CN117083070A - 用于基因疗法的原细小病毒和四细小病毒组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了重组病毒体，其具有原细小病毒或四细小病毒的衣壳蛋白或其变体以及包含异源核酸的核酸。

Description

用于基因疗法的原细小病毒和四细小病毒组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月23日提交的美国临时申请号63/129,848的优先权的权益，所述申请的整个内容以引用的方式并入本文。
背景技术
治疗性转基因的有效递送是成功的基因疗法的先决条件。当基因疗法在20世纪70年代初被概念化时，哺乳动物病毒被认为是递送基因“药物”的有效媒介物。从那时起，病毒载体已被深入研究并广泛用于基因转移应用。近年来，腺相关病毒(AAV)已成为基因疗法的优选病毒载体，这是因为它能够转导多种细胞类型，穿过血脑屏障，并主要作为附加型元件保持长期稳定表达。来源于细小病毒科的非致病性依赖性细小病毒属的AAV载体不保留病毒基因，并且已被开发用于人应用，其中与载体相关的严重不良事件的报告相对较少。
然而，AAV的某些特性限制了其在基因疗法中的应用。特别是，AAV仅能够包装少于5kb的治疗性DNA，这将许多治疗性基因和方法排除在开发之外。例如，用于治疗发病率最高的严重遗传性疾病(即杜氏肌营养不良、血友病A和囊性纤维化)的治疗性基因超过了AAV的大小限制，因此排除了AAV介导的基因疗法作为这些疾病的治疗选项。此外，许多AAV血清型似乎是地方性的，这导致人群体中广泛的抗病毒免疫，使许多受试者中的AAV基因转移复杂化。据估计成人中针对AAV的血清转化的发生率≥70％。由于野生型AAV和辅助病毒(通常为腺病毒)的生产性(共)感染，血清转化通常发生在儿童期，从而产生与大多数灵长类动物AAV衣壳所共有的表位交叉反应的抗体。目前，对预期的基因疗法患者进行中和抗体(nAb)筛查，并且如果nAb超过任意选择的阈值滴度，则可能没有资格进行AAV基因疗法。因此，很大一部分患者群被AAV排除在基因疗法之外。此外，尽管AAV的天然多样性是巨大的，并且AAV物种之间的宿主嗜性不同，但用于基因疗法的几种重要的细胞类型和组织仍有待于被开发来进行靶向。
因此，非常需要用于基因疗法的整合AAV载体的效用，同时克服其局限性的病毒组合物和方法。
发明内容
本发明至少部分基于以下发现，即包含原细小病毒或四细小病毒的至少一种衣壳蛋白或其变体的重组病毒体作为用于基因疗法的媒介物是特别有利的。
首先，由于更大的病毒体基因组大小，原细小病毒(约5.3kb(例如，犬细小病毒)与约4.7kb的AAV相比)或四细小病毒(约5.3kb)可以包装比AAV大至少0.6kb的核酸，从而允许递送大小超过AAV容量的治疗性基因。较大的病毒体基因组大小还允许将治疗性转基因与基因组安全港(GSH)序列一起递送，所述基因组安全港(GSH)序列适应转基因在所需基因组位置处的位点特异性重组。这种位点特异性重组允许转基因整合在基因组中的惰性位置处，而不是可能破坏必需基因的随机整合及其表达。第二，与AAV不同，原细小病毒或四细小病毒不如AAV流行。因此，施用包含原细小病毒或四细小病毒的衣壳蛋白的重组病毒体，例如包含治疗性基因的重组病毒体不会引发阻碍有效的基因递送的广泛的抗病毒免疫反应。因此，包含原细小病毒或四细小病毒的衣壳蛋白的重组病毒体可以以AAV不能匹敌的效率实现基因递送。第三，原细小病毒和四细小病毒对特定组织具有异乎寻常的嗜性。例如，原细小病毒对造血干细胞具有嗜性，特别可用于治疗或预防血液疾病，诸如血红蛋白病、贫血、骨髓增生性病症、凝血病和癌症。此外，原细小病毒可以通过其与转铁蛋白受体的相互作用而有效地跨细胞进行转胞吞。因此，原细小病毒可以穿过血脑屏障(BBB)，将治疗基因递送至隐藏在内皮屏障后面的神经细胞。因此，包含原细小病毒的衣壳蛋白的重组病毒体为患有例如神经退行性疾病或神经肌肉疾病的患者提供了新型的基因疗法手段。类似地，四细小病毒对包括干细胞(CD34+干细胞；间充质干细胞)、骨髓、肺、小肠和肝脏的细胞/器官具有嗜性。因此，包含原细小病毒或四细小病毒的衣壳蛋白的重组病毒体为基因治疗提供了新的模式，所述基因疗法可以靶向特定的细胞/组织/器官，以用于治疗或预防多种人疾病。
在某些方面，本文提供了包含原细小病毒或四细小病毒的至少一种衣壳蛋白(或其变体)的重组病毒体或包含所述重组病毒体的药物组合物。本文还提供了具有同源臂(例如，与靶细胞的基因组DNA具有同源性的序列)的重组病毒体以及将异源核酸整合到靶基因组内的方法，所述同源臂可以促进所述核酸整合到靶基因组内的特定位点中。在一些实施方案中，整合由细胞过程介导，所述细胞过程例如同源重组或非同源末端连接。在一些实施方案中，整合由外源引入的核酸酶(例如ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9-gRNA)启动和促进。在一些实施方案中，至少一种衣壳蛋白的变体改变了重组病毒体对参与重组病毒体内化的至少一种细胞受体的亲和力和/或特异性，和/或允许亲和纯化。
在某些方面，本文还提供了使用本文所述的重组病毒体预防或治疗受试者的疾病的方法。在一些实施方案中，向受试者施用重组病毒体，从而在体内预防或治疗疾病。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者获得多个细胞、转导本文所述的重组病毒体以及向受试者施用有效量的转导细胞。原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白对不同细胞类型的高亲和力和特异性使得这些重组病毒体特别可用于多种人疾病的基因疗法中。在一些实施方案中，所述方法还包括再施用额外量的病毒体、药物组合物或转导细胞(例如，用于减毒后的重复给药或用于校准)。
在一些实施方案中，重组病毒体和/或药物组合物的核酸编码蛋白质，例如治疗性蛋白质。在一些实施方案中，核酸降低或消除内源基因的表达(例如，通过RNAi、CRISPR)。
在某些方面，本文提供了治疗疾病的方法，其还包括向受试者施用调节核酸表达的剂或使细胞接触所述剂。在一些实施方案中，剂选自小分子、代谢物、寡核苷酸、核糖开关、肽、肽模拟物、激素、激素类似物和光。在一些实施方案中，剂选自四环素、cumate、他莫昔芬(tamoxifen)、雌激素和反义寡核苷酸(ASO)。在一些实施方案中，所述方法还包括以一定间隔再施用剂一次或多次。在一些实施方案中，剂的再施用导致核酸的脉冲式表达。在一些实施方案中，基于从核酸表达的蛋白质的血清浓度和/或半衰期，增加或减少间隔时间和/或剂的量。
在某些方面，本公开提供了重组病毒体和/或药物组合物用于治疗或预防受试者的疾病的用途。在某些方面，本公开提供了本文所述的重组病毒体和/或药物组合物用于制备用于治疗有需要的受试者(例如人)的药物中的用途。
在某些方面，本文提供了调节细胞或受试者中的基因表达的方法，其包括转导本文所述的重组病毒体和/或药物组合物。这种调节可涉及增加或恢复内源性基因的表达，所述内源性基因的表达异常低于健康受试者的表达。或者，所述调节可涉及降低或消除内源基因的表达，所述内源基因的表达异常高于健康受试者的表达。
在某些方面，本文提供了调节靶细胞中的蛋白质的功能和/或结构的方法，所述蛋白质的功能和/或结构不同于野生型蛋白质(例如，由于突变或异常基因表达)。在某些实施方案中，所述调节可以改善和/或恢复患有疾病的受试者的细胞中缺陷蛋白的功能和/或结构。
在某些方面，本文还提供了用于产生本文所述的重组病毒体的方法和组合物。在一些实施方案中，通过引入一组表达病毒结构和非结构蛋白的基因以及病毒体基因组来在哺乳动物细胞中产生重组病毒体。在优选的实施方案中，重组病毒体通过感染昆虫细胞产生。在某些实施方案中，将包含产生病毒体所需的序列的核酸(例如，包含至少一个ITR序列或病毒体DNA复制起点的核酸、编码至少一种病毒复制蛋白的核酸、编码至少一种衣壳蛋白的核酸)瞬时引入到哺乳动物细胞或昆虫细胞中。在一些实施方案中，所述核酸被整合在哺乳动物或昆虫细胞基因组中。
附图说明
图1A-图1C示出AAV ITR的二级结构和滚动发夹复制模型的示意图。图1A示出AAVITR的结构，其形成了巨大的二级结构。ITR可以获得两种构型(外翻(flip)和内翻(flop))。图1B示出示出病毒核酸复制的滚动发夹复制模型的示意图。图1C示出属于不同AAV血清型的ITR的示例性序列的比对。
图2示出表示异源核酸/转基因构建体的示意图，所述构建体含有与在5’末端侧接一个或多个HS序列的β-珠蛋白启动子可操作地连接的β-珠蛋白基因。哺乳动物β-珠蛋白基因由称为基因座控制区(LCR)的调控区调控，所述调控区含有一系列5个DNA酶I超敏感位点(HS1-HS5)。HS是β-珠蛋白基因的有效表达所需要的。每个转基因构建体置于两条同源臂(5’同源臂和3’同源臂)之间，这有利于通过同源重组在靶细胞基因组上进行位点特异性整合。
图3示出代表含有各种启动子的异源核酸/转基因构建体的示意图。每个启动子(例如，CAG启动子、AHSP启动子、MND启动子、W-A启动子、PKLR启动子)与所关注的转基因可操作地连接，并且整个构建体置于两个同源臂(5’同源臂和3’同源臂)之间，这有利于通过同源重组在靶细胞基因组上进行位点特异性整合。
图4示出PKLR红细胞系特异性启动子的部分DNA序列。469-bp区包含上游调控结构域。人和大鼠PK-R启动子之间的保守性元件由虚线描绘。PK-R转录起始位点的胞嘧啶加下划线。GATA-1、CAC/Sp1基序和上游270-bp区域中的调控元件PKR-RE1由方框示出(由箭头指示的方向)。
图5A和图5B示出可被本文所述的重组病毒体靶向的示例性miRNA。红细胞细小病毒重组病毒体可以包含miRNA序列。或者，重组病毒体可包含使miRNA失活的核酸序列。
图6示出脉冲式转基因表达系统。示意图示出表达的负调控和正调控。实例I(上图)显示ASO(反义寡核苷酸ASO或AON)可以负调控转录后的基因表达。在没有ASO的情况下，初级转录物(左)被剪接成可翻译的mRNA(顶线)。在内含子的3’末端/外显子2的5’末端添加与剪接受体互补的ASO(红线)会干扰剪接。因此，在ASO存在下，内含子保留在转录物中。未加工的RNA是不可翻译的，或者在翻译后产生无功能的蛋白质。实例II(下图)说明ASO可以正面影响转录后的基因表达。初级转录物(左)含有4个外显子：外显子1、外显子3和外显子4编码治疗性蛋白质，并且外显子2含有无义突变或框外突变(OOF)。这种外显子2可以被工程化成任何转基因。在没有ASO的情况下，转录物被加工成包含4个外显子(底线)的成熟mRNA，即保留具有无义突变或OOF突变的外显子2。因此，所得mRNA翻译成截短的或无功能的蛋白质。相比之下，ASO的添加干扰剪接，并且成熟mRNA由外显子1、外显子3和外显子4组成，即具有无义突变或OOF突变的外显子2被剪接掉。因此，在默认状态(无ASO)，不产生治疗性蛋白质。仅在添加ASO后，才产生治疗性蛋白质，从而产生正调控。
图7示出杆状病毒表达载体(BEV)系统的示意图，所述系统用于产生并表征制造本公开的重组病毒体所必需的组分。
图8A和图8B示出犬细小病毒(CPV)衣壳蛋白的成功过表达。图8A示出在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离的过表达的CPV衣壳蛋白(VP1和VP2)。凝胶用考马斯蓝染色。泳道1：分子量标记。泳道2：过表达的CPV衣壳(细胞组分)。泳道3：过表达的CPV衣壳(上清液)。图8B示出蛋白质印迹分析。使用抗CPV VP2抗体检测过表达的CPV VP2。利用计算机设计来鉴定VP蛋白起始密码子。CPV衣壳蛋白的表达成功地适应了BEV表达系统。过表达实现的所需CPV VP1/VP2化学计量比为1:25。
图9A-图9C示出产生本公开的重组病毒体所需的额外试剂的开发和表征。图9A示出蛋白质印迹分析。使用抗AAV Rep抗体检测过表达的AAV2 Rep蛋白(p5(Rep78和Rep68)和p19(Rep 52和Rep 40)蛋白)。Rep a、Rep b和Rep c是指表达Rep蛋白的独立细胞克隆。图9B示出侧接AAV2 ITR(AAV2 ITR-GFP转基因)的报告GFP基因构建体的示意图。功能性重组病毒体需要有效扩增被病毒ITR，例如AAV2 ITR包围的转基因。图9C示出AAV2 ITR-GFP转基因的成功扩增，并证明AAV2 ITR和Rep系统组分的功能性。
具体实施方式
在某些方面，本文提供了允许有效基因疗法的重组病毒体、药物组合物和方法。
定义
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指该冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。例如，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。
术语“施用”旨在包括允许疗法实现其预期功能的施用途径。施用途径的实例包括注射(肌内、皮下、静脉内、胃肠外、腹膜内、鞘内、鼻内、颅内、玻璃体内、视网膜下等)途径。施用途径还包括直接注射到骨髓。注射可以是弹丸注射或者可以是连续输注。根据施用途径，剂可以用所选材料包衣或置于其中，以保护其免于可能对其发挥预期功能的能力产生不利影响的自然条件。
