CN117089532A - 一种漆酶基因的异源表达及其表达产物 - Google Patents

一种漆酶基因的异源表达及其表达产物 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种漆酶基因的异源表达及其表达产物。本发明将编码漆酶的基因与载体质粒连接，形成重组载体质粒，将重组载体质粒转染至宿主菌进行异源表达，获得漆酶。编码所述漆酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明所述漆酶的最适反应pH值为1.0，最适反应温度为50℃；对底物2，2‑联氮‑二（3‑乙基‑苯并噻唑‑6‑磺酸）二铵盐的最大反应速率为0.05mM min‑1；Km值为0.36mM。

Description

一种漆酶基因的异源表达及其表达产物
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及微生物基因的异源表达，具体涉及一种漆酶基因的异源表达及其表达产物。
背景技术
木质素主要存在于植物当中，与纤维素、半纤维素等共同组成植物细胞壁。作为广泛的生物质来源，纤维素和半纤维素结构简单，便于降解利用。而木质素含有自然界中含量最丰富的可再生芳香基，有望作为石油的替代品。但由于木质素结构复杂，难以解聚，增加了其转化和降解的难度，这也成为阻碍木质素可持续利用的主要问题。
目前木质素的降解方法主要有物理、化学、生物处理。物理方法主要是通过粉碎、高温高压等方法处理秸秆，但成本较高。化学方法主要有酸处理、碱处理等方法，但存在较为严重的污染。生物方法主要通过多种微生物或酶的作用，降解秸秆中的木质素、纤维素等成分，生物降解具有无污染、可持续的优点，具有良好的应用前景。
自然界中存在大量对木质素有降解能力的真菌、细菌。真菌中的白腐菌分泌的过氧化物酶、漆酶、锰过氧化物酶已经有较多的研究。但真菌在培养过程中面临许多问题，如胞外酶产量低，环境适应性差，因此商业化应用也受到了一些限制。相对于真菌分泌的漆酶，细菌型漆酶往往在底物类型、反应温度、pH范围等方面更有优势，这些优势使得细菌型漆酶比真菌型漆酶有着更多的应用前景。但是相比于真菌，细菌木质素降解的研究较晚，许多降解机制研究不够透彻。因此，为促进对漆酶的了解和应用，从分子或基因维度研究细菌中的漆酶的性质是十分有必要的。
发明内容
木质素结构的复杂性决定了其降解的难度，基于上述技术问题，本发明提以下技术方案，以实现木质素的有效降解和利用。
本发明首先提供一种漆酶基因的异源表达方法，将编码漆酶的基因与载体质粒连接，形成重组载体质粒，将重组载体质粒转染至宿主菌进行异源表达，获得漆酶；编码所述漆酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述基因源自菌株Erwiniasp.QL-Z3；所述漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，在上述方法中，所述漆酶对于底物2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）的最适反应pH为1.0，最适反应温度为50℃。
进一步地，在上述方法中，所述漆酶对于底物ABTS的最大反应速率为0.05mM min-1；Km值为0.36mmol/L；Kcat值为36.09min-1。
另外，本发明还提供一种漆酶，所述漆酶由上述的方法获得。
本发明还请求保护上述方法，或上述漆酶在木质素降解中的应用。
与现有技术相比，本发明“一种漆酶基因的异源表达及其表达产物”具有以下有益效果：
本发明建立了一种木质素降解酶的酶学性质研究方法，这种方法为其他微生物酶类的研究提供了可供参照的技术途径。
本发明明确了由Erwiniasp.QL-Z3菌株产生的漆酶的酶学性质：漆酶的最适反应pH为1.0；最适反应温度为50℃。所述漆酶对于底物ABTS的最大反应速率为0.05mM min-1；Km值为0.36mM；Kcat值为36.09min-1。
本发明提供的漆酶相较于真菌产生的漆酶，具有培养简单，生长速度快，环境适应性好等优点。
本发明提供的方法有助于了解漆酶和其他木质素降解酶的酶学性质，进而益于实现木质素高效利用。
附图说明
