CN117106048A - 一种提高植物遗传转化效率的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高植物遗传转化效率的新方法。本发明所解决的技术问题是如何提高核酸分子转化植物的转化效率。具体公开了序列2所示的蛋白质、提高所述蛋白质的编码基因表达的物质或提高所述蛋白质的活性或含量的物质在下任一种中的应用；A1)调控核酸分子转化植物的转化效率中的应用，或在制备调控核酸分子转化植物的转化效率的产品中的应用；A2)促进核酸分子转化植物中的应用，或在制备促进核酸分子转化植物的产品中的应用。将调控基因表达的物质和目的核酸分子导入植物中，可以提高所述目的核酸分子导入植物的转化效率，尤其在麦类中，本发明对麦类的遗传转化实验进行做出贡献。
Description
技术领域
本发明本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高植物遗传转化效率的新方法。
背景技术
小麦是世界上重要的粮食作物之一，分布范围广，种植面积大，关系到经济和社会稳定发展。因此，培育具有高产、优质、抗病、抗逆等优良性状的小麦品种具有重要意义。常规杂交育种一直是培育小麦新品种的主要途径，对增加小麦产量发挥了重要作用，但随着全球气候变化导致农作物生物胁迫和非生物胁迫的加重，人口增加对粮食需求量的增大，利用杂交育种技术难以解决小麦生产中出现的一些新问题和过去长期没有解决的一些老问题，需要利用生物技术，尤其是转基因技术培育某一性状突出或综合性状优良的小麦品种。在基因水平操控和定向改良方面，转基因技术有明显的优势，是改良植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗旱等优良性状的有力工具。20世纪80年代以来，转基因技术及其在植物遗传改良上的应用引起了科研工作者的广泛兴趣。人们尝试利用不同转化方法对植物进行改良，如基因枪介导、农杆菌介导、花粉管通道、电击穿孔等，培育了抗虫棉花、抗虫玉米、抗除草剂大豆、抗除草剂油菜、抗病毒木瓜、延熟番茄、高维生素含量水稻、抗旱小麦等转基因植物新品种和新材料(James，2012；张双喜等，2011)，在生产上发挥了重要作用。转基因作物不但提高了农产品产量，改良了品质，增加了农民收入，而且减少了杀虫剂使用，保护了环境和生物多样性，提高了农产品品质。但是小麦属于遗传转化比较困难的作物，全球转基因小麦研究和产业化明显处于落后状态，低效率的遗传转化技术是限制转基因小麦研发的瓶颈之一。
小麦的遗传转化效率一直较低，但是近几年取得了较大的进展。王轲所在实验室通过引进PureWheat技术，Fielder转化效率达53％，同时成功转化济麦22、矮抗58、郑麦7698、周麦18、扬麦16、内麦836、西农979、川麦42、科农199、石4185、师栾02-1、冀麦5265、中麦895、轮选987等我国多个商业化推广的小麦品种，转化效率2.9-22.7％(Wang等，Generation of marker-free transgenic hexaploid wheat via an Agrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercial Chinese wheat varieties,Plant Biotechnology Journal,2017,15(5):614-623.)。尽管如此，小麦的基因型依赖性依旧非常严重，澳大利亚小麦品种Sunstate，中国小麦品种京411、矮抗58、宁春4号等仍然不能转化成功，济麦22等主要商业化品种的转化效率仍然较低，这远远不能满足小麦育种家的需要。因此，解决小麦遗传转化的基因型限制，尤其提高大面积推广小麦品种的转化效率，对于充分发挥转基因技术在小麦遗传育种中的作用迫在眉睫。
尽管诸多组织培养方案和技术在提高小麦遗传转化方面取得了一定的效果，显然其解决不了小麦基因型限制的问题。植物组织培养再生性能作为影响转基因技术成败的关键性状，其势必由某个或某些主效基因控制。所以，克隆并利用再生相关基因成为解决小麦遗传转化基因型依赖性的关键。
发明内容
本申请所要解决的技术问题是如何提高植物遗传转化效率，尤其是大麦和小麦。
为了解决上述问题，本申请提供了一种下述应用。
蛋白质、调控基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下任一种中的应用；
A1)调控核酸分子转化植物的转化效率中的应用，或在制备调控核酸分子转化植物的转化效率的产品中的应用；
A2)促进核酸分子转化植物中的应用，或在制备促进核酸分子转化植物的产品中的应用所述蛋白质为如下任一种：
B1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述基因编码所述蛋白质。
序列2具体如下：
MPQTPSTRWCPTPEQLMILEEMYRSGVRTPNAAEIQQITAHLAYYGRIEGKNVFYWFQNHKARERQRLRRRLCARHQQPSSPAAPPPPPPHTGAAGGGGNAAGAGAGVNAIHPAVMQLHHHHHTYATSCFMAPQGYLQQETAAGGALPVSGLEFAGKTSQQQEWMTQQQMVMENSNFNNSVAAAGGSSAAAGGGMNNMTPPPWPCCRPLRTLELFPTKSTGGGLRDECSSSKSSSCSTSTN。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述蛋白质中，序列2(SEQ ID No.2)由个241个氨基酸残基组成。将其命名为TaWOX3蛋白。其编码基因为TaWOX3基因。
如上所述的应用，所述蛋白来源于小麦。
发明内容：
上文中，所述小麦可为小麦品系CB037。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
如上所述的应用，所述调控基因表达的物质为下述任一种：
D1)、编码上述蛋白质的核酸分子；
D2)、含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)、含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)、含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)、含有D1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有D2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有D3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
D6)、含有D1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有D3)所述重组载体的转基因植物组织；
D7)、含有D1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有D3)所述重组载体的转基因植物器官。
D1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质TaWOX3的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质TaWOX3的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质TaWOX3且具有蛋白质TaWOX3功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为pWMB110载体；
