CN117106025A - 一种拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19‑30及其应用，其分子式为C58H102N26O13S1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示，其C端进行酰胺化修饰。本发明抗菌肽水溶性好，抗菌活性高，抗菌谱广且安全，具有广阔应用前景；对临床致病性细菌、主要致病真菌和水产致病菌均有良好的抗菌活性，对HaCaT和Raw264.7细胞无细胞毒性。
Description
技术领域
本发明属于海洋分子生物学技术领域，具体涉及一种拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30及其应用。
背景技术
近年来，世界卫生组织持续报道了日益盛行的耐药性细菌感染，2014年全球监测报告提到了细菌耐药性问题已在全球多地域涌现，耐药形势严峻，迫切需要制定一项针对抗生素耐药性的全球干预计划。目前，每年因耐药性细菌感染的死亡人数高达70万，如不采取有效措施，2050年这一人数将高达1000万。
真菌感染仍然是一个重大的全球健康问题，可引起症状较轻的浅表、黏膜感染和危及生命的侵袭性真菌感染。浅表真菌感染以皮肤和指甲感染最为常见，口腔和生殖器的黏膜感染也很常见。全球近10亿人患有皮肤、指甲和毛发真菌感染，数百万人患有黏膜念珠菌病，患有严重的真菌疾病的群体远高于1.5亿人，每年因真菌感染的死亡人数超过150万。其中，念珠菌属、隐球菌属、曲霉属和肺囊虫属的真菌引起了90％的真菌死亡病例。
抗生素的滥用和过度使用加剧了耐药性细菌和真菌的产生与传播，无疑增加了治疗难度和医疗成本，甚至出现无药可用的境地。过去数十年，新型抗生素的发现远滞后于抗生素耐药性的发展速率，新型抗菌药物研发迫在眉睫。抗菌肽具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、促进伤口愈合、抗炎和免疫调控等作用，抗菌机制多样，可快速清除病原体且不易产生耐药性，被认为是天然抗生素的替代品。已有天然多肽、人工合成或设计改造的多肽进入临床试验，用于真菌或细菌感染的治疗。鉴于其潜在的临床应用价值，挖掘新型抗菌肽，寻找有效的抗生素替代品，以减少和改善临床耐药性问题变得尤为重要。
发明内容
本发明目的在于提供一种拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30，其分子式为C58H102N26O13S1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示，其C端进行酰胺化修饰。
上述拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30在制备抗细菌组合物中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，所述抗细菌组合物对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、屎肠球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌具有抑制和杀灭作用。
一种抗细菌组合物，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30。
在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为上述拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30。
上述拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30在制备抗酵母真菌组合物中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，所述抗酵母真菌组合物对酵母真菌具有抑制和杀灭作用。
进一步优选的，所述酵母真菌为新型隐球菌和白假丝酵母。
一种抗酵母真菌组合物，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30。
在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为上述拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30。
上述拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30在制备水产饲料添加剂中的应用。
一种水产饲料添加剂，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30。
本发明的有益效果是：
1、本发明兼具抗细菌和抗真菌活性，由12个氨基酸组成，C端进行酰胺化修饰，分子量为1403.67道尔顿，其中含3个精氨酸、2个组氨酸和1个甘氨酸。HeliQuest预测该抗菌肽电荷数为+3，疏水性为0.301，水溶性好，抗菌活性高，抗菌谱广且安全，具有广阔应用前景。
2、本发明对临床致病性细菌、主要致病真菌和水产致病菌均有良好的抗菌活性，对HaCaT和Raw264.7细胞无细胞毒性。
附图说明
图1为本发明实施例3中拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30对大肠埃希氏菌CGMCC1.2389和金黄色葡萄球菌CGMCC1.2465的杀菌动力学曲线图。
图2为本发明实施例4中拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30处理对金黄色葡萄球菌CGMCC1.2465、铜绿假单胞菌QZ19122和新型隐球菌CGMCC 2.1563引起的形态结构变化图。其中，A为金黄色葡萄球菌，B为金黄色葡萄球菌+12μM Scyovacin19-30，C为铜绿假单胞菌，D为铜绿假单胞菌+6μM Scyovacin19-30，E为新型隐球菌，F为新型隐球菌+12μMScyovacin19-30。A至D图中标尺为1μm，E和F图中标尺为3μm。
图3为本发明实施例5中MTS法检测拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30对HaCaT细胞和Raw264.7细胞细胞毒性实验结果图.其中，横坐标为Scyovacin19-30蛋白浓度(μM)，纵坐标为细胞存活率(％)。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
本实施例中的拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30的氨基酸序列为SEQ ID NO.01：RRHGHVRCSVVV-NH2，C端进行酰胺化修饰(-NH2)，即第12位的缬氨酸经-NH2修饰。
本实施例委托南京金斯瑞有限公司以固相合成方法合成获得纯度达95％以上的拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30，并提供多肽分子量、HPLC等检测信息，用HeliQuest预测其电荷和疏水性，其他理化参数均用ProtParam预测，拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30理化参数如表1所示。
表1拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30理化参数
实施例2拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30最小杀菌浓度的测定