图1为本发明的技术路线图。
图2为目的基因扩增电泳图。M为Trans 5K DNA marker的电泳；1、2泳道为基因组模板扩增产物的电泳。
图3为目的基因与载体连接后的电泳图。M为Trans 2K DNA marker的电泳；1~5泳道为重组质粒扩增产物的电泳。
图4为不同浓度异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的蛋白表达量的电泳图。M为蛋白marker；1、2、3、4泳道分别为pCold Ⅰ-ELac_205质粒的在BL21（DE3）中使用0、0.25、0.5、0.75mmol/L IPTG诱导的蛋白表达结果；5、6、7、8泳道分别为pCold Ⅰ空白质粒在BL21（DE3）中使用0、0.25、0.5、0.75 mmol/L IPTG诱导蛋白表达结果。
图5分别为带有目的基因的质粒（pCold Ⅰ-ELac_205）和空白质粒（pCold Ⅰ）在BL21（DE3）中诱导表达目的蛋白电泳结果。图5中的（A）为pCold Ⅰ-ELac_205质粒在BL21（DE3）中诱导表达结果，其中，1泳道为菌体沉淀液；2~3泳道为菌体破碎后离心的上清液；4泳道为流出液；5~6泳道为杂蛋白洗脱液；7~9泳道为目的蛋白洗脱液。图5中的（B）为pColdⅠ空白质粒在BL21（DE3）中诱导表达结果，10泳道为菌体沉淀液；11~12泳道为菌体破碎后离心的上清液；13泳道为流出液；14~15泳道为杂蛋白洗脱液；16~18泳道为目的蛋白洗脱液。
图6为目的蛋白的免疫印记实验（Western Blot）检测结果。M为蛋白marker；1~3泳道为空白对照组；4~6泳道为目的蛋白。
图7为ELac_205目的蛋白在不同pH条件下的相对酶活性。
图8为ELac_205目的蛋白在不同温度条件下的相对酶活性。
图9为ELac_205目的蛋白在ABTS作为底物时，不同浓度ABTS对应反应速率的变化曲线。
图10为过表达质粒构建的验证电泳，泳道4为成功扩增的条带，泳道1、2、3、5、6、7质粒转化未成功的条带。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行说明，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
培养基及试剂配方如表1所示，所用培养基均在121℃灭菌30min。
表1，培养基及试剂配方
各实施例中仪器与设备信息如表2。
表2，仪器与设备信息
各实施例中所用菌株及质粒见表3。
表3，试验菌株及质粒
各实施例所用的细菌基因组提取试剂盒来源于TianGen公司；质粒提取试剂盒来源于Omega公司。本发明技术路线如图1所示。
实施例1
本实施例提供了异源表达工程菌的构建。
1.目的基因的体外扩增
将Erwiniasp.QL-Z3菌株接种于LB培养基，于30℃、180rpm转速的摇床中过夜培养，按照TianGen DNA提取试剂盒说明书提取Erwiniasp.QL-Z3菌株的基因组DNA。
设计编码漆酶的基因（即目的基因ELac_205）的上下游引物，并在上游引物5’端添加酶切位点Xho Ⅰ，下游引物5’添加酶切位点Xba Ⅰ，便于与表达载体pCold Ⅰ连接。
以上述基因组DNA为模板，扩增目的基因ELac_205，对扩增产物进行纯化回收（TianGen DNA基因提取试剂盒），方法参照按照试剂盒说明书。目的基因ELac_205和表达载体pCold Ⅰ引物序列分别为：
ELac_205：
F：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGAGCCTGATCACGCCTGAC；
R：AGCAGAGATTACCTATCTAGATTATATCAGCCAGATCAAACTTGCCAG。
pCold Ⅰ：
F：GCTAGCGCATATCCAGTGTAG；
R：GACAAGCTGTGACCGTCTCC。
PCR扩增反应体系以及反应条件见表4、5。
表4，PCR扩增反应体系
表5，PCR扩增反应条件
2.目的基因ELac_205与载体质粒pCold Ⅰ连接
将带有pCold Ⅰ质粒的E.coliDH5α宿主菌在LB培养基中（含50mg/L的氨苄西林），于37℃、180rpm转速的摇床中过夜活化。