术语“基因”被广泛用于指与生物功能相关的任何核酸。术语“基因”适用于特定的基因组序列，以及由该基因组序列编码的cDNA或mRNA。基因可以与调控元件缔合，所述调控元件例如增强子、启动子和基因座控制区、非翻译区(UTR)、内含子、聚腺苷酸化信号、Kozak基序、TATA盒或无TATA启动子以及转录后元件(例如WPRE)。
术语“异源的”是本领域公认的，并且当关于重组病毒体中的核酸使用时，异源核酸对于至少一种衣壳蛋白所来源的病毒是异源的。
术语“同源重组”是本领域公认的，并且当关于靶基因组中的核酸插入使用时，它旨在包括同源性依赖性修复。
两个核酸分子的核酸序列之间的“同一性”可以使用已知的计算机算法诸如“FASTA”程序，使用例如Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444中的默认参数来确定为同一性百分比(其他程序包括GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic AcidsResearch 12(I):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA Atschul，S.F.等人,J Molec Biol215:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop编,Academic Press,SanDiego,1994以及Carillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，可以使用国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)数据库的BLAST功能来确定身份。其他商业或公共可用的程序包括DNAStar“MegAlign”程序(Madison,Wis.)和威斯康辛大学遗传学计算机组(University of Wisconsin Genetics ComputerGroup，UWG)“Gap”程序(Madison Wis.))。
术语“受试者”或“患者”是指任何健康或患病的动物、哺乳动物或人，或任何动物、哺乳动物或人。在一些实施方案中，受试者患有血液疾病。在本发明的方法的各种实施方案中，受试者没有接受治疗。在其他实施方案中，受试者已经接受治疗。
物质或细胞或病毒体的“治疗有效量”是能够在接受治疗的患者中产生医学上期望的结果(例如，临床改善)的量，优选在人或非人哺乳动物中具有可接受的益处:风险比。
术语“治疗”包括预防性和/或治疗性治疗。术语“预防性或治疗性”治疗是本领域公认的，并且包括向受试者施用一种或多种本文所述的组合物。如果在不希望的状况(例如，受试者的疾病或其他不希望的状态)的临床表现之前施用治疗，则治疗是预防性的(即，其保护受试者免于发展不希望的状况)；然而，如果在不希望的状况表现后施用治疗，则治疗是治疗性的(即，旨在减少、改善或稳定现有的不希望的状况或其副作用)。
重组病毒体
在某些方面，本文提供了一种重组病毒体，其包含(1)原细小病毒或其基因型变体的至少一种衣壳蛋白或其变体；和(2)核酸，其中所述核酸包含异源核酸。
在一些实施方案中，原细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：食肉动物原细小病毒(Carnivore protoparvovirus)、食肉动物原细小病毒1、翼手目原细小病毒(Chiropteran protoparvovirus)1、劳亚食虫目原细小病毒(Eulipotyphlaprotoparvovirus)1、灵长类原细小病毒(Primate protoparvovirus)1、灵长类原细小病毒2、灵长类原细小病毒3、灵长类原细小病毒4、啮齿类原细小病毒(Rodentprotoparvovirus)1、啮齿类原细小病毒2、啮齿类原细小病毒3、有蹄类原细小病毒(Ungulate protoparvovirus)1和有蹄类原细小病毒2。
在一些实施方案中，原细小病毒或其基因型变体选自犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒(feline panelukepenia virus)、人布法病毒(human bufavirus)1、人布法病毒2、人布法病毒3、人图萨病毒(human tusavirus)、人库塔病毒(human cutavirus)、Wuharv细小病毒、猪细小病毒、小鼠微小病毒、果蝠布法病毒(megabat bufavirus)及其基因型变体。
在某些方面，本文提供了一种重组病毒体，其包含(1)四细小病毒或其基因型变体的至少一种衣壳蛋白或其变体；和(2)核酸，其中所述核酸包含异源核酸。
在一些实施方案中，四细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：翼手目四细小病毒1、灵长类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒2、有蹄类四细小病毒3和有蹄类四细小病毒4。
在一些实施方案中，四细小病毒或其基因型变体选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3、黑猩猩细小病毒4、黄毛果蝠(eidolon helvum)细小病毒、牛香港病毒(hokovirus)1、牛香港病毒2、猪香港病毒、猪cn病毒(porcine cnvirus)、牦牛细小病毒、绵羊香港病毒1、负鼠四细小病毒、啮齿类四细小病毒、四细小病毒某个种(tetraparvovirus sp.)及其基因型变体。
在一些实施方案中，四细小病毒是人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3或其基因型变体。
重组病毒体可以是二十面体的。在一些实施方案中，衣壳蛋白或其变体包含结构蛋白VP1和/或VP2。
VP2的存在量可以超过VP1。例如，VP2的存在量可以超过VP1至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％、1500％、2000％、2500％、3000％、3500％、4000％、4500％、5000％、5500％、6000％、6500％、7000％、7500％、8000％、9000％或10000％。
在一些实施方案中，VP1包含与选自SEQ ID NO:4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20和22的序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VP2包含与选自SEQ ID NO:4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21和23的序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的氨基酸序列。
在某些方面，本文提供了包含异源核酸的重组病毒体，其中所述异源核酸包含与靶细胞的核酸序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，异源核酸与哺乳动物的核酸序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的同一性，优选地其中所述哺乳动物是人。
在一些实施方案中，异源核酸不与原细小病毒或四细小病毒启动子可操作地连接。
在一些实施方案中，本公开的重组病毒体包含至少一个反向末端重复(ITR)。在一些实施方案中，至少一个ITR包括：(a)依赖性细小病毒ITR，(b)AAV ITR，任选地AAV2 ITR，(c)原细小病毒ITR，或(d)四细小病毒ITR。
在一些实施方案中，原细小病毒ITR选自犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、人布法病毒1、人布法病毒2、人布法病毒3、人图萨病毒、人库塔病毒、Wuharv细小病毒、猪细小病毒、小鼠微小病毒、果蝠布法病毒及其基因型变体的ITR。
在一些实施方案中，四细小病毒ITR选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3、黑猩猩细小病毒4、黄毛果蝠细小病毒、牛香港病毒1、牛香港病毒2、猪香港病毒、猪cn病毒、牦牛细小病毒、绵羊香港病毒1、负鼠四细小病毒、啮齿类四细小病毒、四细小病毒某个种及其基因型变体的ITR。
在一些实施方案中，四细小病毒ITR选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3及其基因型变体的ITR。
在某些方面，本文提供了包含核酸的重组病毒体，其中所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。在一些实施方案中，DNA是单链或自我互补的双链体。
在一些实施方案中，核酸包含Rep蛋白依赖性复制起点(ori)，从而允许复制所述核酸(例如，用于载体生产)。在一些实施方案中，核酸包含与启动子可操作地连接的核酸，所述启动子任选地位于两个ITR之间。
在一些实施方案中，启动子选自：(a)和与其可操作连接的核酸异源的启动子；(b)促进核酸的组织特异性表达的启动子，优选地其中启动子促进造血细胞特异性表达或红细胞谱系特异性表达；(c)促进核酸的组成型表达的启动子；和(d)可诱导性表达的启动子，任选地响应于代谢物或小分子或化学实体来表达。
在一些实施方案中，启动子选自CMV启动子、β-珠蛋白启动子、CAG启动子、AHSP启动子、MND启动子、Wiskott-Aldrich启动子和PKLR启动子。
在一些实施方案中，核酸不与载体中的启动子可操作地连接，而是依赖于同源依赖修复(HDR)来整合到基因组区域中进行表达，或者整合到异源基因座中(例如，利用HDR整合到白蛋白外显子中以产生融合蛋白)，或者整合到同源基因座中以恢复开放阅读框。在这两种情况中的任一种情况下，载体DNA保持“沉默”，除非整合到细胞基因组中能够实现转录活性的位点。
本公开的重组病毒体可以包含编码编码RNA和/或非编码RNA的异源核酸。
例如，编码RNA可以包含：(a)编码蛋白质或其片段，优选地人蛋白质或其片段的基因；(b)编码核酸酶，任选地编码转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、megaTAL或CRISPR核酸内切酶(例如，Cas9核酸内切酶或其变体)的核酸；(c)编码报告蛋白，例如荧光素酶或GFP的核酸；和/或(d)编码药物抗性蛋白，例如新霉素抗性蛋白的核酸。
在一些实施方案中，编码RNA被密码子优化以在靶细胞中表达。
在一些实施方案中，重组病毒体包含异源核酸，所述异源核酸包含编码选自以下的多肽或其片段的基因：(HBA1、HBA2、HBB、HBG1、HBG2、HBD、HBE1和/或HBZ)、α-血红蛋白稳定蛋白(AHSP)、凝血因子VIII、凝血因子IX、冯·维勒布兰德因子(von Willebrandfactor)、肌营养不良蛋白或截短的肌营养不良蛋白、微肌营养不良蛋白、抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)或截短的抗肌萎缩蛋白相关蛋白、微抗肌萎缩蛋白相关蛋白、usherin(USH2A)、CEP290、INS、F8或其片段(例如编码B结构域缺失多肽(例如VIII SQ、p-VIII)的片段)以及囊性纤维化跨膜转导调控因子(CFTR)。
在一些实施方案中，非编码RNA包括lncRNA、piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA和/或指导RNA。
在一些实施方案中，编码RNA、蛋白质或非编码RNA增加或恢复靶细胞的内源基因的表达。或者，在一些实施方案中，编码RNA、蛋白质或非编码RNA降低或消除靶细胞的内源基因的表达。
在某些方面，本文提供了重组病毒体，其包含编码以下的核酸：(a)铁调素或其片段和/或稳态铁调控因子(HFE)或其片段；(b)至少一种靶向DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)；(c)靶向DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
在一些实施方案中，重组病毒体(a)增加转导细胞中HFE和/或铁调素的表达；和/或(b)降低转导细胞中DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE内源性突变形式的表达。
在一些实施方案中，重组病毒体预防或治疗血色沉着病、遗传性血色沉着病、幼年型血色沉着病和/或威尔逊氏病(Wilson’s disease)。
