CN112940972A - 多环芳烃降解功能的植物内生细菌px1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多环芳烃降解功能的植物内生菌PX1及其应用，多环芳烃降解功能的植物内生菌PX1的分类命名为寡养单胞菌（Stenotrophomonassp.），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21310，保藏日期为2020年12月07日。本发明的芘降解功能植物内生细菌PX1可高效去除培养基中20 mg·L^‑1芘以及萘、菲、荧蒽和苯并[a]芘等多种多环芳烃；能适应较宽的pH和温度等环境条件；在共代谢条件下PAHs降解效率更高；通过浸种可定殖到多种农作物体内，促进农作物生长降低PAHs污染。可用作促进农作物生产降低农产品PAHs污染功能菌剂，具有较好的应用前景。

Description

多环芳烃降解功能的植物内生细菌PX1及其应用

技术领域

本发明属于微生物生物技术领域，具体涉及多环芳烃降解功能的植物内生菌PX1及其在降低农作物中多环芳烃污染中的应用。

背景技术

多环芳烃(PAHs)是一类具有致癌的环境污染物。化石燃料的使用等造成了环境中的PAHs污染。土壤中富含PAHs污染已多次被报道。大气、水和土壤中PAHs污染可被农作物吸收富集，通过食物链威胁人体健康。如何降低农作物体内的PAHs污染、保障人类健康是农业生产过程中亟待解决的难题。

芘作为PAHs中四环污染物的典型代表，由于其环境持久性以及毒性，常被用作测定环境中PAHs污染的指示物和PAHs生物降解的模型分子。

以微生物降解为核心的生物修复技术具有安全、高效、无二次污染、无残留等优点，逐渐成为治理有机物的重要手段。从现有技术可以看出，微生物菌剂在降解多环芳烃中具有潜在的应用价值。但是，由于微生物降解多环芳烃的能力会因菌株不同而存在一定的差异，并且不同菌株可能会在治理过程中对原有环境以及环境中的植物产生影响。因此，进一步筛选获得具有高效降解多环芳烃能力以及与环境以及宿主植物和谐共生的微生物菌株，对于有效解决多环芳烃对生态环境的残留污染问题具有重要意义。

发明内容

发明目的：本发明从PAHs污染环境中生长的植物体内筛选了一种植物功能内生菌，该菌可定殖于植物健康组织间隙或细胞内，与宿主植物和谐共生，降解植物体内的PAHs并促进植物生长，达到防治农作物PAHs污染的目的。本发明筛选的功能内生细菌不仅可以在调控植物对污染物的吸收同时提高植物降解有机污染物的能力，还具有促进植物生长的功能。

本发明还提供了所述植物功能内生菌在降低农作物中多环芳烃污染中的应用。

技术方案：本发明提供了一种多环芳烃降解功能的植物内生细菌PX1，其分类命名为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21310，保藏日期为2020年12月07日，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所述功能植物功能菌PX1的筛选方法为：采集PAHs污染区域生长的植物，植物表面消毒，研磨液接种于芘无机盐培养基中富集菌株，然后再稀释涂布于芘无机盐固体平板上分离纯化菌株；挑选有明显降解圈且长势旺盛的菌株对其芘降解能力进行测定，最终筛选出芘降解功能植物内生细菌。所述芘降解功能植物内生细菌PX1从多环芳烃污染环境中的植物体内分离筛选纯化获得。

其中，所述筛选培养基为芘无机盐培养基。芘无机盐培养基包含以下成分：(NH₄)₂SO₄、K₂HPO₄·3H₂O、KH₂PO₄、NaCl、MgSO₄·7H₂O、微量元素溶液，pH 7.0～7.2，芘含量为20～50mg·L^-1。其中，上述微量元素溶液包含以下成分：CoCl₂·6H₂O、MnCl₂·4H₂O、ZnCl₂、NiCl₂·6H₂O、CuSO₄·5H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O、Na₂SeO₄·2H₂O。其中，上述微量元素溶液具体由以下成分组成：CoCl₂·6H₂O 0.1g，MnCl₂·4H₂O 0.425g，ZnCl₂ 0.05g，NiCl₂·6H₂O 0.01g，CuSO₄·5H₂O 0.015g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.01g，Na₂SeO₄·2H₂O 0.01g，水定容至1L。

其中，所述多环芳烃为萘、菲、芘、荧蒽或苯并[a]芘中的一种或几种。

本发明内容还包括所述的多环芳烃降解功能的植物内生菌PX1在降低植物体内和/或种植环境中的多环芳烃污染的应用。

其中，所述应用包括：将所述多环芳烃降解功能的植物内生菌PX1定殖于植物中降低植物中和/或种植环境中的多环芳烃。

其中，所述植物功能菌在植物中的定殖方法为浸种定殖：将植物种子表面消毒，催芽、育苗24～72h后，用菌株PX1菌悬液(OD_600nm＝1.0，浓度约10⁸cfu·mL^-1)，浸泡4～8h进行定殖。

其中，所述植物包含了小麦、荞麦、空心菜、绿豆等农作物。

有益效果：相对于现有技术，本发明的功能植物内生菌PX1，在培养基中可以高效降解萘、菲、芘、荧蒽或苯并[a]芘。通过浸种定殖在小麦、荞麦、空心菜、绿豆体内，促进农作物生长，降低了农作物及其生长基质中的芘污染。因此该菌株可作为防治农作物体内多环芳烃污染定殖菌剂，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310平板菌落形态；

图2为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310的细胞形态(透射电镜)；

图3为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310的生长曲线(30℃，150r·min^-1培养条件)；

图4为基于16S rRNA基因序列同源性的本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310的系统发育树；

图5为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310对芘的降解动力学曲线(20.0mg·L^-1芘)；

