7
								标准扑草净溶液（ml）	0	1	2	4	6	8	10
正己烷（ml）	10	9	8	6	4	2	0

（6）降解菌的降解曲线绘制

将菌悬液在条件为28℃、150 r/min的摇床上避光震荡培养5 d，在第1d，3d，5d同一时间点采样5ml培养液按上述方法提取扑草净，设置无菌的空白培养基作为对照。用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）测得不同时期培养液扑草净的峰面积，计算出扑草净的含量，并根据扑草净变化算出降解效率。最后以时间为横坐标，降解效率为纵坐标绘制降解菌的降解曲线

（7）降解菌生长曲线绘制

将降解菌SWFU-DH02接种于LB固体培养基上28℃培养3d，从平板上挑取单菌落接种于50ml液体LB培养基上，培养24h。各取10ml 接种到200ml含扑草净50mg/L的LB液体培养基及不含扑草净的LB液体培养基中，混匀后将其分装到已灭菌的试管中，每支试管分装5ml，分别于30℃，150r/min摇床培养0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、24h、26h、28h。每组设三个平行，并设置不接菌空白对照。利用不接菌的LB液体培养基调零测定其OD₆₀₀值，并以时间为横坐标，OD₆₀₀为纵坐标绘制降解菌生长曲线。

2、实验结果

（1）通过气相色谱质谱联用仪所测的数据以扑草净浓度为横坐标，与之对应的峰面积为纵坐标，绘制得到扑草净的标准曲线。如图5所示

（2）扑草净降解曲线如图6所示，SWFU-DH02在第3天时降解效率最高，为75.08%，这表明菌株SWFU-DH02对扑草净的降解效果较好

（3）降解菌生长曲线如图7所示，由图可知当LB液体培养基中含有扑草净时，相同时间内降解菌SWFU-DH02 OD₆₀₀值更大，降解菌生长更快，说明降解菌能够将扑草净作为生长所需的能源物质，供自身生长所需，所以生长更快。

实施例3 降解菌SWFU-DH02最优生长条件测定

1、实验方法

（1）pH对降解菌生长的影响

在适宜盐浓度下配置不同pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）的液体培养基。根据不同pH要求添加终浓度为25~50mmol/L的Tricine缓冲液（PH=7.0），以培养基体积的1%接种量接种，每组设置三个平行，并设置不接菌的空白对照。在28℃摇床上进行培养。培养48h后，测定菌液的吸光度OD₆₀₀值

（2）NaCl浓度对降解菌生长的影响

在pH值为7下配置不同盐浓度（0%、1%、3%、5%、7%、10%）的液体培养基。以培养基体积的1%接种量接种，每组设置三个平行，并设置不接菌的空白对照。在28℃摇床上进行培养。培养48h后，以不接种培养基作对照，测定菌液的吸光度OD₆₀₀值

（3）温度对降解菌生长的影响

在盐浓度为1%和pH7条件下配置基础盐培养基，分装在试管中，每支试管5ml，灭菌后以体积的1%接种菌液，每组设置三个平行，并设不接菌的试管作对照。在不同温度（4℃（冰箱）、20℃、28℃、37℃、45℃、60℃）条件下进行振荡培养48h，以不接种培养基作对照，测定菌液的吸光度OD₆₀₀值。

2、实验结果

（1）降解菌SWFU-DH02在不同pH下生长状况如图8所示。通过对在不同pH下培养48h的 OD₆₀₀值作图可见，降解菌在pH=7时OD₆₀₀值最大为0.863，由此可见微小杆菌SWFU-DH02最适生长的pH 值为7

（2）降解菌在不同盐浓度下生长情况如图9所示。通过比较降解菌在不同盐浓度下生长48h时的OD₆₀₀值，发现当NaCl浓度等于1%时，细胞生长情况最好，OD₆₀₀为0.506，浓度大于1%后，随着浓度的增大降解菌SWFU-DH02的OD₆₀₀值不断减小。由此可知降解菌SWFU-DH02的最适生长盐浓度为1%

（3）降解菌在不同温度下生长情况如图10所示。通过对不同温度下培养48h的菌体的OD₆₀₀值的比较，可知随着温度的升高，降解菌SWFU-DH02生长越来越好，温度为28℃时，生长最好；当温度超过28℃时，降解菌SWFU-DH02生长量逐渐下降，在温度达到60℃时菌体基本不生长。由此可知，降解菌SWFU-DH02的最适生长温度为28℃。