上述生物材料中，D2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
上述D3)中，所述重组载体可为用植物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、pMDC85或pCAMBIA1391-Xb。使用OsSOAR1构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。作为一个具体实施例，本申请使用pWMB110载体作为表达载体。
作为一个具体实施例，所述重组载体为pWMB110-TaWOX3载体。所述pWMB110-TaWOX3载体是核苷酸序列为序列1的DNA分子。
作为一个具体实施例，所述重组微生物中的微生物菌株可为农杆菌C58C1。
如上所述的应用，D1)所述的核酸分子为核苷酸序列为序列1的第9994-10855所示的DNA分子。
序列1具体如下：
AAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAATCGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCTCGGGATCAAAGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCACCGGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTGACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATCCAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGCCGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACCCGGAGCGGGCGCGAGGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCGGCACAGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCGGCTGCACTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCCACCGAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCCGAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGCGGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCTCAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCAGCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCTTGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACAAATACGCAAGGGGAACGCATGAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGCCCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCGCGATTGGGCGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGACCGCGACGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGGCGGACTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGACTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGCCAAGCCCTTACGACATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCGCATTGAGGTCACGGATGGAAGGCTACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACGCGCATCGGCGGTGAGGTTGCCGAGGCGCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCCCGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGGCACTGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGAATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGCGCTGGCCGCTGAAATTAAATCAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGCACAAACACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTGGCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGAAGATGTACGCGGTACGCCAAGGCAAGACCATTACCGAGCTGCTATCTGAATACATCGCGCAGCTACCAGAGTAAATGAGCAAATGAATAAATGAGTAGATGAATTTTAGCGGCTAAAGGAGGCGGCATGGAAAATCAAGAACAACCAGGCACCGACGCCGTGGAATGCCCCATGTGTGGAGGAACGGGCGGTTGGCCAGGCGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCGGCCCTGCAATGGCACTGGAACCCCCAAGCCCGAGGAATCGGCGTGACGGTCGCAAACCATCCGGCCCGGTACAAATCGGCGCGGCGCTGGGTGATGACCTGGTGGAGAAGTTGAAGGCCGCGCAGGCCGCCCAGCGGCAACGCATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGTGGCAAGCGGCCGCTGATCGAATCCGCAAAGAATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTGCGCCGTCGATTAGGAAGCCGCCCAAGGGCGACGAGCAACCAGATTTTTTCGTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCACCCGCGATAGTCGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCGTGACCGACGAGCTGGCGAGGTGATCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCAGGGCCGGCCGGCATGGCCAGTGTGTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTCCCATCTAACCGAATCCATGAACCGATACCGGGAAGGGAAGGGAGACAAGCCCGGCCGCGTGTTCCGTCCACACGTTGCGGACGTACTCAAGTTCTGCCGGCGAGCCGATGGCGGAAAGCAGAAAGACGACCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACACCACGCACGTTGCCATGCAGCGTACGAAGAAGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCGAGGGTGAAGCCTTGATTAGCCGCTACAAGATCGTAAAGAGCGAAACCGGGCGGCCGGAGTACATCGAGATCGAGCTAGCTGATTGGATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAACCCGGACGTGCTGACGGTTCACCCCGATTACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCCGTTTTCTCTACCGCCTGGCACGCCGCGCCGCAGGCAAGGCAGAAGCCAGATGGTTGTTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGCGCCGGAGAGTTCAAGAAGTTCTGTTTCACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGGAGTACGATTTGAAGGAGGAGGCGGGGCAGGCTGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAACCTGATCGAGGGCGAAGCATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGATGCTAGGGCAAATTGCCCTAGCAGGGGAAAAAGGTCGAAAAGGTCTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGAACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGTCACACATGTAAGTGACTGATATAAAAGAGAAAAAAGGCGATTTTTCCGCCTAAAACTCTTTAAAACTTATTAAAACTCTTAAAACCCGCCTGGCCTGTGCATAACTGTCTGGCCAGCGCACAGCCGAAGAGCTGCAAAAAGCGCCTACCCTTCGGTCGCTGCGCTCCCTACGCCCCGCCGCTTCGCGTCGGCCTATCGCGGCCGCTGGCCGCTCAAAAATGGCTGGCCTACGGCCAGGCAATCTACCAGGGCGCGGACAAGCCGCGCCGTCGCCACTCGACCGCCGGCGCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGCTGATGAATCCCCTAATGATTTTGGTAAAAATCATTAAGTTAAGGTGGATACACATCTTGTCATATGATCAAATGGTTTCGCGAAAAATCAATAATCAGACAACAAGATGTGCGAACTCGATATTTTACACGACTCTCTTTACCAATTCTGCCCCGAATTACACTTAAAACGACTCAACAGCTTAACGTTGGCTTGCCACGCATTACTTGACTGTAAAACTCTCACTCTTACCGAACTTGGCCGTAACCTGCCAACCAAAGCGAGAACAAAACATAACATCAAACGAATCGACCGATTGTTAGGTAATCGTCACCTCCACAAAGAGCGACTCGCTGTATACCGTTGGCATGCTAGCTTTATCTGTTCGGGCAATACGATGCCCATTGTACTTGTTGACTGGTCTGATATTCGTGAGCAAAAACGACTTATGGTATTGCGAGCTTCAGTCGCACTACACGGTCGTTCTGTTACTCTTTATGAGAAAGCGTTCCCGCTTTCAGAGCAATGTTCAAAGAAAGCTCATGACCAATTTCTAGCCGACCTTGCGAGCATTCTACCGAGTAACACCACACCGCTCATTGTCAGTGATGCTGGCTTTAAAGTGCCATGGTATAAATCCGTTGAGAAGCTGGGTTGGTACTGGTTAAGTCGAGTAAGAGGAAAAGTACAATATGCAGACCTAGGAGCGGAAAACTGGAAACCTATCAGCAACTTACATGATATGTCATCTAGTCACTCAAAGACTTTAGGCTATAAGAGGCTGACTAAAAGCAATCCAATCTCATGCCAAATTCTATTGTATAAATCTCGCTCTAAAGGCCGAAAAAATCAGCGCTCGACACGGACTCATTGTCACCACCCGTCACCTAAAATCTACTCAGCGTCGGCAAAGGAGCCATGGGTTCTAGCAACTAACTTACCTGTTGAAATTCGAACACCCAAACAACTTGTTAATATCTATTCGAAGCGAATGCAGATTGAAGAAACCTTCCGAGACTTGAAAAGTCCTGCCTACGGACTAGGCCTACGCCATAGCCGAACGAGCAGCTCAGAGCGTTTTGATATCATGCTGCTAATCGCCCTGATGCTTCAACTAACATGTTGGCTTGCGGGCGTTCATGCTCAGAAACAAGGTTGGGACAAGCACTTCCAGGCTAACACAGTCAGAAATCGAAACGTACTCTCAACAGTTCGCTTAGGCATGGAAGTTTTGCGGCATTCTGGCTACACAATAACAAGGGAAGACTTACTCGTGGCTGCAACCCTACTAGCTCAAAATTTATTCACACATGGTTACGCTTTGGGGAAATTATGAGGGGATCTCTCAGCGTTAAGGGATTTTGGTCATGCATTCTAGGTACTAAAACAATTCATCCAGTAAAATATAATATTTTATTTTCTCCCAATCAGGCTTGATCCCCAGTAAGTCAAAAAATAGCTCGACATACTGTTCTTCCCCGATATCCTCCCTGATCGACCGGACGCAGAAGGCAATGTCATACCACTTGTCCGCCCTGCCGCTTCTCCCAAGATCAATAAAGCCACTTACTTTGCCATCTTTCACAAAGATGTTGCTGTCTCCCAGGTCGCCGTGGGAAAAGACAAGTTCCTCTTCGGGCTTTTCCGTCTTTAAAAAATCATACAGCTCGCGCGGATCTTTAAATGGAGTGTCTTCTTCCCAGTTTTCGCAATCCACATCGGCCAGATCGTTATTCAGTAAGTAATCCAATTCGGCTAAGCGGCTGTCTAAGCTATTCGTATAGGGACAATCCGATATGTCGATGGAGTGAAAGAGCCTGATGCACTCCGCATACAGCTCGATAATCTTTTCAGGGCTTTGTTCATCTTCATACTCTTCCGAGCAAAGGACGCCATCGGCCTCACTCATGAGCAGATTGCTCCAGCCATCATGCCGTTCAAAGTGCAGGACCTTTGGAACAGGCAGCTTTCCTTCCAGCCATAGCATCATGTCCTTTTCCCGTTCCACATCATAGGTGGTCCCTTTATACCGGCTGTCCGTCATTTTTAAATATAGGTTTTCATTTTCTCCCACCAGCTTATATACCTTAGCAGGAGACATTCCTTCCGTATCTTTTACGCAGCGGTATTTTTCGATCAGTTTTTTCAATTCCGGTGATATTCTCATTTTAGCCATTTATTATTTCCTTCCTCTTTTCTACAGTATTTAAAGATACCCCAAGAAGCTAATTATAACAAGACGAACTCCAATTCACTGTTCCTTGCATTCTAAAACCTTAAATACCAGAAAACAGCTTTTTCAAAGTTGTTTTCAAAGTTGGCGTATAACATAGTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCGCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATCGTTACAATCAACATGCTACCCTCCGCGAGATCATCCGTGTTTCAAACCCGGCAGCTTAGTTGCCGTTCTTCCGAATAGCATCGGTAACATGAGCAAAGTCTGCCGCCTTACAACGGCTCTCCCGCTGACGCCGTCCCGGACTGATGGGCTGCCTGTATCGAGTGGTGATTTTGTGCCGAGCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTAATTCGGGGGATCTGGATTTTAGTACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGAAATTTTATTGATAGAAGTATTTTACAAATACAAATACATACTAAGGGTTTCTTATATGCTCAACACATGAGCGAAACCCTATAGGAACCCTAATTCCCTTATCTGGGAACTACTCACACATTATTATGGAGAAACTCGAGTCAAATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGACGGGGCGGTACCGGCAGGCTGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCACGTCATGCCAGTTCCCGTGCTTGAAGCCGGCCGCCCGCAGCATGCCGCGGGGGGCATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCGCACGCTCGGGTCGTTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTGGAGCCCAGTCCCGTCCGCTGGTGGCGGGGGGAGACGTACACGGTCGACTCGGCCGTCCAGTCGTAGGCGTTGCGTGCCTTCCAGGGGCCCGCGTAGGCGATGCCGGCGACCTCGCCGTCCACCTCGGCGACGAGCCAGGGATAGCGCTCCCGCAGACGGACGAGGTCGTCCGTCCACTCCTGCGGTTCCTGCGGCTCGGTACGGAAGTTGACCGTGCTTGTCTCGATGTAGTGGTTGACGATGGTGCAGACCGCCGGCATGTCCGCCTCGGTGGCACGGCGGATGTCGGCCGGGCGTCGTTCTGGGCTCATGGTAGACTCGAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGACACCGCGCGCGATAATTTATCCTAGTTTGCGCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATGTTAATTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGACCGGCAACAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCAAATGTTTGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCCTAGTTTGTGGAGGTGGAGCAAGAGGAGGACTTGGAGCTGCTGCACTCGTCCCTGAGGCCGCCACCGGTGCTCTTTGTAGGGAAGAGCTCTAGGGTTCTGAGCGGCCGGCAGCATGGCCATGGCGGCGGGGTCATATTATTCATACCACCGCCGGCCGCTGCGGAGCTGCCTCCAGCTGCTGCTACACTGTTGTTAAAGTTGCTGTTCTCCATCACCATCTGCTGCTGTGTCATCCATTCCTGCTGCTGGCTTGTCTTGCCTGCAAACTCCAACCCCGAAACTGGAAGAGCTCCTCCTGCTGCTGTTTCCTGCTGCAAGTAGCCCTACATATGTATATTCCATGAGTTAATTGTTATGGCTATATTGTTTTTGTTTCTTCAGAAAAGAGGTAGAGGAATAAATATAGGTATGCGCGCGTATAGAAATTACTCATAAGTTAGCAATAGAAAATTTAAAGACCTGAGGCGCCATGAAGCAGCTGGTTGCGTATGTGTGGTGGTGATGGTGCAGCTGCATCACCGCGGGGTGAATCGCGTTCACGCCCGCACCAGCACCAGCAGCATTGCCTCCGCCGCCGGCAGCACCAGTATGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGCCGCCGGCGAGGAGGGTTGCTGGTGGCGGGCGCAGAGGCGGCGACGGAGACGCTGGCGCTCGCGGGCCTTGTGGTTCTGGAACCAGTAGAAGACGTTCTTTCCCTCGATGCGGCCGTAGTAGGCGAGGTGCGCCGTGATCTGCTGGATCTCCGCCGCGTTAGGTGTGCGCACGCCGCTCCGGTACATCTCCTCCAGGATCATCAGCTGCTCAGGCGTCGGGCACCAACGGGTCGATGGCGTCTGCGGCATGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAGGGTGAGCATCGACAAAAGAAACAGTACCAAGCAAATAAATAGCGTATGAAGGCAGGGCTAAAAAAATCCACATATAGCTGCTGCATATGCCATCATCCAAGTATATCAAGATCAAAATAATTATAAAACATACTTGTTTATTATAATAGATAGGTACTCAAGGTTAGAGCATATGAATAGATGCTGCATATGCCATCATGTATATGCATCAGTAAAACCCACATCAACATGTATACCTATCCTAGATCGATATTTCCATCCATCTTAAACTCGTAACTATGAAGATGTATGACACACACATACAGTTCCAAAATTAATAAATACACCAGGTAGTTTGAAACAGTATTCTACTCCGATCTAGAACGAATGAACGACCGCCCAACCACACCACATCATCACAACCAAGCGAACAAAAAGCATCTCTGTATATGCATCAGTAAAACCCGCATCAACATGTATACCTATCCTAGATCGATATTTCCATCCATCATCTTCAATTCGTAACTATGAATATGTATGGCACACACATACAGATCCAAAATTAATAAATCCACCAGGTAGTTTGAAACAGAATTAATTCTACTCCGATCTAGAACGACCGCCCAACCAGACCACATCATCACAACCAAGACAAAAAAAAGCATGAAAAGATGACCCGACAAACAAGTGCACGGCATATATTGAAATAAAGGAAAAGGGCAAACCAAACCCTATGCAACGAAACAAAAAAAATCATGAAATCGATCCCGTCTGCGGAACGGCTAGAGCCATCCCAGGATTCCCCAAAGAGAAACACTGGCAAGTTAGCAATCAGAACGTGTCTGACGTACAGGTCGCATCCGTGTACGAACGCTAGCAGCACGGATCTNACACAAACACGGATCTAACACAAACATGAACAGAAGTAGACTACCGGGCCCTAACATGGACCGAACGCGATCTAGAGAGTANAGAGGGGGGGGGGGGAGGACGAGCGGCGTACCTTGAAGCGGAGGTGCCGACGGGTGGATTTGGGGGAGATCTGGTTTGTGTGTGTGTGCGCTCCGAACAACACGAGGTTGGGGAAAGAGGGTGTGGAGGGGGTGTCTATTTATTACGGCGGGCGAGGAAGGGAAAGCGAAGGAGCGGTGGGAAAGGAATCCCCCGTAGCTGCCGGTGCCGTGAGAGGAGGAGGAGGCCGCCTGCCGTGCCGGCTCACGTCTGCCGCTCCGCCACGCAATTTCTGGATGCCGACAGCGGAGCAAGTCCAACGGTGGAGCGGAACTCTCGAGAGGGGTCCAGAGGCAGCGACAGAGATGCCGTGCCGTCTGCTTCGCTTGGCCCGACGCGACGCTGCTGGTTCGCTGGTTGGTGTCCGTTAGACTCGTCGACGGCGTTTAACAGGCTGGCATTATCTACTCGAAACAAGAAAAATGTTTCCTTAGTTTTTTTAATTTCTTAAAGGGTATTTGTTTAATTTTTAGTCACTTTATTTTATTCTATTTTATATCTAAATTATTAAATAAAAAAACTAAAATAGAGTTTTAGTTTTCTTAATTTAGAGGCTAAAATAGAATAAAATAGATGTACTAAAAAAATTAGTCTATAAAAACCATTAACCCTAAACCCTAAATGGATGTACTAATAAAATGGATGAAGTATTATATAGGTGAAGCTATTTGCAAAAAAAAAGGAGAACACATGCACACTAAAAAGATAAAACTGTAGAGTCCTGTTGTCAAAATACTCAATTGTCCTTTAGACCATGTCTAACTGTTCATTTATATGATTCTCTAAAACACTGATATTATTGTAGTACTATAGATTATATTATTCGTAGAGTAAAGTTTAAATATATGTATAAAGATAGATAAACTGCACTTCAAACAAGTGTGACAAAAAAAATATGTGGTAATTTTTTATAACTTAGACATGCAATGCTCATTATCTCTAGAGAGGGGCACGACCGGGTCACGCTGCACTGCAGGCATGC。
如上所述的用途，所述调控为上调或增强或提高。
如上述的用途，述植物为如下任一种：
G1)单子叶植物；
G2)禾本科植物；
G3)小麦或大麦属属植物；
G4)小麦或大麦。
本申请中，所述小麦可为科农199、冀5265、济麦22、郑7698、杨麦16、中麦895、烟农19或周麦18。
本申请中，所述大麦可为Vlamingh。
发明内容：
本申请中，所述侵染效率可为愈伤组织侵染效率。所述愈伤组织可为大麦或小麦愈伤组织。
为了解决上述问题，本申请还提供了促进核酸分子转化植物的方法。
所述方法包括将上述的物质和目的核酸分子导入植物，以促进所述目的核酸分子导入植物。
本申请中，所述植物可为大麦或小麦。
本申请中，所述侵染可为可通过Ti质粒进行。所述Ti质粒可为pWMB110载体。
为了解决上述问题，本申请还提供了提高核酸分子转化植物的转化效率的方法。
所述方法包括将上述的物质和目的核酸分子导入植物中，以提高所述目的核酸分子导入植物的转化效率。
所述目的核酸分子可为质粒。
当所述物质为D1)所述核酸分子或D2)所述表达盒时，所述物质和目的核酸分子可通过一个载体也可以通过不同的载体转入目的植物中。
所述导入可为农杆菌介导的导入。
本申请中，所述小麦可为科农199、冀5265、济麦22、郑7698、杨麦16、中麦895、烟农19或周麦18。
本申请中，所述大麦可为Vlamingh。
上述的方法中，所述物质为D1)所述核酸分子或D2)所述表达盒时，所述物质和目的核酸分子通过pWMB110载体转入目的植物中。
上述的方法中，述植物为如下任一种：
G1)单子叶植物；
G2)禾本科植物；
G3)小麦或大麦属植物；
G4)小麦或大麦。
有益效果
本发明公开了遗传转化效率相关基因及其生物材料的应用。本发明所解决的技术问题是如何提高核酸分子转化植物的转化效率。
本申请构建了粒pWMB110-TaWOX3和pWMB110-GUS载体，分别将pWMB110-GUS载体和pWMB110-TaWOX3转入农杆菌，构建pWMB110-GUS/农杆菌C58C1和pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1，分别将pWMB110-GUS/农杆菌C58C1与pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1的混合菌、pWMB110-GUS/农杆菌C58C1侵染小麦，并获得转基因阳性植株，结果表明，与pWMB110-GUS/农杆菌C58C1侵染相比，pWMB110-GUS/农杆菌C58C1与pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1的混合菌侵染后小麦的遗传转化效率有大幅度提升。
进一步，分别使用pWMB110-GUS载体/农杆菌C58C1和pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1侵染大麦，结果表明，与pWMB110-GUS/农杆菌C58C1侵染相比，利用pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1侵染的大麦的遗传转化效率有大幅度提升。
上述结果表明，TaWOX3基因能提高小麦的遗传转化效率，尤其是麦类，其中，最为明显的是大麦或小麦。TaWOX3基因可与目的基因在不同载体然后与目标基因混合转化，促进目的基因的转化效率。
附图说明
图1为pWMB110载体示意图。
图2为pWMB110-TaWOX3载体示意图。
图3为pWMB110-GUS载体示意图。
图4小麦转基因植株的GUS基因的PCR检测结果。
图5大麦转基因植株的Bar基因的PCR检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体试验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
试验例中所举的质粒、菌株来源如下：
植物表达载体pWMB110记载在如下文献中：Liu et.al 2020Efficient inductionof haploid plants in wheat by editing of TaMTL using an optimizedAgrobacterium-mediated CRISPR system.Journal of Experimental Botany,71:1337–1349.该文献中的名称为plasmid pWMB110，也可通过常规途径购买。
大肠杆菌TOP10：为北京市全式金公司市售产品；大肠杆菌PRK2013和由本实验室保存，均为市售产品。