图6为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310对不同浓度芘的降解能力；

图7为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310对芘降解中间产物的质谱图；

图8为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310对PAHs的降解广谱性；

图9从定殖的空心菜(A)、小麦(B)、绿豆芽(C)和荞麦(D)中筛选的功能植物内生细菌CGMCC No.21310；

图10为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310定殖对空心菜中芘积累的影响；

图11为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310定殖对空心菜Hoagland营养液中芘残留的影响，其中(A1)、(A2)、(A3)芘初始浓度分别为0.1mg·L^-1、1.0mg·L^-1、10.0mg·L^-1；

图12为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310定殖对小麦体内芘积累的影响；

图13为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310定殖对小麦Hoagland营养液中芘残留的影响，其中(A1)、(A2)、(A3)芘初始浓度分别为0.1mg·L^-1、1.0mg·L^-1、10.0mg·L^-1；

图14为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310定殖对绿豆芽体内芘积累的影响；

图15为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310定殖对绿豆芽Hoagland营养液中芘残留的影响，其中(A1)、(A2)、(A3)芘初始浓度分别为0.1mg·L^-1、1.0mg·L^-1、10.0mg·L^-1；

图16为本发明功能植物内生细菌CGMCCNo.21310定殖对荞麦体内芘积累的影响；

图17为本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310定殖对荞麦Hoagland营养液中芘残留的影响，其中(A1)、(A2)、(A3)芘初始浓度分别为0.1mg·L^-1、1.0mg·L^-1、10.0mg·L^-1。

具体实施方式

结合下面的具体实施例详细阐述本发明功能植物内生细菌CGMCC No.21310及其应用。

实施例1：可降解多环芳烃的功能植物内生菌的分离纯化、筛选和鉴定

1.功能植物内生菌分离和驯化

从江苏省南京市的金陵石化公司排污口附近采集生长良好的植物样本(野生牛筋草等)，将采集的植物样品清洗干净后置于无菌操作台内依次用75％乙醇漂洗3～5min，无菌水冲洗3～4次，0.1％NaClO漂洗2～5min，再用无菌水冲洗。将消毒好的植物样品移入LB固体平板中30℃培养72h，检查表面是否有残留微生物。剪碎消毒好的植物样品，放进含有适量无菌水的灭菌研钵中充分研磨，吸取上清液接种到20mg·L^-1的芘无机盐培养基中，30℃，150r·min^-1摇床培养7d。然后逐步提高芘无机盐培养基中芘的浓度，依次转接到30mg·L^-1、40mg·L^-1、50mg·L^-1的芘无机盐培养基中培养，培养条件相同。采用梯度稀释法将，最后一次培养液涂布到含芘的固体培养基上，在30℃恒温培养箱培养3～7d，挑取不同形态的单菌落，采用平板划线法进行分离纯化。挑选有明显降解圈且长势旺盛的菌株对其芘降解能力进行测定，最终筛选出芘降解功能植物内生细菌Stenotrophomonas sp.PX1。

该芘降解功能植物内生细菌PX1，其分类命名为寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.21310，保藏日期为2020年12月07日，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

取上述纯化的菌株Stenotrophomonas sp.PX1接种到的LB培养基中(含20mg·L^-1芘，丙酮含量低于0.5‰)分批培养，30℃、150r·min^-1摇床培养24h，6000r·min^-1离心10min，弃掉上清液，用无机盐液体培养基冲洗菌体使其混匀，再次离心，洗涤2～3次，用无机盐液体培养基制成菌悬液(菌悬液OD_600nm＝1.0，约10⁸cfu·mL^-1)。

LB培养基组成：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，水定容至1L，pH 7.0～7.2。培养基制备固体平板时添加1.8％～2％的琼脂。

芘无机盐液体培养基组成：(NH₄)₂SO₄ 1.50g，K₂HPO₄·3H₂O 1.91g，KH₂PO₄ 0.50g，NaCl 0.50g，MgSO₄·7H₂O 0.20g，微量元素溶液2mL，水定容至1L，pH 7.0～7.2得到无机盐液体培养基。微量元素溶液由以下成分组成：CoCl₂·6H₂O 0.1g，MnCl₂·4H₂O 0.425g，ZnCl₂0.05g，NiCl₂·6H₂O 0.01g，CuSO₄·5H₂O 0.015g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.01g，Na₂SeO₄·2H₂O0.01g，水定容至1L。

芘无机盐固体培养基：无机盐液体培养基中加入1.8％～2％的琼脂后121℃后高压灭菌20min，待培养基冷却至50℃培养基冷却加入适量的芘丙酮溶液，使培养基中芘的终浓度为20.0mg·L^-1。

2.菌株PX1菌株生长曲线

将菌株接种到LB培养基中，30℃、150r·min^-1的条件下摇床培养，每隔1～2h取样测量菌液在600nm处的吸光度值。根据菌株不同时间的生长数据，选择修正Sgompertz模型拟合菌株的生长曲线，该菌株的Sgompertz模型为lg(N_t/N₀)＝2.79×exp{-exp[-0.36×(t-5.10)]}，R²＝0.993，最大生长比率U为0.37h^-1，微生物生长的延滞期LPD为2.31h(如图4，其中N_t和N₀分别表示在时间t时和初始时间细菌数量)。

3.菌株PX1菌株的鉴定

对上述菌株进行菌种鉴定，一是染色后采用光学显微镜观察菌体显微形态；二是对菌株进行生理生化特征分析，三是提取菌株的基因DNA，PCR扩增其16S rRNA基因，对扩增的基因序列进行分析。