在某些方面，本文提供了重组病毒体，其包含编码以下的核酸：(a)TNFα受体的可溶形式、IL-6受体的可溶形式、IL-12受体的可溶形式和/或IL-1β受体的可溶形式；(b)至少一种靶向TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体和/或IL-1β受体的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)；(c)靶向TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体和/或IL-1β受体的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
在一些实施方案中，重组病毒体(a)增加转导细胞中TNFα受体的可溶性形式、IL-6受体的可溶形式、IL-12受体的可溶形式或IL-1β受体的可溶形式的表达；和/或(b)降低转导细胞中TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体或IL-1β受体的表达。
在一些实施方案中，重组病毒体预防或治疗类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病关节炎、幼年型慢性关节炎、银屑病和/或强直性脊柱炎。
在某些方面，本文提供了重组病毒体，其包含编码选自以下的蛋白质或其片段的核酸：IRGM、NOD2、ATG2B、ATG9、ATG5、ATG7、ATG16L1、BECN1、EI24/PIG8、TECPR2、WDR45/WIP14、CHMP2B、CHMP4B、Dynein、EPG5、HspB8、LAMP2、LC3b UVRAG、VCP/p97、ZFYVE26、PARK2/Parkin、PARK6/PINK1、SQSTM1/p62、SMURF、AMPK和ULK1。
在一些实施方案中，重组病毒体增加了转导细胞中所述蛋白质或其片段的表达。在一些实施方案中，重组病毒体调节自噬。
在一些实施方案中，重组病毒体预防或治疗自噬相关疾病。在一些实施方案中，自噬相关疾病选自癌症、神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、帕金森病(Parkinson's disease)、亨廷顿病(Huntington's disease)、共济失调)、炎性疾病、炎症性肠病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化、慢性阻塞性肺病/COPD、肺纤维化、囊性纤维化、干燥综合征(Sjogren's disease)、高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、胰岛素抵抗性糖尿病(例如，门登霍尔综合征(Mendenhall's Syndrome)、沃纳综合征(Werner Syndrome)、矮怪病和脂肪缺乏性糖尿病)、血脂异常、高脂血症、低密度脂蛋白(LDL)升高、高密度脂蛋白(HDL)降低、甘油三酯升高、代谢综合征、肝病、肾病、心血管疾病、局部缺血、中风、再灌注期间的并发症、肌肉退化、萎缩、衰老症状(例如，肌肉萎缩、虚弱、代谢障碍、低度炎症、动脉粥样硬化、中风、年龄相关性痴呆和散发形式的阿尔茨海默氏病、癌前状态和包括抑郁症在内的精神疾病)、脊髓损伤、动脉粥样硬化、传染病(例如，细菌、真菌、病毒)、AIDS、结核病、胚胎发育缺陷、不育症、溶酶体贮积病、活化因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷脂贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症(aspartylglucoaminuria)、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸病、达农病(Danon disease)、法布里病(Fabry disease)、法伯病(Farber disease)、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病(Gaucher Disease，I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积症(婴儿型、晚期婴儿型/青少年型和成人型/慢性)、亨特综合征(MPS II)、I-细胞病/粘脂沉积症II、婴儿游离唾液酸贮积症(ISSD)、青少年己糖胺酶A缺乏症、克拉贝病(Krabbe disease)、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、赫勒综合征(Hurlersyndrome)、谢伊综合征(Scheie syndrome)、赫-谢二氏综合征(Hurler-Scheiesyndrome)、桑菲里波综合征(Sanfilippo syndrome)、A型和B型莫尔基奥(Morquio)、马-拉米综合征(Maroteaux-Lamy)、斯莱综合征(Sly syndrome)、粘脂贮积病、多发性硫酸盐缺乏症、尼曼匹克病(Niemann-Pick disease)、神经元蜡样脂褐质沉积症(Neuronal ceroidlipofuscinose)、CLN6病、詹-比二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)、庞贝病(Pompedisease)、致密性成骨不全症、桑霍夫病(Sandhoff disease)、辛德勒病(Schindlerdisease)、泰-萨二氏病(Tay-Sachs)和沃尔曼病(Wolman disease)。
在某些方面，本文提供了重组病毒体，其包含编码以下的核酸：(a)CFTR或其片段，(b)至少一种靶向CFTR的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，(c)靶向CFTR的内源性突变形式的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
在一些实施方案中，重组病毒体(a)增加CFTR或其片段的表达；和/或(b)降低转导细胞中CFTR的内源性突变形式的表达。在一些实施方案中，重组病毒体预防或治疗囊性纤维化。
在某些方面，本文提供了重组病毒体，其包含编码与不同形式的进展性家族性肝内胆汁淤积相关的ATPB1、ATPB11或ABCB4或其片段的核酸。
在某些方面，本文提供了重组病毒体，其包含编码与溶酶体贮积症相关的CPS1或其片段的核酸。
在某些方面，本文提供了重组病毒体，其包含编码ATPB7或其片段的核酸、与威尔逊病(Wilson disease)相关的基因，所述威尔逊病是由肝脏中铜过量积累引起的病理。
在某些方面，本文提供了重组病毒体，其包含编码KRT5、KRT14、PLEC1、Col7A1、ITGB4、ITGA6、LAMA3、LAMB3、LAMC2或KIND1或其片段的核酸，所述核酸是与大疱性表皮松解症(EB)相关的基因。
在某些方面，本文提供了包含非编码DNA的重组病毒体。在一些实施方案中，非编码DNA包含：(a)转录调控元件(例如，增强子、转录终止序列、非翻译区(5’UTR或3’UTR)、近端启动子元件、基因座控制区、聚腺苷酸化信号序列)，和/或(b)翻译调控元件(例如，Kozak序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)。在一些实施方案中，转录调控元件是基因座控制区，任选地是β-珠蛋白LCR或β-珠蛋白LCR的DNA酶超敏感位点(HS)。
在某些方面，本文提供了重组病毒体，其包含与靶细胞的基因组安全港(GSH)的核酸序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，将与GSH具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的核酸序列置于待整合核酸的5’和3’，从而允许通过同源重组整合到靶基因组中的特定基因座。
在某些实施方案中，GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5、NUPL2的基因间区域、胶原、HTRP、HI 1(HI 1基因座处的胸苷激酶编码核酸)、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR、RUNX1、KLHL7、mir684、KCNH2、GPNMB、MIR4540、MIR4475、MIR4476、PRL32P21、LOC105376031、LOC105376032、LOC105376030、MELK、EBLN3P、ZCCHC7或RNF38。在一些实施方案中，GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5或NUPL2的基因间区域。
在一些实施方案中，在转导后，核酸被整合到靶细胞的基因组中。在优选的实施方案中，在转导后，核酸被整合到靶细胞基因组的GSH中。在一些实施方案中，GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5、NUPL2的基因间区域、胶原、HTRP、HI 1(HI 1基因座处的胸苷激酶编码核酸)、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR、RUNX1、KLHL7、mir684、KCNH2、GPNMB、MIR4540、MIR4475、MIR4476、PRL32P21、LOC105376031、LOC105376032、LOC105376030、MELK、EBLN3P、ZCCHC7或RNF38。在一些实施方案中，GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5或NUPL2的基因间区域。
在一些实施方案中，核酸通过同源重组，随后由外源核酸酶诱导形成DNA断裂来整合到靶基因组中。在一些实施方案中，核酸酶是TALEN、ZFN、大范围核酸酶、megaTAL或CRISPR核酸内切酶(例如，Cas9核酸内切酶或其变体)。
本公开的重组病毒体可包含如下核酸，所述核酸包含编码至少一种复制蛋白和衣壳蛋白或其变体的核酸序列。在一些实施方案中，重组病毒体自主复制。
在一些实施方案中，重组病毒体结合和/或转导癌细胞或非癌细胞。在一些实施方案中，重组病毒体结合和/或转导干细胞(例如，造血干细胞、CD34+干细胞、CD36+干细胞、间充质干细胞、癌症干细胞)。在一些实施方案中，重组病毒体结合和/或转导表达转铁蛋白受体(CD71)的细胞。
在一些实施方案中，重组病毒体结合和/或转导造血细胞、造血祖细胞、造血干细胞、红系细胞、巨核细胞、红系祖细胞(EPC)、CD34+细胞、CD36+细胞、间充质干细胞、神经细胞、肠细胞、肠干细胞、肠上皮细胞(gut epithelial cell)、内皮细胞、肺细胞、肠上皮细胞(enterocyte)、肝脏细胞(例如，肝细胞(hepatocyte)、肝星状细胞(HSC)、库弗氏细胞(Kupffer cell，KC)、肝窦内皮细胞(LSEC))、脑微血管内皮细胞(BMVEC)、红系祖细胞、淋巴祖细胞、B淋巴母细胞、B细胞、T细胞、嗜碱性地方性伯基特淋巴瘤(basophilic EndemicBurkitt Lymphoma，EBL)、多染性成红细胞、表皮干细胞、P63阳性角质细胞源性干细胞、角质细胞、胰腺β细胞、K细胞、L细胞和/或正染性成红细胞。
原细小病毒衣壳蛋白的合理修饰
原细小病毒通过其与靶细胞上表达的转铁蛋白受体(TfR)的相互作用转导细胞。原细小病毒(例如，犬细小病毒)与来自各种物种的TfR相互作用的能力依赖于位于VP2蛋白中的特定氨基酸残基。对于犬细小病毒，这些相互作用映射到VP2的氨基酸残基93、300和323(Hueffer,Govindasamy等人2003,Hueffer,Parker等人2003)。此外，VP2位置300是食肉动物细小病毒种基因组中最易变的氨基酸，这表明在确定宿主范围方面具有相关作用(Allison,Organtini等人2016)。转铁蛋白受体经历翻译后修饰，特别是N-连接的糖基化，从而产生具有末端唾液酸部分的触角结构。VP2中的这些残基与转铁蛋白受体中的唾液酸相互作用。与转铁蛋白受体唾液酸的相互作用对于病毒衣壳从细胞顶端到基底外侧的转胞吞作用是至关重要的。因此，本文使用携带VP2的特异性突变(CPV aa 90至95、aa 299至301和/或320至325)的细小病毒衣壳来合理调节宿主范围及其转胞吞能力。
相应地，在某些方面，本文所述的重组病毒体涵盖包含野生型VP2和/或含有一个或多个突变的VP2的重组病毒颗粒。在优选的实施方案中，此重组病毒体显示出改变的嗜性、生物分布、改变的与TfR和/或表达TfR的细胞的相互作用、改变的转导表达TfR的细胞的能力、和/或改变的从细胞顶端向基底外侧转胞吞的能力。