实施例4 降解菌SWFU-DH02降解土壤中扑草净的实验

1、实验方法

（1）菌悬液制备：

将纯化后的菌种SWFU-DH02接入含有10mL的LB液体培养基于摇床200rmp过夜活化培养至对数期，4℃低温离心后菌体用生理盐水(0.9％NaCl)冲洗，冲洗2次，所得菌体作为接种体，再用MSM液体培养基进行重悬，使所有样品的OD值达到一致（OD₆₀₀=0.5）

（2）扑草净污染土壤制备

土壤样品取自西南林业大学树木园软硬适中的地表层土(0～10cm)，超过5年未施用任何农药。土壤样品取回后首先置于阴凉通风处自然风干，风干后碾磨，过2mm筛，分别取一定量的扑草净溶于丙酮中，然后浸泡硅藻土，使扑草净被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入土壤中，使土壤中扑草净的终浓度为50mg/kg。取500g土样，将菌悬液100ml（OD₆₀₀=0.5）接入土中，搅拌均匀，于28℃恒温恒湿培养箱中培养；以接等量无菌水的土壤作为对照，土壤的含水量保持在20％左右。在28℃和避光条件下连续培养15天，并每隔3天进行取样。每个处理组设置三个重复

（3）扑草净的提取

取5g土样，添加10ml正己烷，超声（90KHz，28℃）提取一次，提取2小时后，在4000rpm下离心10分钟，取上清液，通过旋转蒸发仪在50℃，80r/min水浴条件下旋蒸至干。向旋蒸瓶中加入3.0mL的正己烷（色谱纯）溶解扑草净后，用注射器（10ml）吸取溶解液，用0.45μm孔径的有机相滤膜过滤，将有机相转入2.0mL的安捷伦进样瓶，待测

（4）降解效率测定

方法同实施例2所述。

2、实验结果

实验结果如表4所示，在培养15天后，施加了菌株SWFU-DH02的土壤，扑草净降解效率达到78.18%，表明菌株SWFU-DH02对扑草净污染的土壤有较好修复效果，这为菌株SWFU-DH02对扑草净的土壤修复提供了理论依据。

表4 菌株SWFU-DH02对土壤中扑草净的降解效率

时间（d）	菌株SWFU-DH02的扑草净降解效率（%）
		0	0.00
3	33.52
		6	40.18
9	45.56
		12	64.53
15	78.18

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其余采用的原理与本发明相同但做出一些改变、组合等的实施方式都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一株可高效降解三嗪类除草剂扑草净的菌株，其特征在于，其为微小杆菌（Exiguobacteruim sp.）SWFU-DH02，并于2021年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23948。

2.根据权利要求1所述的一种三嗪类除草剂扑草净降解菌株的制备方法，其特征在于，添加农田土壤至含有扑草净的富集培养基中，进行富集培养，得到富集培养液；将上述富集培养液接种于以扑草净为唯一碳源的无机盐培养基中进行驯化培养，得到驯化培养液；将上述驯化培养液稀释后涂布于以扑草净为唯一碳源的无机盐培养基上进行培养，得到降解菌株。

3.根据权利要求2所述的一种扑草净降解菌株微小杆菌SWFU-DH02的制备方法，其特征在于，所述步骤中，每升富集培养基添加的农田土壤的质量为50g；每升所述富集培养基中含扑草净150mg，其余培养基中含扑草净50mg ；富集培养液的接种量为5%~10%，富集培养的温度为28℃，驯化培养的温度为28℃，划线培养的温度为28℃。

4.一种如权利要求2或3中任一项所述制备方法制得的农药降解菌株微小杆菌（Exiguobacteruim sp.）在降解三嗪类农药或制备降解菌剂方面的应用。

5.一种如权利要求2或3中任一项所述制备方法制得的农药降解菌株微小杆菌（Exiguobacteruim sp.）在修复三嗪类农药污染的自然环境或制备修复菌剂方面的应用。

6.根据权利要求4或5所述应用，其特征在于，所述三嗪类农药为扑草净。

7.根据权利要求4或5所述应用，其特征在于，所述微小杆菌（Exiguobacteruim sp.）为权利要求1所述微小杆菌菌株SWFU-DH02。

8.根据权利要求4或5所述应用，一种高效降解三嗪类农药的菌剂，其特征在于，含有微小杆菌（Exiguobacteruim sp.）。

9.根据权利要求8所述的菌剂，其特征在于，所述微小杆菌（Exiguobacteruim sp.）为权利要求1所述微小杆菌菌株SWFU-DH02。