4.芘降解功能植物内生细菌PX1形态，生理和生化特征

在LB培养基平板上PX1单菌落为为圆形、淡黄色、边缘整齐、表面光滑、中间隆起、不透明的特征。PX1菌落形态特征的光学显微形状如图1所示，细胞形态如图2所示。

菌株PX1的生理生化特征如表1所示。

菌株PX1用LB培养基将菌株培养至对数期，菌株生长曲线如图3。将菌液送至南京擎科生物科技有限公司进行16S rRNA基因测序，该16S rRNA基因序列参加序列表SEQ IDNO：1。基于16S rRNA基因序列同源性的菌株PX1系统发育树如附图4所示。菌株PX1与寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)的16S rRNA基因的相似性为99.86％，形态观察、生理生化分析和16S rRNA基因序列分析结果表明，菌株PX1为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)。

表1

注：+表示阳性，-表示阴性。

实施例2：菌株降解多环芳烃和促生能力

1.菌株PX1降解芘能力

驯化好PX1的菌悬液(菌悬液OD_600nm＝1.0，约10⁸cfu·mL^-1)，按5％接种量加入芘无机盐液体培养基(含20.0mg·L^-1芘，丙酮含量低于0.5‰)中，30℃、150r·min^-1摇床培养15d，每天定时整瓶取样，测定培养基中芘的残留浓度和菌株数量。培养液中芘的浓度采用定时整瓶提取培养基的方法，超声萃取混匀，静置后过0.22μm滤膜，用岛津高效液相色谱测定芘的浓度。采用岛津高效液相色谱(LC-20AT)测定。HPLC分析条件：Inertsil ODS-SP-C₁₈反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇和水(95∶5)，流速1.20mL·min^-1，柱温40℃，检测波长245nm，进样量20μl。培养液中功能植物内生菌数量的测定采用稀释涂布法，30℃恒温培养72h，回收的菌株经菌落形态以确定其为目标菌株，3个重复。菌株PX1对芘的降解动力学曲线见附图5，相比对照中芘的半衰期为495d，菌株PX1培养基中的芘半衰期为11.89d。

菌株PX1对不同浓度芘的降解能力见图6。培养10d，菌株PX1对10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0mg·L^-1的芘降解率分别为75.0％、51.0％、46.5％、42.7％、40.9％、37.7％、30.3％、26.5％。说明菌株在80.0mg·L^-1芘环境下依然可以降解环境中的芘，10d可降解环境中75％以上的芘(10.0mg·L^-1)。

2.菌株PX1降解芘的途径

通过LC-MS进行定性分析，深入研究Stenotrophomonas sp.PX1芘降解过程中的一系列中间代谢产物。中间产物研究具体步骤为：20mL的芘无机盐液体培养基(20mg·L^-1)中加入5％的菌悬液(菌悬液OD_600nm＝1.0，约10⁸cfu·mL^-1)，30℃、150r·min^-1摇床避光培养15d，每3d收集培养基进行测定。

采用固相萃取技术浓缩纯化培养液中代谢物(在培养液原始pH条件下进行)。具体步骤如下：首先依次用5mL甲醇、5mL超纯水活化和平衡Cleanert PEP小柱(Agela)，然后将取样的培养液加入固相萃取柱中，依靠重力或者用洗耳球施加压力，使培养液缓慢过柱，培养液完全通过后弃去，再用10ml甲醇洗脱，收集滤液在40℃下用氮气吹干，用甲醇定容至1ml。用AB SCIEX高分辨液质联用仪(Triple TOF 5600plus)测定样品中的组分。

色谱条件：色谱柱为2.1mm×50mm烷基C₁₈反相柱；流动相为甲醇/水(含有0.1％冰醋酸)；梯度洗脱，洗脱程序见表2，分析时间共29min；流速0.20mL·min^-1，进样量为5μL。质谱条件：多重反应监测(MRM)的扫描方式下正负离子同时监测；离子源ESI源；源喷射电压5500和-4500V；源温度(TEM)550℃；雾气化GS1 65psi；辅助GS265psi；气帘气25psi；接口持续加热；全程使用氮气；碰撞气压力medium；Q1和Q3分辨率UNIT。采用AB SCIEX公司提供的PeakView 2.2软件进行数据的采集与分析。

表2

通过LC-MS进行定性分析，在体系中共发现8种菌株PX1降解芘的中间产物，见图7。一级质谱结果中获得8种质子化分子离子特征峰，分别为I：m/z＝203.0853[M+H]⁺，II：m/z＝217.0658[M-H]^-，III：m/z＝233.0610[M-H]^-，IV：m/z＝219.0295[M-H]^-，V：m/z＝187.0396[M+H]⁺，VI：m/z＝153.0191[M-H]^-，VII：m/z＝137.0243[M-H]^-，VIII：m/z＝121.0300[M+H]⁺，IX：m/z＝141.0189[M-H]^-。

3.菌株PX1降解多环芳烃能力

通过测定培养液中PAHs的残留浓度来研究菌株PX1降解其他PAHs的降解能力，萘、菲、荧蒽、芘和苯并[a]芘分别作为2环PAHs、3环PAHs、4环PAHs和5环PAHs代表进行研究，培养基中分别添加100.0mg·L^-1萘；50.0mg·L^-1菲、20.0mg·L^-1芘、20.0mg·L^-1荧蒽或10.0mg·L^-1苯并[a]芘。

向20mL的PAHs无机盐液体培养基中加入5％的菌悬液(菌悬液OD_600nm＝1.0，约10⁸cfu·mL^-1)。30℃、150r·min^-1摇床避光培养10d后取样测定培养液中萘、芴、菲的残留浓度，10d后取样测定培养液中芘、荧蒽、苯并[a]芘的残留浓度。