在一些实施方案中，包含一个或多个VP2突变的重组病毒体特异性转导第一靶细胞(例如，肠上皮细胞)，但通过转胞吞作用穿过上皮屏障并到达其他组织的能力降低，从而在第一靶细胞中积累。这增强了第一靶细胞的靶向和基因递送。在一些实施方案中，口服施用的包含一个或多个VP2突变的重组病毒体提供了肠道上皮中表达TfR的细胞(例如，肠上皮细胞)的优先靶向和基因递送，从而使其成为用于疾病诸如血色沉着病(也在下文描述)的理想病毒载体。
在一些实施方案中，包含一个或多个VP2突变的重组病毒体特异性转导第一靶细胞，并且可以通过转胞吞作用穿过上皮屏障并到达其他组织。在优选的实施方案中，包含一个或多个VP2突变的重组病毒体显示出跨上皮屏障的转胞吞作用的效率增强。这通过穿过血脑屏障向神经系统的细胞提供增强的靶向和基因递送。
在一些实施方案中，重组病毒体包含犬细小病毒VP2中的一个或多个突变。
在一些实施方案中，重组病毒体包含变体衣壳蛋白，其中变体衣壳包含相对于犬细小病毒株N(UniProtKB-P12930)或氨基酸序列SEQ ID NO:27具有一个或多个突变的VP2序列。在一些实施方案中，一个或多个突变位于具有SEQ ID NO:27的氨基酸残基(i)91-95、(ii)297-301和/或(iii)320-324或其他原细小病毒的VP2的相应氨基酸残基的VP2区域。在一些实施方案中，一个或多个突变包括取代、缺失和/或插入。
在一些实施方案中，一个或多个突变改变重组病毒体对参与重组病毒体内化的至少一种细胞受体的亲和力和/或特异性，任选地其中至少一种细胞受体是转铁蛋白受体。在一些实施方案中，一个或多个突变改变：a)重组病毒体对细胞的嗜性或亲和力；b)重组病毒体转导细胞的能力；和/或
c)重组病毒体穿过细胞转胞吞的能力。
在某些方面，本文进一步提供了包含至少一种衣壳蛋白或其变体的重组病毒体，所述衣壳蛋白或其变体包含异源肽标签。在一些实施方案中，异源肽标签允许使用抗体、抗体的抗原结合片段或纳米抗体进行亲和纯化。在一些实施方案中，异源肽标签包含选自血凝素、His(例如6X-His)、FLAG、E-标签、TK15、Strep-标签II、AU1、AU5、Myc、Glu-Glu、KT3和IRS的表位/标签。
药物组合物
在某些方面，本文提供了包含本文所述的重组病毒体和载剂和/或稀释剂的药物组合物。如本文所用，药学上可接受的载剂旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药学活性物质的此类介质和剂的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或剂与活性化合物不相容，预期将其用于组合物中。为了确定相容性，可以考虑各种相关因素，例如渗透压、粘度和/或局麻药物比重(baricity)。补充性活性化合物也可并入组合物中。
本发明的药物组合物被配制成与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服、鼻内(例如吸入)、经皮、经粘膜、血管内、脑内、肠胃外、腹膜内、硬膜外、椎管内、胸骨内、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心内、肌内、肺内和直肠施用。在某些实施方案中，考虑直接注射到骨髓中。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的剂，诸如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱，诸如盐酸或氢氧化钠来调节。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。例如，林格氏溶液和乳酸化林格氏溶液被USP批准用于配制IV治疗剂，并且那些溶液用于一些实施方案中。在某些实施方案中，根据合适的方法建立保持生物活性的赋形剂和载体相容性。对于静脉内施用或向骨髓注射，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物应是无菌的，并且应是易于注射的液体。在制备和储存的条件下它必须稳定并且应当针对诸如细菌和真菌的微生物污染作用而防腐。载剂可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的适合的混合物。适当的流动性可例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散剂的情况下保持需要的粒度以及通过使用表面活性剂来保持。对微生物作用的抑制可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，所述抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，只要它们不影响本文所述的病毒组合物的完整性/活性。在许多情况中，优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇诸如甘露醇、山梨醇、氯化钠。
可以通过将所需量的活性化合物与一种上文列举的成分或其组合掺入适当的溶剂中，按照需要，接着进行过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中制备分散体，所述媒介物含有碱性分散介质和上文列举的所需要的其他成分。
对于通过吸入施用，本文所述的病毒颗粒以气溶胶喷雾形式从含有合适推进剂例如气体诸如二氧化碳的加压容器或分配器，或喷雾器中递送。
全身施用也可以通过经粘膜方式进行。对于经粘膜施用，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。
原细小病毒
原细小病毒种包括人布法病毒基因型1、2和3、人图萨病毒、人库塔病毒、犬细小病毒、猪细小病毒、小鼠微小病毒和果蝠布法病毒(关于国际病毒分类学委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)指定的术语，也参见表1；万维网网址为talk.ictvonline.org/taxonomy/)。
鉴于以下固有特征，原细小病毒作为基因疗法载体是特别令人关注的。首先，针对人原细小病毒、布法病毒、图萨病毒和库塔病毒的中和抗体在许多西方国家的流行率较低(Vaisanen,Mohanraj等人2018)。虽然根据病毒特异性抗体的流行率推断，人原细小病毒的传播在中东或非洲已超过50％，但在欧洲国家和美国的传播却非常低，在0％和5％之间变化(Vaisanen,Mohanraj等人2018)。与具有40-70％的人IgG流行率的AAV源性载体相比，这一方面使得原细小病毒对基因疗法特别有吸引力。
第二，原细小病毒具有包封和递送更大核酸分子的能力。布法病毒可以并入约5.1Kb的DNA分子，允许设计并递送编码更大蛋白质或在这些载体中含有顺式作用调控元件的基因组(与AAV相比)，而图萨病毒和库塔病毒可以并入类似于AAV大小的基因组(约4.6Kb)。
第三，原细小病毒可以靶向某些细胞类型/组织/器官。已从人呼吸道和胃肠道(GI)(或粪便)中分离出人布法病毒和图萨病毒，并且在非人灵长类动物中进行的研究表明，布法病毒可引发系统性感染(Vaisanen,Mohanraj等人2018)。因此，布法病毒可用于靶向不同人器官的基因疗法，所述器官包括但不限于小肠、肝脏、心脏、肺、脑和肌肉。此外，细小病毒源性衣壳可以耐受恶劣的环境条件，诸如低pH水平或胃中发现的生理条件。这种耐受性使得包含原细小病毒的衣壳蛋白的重组病毒体适用于转导胃肠道细胞，包括肠干细胞。小肠上皮被组织成两个基本结构：绒毛和隐窝。绒毛形成由多种分化细胞组成的功能性吸收单位，所述分化细胞包括肠上皮细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞、簇状细胞(tuft)和微皱褶细胞。每个绒毛由至少六个内陷或利氏肠隐窝(crypt of Lieberkuhn)支撑(Clevers2013)。隐窝主要由未分化细胞，包括短暂扩增细胞占据；然而，分化的肠内分泌细胞和潘氏细胞(Paneth cell)也存在于隐窝中。在潘氏细胞之间嵌入隐窝基底柱状细胞，其通过自我更新并连续替换不断更新的分化细胞来维持体内平衡。因此，用包含本公开的原细小病毒衣壳的重组病毒体靶向肠干细胞，为预防或治疗包括遗传性血色沉着病或炎症性肠病在内的不同GI相关并发症提供了可能性。使用经验证的基因组安全港来靶向肠干细胞中的转基因对于提供长期表达并避免通常与随机基因组插入相关的任何分化效应是非常有益的。
特征
原细小病毒属的成员是单源的，并且共享标准NS1序列识别标准。该属分为两个分支，一个分支由已被详细研究的该家族的创始成员占据，而第二个分支专门由预测的病毒占据，所述预测的病毒的编码序列最近在野生环境中使用病毒发现方法鉴定，但其生物学的探索仍极少。创始原细小病毒的基因组是独特的，因为它们含有许多重复的四核苷酸序列5′-TGGT-3′(或其互补序列5′-ACCA-3′)，这是NS1双链DNA识别位点的模块结合基序，通常描述为(TGGT)2-3(Cotmore等人,1995)。小鼠微小病毒NS1识别TGGT基序的可变间隔簇、串联簇和反向簇，使其能够结合分布在整个复制型病毒DNA中的多种序列。TGGT/ACCA四核苷酸簇也分散在新病毒的整个基因组中，表明与创始成员有显著的生物学相似性。例如，在布法病毒1a(人)(JX027296)的4822nt序列中有95个ACCA或TGGT拷贝，而在黑色素瘤相关性人库塔病毒(KX685945)的4452nt序列中有105个单独的拷贝。
病毒体
X射线重建表明，原细小病毒衣壳中的第一个有序VP残基位于5重孔底部的颗粒内部，分别留下约180和37个残基的未解析VP1和VP2 N-末端(Halder等人,2013，Agbandje-McKenna等人,1998，Xie和Chapman 1996)。此未解析序列的C-末端区域形成了细长的富含甘氨酸的链，存在于VP1和VP2中，在小鼠微小病毒(MVM)变体VLP中，所述链可以被建模为爪状密度，其位于一些cryoEM重建中5重通道下方的衣壳内(Subramanian等人,2017)。然而，在MVM病毒体而非空颗粒的X射线结构中，来自该序列(VP2 G37–G28)的单个拷贝的前10个氨基酸可以被建模为亚摩尔密度，其占据大多数5重圆柱体的中心孔。尽管所有VP1和VP2N-末端肽都被隔离在空颗粒中，但MVM VP2N-末端的子集在基因组衣壳化期间早期暴露在病毒体表面(Cotmore和Tattersall 2005a)，推测是经由了解不多的涉及5重圆柱体扩展的构象变化来暴露。这些外化的VP2 N-末端含有核输出信号(Maroto等人,2004)，所述信号在一些细胞中有效地将运输中性衣壳转化为核输出活性颗粒。病毒体以这种形式从受感染细胞中释放出来(Cotmore和Tattersall2005a)，但在细胞外环境和细胞进入期间，暴露的N-末端经历蛋白水解切割，从而去除约25个氨基酸并将VP2转化为称为VP3的形式。因为X-射线结构显示出略少于一个聚甘氨酸束穿过每个圆柱体，重要的是约90％的约50MVM VP2末端最终暴露于表面并被切割。切割的病毒体(主要是VP3病毒体)的X射线结构表明，这种蛋白水解使得切割的蛋白质的聚甘氨酸束缩回到衣壳内部，它在衣壳中折叠并呈现延伸至残基G30的额外二十面体排序，同时在圆柱体中被新的VP2 N-末端簇置换(Govindasamy L,Gurda BL,Halder S,Van Vliet K,McKenna R,Cotmore SF,Tattersall P,Agbandje-McKenna M.2010，未发表的观察结果)。外化的VP2 N-末端也起到重要的结构作用，在细胞进入之前稳定圆柱体，并防止VP1 N-末端和最终基因组过早暴露(Cotmore和Tattersall2012)。因此，在原细小病毒属的成员中，5重圆柱体充当三种不同形式货物的入口，介导1)基因组易位进出完整颗粒，2)VP1SR在双层转运前挤出，和3)伴随基因组衣壳化的一些VP2N末端的早期外化。这与仅依赖这些门户功能中的一种或两种的许多其他细小病毒属中的病毒形成鲜明对比。
原细小病毒体的第二个显著特征是，在X射线结构中，不仅衣壳是二十面体有序的，而且约11–34％的单链DNA基因组也是如此，从而在每个不对称单元中形成位于衣壳内表面上的空腔下方的片段。这种有序的DNA包含2-3条短(8–11nt)单链，其采用反向环构型，在内部通过两个Mg++离子螯合磷酸盐，而碱基向外指向衣壳，在衣壳中它们与特定氨基酸侧链建立非共价相互作用(Halder等人,2013，Agbandje-McKenna等人,1998，Chapman和Rossmann 1995)。已经使用原子力显微镜来探测单个MVM颗粒沿其5重、3重和2重对称轴的刚性，这表明在空颗粒中，而不是在含有DNA的病毒体中，二重轴可以容易地被纳米压痕扭曲，这表明基因组对该区域的衣壳刚性具有主要影响(Carrasco等人,2006)。单个丙氨酸突变不损害衣壳内相互作用，但破坏了衣壳与结合的DNA片段之间的主要相互作用，对空颗粒没有影响，但消除了在完整颗粒中看到的基因组增强的2倍刚性，表明它主要来自这些有序的DNA:衣壳相互作用(Carrasco等人,2008)。这可能表明全长5kb基因组在建立野生型衣壳动力学中的重要性，体外脱壳研究也表明了这一点(Cotmore等人,2010)。