济麦22，冀5265，郑7698(郑麦7698)，杨麦16(杨麦16号)，中麦895和周麦18均记载在如下文献中：Wang et.al 2022The gene TaWOX5 overcomes genotype dependency inwheat genetic transformation.Nature Plants,8:110-117，济麦22，冀5265，郑7698，杨麦16，中麦895和周麦18也可通过常规商业途径购买；烟农19(烟农19号)记载在如下文献中：赵倩等，2005，优质高产小麦烟农19的选育及其特性研究，莱阳农学院学报，22(3)：168～174，烟农19可通过常规商业途径购买。
pWMB123载体和辅助菌PRK2013记载于如下文献：wang et.Al 2017Generation ofmarker-free transgenic hexaploid wheat via an Agrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercial Chinese wheat varieties Plantbiotechnology journal 15:614-623，该文献中的名称为vector pWMB123。
发根农杆菌C58C1记载于如下文献：Wang et.al 2017Generation of marker-free transgenic hexaploid wheat via an Agrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercial Chinese wheat varieties Plantbiotechnology journal 15:614-623，也可通过常规途径购买。
实施例1、小麦TaWOX3基因在小麦转基因中的应用
一、小麦TaWOX3基因克隆
设计引物(TaWOX3F：TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGCCGCAGACGC CATC；TaWOX3R：ACGATCGGGGAAATTCGAGCTCCTAGTTTGTGGAGGTGG AGCAAG)。
提取小麦品系CB037(小麦高效转基因受体品系CB037)的基因组DNA作为模板，用上述引物TaWOX3F和TaWOX3R进行AS-PCR扩增，得到907bp片段的PCR产物，备用；然后利用BamHI和SacI限制性内切酶对pWMB110载体(图1)进行酶切，得线性化载体。
将上述PCR产物和上述线性化载体利用Infusion法进行连接反应，将反应液转大肠杆菌Top10，抗性筛选后并测序，测序正确的质粒命名为pWMB110-TaWOX3或植物表达载体pWMB110-TaWOX3(图2)。将含有pWMB110-TaWOX3的菌株命名为pWMB110-TaWOX3/大肠杆菌Top10，备用。
测序结果表明植物表达载体pWMB110-TaWOX3的核苷酸序列为序列1。
其中，序列1的第8725-9402位为35S启动子，第8129-8680位为Bar基因，第7948-8122位为PloyA终止子，10856-12858位为UBI启动子，第9994-10855位为TaWOX3基因，第9725-9977位为Nos终止子。TaWOX3基因的长度为862bp，含有1个136bp的内含子，序列1的第10453-10855位为第1外显子，序列1的第10317-10452位为第1内含子，序列1的第9994-10316位为第2外显子，编码241个氨基酸，该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列2，该蛋白命名为TaWOX3蛋白。
设计引物(GUSF：CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGACCACCAGTG CAAGAA；GUSR：ACGATCGGGGAAATTCGAGCTCGGTCACACGTGATGGTG TGG)。以含有GUS基因的pWMB123载体为模板，用上述引物GUSF和GUSR进行AS-PCR扩增，得到2121bp片段的PCR产物，备用；然后利用BamHI和SacI限制性内切酶对pWMB110载体(图1)进行酶切，得线性化载体。
将上述PCR产物和上述线性化载体利用Infusion法进行连接反应，将反应液转大肠杆菌Top10，抗性筛选后并测序，测序正确的质粒命名为pWMB110-GUS或重组载体pWMB110-GUS(植物表达载体图3)。将含有pWMB110-GUS的菌株命名为pWMB110-GUS/大肠杆菌Top10，备用。
pWMB110-GUS是将pWMB110载体的BamHI酶切识别位点至SacI酶且识别位点之间的小片段替换为GUS基因片段，并保持pWMB110载体其他其序列不变，得到的重组载体。其中第8725-9402位为35S启动子，第8129-8680位为Bar基因，第7948-8122位为PloyA终止子，10069-14069位为UBI启动子，第9997-12068位为GUS基因，第9725-9977位为Nos终止子。GUS基因的长度为2072bp，含有1个190bp的内含子，第12033-10068位为第1外显子，序列1的第11843-12032位为第1内含子，序列1的第9997-11842位为第2外显子，编码627个氨基酸。
2、重组质粒转入发根农杆菌C58C1
1)将发根农杆菌C58C1(简称农杆菌C58C1)在4ml含Rif(利福平)、Gen(庆大霉素)的LB培养基的试管中，180rpm,28℃培养40h，得到农杆菌C58C1菌液；
将上述pWMB110-TaWOX3/大肠杆菌Top10及辅助菌PRK2013分别在4ml含Kan(卡那霉素)的LB培养基的试管中，225rpm,37℃培养16h，得到pWMB110-TaWOX3/大肠杆菌Top10菌液和辅助菌PRK2013菌液；
2)将上述农杆菌C58C1菌液、上述pWMB110-TaWOX3/大肠杆菌Top10和上述辅助菌PRK2013菌液各100μl加入1.5ml离心管中，混匀，得混合菌液一(目的菌)；
3)将上述农杆菌C58C1菌液和辅助菌PRK2013菌液各100μl加入1.5ml离心管中作对照，得混合菌液二(对照菌)；将混合得混合菌液一和混合菌液二分别4000rpm,离心3min收集菌体；
4)弃上清，并分别用移液枪将剩余的上清液吸干，加入50μl不含抗生素的LB培养基，重悬浮菌体，分别得重悬浮菌体一(目的菌)和重悬浮菌体二(对照菌)；
5)用移液枪将重悬浮菌体一和重悬浮菌体二分别加入不含抗生素的LB固体培养基上，不晃动平板，使菌体成团，待平板晾干后，用封口膜封好，28℃培养24h，分别获得恢复重悬浮菌体一(目的菌)和恢复重悬浮菌体二(对照菌)；
用接种针分别在恢复重悬浮菌体一(目的菌)和恢复重悬浮菌体二(对照菌)菌团上接取少量菌体，在含Rif(50mg L-1)、Gen(50mg L-1)、Kan(50mg L-1)的LB固体培养基上划线，每个平板的不同区域划一个目的菌(恢复重悬浮菌体一)和一个对照菌(恢复重悬浮菌体二)，28℃培养48h得到三亲杂交的平板。
6)从三亲杂交的平板上挑取单克隆，PCR验证阳性农杆菌菌株，即pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1(以其基因组DNA为模板，用上述引物TaWOX3F和TaWOX3R进行PCR，得到907bp的PCR产物的农杆菌菌株)。
pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1为将上述pWMB110-TaWOX3转入农杆菌C58C1得到的重组菌。
采用同样的方法将载体pWMB110-GUS转入农杆菌C58C1得到的重组菌，命名为pWMB110-GUS/农杆菌C58C1。