菌株PX1对多种单一PAHs的降解能力见图8。培养10d，菌株PX1几乎可彻底降解培养基中的100.0mg·L^-1萘；对菲(50.0mg·L^-1)、芘(20.0mg·L^-1)、荧蒽(20.0mg·L^-1)、苯并[a]芘(10.0mg·L^-1)的降解率分别为72.6％、50.7％、31.9％、12.9％。由此表明，菌株PX1不仅可高效降解2～3环的低分子量PAHs(LMW-PAHs)，同时可降解4～5环的高分子量PAHs(HMW-PAHs)。

4.菌株PX1的促植物生长特性

菌株PX1产吲哚乙酸(IAA)的能力的测定，具体步骤如下：1mL菌悬液(菌悬液OD_600nm＝1.0，约10⁸cfu·mL^-1)以(5％的接种量)接入20mL含有500mg·L^-1的L-色氨酸的有氮培养基中，在培养箱中恒温30℃、150r·min^-1摇床培养48h后，将培养液以8000r·min^-1高速离心10min；弃沉淀，取1mL上清液加入到5mL离心管中，同时加入10mmol.L^-1磷酸溶液50μL和2mL显色剂(0.5mol·L^-1FeCl₃·7H₂O 1.0mL和35％HClO₄ 49.0mL的混合液)充分混匀。置于黑暗处，25℃恒温静置30min后利用紫外分光光度计于530nm波长处比色(注意设置不接菌为对照组)。

菌株PX1产铁载体(Siderophore)能力的测定，具体步骤如下：1mL菌悬液(OD_600nm＝1.0，约10⁸cfu·mL^-1)(5％的接种量)接入20mL的有氮培养基中，置于30℃、150r·min^-1条件下振荡培养48h后，将培养液以8000r·min^-1高速离心10min；弃沉淀，取3mL上清液于加入到10mL离心管中，同时加入3mL的CAS检测液，充分混匀后静置1～2h，利用紫外分光光度计于630nm处测定吸光度，同时取3mL CAS检测液和3mL不接菌的有氮培养基上清液混匀作为CK对照组，根据与实验组的比值，判断菌株PX1产铁载体能力的大小。其中，有氮培养基成分为蔗糖10.0g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.1g，酵母提取物0.5g，CaCO₃ 0.5g，用水定容至1L，调节pH 7.0。CAS检测液成分为10mmol·L^-1十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)6mL，1.0mmol·L^-1FeCl₃ 1.5mL，2.0mmol·L^-1铬天青7.5mL，哌嗪-1，4-二乙磺酸(PIPES)4.307g，12mmol·L^-1HCl 6.25mL，加无菌水定容至100mL，调节pH至5.6。

菌株PX1的溶磷能力的测定，具体步骤如下：用无菌水洗涤收集菌株PX1后调节初始OD_600nm值约为1.0。取10μL菌悬液(OD_600nm＝1.0，约10⁸cfu·mL^-1)分别点接于有机磷和无机磷溶解能力测定培养基的中央，30℃条件下恒温培养12d后，测量菌株菌落溶磷透明圈直径(D)与菌落直径(d)的比值，以此来判断溶磷能力的强弱：其比值越大，则溶磷能力越强；比值越小，溶磷能力越弱；当比值为1.0时表示菌落无溶磷能力。

从表3可知，菌株PX1在有氮培养基上可以分泌IAA和铁载体，其中产IAA的量为4.356μg·mL^-1，呈中等水平；铁载体相对含量为0.526，说明菌株对铁离子的利用能力较强。同时，菌株PX1具有一定的溶有机磷和无机磷的能力。这三项指标共同说明，菌株PX1有促进植物生长、提高植物生物量的潜力和优势。

表3

实施例3：菌株PX1定殖方法

1.菌株PX1抗抗生素标记

抗生素选择：氯霉素(Chl)、氨苄青霉素(Amp)、壮观霉素(Spe)、盐酸四环素(Tet)、链霉素(Str)、卡那霉素(Km)、红霉素(Et)、和庆大霉素(Gm)。抗生素浓度设定为：10、20、50、75、100、125、150mg·L^-1。

LB抗性平板的制作步骤为：将LB液体培养基中加入1.8％的琼脂后121℃高压灭菌20min，待培养基冷却至50℃～60℃加入适量的抗生素溶液，使抗生素的最终浓度达到试验的目标浓度(10～150mg·L^-1抗生素溶液)。

将所筛菌株PX1的菌悬液(菌悬液OD_600nm＝1.0，约10⁸cfu·mL^-1)分别点接于含有不同浓度抗生素的LB固体平板上，30℃培养72h，以不加抗生素作为阴性对照，试验设置3个平行，观察培养皿中菌落生长情况。结果见表4。

表4

注：“+”表示有抗性，“-”表示无抗性。

将菌株PX1接种至LB抗性平板上，30℃培养2～4d，待有菌落长出后，挑取单菌落移入浓度较高抗性的平板上，逐渐提高抗生素的浓度。挑选在抗生素浓度至100mg·L^-1的抗性平板上稳定生长、菌落形态及其他生物学特性保持不变菌株，在抗性平板上传代5次以上，验证其抗性的稳定性，并通过16S rRNA基因验证为菌株PX1。

根据菌株PX1抗抗生素能力，选择壮观霉素和盐酸四环素制作MSM抗性平板，进行定殖效率研究时的再筛选培养基。抗性平板制作方法：将无机盐液体培养基中加入1.8％的琼脂后121℃高压灭菌20min，待培养基冷却至50℃～60℃加入适量的抗生素溶液和芘丙酮溶液，使抗生素和芘的最终浓度分别为50mg·L^-1和20mg·L^-1。

2.定殖菌株PX1接种体

将菌株PX1接种到含芘LB培养基中(丙酮含量低于0.5‰，含20mg·L^-1芘)，在LB液体中加壮观霉素和盐酸四环素，使芘和两种抗生素的终浓度分别为为20mg·L^-1和50mg·L^-1。30℃，150r·min^-1摇床培养24h。收集菌液，6000r·min^-1离心10min，弃掉上清液。加入无菌水冲洗菌体，再次离心分离菌体。重复洗涤菌株2～3次。最后用无机盐液体培养基调整菌株PX1悬液的OD_600nm＝1.0，菌株浓度约10⁸cfu·mL^-1，4℃保存备用。

3.菌株PX1定殖方法

植物种子经表面消毒，催芽、育苗24～72h后，用菌株PX1接种体浸种4～8h(CB)，以灭活菌株浸种作为对照(CK)。

通过从定殖植物体内再次筛选具有抗性的菌株PX1，判断菌株PX1是否定殖成功。

4.菌株PX1定殖效率

用超纯水清洗收获的植物样品，用滤纸上吸除植物表面水分后，用剪刀将植物根和茎叶分离，分别称取根和茎叶鲜重。将植物样品清洗干净后置于无菌操作台内依次用75％乙醇漂洗3～5min，无菌水冲洗3～4次，0.1％NaClO漂洗2～5min，再用无菌水冲洗。将消毒好的植物样品移入LB固体平板中30℃培养72h，检查确定植物表面无残留微生物。剪碎消毒好的植物样品，放进含有适量无菌水的灭菌研钵中充分研磨，吸取上清液稀释涂布于MSM抗性平板上，30℃恒温培养72h，计算细菌菌落数，每个处理设置3个重复。回收的菌株通过菌落形态与16S rRNA基因鉴定确认为菌株PX1，计算每g新鲜组织内菌株PX1数量(cfu·g^-1)。

从空心菜(图9-A)、小麦(图9-B)、绿豆芽(图9-C)和荞麦(图9-D)定殖试验结果显示，功能植物内生菌株PX1可通过浸种的方式成功地定殖到目标植物体内。

实施例4：菌株PX1在空心菜中定殖

1.材料准备

(1)供试植物：空心菜(Ipomoea aquatic Forsk)；

(2)定殖菌株PX1接种体(同实施例3)；

(3)芘Hoagland营养液的配制：在Hoagland营养液中加入含芘的丙酮溶液(丙酮含量低于0.5‰)，芘浓度分别为0、0.1、1.0、10mg·L^-1，依次以S0、S1、S2、S3代表。

2.空心菜种子经表面消毒，催芽、育苗24～72h后，用菌株PX1接种体浸种4～8h(CB)，以灭活菌株浸种作为对照(CK)。待植物株高为10cm左右时，选择长势相同的植株，移入相应装有800mL芘Hoagland营养液的植物水培盒中(15棵/盒)，每个处理3个重复，置于人工气候箱中，昼夜25/20℃培养。各处理参见表5。4d后采集植物样本进行测定。

3.菌株PX1的定殖状态

用超纯水清洗收获的空心菜样本，用滤纸上吸除植物表面水分后，用剪刀将植物根和茎叶分离，分别称取根和茎叶鲜重。

参照实施例3菌株PX1定殖效率的测定方法，计算每g新鲜空心菜组织内菌株PX1数量(参见表6)。从表6可知，浸种处理成功地将菌株PX1定殖到空心菜中，对照组均未检测到目标菌PX1。

表5

表6

注：表中同一植物组织的同列不同字母表示差异达到显著水平(p＜0.05)，“ND”表示未检出菌株PX1。

4.菌株PX1定殖促进了空心菜的生长

从表7可见菌株PX1定殖可促进空心菜的生长。在芘污染条件下，菌株PX1定殖显著提高了空心菜生长量达到128.4％(0.1mg·L^-1芘)、67.6％(1.0mg·L^-1芘)。

表7

注：表中同列不同字母表示差异达到显著水平(p＜0.05)。

5.菌株PX1定殖降低了空心菜中芘污染

空心菜中芘的提取与测定：(1)冷冻干燥后的空心菜根和茎叶，充分研磨粉碎，过20目筛，然后称取一定量空心菜样品于30mL玻璃离心管中，再加入10mL正己烷和二氯甲烷(V∶V＝1∶1)的溶液超声萃取30min，超声萃取重复3次。(2)将全部萃取液过无水硫酸钠柱-硅胶柱净化，用11mL的二氯甲烷和正己烷(V∶V＝1∶1)混合液洗脱。(3)将旋转烧瓶中洗脱液于40℃恒温旋转浓缩至干，加甲醇定容至1mL，0.22μm孔径滤膜过滤，选用HPLC法测定小麦茎叶和根中芘含量，并计算芘浓度(mg·kg^-1)、芘积累量(μg·pot^-1)。

空心菜体内芘积累量(Accumulation，A)的计算公式：A＝Cp×M，其中Cp表示植物体内芘的浓度(mg·kg^-1)，M表示植物干重(mg·棵^-1)。

由表8可知，菌株PX1定殖可显著降低空心菜中芘污染，空心菜根中芘浓度远高于茎叶中芘浓度，植株中芘含量随培养液中芘污染的加重而增大。

表8

注：表中同一植物组织的同列不同字母表示差异达到显著水平(p＜0.05)，“ND”表示未检出芘。

从不同条件下植物积累芘结果可见，菌株PX1定殖降低了芘在植物中的积累。在芘污染条件下，菌株PX1定殖处理的空心菜中芘的积累量分别为0.031μg·棵^-1(0.1mg·L^-1芘暴露)、1.079μg·棵^-1(1mg·L^-1芘暴露)、2.596μg·棵^-1(10mg·L^-1芘暴露)。分别比未定殖菌株PX1的空心菜体内累积量降低50.9％、38.3％和14.5％。可知，菌株PX1定殖处理中空心菜体内芘的积累量低于无菌株定殖的空心菜。