基因组组织和复制
原细小病毒具有约5kb的异十聚体基因组，在其左端侧接约120nt的发夹端粒，通常呈单一序列取向，而右端发夹为约250nt并且可以作为两个反向互补序列中的任一个出现，称为“外翻”和“内翻”原细小病毒基因组的右端可以通过发夹转移从发夹构型的复制中间体中切除，在MVM中，发夹转移涉及使NS1复合物与两个独立的(TGGT)2-3结合位点簇的结合，一个簇将NS1定位在切割位点(5′-CTATCA-3′)上并且第二个簇在发夹轴约120bp处。为了发生切割，这两个位点处的NS1复合物必须配合，并且通过从宿主HMGB家族募集DNA弯曲蛋白来重新折叠起点，所述弯曲蛋白结合NS1并在介入的富含G的起点DNA中产生必需的约30bp双螺旋环(Cotmore等人,2000)。相反，从该病毒左端产生的起始序列在发夹构型中不被切割，因为在发夹茎中存在关键的TC/GAA错配。为了创建活性起点，左侧发夹必须被展开并复制以形成碱基配对的连接区，所述连接区跨越二聚体RF中的相邻基因组，其中发夹的两个臂在对称轴的两侧被有效地分开。然而，仅TC臂产生活性起点，因为二核苷酸充当位于NS1结合位点和称为细小病毒起始因子(PIF，也称为糖皮质激素调节元件结合蛋白GMEB)的必需辅因子结合位点之间的间隔元件。PIF是异二聚体宿主复合物，与位于DNA回文轴附近的两个间隔的5′-ACGT-3′半位点结合。在活性起点中，PIF能够与TC二核苷酸中的NS1相互作用，稳定其与相对较弱的NS1结合位点的结合，但它不能稳定NS1与非活性(GAA)臂中GAA三核苷酸上相同结合位点的结合(Christensen等人,2001)。因此，发夹构型的序列或携带GAA序列的完全双链体发夹臂不被切割，使它们潜在地可用于替代性作用，诸如驱动自相邻P4启动子的转录(Gu等人,1995)。由于左端起点和右端起点之间切割效率的主要差异，子代负义单链优先地从基因组的右端置换，结果原细小病毒通常置换并包装主要(约99％)负义子代ssDNA。
此属的病毒利用图距单位(mu)4和38处的两个转录启动子以及对应于mu 95的单个聚腺苷酸化位点，产生3个主要大小类别的mRNA，所有这些mRNA都去除了46-48mu之间的短内含子序列(Pintel等人,1983)。在MVM中，这种剪接具有不同强度的替代性供体(D1和D2)和受体(A1和A2)，它们位于120nt的区域内，使得潜在的D2:A1剪接被最小内含子大小限制消除。因此，剪接产生每种mRNA大小类别的3种形式，以不同的化学计量表示(Haut和Pintel 1999)。由P4产生的转录物仅去除了这个中心内含子，编码单一形式的NS1，其翻译终止于D1的上游。然而，在一些P4转录物中，10–40mu之间的第二个长内含子也被切除，从而产生编码约25kDa NS2蛋白的mRNA。它们与NS1共享N-末端序列的85个氨基酸，但随后被剪接成不同的阅读框，并最终到达中心短内含子，在其中可以添加2个不同的C-末端六肽。这产生了称为NS2P和NS2Y的变体，它们以约5:1比率表达。P38转录被NS1的C-末端结构域强烈反式活化，由NS1与上游5′-TGGT-3′重复序列的结合介导(Christensen等人,1995，Lorson等人,1996)。短内含子处的替代性剪接也导致衣壳蛋白的两种大小变体以约1:5的化学计量比表达，其中VP1(约83kDa)起始于位于两个受体位点之间的ATG密码子，而VP2(约64kDa)起始于剪接的下游。
在感染期间，新合成的衣壳蛋白在细胞质中组装成两种类型的三聚体(仅VP2和1xVP1+2xVP2)，并使用非常规的结构依赖性运输基序运输到核中来进行衣壳组装(Lombardo等人,2000)。然而，这种易位仅限于S期(Gil-Ranedo等人,2015)，并依赖于细胞Raf-1激酶的三聚体磷酸化(Riolobos等人,2010)。
由原细小病毒编码的辅助蛋白包括NS2变体，其似乎具有主要由与宿主蛋白的相互作用介导的多种功能，以及小的替代性翻译(SAT)蛋白(Zádori等人,2005)。MVM NS2在转化的人细胞系中不是必需的，但它在鼠细胞中的缺失导致在感染周期早期双链体DNA扩增通过未知机制快速停止(Naeger等人,1990，Ruiz等人,2006)。这种早期缺陷可以通过相对低水平的NS2表达来消除，但在周期的后期需要高得多的NS2水平来实现有效的衣壳装配(Cotmore等人,1997)，这是子代DNA单链的后续积累和病毒体释放的先决条件。在晚期衣壳缺陷中，VP蛋白被表达，但大多数不能装配到衣壳中并被迅速降解，这可能反映了如下所讨论的与正常核/细胞质蛋白运输中的严重转位相关的前体亚基的核易位不足。在MVM感染期间，NS2与来自细胞14-3-3家族的蛋白质缔合(Brockhaus等人,1996)并与核输出因子CRM1缔合(Bodendorf等人,1999)。值得注意的是，NS2核输出信号(NES)以“超生理”亲和力与CRM1接合，这不依赖于RanGTP的存在，因此可以潜在地抵抗细胞质释放(Engelsma等人,2008)。在野生型MVM感染期间，可在核周细胞质中检测到CRM1，但这种再分布在突变病毒感染中加剧，所述突变病毒携带接近NS2 NES的点突变，导致CRM1以甚至更高的亲和力结合(López-Bueno等人,2004)。这些突变也加速了感染后期步骤的开始，其特征在于大的、典型的核结构(包括NS1和空衣壳)的胞质积累，再次表明正常核/胞质运输途径中的主要破坏。在转染到A9成纤维细胞后，野生型MVMi基因组表达低水平的NS2，但是当这些基因组被工程化以表达NS2-NES突变之一时，所得的低水平突变NS2能够驱动野生型水平的病毒子代积累，证实了在表达不足的NS2的细胞中观察到的累积晚期感染阻断是由NS2:CRM1相互作用的化学计量限制引起的(Choi等人,2005)。对其中NS2:CRM1结合受损而非增强的突变病毒的研究类似地表明，在感染期间，此相互作用对于病毒体的有效释放是必需的(Eichwald等人,2002，Miller和Pintel 2002)。
第二种原细小病毒辅助蛋白SAT在衣壳基因中编码，并从与VP2相同的mRNA晚期表达。SAT在受感染细胞的内质网(ER)中积累(Zádori等人,2005)。像NS2一样，它增强了病毒在培养物中传播的速率，但它通过不同的机制发挥作用，所述机制涉及诱导不可逆的ER应激，并与增强的细胞坏死有关(Mészáros等人,2017b)。尽管SAT和依赖性细小病毒辅助蛋白AAP在衣壳基因中占据相似的位置，并含有必需的N-末端疏水结构域，但未知这些蛋白质表现功能同源性。因此，在原细小病毒中，早期病毒体输出是独特的特征，它可以由多种机制驱动，从而发生在细胞裂解之前并由VP2信号或随细胞类型变化的Crm1相互作用介导，或者与细胞坏死增强有关并由SAT驱动。在输出期间，已知一些病毒体被内化到内质网的COPII囊泡中，并经历向高尔基体的凝溶胶蛋白依赖性运输，在高尔基体中它们经历酪氨酸磷酸化，并可能通过增强其随后的颗粒与传染性比率的其他修饰(等人,2008，/>等人,2013)。在周期的早期释放使感染迅速传播，在中和抗体积累之前，有可能提高受感染组织的总体子代产率。
生物学
Kilham大鼠病毒(KRV)是用于建立细小病毒科的原始病毒之一，于1959年从实验大鼠肿瘤的裂解物中分离(Kilham和Olivier 1959)。在接下来的十年中，在可移植肿瘤、组织培养细胞系或其他病毒的实验室储备中发现了一系列类似的单链DNA病毒。其中一些病毒诸如MVM非常类似于现在已知感染野生啮齿类的病毒，而同一物种的其他成员(啮齿类原细小病毒1)诸如LuIII(M81888)似乎是自然界中发现的病毒的远缘重组体。在中间的几年里，这些病毒被广泛研究，成为定义家族的基本特征和潜在生物学的重要模式系统。在啮齿类动物中，来自啮齿类原细小病毒1种的病毒表现出一系列病理学特征，从无症状病毒血症到致畸和胎儿或新生儿细胞死亡。虽然这些病毒不能感染正常人细胞，但当人细胞经历致癌转化时，宿主限制通常会放松，从而允许病毒优先溶瘤，并表明它们在临床癌症病毒疗法中的潜在用途。为此，最近完成了使用病毒H-1(X01457)靶向晚期胶质母细胞瘤的I/IIa期临床试验，这提供了病毒耐受性良好的证据，并可以部分破坏通常与这种癌症相关的局部免疫抑制(Geletneky等人,2017，Angelova等人,2017)。
在一些细胞中，细小病毒感染导致延迟但显著的1型IFN释放，而用外源性IFN-β预处理强烈抑制病毒生命周期(Grekova等人,2010，Mattei等人,2013)。在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的MVMp感染期间，IFN反应不涉及线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)和RIG-I感应，并且不显著抑制病毒DNA复制(Mattei等人,2013)，尽管在另一项研究中用IFN-β中和抗体预处理细胞确实增强了感染(Grekova等人,2010)。然而，受感染的MEF对Poly(I:C)刺激无反应，这表明该病毒能够使由I型IFN引发的抗病毒免疫机制失活。
此属中的重要病原体包括猫细小病毒(FPV)，也称为猫泛白细胞减少症病毒；以及密切相关的貂和浣熊细小病毒，它们已经存在超过100年；以及犬细小病毒(CPV)，它在20世纪70年代中期作为变体出现，并于1978年在世界范围内传播，在狗、狼和郊狼中引起疫情病。这些变种都属于单一种食肉动物原细小病毒1。在成年动物中，此种的病毒主要感染淋巴组织，导致白细胞减少或淋巴细胞减少，并且感染肠上皮细胞，导致严重腹泻、脱水和发烧。相反，新生儿感染的特征在于小猫或雪貂的小脑病变，潜在地导致共济失调，或特征在于幼犬的心肌炎。通过接种疫苗，疾病得到很好的控制，但受影响的同窝幼仔的死亡率在20％至100％之间变化(综述见(Kailasan等人,2015a))。
猪细小病毒(PPV)是有蹄类原细小病毒1的成员，是世界范围内猪胎儿死亡和不育的主要原因，尽管单独PPV感染很少在未怀孕的猪或小猪中引起疾病。然而，当血清反应阴性的妊娠母猪在妊娠的前70天期间暴露于毒性PPV毒株时，经胎盘感染可导致称为SMEDI(死产、木乃伊化、胚胎死亡和不孕)的综合征(Mészáros等人,2017a)。存在PPV的弱致病性疫苗株(例如，NADL-2)，如果注射到羊水中是致命的，但是它们不像致病性株(例如，Kresse)那样有效地穿过胎盘屏障，因此疾病是罕见的。预防SMEDI的广泛疫苗接种计划已经到位，但一些新出现的强毒PPV变体不能被通过暴露于当前疫苗株所产生的抗体中和(Mészáros等人,2017a)。与PPV的共感染也可加强猪圆环病毒2型(PCV-2，猪圆环病毒2，圆环病毒科)在断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的发展中的作用。
大多数新发现的病毒分离到原细小病毒树的新分支中的种，所述分支是为布法病毒1a(人)建立的。在2012年在对布基纳法索(Burkina Faso)和突尼斯(Tunisia)腹泻儿童粪便样品的病毒宏基因组分析中鉴定了这种病毒的两种基因型，即BuV1和BuV2(因此称为“布法病毒”)(Phan等人,2012)，而第三种基因型即BuV3，后来在不丹(Bhutanese)儿童的腹泻粪便中发现(Yahiro等人,2014)。迄今为止，已在布基纳法索、突尼斯、不丹、泰国、土耳其、中国和芬兰的儿童以及芬兰、荷兰、泰国和中国的成人腹泻粪便中检测到BuV DNA，但未在非腹泻粪便中发现，这表明存在因果关系(等人,2017)。当分析抗BuV1衣壳IgG的存在时，芬兰和美国成人的血清流行率较低(约2–4％)，但在伊拉克(约85％)、伊朗(约56％)和肯尼亚(约72％)的成人中发现更高比率(/>等人,2018)。
在巴西和博茨瓦纳(Botswanan)儿童的少量腹泻样品中，在法国皮肤T细胞淋巴瘤的四次皮肤活检物(所述病毒由此得名，Phan等人,2016)中，以及在丹麦黑色素瘤患者的恶性皮肤病变(Mollerup等人,2017)中，检测到布法病毒分支中的第二种人原细小病毒，其称为库塔病毒(CuV)。CuV在人疾病中的病因学意义尚未确定。
在上文提及的布法病毒的相同样品系列中，针对CuV的IgG的流行率平均地较低(0–约6％)，这证实了CuV在人群中广泛分布(visnen等人,2018)。相比之下，在突尼斯人粪便样品中检测到的针对第三种新的、尚未分类的原细小病毒(因此图萨病毒，TuV)的IgG(Phan等人,2014)没有出现在相同的血清组中，并且其DNA尚未在其他粪便样品中检测到(等人,2017，/>等人,2018)，因此，迄今为止，TuV是人病毒的证据不足。它在系统发育上与占据原细小病毒系统发育树的原始分支的病毒分离，如先前所讨论的。
表1：原细小病毒属的示例性分离株
四细小病毒