提取质粒（Omega质粒提取试剂盒），方法参照按照试剂盒说明书，并进行核酸电泳检测。
将pCold Ⅰ质粒和ELac_205目的基因在42℃条件下酶切12h，酶切体系见表6。酶切完成后，将酶切产物进行核酸电泳检测并进行纯化回收（TianGen DNA纯化回收试剂盒）。
表6，酶切反应体系
按照表7所示的连接体系将回收产物在22℃、条件下连接3h，得到异源表达载体。
表7，连接反应体系
3.重组载体质粒的转化与鉴定
将完成构建的pCold Ⅰ-ELac_205重组载体质粒加入100 µLE.coliDH5α感受态细胞中。冰上静置30min，之后42℃热激45s后冰浴3min，加入0.6mL LB液体培养基复苏1h，再涂布于固体LB平板上（含50mg/L氨苄西林）。37℃培养，直至长出菌落。
挑取单菌落使用pCold Ⅰ载体通用引物进行扩增验证，PCR条件及体系同表4、5。将扩增产物进行核酸电泳，若扩增产物条带大小符合预期则进行DNA测序。测得的序列与目的基因ELac_205序列相同则表明重组载体质粒构建成功。
4.异源表达菌株的构建
将含有重组载体质粒的E.coliDH5α菌株接种于LB培养基，于37℃、180rpm转速的摇床中过夜培养，提取重组质粒，将重组质粒、pCold Ⅰ质粒分别与BL21（DE3）感受态细胞混合，冰上静置30 min，后续操作方法同步骤3。
挑取单菌落使用pCold Ⅰ载体通用引物进行PCR扩增并进行电泳验证，条带大小符合预期则表明异源表达菌株构建成功。
5.试验结果
以Erwiniasp.QL-Z3菌株基因组为模板扩增目的基因ELac_205，目的基因条带大小应为729bp。经电泳观察得到目的基因条带大小符合预期，如图2。
使用pCold Ⅰ载体通用引物进行PCR扩增，验证目的基因是否与载体质粒重组成功。重组成功后条带大小应为1184bp，图3为PCR扩增后进行电泳验证的结果，从图中观察1~5泳道条带大小符合预期。
实施例2
本实施例提供了目的蛋白(漆酶)诱导表达。
1.预试验
pCold Ⅰ载体表达时需要使用IPTG诱导，预试验用以确定合适的IPTG使用浓度。
将异源表达菌株接种于LB培养基（含50 mg/L的氨苄西林），于37℃、180rpm转速的摇床中过夜活化。
按2%接种量将活化完成的菌液接种至液体LB培养基中（含50mg/L的氨苄西林），在37℃、180rpm转速的摇床中培养至菌液OD600值为0.4~0.6。
将菌液置于4℃冰箱预冷30min，预冷完成后，加入IPTG，使IPTG终浓度分别为0mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、0.75mmol/L，并在15℃、180rpm转速的摇床中培养24h，诱导目的蛋白(漆酶)表达。
取出诱导培养24h后的菌液1.5mL，8000rpm/min离心1min，弃上清液，加入75μL无菌水重悬，重悬后加入25μL的6×蛋白loading buffer，煮沸5min再置于冰上急速降温使细胞破碎，在双面板上急速滑动后再重复煮沸5min，冰上降温后8000rpm/min离心1min得到目的蛋白(漆酶)的粗蛋白。
将不同浓度IPTG诱导表达得到的粗蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到适合的IPTG诱导浓度。
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
取20μL粗蛋白样品和5μL的6×蛋白loading buffer混匀，煮沸处理5min作为上样液。
制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶：先加入7mL分离胶，凝固后，再加入3mL浓缩胶，加入梳齿后等待凝固。电泳时首先加入1×Running buffer，取10μL上样液上样，80V电泳30min后升高电压至120V电泳1h。电泳结束后取出凝胶，使用染色液染色4h后脱色，每60min更换一次脱色液，重复3~4次。
3.目的蛋白提取
培养异源表达菌株，方法同步骤1。按照步骤2确定的IPTG诱导浓度，低温诱导目的蛋白表达24h。