为了进一步表征菌株PX1对空心菜体内芘降解的作用，引入了促进效率。菌株PX1的促进效率(Enhancement ratio，E％)的计算方式如下，其中C_CK表示对照组植物体内芘平均浓度(mg·kg^-1)，C_CB表示定殖处理组植物体内芘浓度(mg·kg^-1)：

如附图10所示，培养4d后，在污染浓度为1.0mg·L^-1的培养液中，空心菜茎叶、根中菌株PX1的促进效率分别为59.1％、42.5％；在污染浓度为10mg·L^-1的培养液中，空心菜茎叶、根中菌株PX1的促进效率分别为35.3％、29.7％。结果表明，功能植物内生细菌PX1在不同程度上都减少了空心菜根和茎叶中芘的浓度。

6.菌株PX1定殖降低了芘Hoagland营养液中芘的残留

Hoagland营养液中芘的提取与测定：培养4d后，在10mL的芘污染Hoagland营养液中加入两倍体积的甲醇，超声萃取30min，过0.22μm孔径滤膜，采用高效液相色谱(HPLC)测定芘污染Hoagland营养液中芘含量(mg·L^-1)。(图11)结果可见，菌株PX1定殖可以有效地促进芘污染Hoagland营养液中芘的去除。Hoagland营养液中芘的去除计算公式如下：

其中C₀为0d时Hoagland营养液中芘浓度，C₄为4d时该处理Hoagland营养液中芘浓度。

在含0.1mg·L^-1、1mg·L^-1和10mg·L^-1芘Hoagland营养液中，无功能植物内生菌的CK组芘的去除率分别为36.8％、45.3％和54.5％，而菌株PX1定殖组(CB)的去除率分别为41.9％、51.1％和60.9％。因实验操作过程中采用植物水培盒密闭培养空心菜减少了挥发和光降解等因素导致的芘去除，且空心菜体内芘含量降低，故认为本试验芘污染Hoagland营养液中芘的去除主要源于植物和微生物降解。

实施例5：菌株PX1在小麦中定殖

1.材料准备

(1)供试植物：小麦(Triticum aestivum L)；

(2)定殖菌株PX1接种体(同实施例3)

(3)芘污染Hoagland营养液的配制：在Hoagland营养液中加入含芘的丙酮溶液(丙酮含量低于0.5‰)，芘浓度分别为0、0.1、1.0、10mg·L^-1，依次以S0、S1、S2、S3代表(同实施例4)。

2.小麦种子经表面消毒，催芽、育苗24～72h后，用菌株PX1接种体浸种4～8h(CB)，以灭活菌株浸种作为对照(CK)。待小麦幼苗株高为10cm左右时，选择长势相同的植株，移入相应装有800mL芘Hoagland营养液的植物水培盒中(15棵/盒)，每个处理3个重复，置于人工气候箱中，昼夜25/20℃培养。各处理参见表5。4d后采集植物样本进行测定。

3.菌株PX1的定殖状态

用超纯水清洗收获的小麦样本，用滤纸上吸除植物表面水分后，用剪刀将植物根和茎叶分离，分别秤取根和茎叶鲜重。

参照实施例3菌株PX1定殖效率的测定方法，计算每g新鲜小麦组织内菌株PX1数量(参见表9)。从表9可知，浸种处理成功地将菌株PX1定殖到小麦幼苗体内，对照组均未检测到目标菌PX1。

表9

注：表中同一植物组织的同列不同字母表示差异达到显著水平(p＜0.05)，“ND”表示未检出菌株PX1。

4.菌株PX1定殖促进了小麦的生长

从表10可见无论是否存在芘污染，功能菌株PX1定殖对小麦生长都具有显著促进作用。菌株PX1定殖显著提高了小麦生长量，对生长的促进作用分别达到53.2％(无芘污染)、57.8％(0.1mg·L^-1芘)、71.5％(1.0mg·L^-1芘)、62.6％(10.0mg·L^-1芘)。

表10

注：表中同列不同字母表示差异达到显著水平(p＜0.05)。

5.菌株PX1定殖降低了小麦体内芘污染

小麦中芘的提取与测定：参照实施例4中空心菜体内芘提取方法。

表11

注：表中同一植物组织的同列不同字母表示差异达到显著水平(p＜0.05)，“ND”表示未检出芘。

由表11可知，菌株PX1定殖可显著降低小麦中芘残留浓度。从不同条件下植物积累芘结果可见，菌株PX1定殖显著降低了芘在小麦中的积累。在芘污染条件下，菌株PX1定殖处理的小麦中芘的积累量分别为0.828μg·棵^-1(0.1mg·L^-1芘暴露)、2.065μg·棵^-1(1mg·L^-1芘暴露)和6.487μg·棵^-1(10mg·L^-1芘暴露)，分别比未定殖菌株PX1的小麦体内累积量降低了43.0％、49.7％、54.1％。可知，菌株PX1定殖的小麦体内芘的积累量低于无菌株定殖的小麦。

如图12所示，培养4d后，在污染浓度为0.1mg·L^-1的培养液中，小麦茎叶、根中菌株PX1芘去除促进效率分别为60.6％、51.3％；在污染浓度为1.0mg·L^-1的培养液中，小麦茎叶、根中菌株PX1芘去除促进效率分别为67.2％、62.0％；在污染浓度为10.0mg·L^-1的培养液中，小麦茎叶、根中菌株PX1芘去除促进效率分别为73.4％、66.5％。结果表明，功能植物内生细菌PX1在不同程度上都减少了小麦根和茎叶中芘的浓度。