四细小病毒属包括人细小病毒4(PARV4)、猪细小病毒2、黄毛果蝠细小病毒、牦牛细小病毒、猪香港病毒和绵羊香港病毒。PARV4最初在通过注射药物使用而具有感染HIV风险的人的血浆中检测到(Jones,Kapoor等人,2005)。它具有约5.3Kb的基因组，比AAV大600nt，并且它的衣壳高度耐热，这使它成为非常通用且稳定的病毒载体。PARV4在某些地理区域流行，但发现在其他地方仅限于某些高危群体，诸如在注射药物的个人情况下患有HIV、HBV或HCV感染的患者以及具有多次输血史的那些患者。目前尚不确定PARV4实际上是导致观察到的疾病，或者是在高度暴露的高危(病毒感染)群体中检测到的非致病性机会性病毒。在世界不同地区，普通群体中PARV4的血清阳性率为0％至25％不等(Sharp,Lail等人2009)。尽管据报告，在世界不同地区，患有慢性病毒感染的患者中的抗PARV4抗体流行率在15-35％之间，但来自其他西方国家的健康个体中的流行率已显示低于1％。对英国献血者进行的PARV4 IgG筛查鉴定血清阳性率为4.8％，显著低于灵长类AAV抗原的所观察到的血清阳性率(Matthews,Sharp等人,2017)。这突出了使用PARV4作为基因疗法载体的主要益处之一。在包括美国在内的几个西方国家群体中，中和抗体血清阳性率降低，以及对特定靶组织的嗜性，使其成为通用的基因疗法载体。PARV4的嗜性和潜伏位置尚未完全了解，但令人信服的数据表明，骨髓、呼吸道、肝脏和肠道代表了病毒复制的潜在位置，并且可能是潜伏或持续感染个体中病毒的储库。因此，PARV4可用于递送所关注基因，以预防或治疗多种人疾病。
基因组组织和复制
PARV4是模式物种的示例性病毒，灵长类四细小病毒1。该种包括氨基酸序列差异小于3％的三种不同的PARV4基因型(G1 AY622943、G2 DQ873390和G3 EU874248)，加上一种感染黑猩猩的病毒(HQ113143)。目前对PARV4的知识已在其他地方详细综述(Qiu等人,2017，Matthews等人,2017)。G1是目前在欧洲和北美传播的主要形式，但G2(有时称为PARV5)也在这些地区传播，并且在20世纪80年代在可能被感染的人中最常见，这表明它可能是当时的主要形式。G2和G2样形式也在亚洲和巴西传播，而G3是在非洲发现的主要毒株。由于没有完整基因组可用，通过将其编码序列转染到组织培养细胞中，暂时研究PARV4基因的表达谱。因为DNA复制通常影响细小病毒的转录模式，所以首先将这些序列插入腺相关病毒5(AAV5)末端发夹之间，并通过用编码AAV5Rep78和腺病毒辅助因子的构建体共转染进293细胞来诱导所得杂交体复制(Lou等人,2012)。鉴定了两个启动子P6和P38，它们分别产生编码NS和VP蛋白的转录物。已预测一些P6转录物在与NS1相同的框中启动，然后被剪接到替代性框中，从而可能产生小的NS2蛋白，尽管这种产物没有被检测到。观察到编码VP2和NS1的信使RNA，产生分子质量分别为约80和约65kDa的蛋白质，但仍不确定如何获得预测的VP1编码序列，所述序列包括含有推定的PLA2结构域的至少261个氨基酸的VP1特异性区域。
生物学
关于该属的任何成员的生物学或临床意义知之甚少。在急性感染期间，在血浆中检测到PARV4基因组，但通常病毒载量低(<3×104个基因组拷贝/毫升)，并且病毒血症似乎持续，通常持续一个月至几个月。在一些肝脏和骨髓样品中也检测到病毒基因组，尽管病毒在哪里复制仍然未知。PARV4 DNA阳性或PARV4 IgG阳性血浆在北美和欧洲的一般群体中很少见，但在携带其他血液传播病毒(最常见的是人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒)的个体中更常见，或在具有肠胃外感染的行为风险因素(诸如静脉内药物使用或依赖混合人血浆的血液衍生物)的个体中更常见(Lahtinen等人,2011，Sharp等人,2009)。然而，在非洲，PARV4是地方性的，并且其流行病学似乎非常不同，在撒哈拉以南和南非，约30-50％的普通群体对PARV4 IgG测试呈血清阳性。病毒血症也经常被检测到，例如在一项研究中，加纳8.6％的无症状儿童DNA呈阳性(Panning等人,2010)，并且在非洲儿童的鼻腔和粪便样品中发现病毒DNA，这表明在该地区传播可能通过食源性、呼吸道或接触介导的途径进行。
PARV4基因型1和2在欧洲和北非占优势，而G3是非洲的主要形式；因此，影响病毒生物学的基因差异可能导致这些极端的流行病学差异。或者，宿主群体的特征可能是重要的。因此，目前的许多研究旨在阐明病毒易感性和传播途径。例如，最近在巴西进行的一项研究(其中可以预测循环G2病毒遵循胃肠外途径/高风险人群模式)显示，在感染人嗜T细胞淋巴病毒(HTLV)的个体中，约6％也呈PARV4 DNA阳性，但这些共感染个体中大多数人没有表明肠道外传播途径的病史，这表明该地区可能涉及额外因素或途径(Slavov等人,2017)。
感染非人宿主的四细小病毒也似乎是地方性的。例如，在喀麦隆(Cameroon)取样的一组73只野生捕获猿的样品中，63％的黑猩猩和18％的大猩猩测试出针对灵长类动物四细小病毒1种中黑猩猩病毒的抗体呈血清阳性(Beierwaltes 1991)，而4种有蹄类动物的病毒，即有蹄类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒2、有蹄类四细小病毒3和有蹄类四细小病毒4，通常在家畜的血清和组织中检测到(Lau等人,2008，Tse等人,2011)。同样，在加纳的黄毛果蝠血液样品和组织中检测到高浓度的蝙蝠病毒(翼手目四细小病毒1)。该病毒在脾脏和肾脏的样品中特别丰富，表明这些器官可能是病毒复制位点(Canuti等人,2011)。
表2：四细小病毒的示例性分离株
病毒的基因型变体
本领域普通技术人员了解，病毒种包含多组基因变体(Van Regenmortel MHV(2000)Virus Taxonomy-Seventh Report of the International Committee onTaxonomy of Viruses)。基因变体可包含突变(包括不同长度的点突变和插入-缺失)、超突变、几种类型的重组和基因组片段重配。在所有病毒中都观察到突变，没有已知的例外(Domingo(2019)Virus as Populations 2020:35-71)。重组也很普遍，它的出现很快被DNA病毒和RNA病毒所接受。基因组片段重配是在有性生殖中接近染色体交换的变异类型，是片段化病毒基因组的适应性有利条件，正如流感病毒的持续进化所证明的。病毒基因组变异的三种模式是兼容的，并且在当今的病毒中，重配-重组-突变基因组不断出现。
因此，本文所述的病毒的基因变体可包含本文所述的多肽或属于本文所述的病毒的那些多肽(例如，衣壳蛋白(VP1、VP2)、NS蛋白等)，其氨基酸序列与本文给出的示例性序列的氨基酸序列或本文引用的示例性病毒的多肽的氨基酸序列具有至少、约或不超过30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的同一性。
基因组安全港(GSH)
基因组安全港(GSH)是人和模式物种基因组的基因内、基因间或基因外区域，其能够适应新整合的DNA的可预测性表达，而对宿主细胞或生物体没有明显的不利影响。GSH可包含内含子或外显子基因序列以及基因间或基因外序列。不受理论的限制，有用的安全港必须允许足够的转基因表达，以产生期望水平的转基因编码的蛋白质或非编码RNA。GSH也不应使细胞倾向于恶性转化，也不应干扰祖细胞分化，也不应显著改变正常细胞功能。GSH与偶然的良好整合事件的区别在于结果的可预测性，这是基于对GSH的先验知识和验证。
本文所述的重组病毒体的较大基因组大小允许将治疗性转基因与GSH序列一起递送，否则这在使用具有有限基因组大小的病毒体例如AAV的情况下是不可能的。因此，本公开的重组病毒体不仅与例如AAV相比促进更大转基因的递送，而且通过允许GSH序列的共递送而促进转基因的安全递送，这确保转基因的可预测表达而对宿主细胞没有不利影响。已被靶向用于转基因添加的示例性GSH包括(i)腺相关病毒位点1(AAVS1)，其为天然存在的、非种系的AAV病毒DNA在染色体19上的整合位点；(ii)趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因，其为被称为HIV-1辅助受体的趋化因子受体基因；(iii)小鼠Rosa26基因座的人直向同源物，所述基因座在鼠环境中被广泛验证用于插入泛表达的转基因；和(iv)鼠细胞中的白蛋白(参见例如美国专利号7,951,925；8,771,985；8,110,379；和7,951,925；美国专利公布号2010/0218264；2011/0265198；2013/0137104；2013/0122591；2013/0177983；2013/0177960；2015/0056705和2015/0159172；所有所述专利均以引用方式并入)。额外GSH包括Kif6、Pax5、胶原、HTRP、HI 1(HI 1基因座处的胸苷激酶编码核酸)、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR、RUNX1、KLHL7、NUPL2或其基因间区域、mir684、KCNH2、GPNMB、MIR4540、MIR4475、MIR4476、PRL32P21、LOC105376031、LOC105376032、LOC105376030、MELK、EBLN3P、ZCCHC7、RNF38或满足如本文所述的基因组安全港标准的基因座(参见例如WO 2019/169233 A1、WO2017/079673 A1；其以引用方式并入)。这些GSH提供了可用于本文所述的重组病毒体的GSH的非限制性代表。本公开考虑使用本领域已知的任何GSH。
在一些实施方案中，GSH允许安全和靶向的基因递送，其具有有限的脱靶活性和最小的基因毒性风险，或在整合外源DNA时导致插入性肿瘤形成，同时可被具有最小脱靶活性的高度特异性核酸酶接近。
在一些实施方案中，GSH具有以下性质中的任一种或多种：(i)在基因转录单位之外；(ii)位于距任何基因的5’末端5-50千碱基(kb)之间；(iii)位于距癌症相关基因5-300kb之间；(iv)位于距任何已鉴定的微小RNA 5-300kb处；和(v)在超保守区域和长的非编码RNA之外。在一些实施方案中，GSH基因座具有以下性质中的任一种或多种：(i)在基因转录单位之外；(ii)位于距任何基因的5’末端>50千碱基(kb)处；(iii)位于距癌症相关基因>300kb处；(iv)位于距任何已鉴定的微小RNA>300kb处；和(v)在超保守区域和长的非编码RNA之外。在转导的诱导多能干细胞中的慢病毒载体整合的研究中，对超过5,000个整合位点的分析显示-17％的整合发生在安全港中。整合到这些安全港中的载体能够从其转基因表达治疗水平的β-珠蛋白，而不干扰内源基因表达。
在一些实施方案中，GSH是AAVS1。AAVS1被鉴定为19号染色体上的腺相关病毒共同整合位点，并位于19号染色体上(位置l9ql3.42)，并且最初被鉴定为在体外已被AAV感染的培养的人细胞系的基因组中野生型AAV的重复恢复的整合位点。AAVS1基因座中的整合中断了基因磷酸酶1调控亚基12C(PPP1R12C；也称为MBS85)，它编码功能尚不清楚的蛋白质。破坏PPP1R12C的一个或两个等位基因的生物后果目前尚不清楚。在携带AAVS1靶向转基因的人和小鼠多能干细胞中没有观察到明显的异常或分化缺陷。最初，将AAV DNA整合到AAVS1位点中是Rep依赖性的，然而，存在可商购获得的CRISPR/Cas9试剂可用于靶向，所述试剂保留了靶向的等位基因的功能，并将PPP1R12C的表达维持在与非靶向细胞相当的水平。还使用ZFN介导的到iPSC或CD34+细胞的重组来评估AAVS1。
如最初表征的，AAVS1基因座>4kb，并被鉴定为19号染色体核苷酸55,1 13,873-55,1 17,983(人基因组装配GRCh38/hg38)，并与编码蛋白磷酸酶1调控亚基12C的PPP1R12C基因的外显子1重叠。此>4kb的区域极其富含G+C核苷酸含量，并且是特别富含基因的19号染色体的基因富含区域(参见Sadelain等人,Nature Revs Cancer,2012；12；51-58的图1A)，并且一些整合的启动子确实可以活化或顺式活化邻近基因，其在不同组织中的结果目前尚不清楚。PPP1R12C外显子1的5’非翻译区包含已知序列内指示的DNA合成的功能性AAV起点(Urcelay等人,1995)。
通过用重组噬菌体基因组文库表征潜在感染的人细胞系中的AAV前病毒结构来鉴定AAVS1 GSH，所述重组噬菌体基因组文库由潜在感染的克隆细胞系(Detroit 6克隆7374IIID5)(Kotin和Berns 1989)产生，Kotin等人分离了侧接前病毒的非病毒细胞DNA，并使用“左”侧翼和“右”侧翼DNA片段的子集作为筛选独立衍生的潜在感染的克隆细胞系组的探针。在大约70％的克隆分离物中，用细胞特异性探针检测到AAV DNA(Kotin等人1991；Kotin等人1990)。对整合前位点的序列分析鉴定出与AAV反向末端重复序列的一部分几乎同源(Kotin,Linden和Beerns 1992)。尽管缺乏特征性间断回文结构，AAVS1基因座保留了与AAV ITR同源的Rep结合元件和末端解析位点(图1A)。