将菌液取出，在4℃、8000rpm/min条件下离心5min收集菌体，弃上清液。准备A液（10mM咪唑）、B液（25mM咪唑）、C液（500mM咪唑），并分别过滤除菌，向收集的菌体中加入10mLA液并重悬菌体，再加入100μL 0.1g/L的溶菌酶溶液，室温反应20min除去细胞壁。在超声破碎仪中处理20min后，4℃、11000rpm/min离心1h。取上清液和沉淀留样后，剩余上清液用于下一步试验。
在4℃条件下清洗镍柱，待镍柱中原有的20%乙醇流干后，依次加入10倍柱体积的ddH2O、70%乙醇、ddH2O、A液清洗镍柱。镍柱清洗完成后，加入上一步中所得上清液，于旋转摇床上孵育1h，取上样流出液100μL，留样。
B液洗脱杂蛋白，一共3次，每次10mL，并收集100μL留样。最后使用5mL C液洗脱目的蛋白，收集全部流出液并取100μL留样。洗脱完成后依次加入10mL A液、10mL ddH2O流干，加入10mL 20%乙醇并留存于镍柱中用于防止污染。将C液洗脱得到的目的蛋白于液氮中迅速冷冻后置于-80℃保存，留存的样品加入25μL 6×蛋白loading buffer，煮沸5min用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot检测。
4.目的蛋白验证
将留存的样品按步骤2进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并进行考马斯亮蓝R-250染色。
再次进行相同的SDS-PAGE用于Western Blot检测：将电泳完成的凝胶转膜，水洗2~3次后，使用3×8cm2硝酸纤维素膜，按4层滤纸-凝胶-膜-4层滤纸的顺序装入半干转槽中。添加1×Transfering buffer，60V半干转1h。转膜完成后用1×TBST buffer洗涤硝酸纤维素膜3次，每次洗涤5min。在4℃条件下、使用5%浓度的脱脂奶粉制备的封闭液过夜封闭。倒掉封闭液体，使用1×TBST buffer洗涤硝酸纤维素膜3次。使用His标签小鼠单克隆抗体（Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody）作为一抗，在脱色摇床上孵育lh。倒掉一抗液，使用1×TBST buffer洗膜。使用山羊抗小鼠IgG（H&L）HRP标记抗体（HRP，Goat Anti-Mouse IgG）作为二抗，脱色摇床孵育lh。倒掉二抗液，洗膜，并使用发光液显色观测。
5.试验结果
不同浓度的IPTG诱导表达预试验结果如图4。M为蛋白marker；1、2、3、4泳道分别为pCold Ⅰ-ELac_205质粒在BL21（DE3）中使用0、0.25、0.5、0.75mmol/L IPTG诱导的蛋白表达结果；5、6、7、8泳道分别为pCold Ⅰ空白质粒在BL21（DE3）中使用0、0.25、0.5、0.75 mmol/LIPTG诱导蛋白表达结果。可以看到1、2、3、4泳道在25~33 KDa之间均有大量目的蛋白，且使用0.25、0.5、0.75 mmol/L IPTG诱导的蛋白表达量相差不大，故选用0.25mmol/L浓度的IPTG用于后续试验。
图5为SDS-PAGE染色结果图。图5中的（A）为pCold Ⅰ-ELac_205质粒在BL21（DE3）中诱导表达结果，其中，1泳道为菌体沉淀液；2~3泳道为菌体破碎后离心的上清液；4泳道为流出液；5~6泳道为杂蛋白洗脱液；7~9泳道为目的蛋白洗脱液。
图5中的（B）为pCold Ⅰ空白质粒在BL21（DE3）中诱导表达结果，10泳道为菌体沉淀液；11~12泳道为菌体破碎后离心的上清液；13泳道为流出液；14~15泳道为杂蛋白洗脱液；16~18泳道为目的蛋白洗脱液。目的蛋白大小在22-35KDa之间，符合预期，且经过镍柱纯化后的蛋白纯度较高。
图6为目的蛋白的Western Blot检测结果。M为蛋白marker；1~3泳道为空白对照；4~6泳道为目的蛋白。从中可以观察到在22-35KDa之间只有一条目的条带，说明带有6×His标签的目的蛋白成功表达。
实施例3
本实施例提供了漆酶酶学性质测定。
1.漆酶浓度测定