6.菌株PX1定殖降低了芘Hoagland营养液中芘的残留

Hoagland营养液中芘的提取、测定方法、以及Hoagland营养液中芘的去除率计算方法参照实施例4。由图13可见，菌株PX1定殖可以有效地促进芘污染Hoagland营养液中芘的去除。在含0.1mg·L^-1、1mg·L^-1和10mg·L^-1芘Hoagland营养液中，无菌株PX1定殖的CK组芘的去除率分别为21.0％、42.8％和45.6％，而菌株PX1定殖的CB组芘的去除率分别为28.3％、47.2％和52.3％。

因实验操作过程中采用植物水培盒密闭培养植物减少了挥发和光降解等因素导致的芘去除，且小麦体内芘含量降低，故认为本试验芘污染Hoagland营养液中芘的去除主要源于植物和微生物降解。

实施例6：菌株PX1在绿豆芽中定殖

1.材料准备

(1)供试植物：绿豆芽(Vigna radiata(L.)R.Wilczak)；

(2)定殖菌株PX1接种体(同实施例3)

(3)芘污染Hoagland营养液的配制：在Hoagland营养液中加入含芘的丙酮溶液(丙酮含量低于0.5‰)，芘浓度分别为0、0.1、1.0、10mg·L^-1，依次以S0、S1、S2、S3代表(同实施例4)。

2.绿豆种子经表面消毒，催芽、育苗24～72h后，用菌株PX1接种体浸种4～8h(CB)，以灭活菌株浸种作为对照(CK)。待绿豆幼苗株高为15cm左右时，选择长势相同的植株，移入相应装有800mL芘Hoagland营养液的植物水培盒中(20棵/盒)，每个处理3个重复，置于人工气候箱中，昼夜25/20℃培养。各处理参见表5。4d后采集植物样本进行测定。

3.菌株PX1的定殖状态

参照实施例3菌株PX1定殖效率的方法，计算每g新鲜绿豆芽组织内菌株PX1数量。从表12可知，浸种处理成功地将菌株PX1定殖到绿豆芽体内，对照组均未检测到目标菌PX1。

表12

注：表中同一植物组织的同列不同字母表示差异达到显著水平(p＜0.05)，“ND”表示未检出菌株PX1。

4.菌株PX1定殖降低了绿豆芽体内芘污染

绿豆芽体内芘的提取与测定：参照实施例4中空心菜体内芘提取方法。

由表13可知，菌株PX1定殖可显著降低绿豆芽中芘污染，绿豆芽根中芘浓度远高于茎叶中芘浓度，植株中芘含量随培养液中芘污染的加重而增大。

从不同条件下植物积累芘结果可见，菌株PX1定殖显著降低了芘在绿豆芽体内的积累。在芘污染条件下，菌株PX1定殖处理的绿豆芽中芘的积累量分别为1.033μg·棵^-1(1mg·L^-1芘暴露)和、2.626μg·棵^-1(10mg·L^-1芘暴露)，分别比未定殖菌株PX1的绿豆芽体内累积量显著降低了8.4％、20.8％。可知，随着芘污染浓度的增大，菌株PX1定殖处理中绿豆芽体内芘的积累量低于无菌株定殖的绿豆芽。

表13

注：表中同一植物组织的同列不同字母表示差异达到显著水平(p＜0.05)，“ND”表示未检出芘。

为了进一步表征菌株PX1对绿豆芽体内芘降解的作用，引入了促进效率。如图14所示，培养4d后，在污染浓度为1.0mg·L^-1的培养液中，绿豆芽茎叶、根中菌株PX1的促进效率分别为33.7％、28.3％；在污染浓度为10.0mg·L^-1的培养液中，绿豆芽茎叶、根中菌株PX1的促进效率分别为44.8％、36.2％。结果表明，功能植物内生细菌PX1在不同程度上都减少了绿豆芽根和茎叶中芘的积累量。

5.菌株PX1定殖降低了芘Hoagland营养液中芘的残留

Hoagland营养液中芘的提取、测定方法、以及Hoagland营养液中芘的去除率计算方法参照实施例4。由图15可见，菌株PX1定殖可以有效地促进芘污染Hoagland营养液中芘的去除。在含0.1mg·L^-1、1mg·L^-1和10mg·L^-1芘Hoagland营养液中，无菌株PX1定殖的CK组芘的去除率分别为35.7％、46.3％和50.9％，而菌株PX1定殖的CB组芘的去除率分别为44.7％、52.8％和60.4％。因实验操作过程中采用植物水培盒密闭培养植物减少了挥发和光降解等因素导致的芘去除，且绿豆芽体内芘含量降低，故认为本试验芘污染Hoagland营养液中芘的去除主要源于植物和微生物降解。

实施例7：菌株PX1在荞麦中定殖

1.材料准备

(1)供试植物：荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)；

(2)定殖菌株PX1接种体(同实施例3)

(3)芘污染Hoagland营养液的配制：在Hoagland营养液中加入含芘的丙酮溶液(丙酮含量低于0.5‰)，芘浓度分别为0、0.1、1.0、10mg·L^-1，依次以S0、S1、S2、S3代表(同实施例4)。

2.荞麦种子经表面消毒，催芽、育苗24～72h后，用菌株PX1接种体浸种4～8h(CB)，以灭活菌株浸种作为对照(CK)。待绿豆幼苗株高为15cm左右时，选择长势相同的植株，移入相应装有800mL芘Hoagland营养液的植物水培盒中(20棵/盒)，每个处理3个重复，置于人工气候箱中，昼夜25/20℃培养。各处理参见表5。4d后采集植物样本进行测定。

3.菌株PX1的定殖状态

参照实施例3菌株PX1定殖效率的方法，计算每g新鲜荞麦组织内菌株PX1数量。从表14可知，浸种处理成功地将菌株PX1定殖到荞麦体内，对照组均未检测到目标菌PX1。