3、农杆菌介导法转化小麦
详细步骤和方法参考Wang et al.,2022和Ishida et al.,2015，具体如下：
1)在侵染前4d，将上述pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1和pWMB110-GUS/农杆菌C58C1分别接种于含Gent(庆大霉素)、50mg L-1、Kana 50mg L-1、Rif(利福平)、50mg L-1的YEP固体培养基上，28℃黑暗条件下复苏培养3d。挑取单菌落于10ml含有Gent 50mg L-1、Kana 50mg L-1、Rif 50mg L-1的YEP液体培养基中，200rpm、28℃黑暗条件下过夜震荡培养，分别获得活化菌液，分别将pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1和pWMB110-GUS/农杆菌C58C1菌液调节OD至OD600＝0.6，获得pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1 OD600＝0.6活化菌液和pWMB110-GUS/农杆菌C58C1 OD600＝0.6活化菌液。
2)分别在室温下3,500rpm离心10min收集农杆菌菌体，倒掉上清，分别用与OD600＝0.6活化菌液等体积的MS重悬液[(1/10MS基本培养基(北京西美杰科技有限公司，货号：M519，glucose 10g L-1)]重悬菌体沉淀，分别得到pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1重悬液和pWMB110-GUS/农杆菌C58C1重悬液，将pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1重悬液和pWMB110-GUS/农杆菌C58C1重悬液按体积比1：1混合，得pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1和pWMB110-GUS/农杆菌C58C1混合侵染重悬液。
3)选择约开花后14天的不同品种(科农199冀5265、济麦22、郑7698、杨麦16、中麦895、烟农19和周麦18)的小麦幼胚随机等分为2份，分别用pWMB110-GUS/农杆菌C58C1侵染重悬液进行侵染以及pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1和pWMB110-GUS/农杆菌C58C1混合侵染重悬液进行侵染，然后平铺于AS基本共培养基上(1/10MS基本培养基，葡萄糖10g L-1，琼脂8g L-1)培养，25℃培养3d。
4)将共培养后的幼胚转移至恢复培养基WLS-RES(MS基本培养基，2,4-D 0.5mg L-1,picloram 2.2mg L-1,Cb(羧苄青霉素)400mg L-1、Cef(头孢霉素)100mg L-1)黑暗下培养5d。
5)将恢复培养后的幼胚转移至第一次筛选培养基WLS-P5(MS基本培养基，2,4-D0.5mg L-1,picloram 2.2mg L-1,PPT(草铵膦)15mg L-1、Cb 400mg L-1、Cef 100mg L-1)黑暗下培养14d。
6)然后再将愈伤转移至第一次筛选培养基WLS-P10(MS基本培养基，2,4-D 0.5mgL-1,picloram 2.2mg L-1,PPT 10mg L-1、Cb 400mg L-1)黑暗下培养21d。
7)将上述愈伤转移至分化培养基LSZ-P5(MS基本培养基、PPT 5mg L-1)，光下培养2周。
8)将小麦绿芽分离出来放置生根培养基MSF-P5(MS培养基，PPT 5mg L-1、IBA0.5mg L-1),培养21d。
待根长好的幼苗移栽到土中，得到pWMB110-GUS的转基因植株(由pWMB110-GUS/农杆菌C58C1侵染重悬液侵染所得，以下简称pWMB110-GUS处理或对照)以及pWMB110-GUS和pWMB110-TaWOX3混合转化的转基因植株(由pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1和pWMB110-GUS/农杆菌C58C1混合侵染重悬液侵染所得，以下简称pWMB110-GUS+pWMB110-TaWOX3处理)。统计幼苗数量。
1)、PCR检测
利用GUSF1和GUSR1对上述幼苗进行基因检测，可扩增出得到996bp的GUS基因片段为阳性植株。利用GUS基因的特异引物(GUSF1:CAAGGAAATCCGCAACCATATC；GUSR1:TCAAACGTCC GAATCTTCTCCC)可以特异性扩增检测到pWMB110-GUS载体的GUS基因。通过上述检测判幼苗是否被转入的重组载体。
结果如图4所示，M：5000bp DNA marker；P：阳性质粒pWMB110-GUS；CK为普通小麦Fielder；1-8：分别为受体小麦是科农199、冀5265、济麦22、郑7698、杨麦16、中麦895、烟农19和周麦18的pWMB110-TaWOX3和pWMB110-GUS混合转化的转基因植株，9-16：分别为受体小麦是科农199、冀5265、济麦22、郑7698、杨麦16、中麦895、烟农19和周麦18的的转基因植株。引物GUSF1和GUSR1能从受体小麦分别是科农199、冀5265、济麦22、郑7698、杨麦16、中麦895、烟农19和周麦18的pWMB110-TaWOX3和pWMB110-GUS混合转化的转基因植株和pWMB110-GUS载体的转基因植株均可扩增出得到996bp的GUS基因片段为阳性植株。
2)、转化效率统计分析
转化效率＝(阳性苗/幼胚数)*％
结果如表1所示，与转对照载体pWMB110-GUS相比，混合转化pWMB110-GUS和pWMB110-TaWOX3载体的处理可以使同一品种的小麦遗传转化效率有大幅度提升，如：杨麦16对照转化效率为5.8％，而混合有TaWOX3载体可以将转化效率提高到100％；科农199对照转化效率为22.7％，混合有TaWOX3载体的处理将转化效率提高到近72.9％；以前转化率较低的品种济麦22、冀5265、郑麦7698、中麦895、烟农19和周麦18等，混合有TaWOX3载体可以使转化效率都提高到20％以上。
由此可见，含有pWMB110-TaWOX3载体的农杆菌C58C1可以大大提高pWMB110-GUS/农杆菌对小麦的转化效率，解决小麦转化的基因型问题。
表1对照载体和TaWOX3载体在小麦中的转化效率比较
实施例2、TaWOX3基因在大麦转基因中的应用
1、农杆菌介导法转化大麦
详细步骤和方法参考龚强等,2020和Wang et al.,2022，具体如下：
1)在侵染前4d，将上述pWMB110-TaWOX3载体/农杆菌C58C1和pWMB110-GUS载体/农杆菌C58C1分别接种于含Gent 50mg L-1、Kana 50mg L-1、Rif 50mg L-1的YEP固体培养基上，28℃黑暗条件下复苏培养3d。挑取单菌落于10ml含有Gent 50mg L-1、Kana 50mg L-1、Rif50mg L-1的YEP液体培养基中，200rpm、28℃黑暗条件下过夜震荡培养，分别获得活化菌液，将pWMB110-TaWOX3载体/农杆菌C58C1和pWMB110-GUS载体/农杆菌C58C1菌液调节OD至OD600＝0.6。获得pWMB110-TaWOX3/农杆菌C58C1 OD600＝0.6活化菌液和pWMB110-GUS/农杆菌C58C1 OD600＝0.6活化菌液。