1.涉及到的菌株有：金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、哈氏弧菌、新型隐球菌和白假丝酵母购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心；迟缓爱德华氏菌购自自然资源部第三海洋研究所海洋微生物菌种保藏管理中心；临床耐药菌QZ18080、QZ19138、QZ20145、QZ19122、QZ18106、QZ18103来源于福建医科大学附属第二医院检验科。
2.具体方法如下：
(1)活化菌种，将保种的细菌划线于营养肉汤平板，37℃培养箱中静置培养；酵母真菌划线于YPD平板，28℃培养箱中静置培养。
(2)待菌落生长至合适大小，细菌挑克隆至营养肉汤中，37℃摇床，180rpm培养至对数期；酵母真菌挑克隆至YPD液体培养基，28℃摇床，230rpm培养至对数期。
(3)离心收集细菌或真菌，细菌用MH液体稀释，使得细菌终浓度约为5×105cfu/mL；酵母真菌用RPMI1640+0.165M MOPS，真菌终浓度约为5×104cfu/mL。
(4)将已合成的Scyovacin19-30粉末溶于无菌Milli-Q水，用0.22μm滤膜过滤后，进行梯度稀释。
(5)在96孔细胞培养板上，每种待测菌设置空白对照组、阴性对照组和待测实验组，每组设置三个平行：
a空白对照组：50μL待测蛋白样品和50μL稀释菌的培养基。
b阴性对照组：50μL无菌Milli-Q水和50μL菌悬液。
c待测实验组：50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液。
将96孔细胞培养板置于培养箱中培养24h后，取共孵的混合液滴至固体培养基，观察并记录对细菌的最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)及对真菌的最小杀菌浓度(minimum fungicidal concentration,MFC)。
3.Scyovacin19-30最小杀菌浓度观察结果如表2所示，Scyovacin19-30兼具有抗细菌和抗真菌活性，对临床致病性细菌、主要致病真菌和水产致病菌均有较好的抗菌活性。
表2抗菌肽Scyovacin19-30的抗菌活性
实施例3拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30杀菌动力学曲线
1.涉及到的菌株有：大肠埃希氏菌CGMCC 1.2389、金黄色葡萄球菌CGMCC1.2465。
2.具体方法如下：
抗菌实验方法同最小杀菌浓度的测定方法一致，抗菌肽和细菌或真菌共孵一定时间后，不同时间点取共孵的混合液梯度稀释后涂布平板，静置培养后，进行菌落计数。
3.Scyovacin19-30对大肠埃希氏菌CGMCC 1.2389、金黄色葡萄球菌CGMCC1.2465杀菌动力学曲线如图1所示，Scyovacin19-30在12μM终浓度下60min内即可将大肠埃希氏菌全部杀灭；Scyovacin19-30在12μM终浓度下120min内即可将金黄色葡萄球菌全部杀灭。
实施例4扫描电镜观察拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30处理后细菌或真菌的形态结构变化
1.涉及到的菌株有：金黄色葡萄球菌CGMCC1.2465、铜绿假单胞菌QZ19122和新型隐球菌CGMCC 2.1563。
2.具体实验方法如下：
(1)扫描电镜样品制备
活化菌种，待克隆长至合适大小，随机挑取3－5个克隆至对应的培养基，摇至对数生长期，离心去上清，细菌用MH培养基调至5×107cfu/mL，酵母真菌则用RPMI1640+0.165MMOPS重悬菌体调至1.25×107cfu/mL，加入等体积抗菌肽，铜绿假单胞菌37℃共孵30min，金黄色葡萄球菌共孵1h后，新型隐球菌28℃共孵2h，离心去上清，用PBS洗一次后收集菌体。
(2)固定、清洗、滴片：
2.5％戊二醛4℃固定步骤(1)的菌体2h以上，用PBS洗涤菌体三次后，制成高浓度悬液，滴至玻片上，待菌体黏附后进行乙醇梯度脱水。
(3)临界点干燥后进行喷金，用扫描电镜观察并拍片记录。
3.拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30对金黄色葡萄球菌CGMCC1.2465、铜绿假单胞菌QZ19122和新型隐球菌CGMCC 2.1563的形态结构变化如图2所示，Scyovacin19-30可导致金黄色葡萄球菌菌体破裂，细胞内容物外流；Scyovacin19-30可改变铜绿假单胞菌细胞壁结构组分，导致菌体皱缩，胞内物质外泄；Scyovacin19-30处理后新型隐球菌凹陷，菌体破裂。
实施例5 MTS法检测和评价拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30的细胞毒性
1.选取人永生化表皮细胞(HaCaT)和小鼠巨噬细胞(Raw264.7)细胞，对拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30细胞毒性进行测定，如图3所示，横坐标为Scyovacin19-30蛋白浓度(μM)，纵坐标为细胞存活率(％)，
2.具体方法如下：
(1)收集生长状态良好的细胞，将HaCaT和Raw264.7细胞浓度分别调至105个/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入上述细胞悬液100μL，细胞置于37℃细胞培养箱，5％CO2。
(2)吸出培养基，加入含有不同浓度Scyovacin19-30的培养基，静置培养24h。
(3)加入20μL MTS-PMS混合溶液，孵育4h后，酶标仪OD492nm读板，计算存活率。
3.结果如图3，Scyovacin19-30对HaCaT和Raw264.7细胞无细胞毒性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (9)
1.一种拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30，其特征在于：其分子式为C58H102N26O13S1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示，其C端进行酰胺化修饰。
2.权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30在制备抗细菌组合物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗细菌组合物对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、屎肠球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌具有抑制和杀灭作用。
4.一种抗细菌组合物，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30。
5.权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30在制备抗酵母真菌组合物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抗酵母真菌组合物对新型隐球菌和白假丝酵母具有抑制和杀灭作用。
7.一种抗酵母真菌组合物，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30。
8.权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30在制备水产饲料添加剂中的应用。
9.一种水产饲料添加剂，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌肽Scyovacin19-30。
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