表14

注：表中同一植物组织的同列不同字母表示差异达到显著水平(p＜0.05)，“ND”表示未检出菌株PX1。

4.菌株PX1定殖降低了荞麦体内芘污染

荞麦体内芘的提取与测定：参照实施例4中空心菜体内芘提取方法。

由表15可知，菌株PX1定殖可显著降低荞麦中芘污染。

从不同条件下植物积累芘结果可见，菌株PX1定殖显著降低了芘在荞麦体内的积累。在芘污染条件下，菌株PX1定殖处理的荞麦中芘的积累量分别为4.72μg·棵^-1(1mg·L^-1芘暴露)和14.94μg·棵^-1(10mg·L^-1芘暴露)，分别比未定殖菌株PX1的荞麦体内累积量降低了25.8％、38.8％。可知，随着芘污染浓度的增大，菌株PX1定殖处理中荞麦体内芘的积累量低于无菌株定殖的荞麦。

为了进一步表征菌株PX1对荞麦体内芘降解的作用，引入了促进效率。如图16所示，培养4d后，在污染浓度为1mg·L^-1的培养液中，荞麦茎叶、根中菌株PX1的促进效率分别为48.4％、38.6％；在污染浓度为10mg·L^-1的培养液中，荞麦茎叶、根中菌株PX1的促进效率分别为57.0％、50.2％。结果表明，功能植物内生细菌PX1在不同程度上都减少了荞麦根和茎叶中芘的浓度。

表15

注：表中同一植物组织的同列不同字母表示差异达到显著水平(p＜0.05)，“ND”表示未检出芘。

6.菌株PX1定殖降低了芘Hoagland营养液中芘的残留

Hoagland营养液中芘的提取、测定方法、以及Hoagland营养液中芘的去除率计算方法参照实施例4。由图17可见，菌株PX1定殖可以有效地促进芘污染Hoagland营养液中芘的去除。在含0.1mg·L^-1、1mg·L^-1和10mg·L^-1芘Hoagland营养液中，无菌株PX1定殖的CK组芘的去除率分别为41.9％、52.5％和53.3％，而菌株PX1定殖的CB组芘的去除率分别为58.1％、64.5％和71.8％。因实验操作过程中采用植物水培盒密闭培养荞麦减少了挥发和光降解等因素导致的芘去除，且荞麦体内芘含量降低，故认为本试验芘污染Hoagland营养液中芘的去除主要源于植物和微生物降解。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 多环芳烃降解功能的植物内生细菌PX1及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1445

<212> DNA

<213> 牛筋草(Eleusine indica L. Gaertn.)

<400> 1

atgaggttgg ctaccatgca gtcgaacggc agcacaggag agcttgctct ctgggtggcg 60

agtggcggac gggtgaggaa tacatcggaa tctacctttt cgtgggggat aacgtaggga 120

aacttacgct aataccgcat acgaccttcg ggtgaaagca ggggaccttc gggccttgcg 180

cggatagatg agccgatgtc ggattagcta gttggcgggg taaaggccca ccaaggcgac 240

gatccgtagc tggtctgaga ggatgatcag ccacactgga actgagacac ggtccagact 300

cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg caagcctgat ccagccatac 360

cgcgtgggtg aagaaggcct tcgggttgta aagccctttt gttgggaaag aaaagcagcc 420

agttaatacc tggttgttct gacggtaccc aaagaataag caccggctaa cttcgtgcca 480

gcagccgcgg taatacgaag ggtgcaagcg ttactcggaa ttactgggcg taaagcgtgc 540

gtaggtggtt gtttaagtct gttgtgaaag ccctgggctc aacctgggaa ttgcagtgga 600

tactgggcga ctagagtgtg gtagagggta gtggaattcc tggtgtagca gtgaaatgcg 660

tagagatcag gaggaacatc catggcgaag gcagctacct ggaccaacac tgacactgag 720

gcacgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cctaaacgat 780

gcgaactgga tgttgggtgc aatttggcac gcagtatcga agctaacgcg ttaagttcgc 840

cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900

cggtggagta tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggc cttgacatgt 960

cgagaacttt ccagagatgg attggtgcct tcgggaactc gaacacaggt gctgcatggc 1020

tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc 1080

cttagttgcc agcacgtaat ggtgggaact ctaaggagac cgccggtgac aaaccggagg 1140

aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc ccttacggcc agggctacac acgtactaca 1200

atggtaggga cagagggctg caaacccgcg agggcaagcc aatcccagaa accctatctc 1260

agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcagat 1320

cagcattgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg 1380

agtttgttgc accagaagca ggtagcttaa ccttcgggag ggcgctgcca cggtgtcccg 1440

attac 1445

Claims (7)

1.一种多环芳烃降解功能的植物内生菌PX1，其特征在于，所述多环芳烃降解功能的植物内生菌PX1的分类命名为寡养单胞菌（Stenotrophomonassp.），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 21310，保藏日期为2020年12月07日。

2.根据权利要求1所述的多环芳烃降解功能的植物内生菌PX1，其特征在于，所述芘降解功能植物内生细菌PX1从多环芳烃污染环境中的植物体内分离筛选纯化获得。

3.根据权利要求2所述的多环芳烃降解功能的植物内生菌PX1，其特征在于，所述多环芳烃为萘、菲、芘、荧蒽或苯并[a]芘中的一种或几种。

4.权利要求1 ~ 3任一项所述的多环芳烃降解功能的植物内生菌PX1在降低植物体内和/或种植环境中的多环芳烃污染的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述多环芳烃降解功能的植物内生菌PX1定殖于植物中降低植物中和/或种植环境中的多环芳烃。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述定殖方法为浸种定殖，所述浸种定殖方法为将植物种子表面消毒，催芽、育苗24 ~ 72h后，用菌株PX1菌悬液，浸泡4 ~ 8 h进行定殖。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为小麦、荞麦、空心菜或绿豆。

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