外显子整合位点的选择是不明显的，并且可能是反直觉的，因为外源DNA的插入和表达可能破坏内源基因的表达。显然，将AAV基因组插入该基因座中不会不利地影响细胞活力或iPSC分化(DeKelver等人2010；Wang等人2012；Zou等人2011)。AAVS1基因座位于高度保守的PPP1R12C基因的5’UTR内。依赖于Rep的DNA合成的最小起点在人、黑猩猩和大猩猩PPP1R12C基因的5’UTR中是保守的。然而，用于将DNA整合到AAVS1中的可商购获得的CRISPR/Cas9试剂靶向PPP1R12C内含子1而非外显子。
在一些实施方案中，GSH是Kif6、Pax5、胶原、HTRP、HI 1、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR、RUNX1、KLHL7、NUPL2的基因间区域、mir684、KCNH2、GPNMB、MIR4540、MIR4475、MIR4476、PRL32P21、LOC105376031、LOC105376032、LOC105376030、MELK、EBLN3P、ZCCHC7和RNF38中的任一种。
在一些实施方案中，GSH是Pax 5基因(也称为成对盒5、或“B细胞谱系特异性活化蛋白”、或BSAP)。在人中PAX 5位于9号染色体的9p 13.2处，并在许多脊椎动物物种中具有直系同源物，所述脊椎动物物种包括人、黑猩猩、猕猴、小鼠、大鼠、狗、马、牛、猪、负鼠、鸭嘴兽、鸡、蜥蜴、非洲爪蟾、秀丽隐杆线虫、果蝇和斑马鱼。PAX5基因位于9号染色体：36,833,275-37,034,185反向链(GRCh38:CM00067l.2)或GRCh37坐标中的36,833,272-37,034,182。
额外示例性GSH列出于表3A和表3B中。
表3A：智人中的示例性GSH基因座(参见例如WO 2019/169232；其以引用方式并入)
表3B:示例性GSH基因座(参见例如WO 2019/169232；其以引用方式并入)
整合到靶基因组中
整合到靶基因组可由细胞过程，诸如同源重组或非同源末端连接(NHEJ)驱动。整合也可以由外源引入的核酸酶启动和/或促进。在优选的实施方案中，包装在本文所述的重组病毒体内的核酸被整合到基因组内的特定基因座，例如GSH。在一些实施方案中，GSH是允许足够的转基因表达以产生期望水平的转基因编码的蛋白质或非编码RNA的任何基因座。GSH也不应使细胞倾向于恶性转化，也不应显著改变正常的细胞功能。向GSH的位点特异性整合可由与GSH同源的核酸介导，将所述核酸置于待整合核酸的5’和3’。此类同源供体序列可以为允许在所需基因座处进行整合的同源依赖修复提供模板。
在优选的实施方案中，本文所述的重组病毒体包含的核酸包含与靶细胞的基因组安全港(GSH)的核酸序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，将与GSH具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的所述核酸置于待整合核酸的5’和3’(同源臂)，从而允许通过同源重组将(位于同源臂之间的核酸)插入到靶基因组中的特定基因座。在一些实施方案中，待整合的核酸是与本文所述的启动子可操作地连接的任一种核酸。在一些实施方案中，GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5、NUPL2的基因间区域、胶原、HTRP、HI 1(HI 1基因座处的胸苷激酶编码核酸)、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR、RUNX1、KLHL7、mir684、KCNH2、GPNMB、MIR4540、MIR4475、MIR4476、PRL32P21、LOC105376031、LOC105376032、LOC105376030、MELK、EBLN3P、ZCCHC7或RNF38。在一些实施方案中，GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5或NUPL2的基因间区域。
在某些实施方案中，重组病毒体的核酸在转导后整合到靶细胞的基因组中。在一些实施方案中，核酸被整合到GSH或EVE中。在一些实施方案中，GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5、NUPL2的基因间区域、胶原、HTRP、HI 1(HI 1基因座处的胸苷激酶编码核酸)、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR、RUNX1、KLHL7、mir684、KCNH2、GPNMB、MIR4540、MIR4475、MIR4476、PRL32P21、LOC105376031、LOC105376032、LOC105376030、MELK、EBLN3P、ZCCHC7或RNF38。在一些实施方案中，GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5或NUPL2的基因间区域。在一些实施方案中，核酸通过同源重组，随后通过外源引入的核酸酶诱导DNA断裂形成来整合到靶基因组中。在一些实施方案中，核酸酶是TALEN、ZFN、大范围核酸酶、megaTAL或CRISPR核酸内切酶(例如，Cas9核酸内切酶或其变体)。在一些实施方案中，CRISPR核酸内切酶与指导RNA形成复合物。
在某些方面，本文提供了将异源核酸整合到细胞中的GSH的方法，其包括：(a)用本文所述的一种或多种病毒体转导细胞，所述病毒体包含在5’末端和3’末端侧接供体核酸序列的异源核酸，所述供体核酸序列与靶GSH核酸具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性；或(b)用一种或多种本文所述的病毒体转导细胞，所述病毒体包含(i)在5’末端和3’末端侧接供体核酸序列的异源核酸，所述供体核酸序列与靶GSH核酸具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的同一性，和(ii)编码核酸酶(例如，Cas9或其变体、ZFN、TALEN)和/或指导RNA的核酸，其中所述核酸酶或核酸酶/gRNA复合物在GSH处形成DNA断裂，所述断裂使用供体核酸修复，从而在GSH处整合异源核酸。在一些实施方案中，在单个病毒体中转导以下项：(i)侧接供体核酸的异源核酸，所述供体核酸与靶GSH核酸具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的同一性，以及(ii)编码核酸酶和/或gRNA的核酸。在一些实施方案中，GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5、NUPL2的基因间区域、胶原、HTRP、HI 1(HI 1基因座处的胸苷激酶编码核酸)、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR、RUNX1、KLHL7、mir684、KCNH2、GPNMB、MIR4540、MIR4475、MIR4476、PRL32P21、LOC105376031、LOC105376032、LOC105376030、MELK、EBLN3P、ZCCHC7或RNF38。在一些实施方案中，GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5或NUPL2的基因间区域。
为了整合位于5’和3’同源臂之间的核酸，5’和3’同源臂应该足够长以靶向GSH，并允许(例如，指导)通过同源重组整合到基因组中。为了增加整合在精确位置的可能性并增强同源重组的可能性，5’和3’同源臂可以包含足够数量的核酸。在一些实施方案中，5’和3’同源臂可包含至少10个碱基对但不超过5,000个碱基对、至少50个碱基对但不超过5,000个碱基对、至少100个碱基对但不超过5,000个碱基对、至少200个碱基对但不超过5,000个碱基对、至少250个碱基对但不超过5,000个碱基对、或至少300个碱基对但不超过5,000个碱基对。在一些实施方案中，5’和3’同源臂包含约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495或500个碱基对。关于同源臂长度和重组频率的详细信息是本领域已知的，参见例如Zhang等人"Efficient precise knock in with a double cut HDR donor afterCRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage."Genome biology 18.1(2017):35，其以引用方式整体并入本文。
5’和3’同源臂可以是与宿主细胞基因组中的GSH靶序列同源的任何序列。在一些实施方案中，5’和3’同源臂可以与本文所述的GSH的部分同源。此外，5’和3’同源臂可以是非编码或编码核苷酸序列。
在一些实施方案中，5’和/或3’同源臂可以与染色体上整合或DNA切割位点紧接上游和/或下游的序列同源。或者，5’和/或3’同源臂可以与远离整合或DNA切割位点的序列，诸如距离整合或DNA切割位点至少1、2、5、10、15、20、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个碱基对的序列，或与DNA切割位点(例如，可以是由外源引入的核酸酶诱导的DNA断裂)部分或完全重叠的序列同源。在一些实施方案中，核苷酸序列的3’同源臂接近ITR。
基因编辑系统
在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物用于将由本文所述的重组病毒体递送的核酸整合到靶基因组内的任何特定基因座(例如GSH)中。在一些实施方案中，整合由外源引入的核酸酶启动和/或促进，并且使用同源臂作为同源重组的指导修复由核酸酶诱导的DNA断裂，从而将侧接所述同源臂的核酸插入靶基因组中。
例如，双链断裂(DSB)可以由位点特异性核酸酶诸如锌指核酸酶(ZFN)或TAL效应物结构域核酸酶(TALEN)产生。参见例如Urnov等人(2010)Nature 435(7042):646-51；美国专利号8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054，其公开内容以引用方式并入本文。
另一种核酸酶系统涉及使用在细菌和古细菌中发现的所谓获得性免疫系统，称为CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas系统在40％的细菌和90％的古细菌中发现，并且在其系统的复杂性方面不同。参见例如美国专利号8,697,359。CRISPR基因座(成簇规律间隔短回文重复序列)是生物体基因组内的区域，其中外源DNA的短片段被整合在短重复回文序列之间。这些基因座被转录，并且RNA转录物(“前体crRNA”)被加工成短CRISPR RNA(crRNA)。有三种类型的CRISPR/Cas系统，它们都并入这些被称为“Cas”蛋白(CRISPR相关)的RNA和蛋白质。I型和III型都具有加工前体crRNA的Cas核酸内切酶，当完全加工成crRNA时，装配多Cas蛋白复合物，所述复合物能够切割与crRNA互补的核酸。
在II型系统中，使用不同的机制产生crRNA，其中与前体crRNA中的重复序列互补的反式活化RNA(tracrRNA)在Cas9蛋白或其变体存在下触发由双链特异性RNA酶III进行的加工。然后，Cas9能够切割与成熟crRNA互补的靶DNA，然而，由Cas9进行的切割依赖于crRNA与靶DNA之间的碱基配对，并且依赖于crRNA中被称为PAM序列的短基序(原间隔序列相邻基序)的存在(参见Qi等人(2013)Cell 152:1173)。此外，tracrRNA还必须在其3’末端与crRNA碱基配对，并且此缔合触发Cas9活性。
Cas9蛋白具有至少两个核酸酶结构域：一个核酸酶结构域类似于HNH核酸内切酶，而另一个类似于Ruv核酸内切酶结构域。HNH型结构域似乎负责切割与crRNA互补的DNA链，而Ruv结构域切割非互补链。Cas9的变体是本领域公认的，例如，降低脱靶活性的Cas9切口酶突变体(参见例如Ran等人(2014)Cell154(6):1380–1389)、nCas、Cas9-D10A。
对crRNA-tracrRNA复合物的需求可以通过使用工程化“单指导RNA”(sgRNA)来避免，所述单指导RNA包含通常由crRNA和tracrRNA的退火形成的发夹(参见Jinek等人(2012)Science 337:816和Cong等人(2013)Science express/10.1126/Science.1231143)。因此，外源引入的CRISPR核酸内切酶(例如Cas9或其变体)和指导RNA(例如sgRNA或gRNA)可以在靶细胞基因组内的特定基因座处诱导DNA断裂。适用于靶向的单指导RNA或指导RNA(sgRNA或gRNA)序列的非限制性实例显示在美国申请2015/0056705的表1中，所述申请以引用方式整体并入本文。此外，sgRNA或gRNA可包含本文所述的GSH基因座序列，包括表3A和表3B中的那些。