测定漆酶浓度（Solarbio蛋白浓度测定试剂盒），将聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）试剂与Cu2+试剂按50：1配置成为BCA工作液，将10μL牛血清白蛋白（BSA）标准品使用磷酸盐（PBS）缓冲液稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0、2、4、6、8、12、16、20μL分别加至96孔板中，并使用PBS缓冲液将每孔补足至20μL。将样品作梯度稀释后，各取20μL分别加入96孔板中，向各孔中加入200μL BCA工作液，37℃反应15~30min，使用酶标仪测定562nm下的吸光值，根据BSA标准品测量得到的标准曲线计算出目的蛋白（漆酶）浓度。
2.漆酶酶学性质测定
以ABTS作为底物，配制含有：50mM、pH值为3.0的乙酸-乙酸钠（HAc-NaAc）缓冲液，0.5mM ABTS和0.5μM的漆酶的反应体系，在420nm波长下测定吸光度的变化，并以单位时间内吸光度变化量表征酶活力大小。
最适pH值的测定：将纯化的漆酶在不同pH值（0.5~7.0）条件下的测量反应速率。设定反应速率的最大值为100%，并以此计算各pH下的相对酶活力，确定漆酶的最适反应pH值。
最适温度的测定：将漆酶于不同温度（20~70℃）条件下测量反应速率。设定反应速率最大值为100%，并以此计算各pH下的相对酶活力，确定漆酶的最适反应pH值。
酶动力学参数测定：将纯化的漆酶与ABTS进行酶促反应，并以单位时间内的吸光度变化值定义为U。在最适反应条件下测定酶促反应速率，完成对应酶动力学曲线。计算Km、Kcat及Kcat/Km值，据此分析Erwiniasp.QL-Z3菌株中漆酶的相关特性。
3.试验结果
根据标准曲线计算得到纯化出的漆酶浓度为0.27mg/mL。
在常温条件下以ABTS为底物测定漆酶在不同pH条件下的酶活性，结果见图7。从图7中可以看出，当pH在1.0附近时，相对酶活力最大。
在常温条件下以ABTS为底物测定漆酶在pH=7时，不同温度条件下的酶活性，图8中可以观察到漆酶最适反应温度为50℃左右。
图9是以ABTS为底物的酶动力学曲线；从图9中可以得到漆酶对于底物ABTS的Vmax值（最大酶促反应速率）为0.05mM min-1，Km值（酶促反应的速率为最大反应速率一半时对应的底物浓度）为0.36mmol/L。结合底物的最大反应速率，可以计算得到漆酶对于底物ABTS的Kcat值（酶的转化数）为36.09min-1。基于图9还可以得到Kcat/Km值（催化效率）为100.25min-1·mM-1。漆酶动力学参数见表8。
表8，漆酶的酶动力学参数
以上所述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。在依据本发明构思的条件下本领域普通技术人员进行的相关推演和替换，在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (5)

1.一种漆酶基因的异源表达方法，其特征在于，将编码漆酶的基因与载体质粒连接，形成重组载体质粒，将重组载体质粒转染至宿主菌进行异源表达，获得漆酶；
编码所述漆酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述基因源自菌株Erwiniasp.QL-Z3；
所述漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的漆酶基因的异源表达方法，其特征在于，所述漆酶对于底物2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐的最适反应pH值为1.0，最适反应温度为50℃。
3.根据权利要求1所述的漆酶基因的异源表达方法，其特征在于，所述漆酶对于底物2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐的最大反应速率为0.05mM min-1；Km值为0.36mmol/L；Kcat值为36.09min-1。
4.一种漆酶，其特征在于，采用权利要求1所述的方法获得。
5.权利要求1所述的漆酶基因的异源表达方法，或权利要求4所述的漆酶在木质素降解中的应用。
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