2)然后分别在室温下3,500rpm离心10min收集农杆菌菌体，倒掉上清，分别用与OD600＝0.6活化菌液等体积的MS重悬液[(1/10MS基本培养基(北京西美杰科技有限公司，货号：M519，glucose 10g L-1)]重悬菌体沉淀，分别得到pWMB110-TaWOX3载体/农杆菌C58C1侵染重悬液和得到pWMB110-GUS载体/农杆菌C58C1侵染重悬液。
3)选择大约开花后14天左右的Vlamingh大麦(Vlamingh大麦记载于下述文献中：,龚强等，农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得。中国农业科学，2020,53(18):3638-3649.，Vlamingh大麦在该文献中的名称为优良大麦品种Vlamingh)幼胚随机等分为2份，分别与pWMB110-GUS载体/农杆菌C58C1侵染重悬液和pWMB110-TaWOX3载体/农杆菌C58C1侵染重悬液进行侵染，然后平铺于AS基本共培养基上(1/10MS基本培养基，glucose10g L-1，agarose 8g L-1)，25℃培养3d。
4)将共培养后的幼胚转移至第一次筛选培养基WLS-P5(MS基本培养基(北京西美杰科技有限公司，货号：M524)，肌醇0.35g L-1,脯氨酸0.69g L-1维生素B11 mg L-1,dicamba2.5mg L-1,水解酪蛋白1g L-1，PPT 5mg L-1,carbenicillin 250mg L-1,cefotaxime100mg L-1,MES1.95g L-1，PPT 5mg L-1、Cb 400mg L-1、Cef 100mg L-1)黑暗下培养14d，形成愈伤。
5)然后再将愈伤转移至第二次筛选培养基WLS-P10(MS基本培养基，肌醇0.35g L-1,脯氨酸0.69g L-1维生素B11 mg L-1,dicamba 2.5mg L-1,水解酪蛋白1g L-1，PPT 5mg L-1,carbenicillin 250mg L-1,MES1.95g L-1，PPT 10mg L-1)黑暗下培养21d。
6)再将上述愈伤转移至分化培养基DM(WLS-P5、CuSO4·5H2O 2.5mg L-1,kinetin1mg L-1,6-benzylaminopurine 0.5mg L-1and 1-naphthaleneacetic acid 0.05mg L-1))，光下培养2周，产生大麦绿芽。
7)将大麦绿芽分离出来放置生根培养基RT(WLS-P5培养基，IBA 1mg L-1),培养21d。
8)待根长好的幼苗移栽到土中，得到pWMB110-GUS的转基因苗(为pWMB110-GUS载体/农杆菌C58C1侵染重悬液侵染而得)和pWMB110-TaWOX3的转基因苗(pWMB110-TaWOX3载体/农杆菌C58C1侵染重悬液侵染而得)。
2、阳性苗鉴定
1)PCR方法
利用F-Bar/R-Bar对上述幼苗进行基因检测。Bar(pWMB110载体上含有Bar基因)引物(F-Bar:ACCATCGTCAACCACTACATCG；R-Bar:GCTGCCAGAAACCACGTCATG)可以特异性扩增检测到pWMB110-TaWOX3载体和pWMB110-GUS载体的Bar基因，可以看出得到430bp片段为阳性植株。
结果如图5所示，M：2000bp DNA marker；P：阳性质粒pWMB110-TaWOX3；CK为普通大麦Vlamingh；1-5：pWMB110-TaWOX3载体的转基因植株，6-10：pWMB110-GUS载体的转基因植株；可以看出得到430bp片段为阳性植株。
2)、转化效率统计分析
转化效率＝(阳性苗/幼胚数)*％
结果如表2所示，与含有对照载体pWMB110-GUS相比，pWMB110-TaWOX3载体可大大提高对大麦Vlamingh的遗传转化效率，对照载体pWMB110-GUS的转化效率为10.1％，而pWMB110-TaWOX3载体的转化效率高达33.3％。
表2对照载体和TaWOX3载体在大麦中的转化效率比较
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.蛋白质、调控基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下任一种中的应用；
A1)调控核酸分子转化植物的转化效率中的应用，或在制备调控核酸分子转化植物的转化效率的产品中的应用；
A2)促进核酸分子转化植物中的应用，或在制备促进核酸分子转化植物的产品中的应用；
所述蛋白质为如下任一种：
B1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述基因编码所述蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白来源于小麦。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述调控基因表达的物质为下述任一种：
D1)、编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；
D2)、含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)、含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)、含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)、含有D1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有D2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有D3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
D6)、含有D1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有D3)所述重组载体的转基因植物组织；
D7)、含有D1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有D3)所述重组载体的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，D1)所述的核酸分子为核苷酸序列为序列1的第9994-10855所示的DNA分子。
5.如权利要求1-4中任一所述的用途，其特征在于，所述调控为上调或增强或提高。
6.如权利要求1-5中任一所述的用途，其特征在于，述植物为如下任一种：
G1)单子叶植物；
G2)禾本科植物；
G3)小麦或大麦属属植物；
G4)小麦或大麦。
7.促进核酸分子转化植物的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求3中所述的物质和目的核酸分子导入植物，以促进所述目的核酸分子导入植物。
8.提高核酸分子转化植物的转化效率的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求3中所述的物质和目的核酸分子导入植物中，以提高所述目的核酸分子导入植物的转化效率。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述物质为D1)所述核酸分子或D2)所述表达盒时，所述物质和目的核酸分子通过pWMB110载体转入目的植物中。
10.如权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于，述植物为如下任一种：
G1)单子叶植物；
G2)禾本科植物；
G3)小麦或大麦属属植物；
G4)小麦或大麦。
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