在一些实施方案中，基因编辑核酸序列编码选自由以下组成的组的基因编辑核酸分子：序列特异性核酸酶、一种或多种指导RNA(gRNA)、CRISPR/Cas、核糖核蛋白(RNP)或其任何组合。在一些实施方案中，序列特异性核酸酶包括：CRISPR/Cas系统(例如Cas蛋白，例如CAS1-9、Csy、Cse、cpfl、Cmr、Csx、Csf、Cpfl、nCAS或其他)的TAL核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、megaTAL或RNA指导的核酸内切酶。这些基因编辑系统是本领域技术人员已知的，参见例如国际专利申请号PCT/US2013/038536和美国专利公布号2017-0191078-A9中描述的TALENS，所述专利以引用方式整体并入本文。CRISPR cas9系统是本领域中已知的，并描述于2013年3月提交的美国专利申请号13/842,859和美国专利号8,697,359、8771,945、8795,965、8,865,406、8,871,445中。本文所述的重组病毒体也可用于失活的核酸酶系统，诸如CRISPRi或CRISPRa dCas系统、nCas或Cas13系统。
指导RNA(gRNA)
一般而言，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交的任何多核苷酸序列，并指导RNA指导的核酸内切酶复合物序列特异性靶向所选基因组靶序列。在一些实施方案中，指导RNA结合靶序列，例如可形成核糖核蛋白(RNP)的CRISPR相关蛋白，例如CRISPR/Cas复合物。
在一些实施方案中，指导RNA(gRNA)序列包含将gRNA序列引导至基因组中的所需位点的靶向序列，与crRNA和/或tracrRNA序列融合，允许指导序列与RNA指导的核酸内切酶缔合。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，指导序列与其相应靶序列之间的互补程度为至少50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高。最佳比对可通过使用任何合适的用于比对序列算法来确定，例如Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler转换的算法(例如Burrows Wheeler比对器)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies,ELAND(Illumina,San Diego,Calif.)、SOAP和Maq。
可以选择指导序列来靶向任何靶序列。在一些实施方案中，靶序列是如本文公开的细胞基因组内或GSH内的序列。在一些实施方案中，指导RNA可以与靶向DNA序列的任一条链互补。本领域技术人员理解，为了通过RNA指导的核酸内切酶进行靶向切割，基因组中独特的靶序列相对于在基因组中出现多于一次的靶序列更优选。生物信息学软件可用于预测指导RNA的脱靶效应并使其最小化(参见例如Naito等人“CRISPRdirect:software fordesigning CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites”Bioinformatics(2014),电子版；Heigwer等人“E-CRISP:fast CRISPR target site identification”Nat.Methods 11:122-123(2014)；Bae等人“Cas-OFFinder:a fast and versatilealgorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guidedendonucleases”Bioinformatics 30(10):1473-1475(2014)；Aach等人“CasFinder:Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes”BioRxiv(2014))。
通常，本文所用术语“crRNA/tracrRNA融合序列”是指与独特的靶向序列融合并且功能为允许形成包含指导RNA和RNA指导的核酸内切酶的复合物的核酸序列。此类序列可以在原核生物中的CRISPR RNA(crRNA)序列之后建模，所述crRNA序列包含(i)称为“原间隔序列”的可变序列，其对应于本文所述的靶序列，和(ii)CRISPR重复序列。类似地，融合物的tracrRNA(“反式活化CRISPR RNA”)部分可被设计成包含类似于原核生物中的tracrRNA序列的二级结构(例如发夹)，以允许形成核酸内切酶复合物。在一些实施方案中，单个转录物还包含转录终止序列，例如polyT序列，例如六个T核苷酸。在一些实施方案中，指导RNA可以包含两个RNA分子，并且在本文中被称为“双指导RNA”或“dgRNA”在一些实施方案中，dgRNA可包含含有crRNA的第一RNA分子和含有tracrRNA的第二RNA分子。第一RNA分子和第二RNA分子可以通过crRNA上的旗杆与tracrRNA之间的碱基配对形成RNA双链体。当使用dgRNA时，旗杆的长度不需要具有上限。
在其他实施方案中，指导RNA可以包含单个RNA分子，并且在本文中被称为“单指导RNA”或“sgRNA”在一些实施方案中，sgRNA可包含与tracrRNA共价连接的crRNA。在一些实施方案中，crRNA和tracrRNA可以通过接头共价连接。在一些实施方案中，sgRNA可以通过crRNA上的旗杆与tracrRNA之间的碱基配对而包含茎环结构。在一些实施方案中，单指导RNA的长度为至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120或更多个核苷酸(例如，长度为75-120、75-110、75-100、75-90、75-80、80-120、80-110、80-100、80-90、85-120、85-110、85-100、85-90、90-120、90-110、90-100、100-120、100-120个核苷酸)。在一些实施方案中，本文所述的用于将所关注的核酸整合到GSH基因座中的核酸载体或其组合物包含编码至少1个gRNA的核酸。例如，第二多核苷酸序列可编码1个gRNA至50个gRNA，或1-50的任何整数。编码不同gRNA的每个多核苷酸序列可以与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，与不同gRNA可操作地连接的启动子可以是相同的启动子。与不同gRNA可操作地连接的启动子可以是不同的启动子。启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子或调控型启动子。
在一些实施方案中，用于整合到GSH基因座中的核酸编码或者包含所述核酸的重组病毒体与包含编码Cas切口酶(nCas；例如，Cas9切口酶或Cas9-D10A)的核酸的另一种病毒体一起施用。本文考虑将这种nCas酶与包含与如本文所述的GSH同源的指导RNA一起使用，并可用于例如释放物理限制的序列或提供扭转释放。释放物理限制的序列可以例如“解开”载体，使得暴露同源定向修复(HDR)模板同源臂，以用于与基因组序列相互作用。
在一些实施方案中，锌指核酸酶用于诱导DNA断裂，这有利于所需核酸的整合。如本文中可互换使用的，“锌指核酸酶”或“ZFN”是指包含至少一个锌指DNA结合结构域的嵌合蛋白分子，所述结合结构域有效连接到至少一种核酸酶或完全组装时能够切割DNA的核酸酶的一部分。如本文所用，“锌指”是指识别并结合DNA序列的蛋白质结构。锌指结构域是人蛋白质组中最常见的DNA结合基序。单个锌指包含大约30个氨基酸，并且所述结构域通常通过每个碱基对的单个氨基酸侧链的相互作用结合3个连续的DNA碱基对来发挥功能。
在一些实施方案中，本文所述的用于整合的核酸在无核酸酶的同源依赖修复系统中被整合到靶基因组中，例如，如Porro等人,Promoterless gene targeting withoutnucleases rescues lethality of a Crigler-Najjar syndrome mouse model,EMBOMolecular Medicine,(2017)中所述的。在一些实施方案中，体内基因靶向方法适用于在不使用核酸酶的情况下插入供体序列。在一些实施方案中，供体序列可以是无启动子的。
在一些实施方案中，位于限制性位点之间的核酸酶可以是RNA指导的核酸内切酶。如本文所用，术语“RNA指导的核酸内切酶”是指与RNA分子形成复合物的核酸内切酶，所述复合物包含与所选靶DNA序列互补的区域，使得RNA分子与所选序列结合，从而将核酸内切酶活性引导至本文鉴定的GSH中的所选靶DNA序列。
CRISPR/CAS系统
如本领域所认识和上文所述，CRISPR-CAS9系统包含蛋白质和核糖核酸(“RNA”)的组合，其可以改变生物体的遗传序列(参见例如美国公布2014/0170753)。CRISPR-Cas9提供了一套工具，其用于在哺乳动物细胞中通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组进行Cas9介导的基因组编辑。本领域普通技术人员可以在许多已知的CRISPR系统，例如I型、II型和III型之间进行选择。在一些实施方案中，本文所述的用于将所关注的核酸整合到GSH基因座中的核酸可被设计成包含编码这些系统的一种或多种组分的序列，所述组分例如指导RNA、tracrRNA或Cas(例如，Cas9或其变体)。在某些实施方案中，单个启动子驱动指导序列和tracrRNA的表达，而单独的启动子驱动Cas(例如，Cas9或其变体)的表达。本领域技术人员将了解，某些Cas核酸酶需要存在与靶核酸序列相邻的原间隔序列相邻基序(PAM)。
包含Cas(例如Cas9或其变体)的RNA指导的核酸酶适用于启动和/或促进由本文所述的重组病毒体递送的核酸的整合。指导RNA可以被引导至DNA的同一条链或互补链。
在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可包含CRISPRi(CRISPR干扰)和/或CRISPRa(CRISPR活化)系统和/或用于将所述系统递送至宿主细胞。CRISPRi和CRISPRa系统包含不能产生双链断裂(DSB)的失活RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或其变体)。这允许核酸内切酶与指导RNA组合，以特异性结合基因组中的靶序列，并提供RNA指导的可逆转录控制。
因此，在一些实施方案中，本文所述的用于将所关注的核酸整合到GSH基因座中的核酸组合物和方法可包含失活的核酸内切酶，例如RNA指导的核酸内切酶和/或Cas9或其变体，其中失活的核酸内切酶缺乏核酸内切酶活性，但保留了以位点特异性方式结合DNA的能力，例如与一种或多种指导RNA和/或sgRNA组合。在一些实施方案中，载体可以还包含一种或多种tracrRNA、指导RNA或sgRNA。在一些实施方案中，失活的核酸内切酶可以还包含转录活化结构域。
在一些实施方案中，本文所述的用于将所关注的核酸整合到GSH基因座中的核酸组合物和方法可包含杂合重组酶。例如，基于来源于与Cys2-His2锌指或TAL效应子DNA结合结构域融合的丝氨酸重组酶的分解酶/转化酶家族的活化催化结构域的杂合重组酶是一类能够提高哺乳动物细胞中的靶向特异性并实现优异的位点特异性整合率的试剂。合适的杂合重组酶包括Gaj等人Enhancing the Specificity of Recombinase-Mediated GenomeEngineering through Dimer Interface Redesign,Journal of the American ChemicalSociety,(2014)中描述的那些。
本文所述的核酸酶可以被改变，例如被工程化以设计序列特异性核酸酶(参见例如美国专利8,021,867)。可以使用例如Certo等人Nature Methods(2012)9:073-975；美国专利号8,304,222；8,021,867；8,119,381；8,124,369；8,129,134；8,133,697；8,143,015；8,143,016；8,148,098；或8,163,514中描述的方法设计核酸酶，所述文献各自的内容以引用方式整体并入本文。或者，具有位点特异性切割特征的核酸酶可以使用可商购获得的技术，例如Precision BioSciences’Directed Nuclease EditorTM基因组编辑技术来获得。
MEGATAL
在一些实施方案中，本文所述的核酸酶可以是megaTAL。MegaTAL是包含转录活化因子样(TAL)效应结构域和大范围核酸酶结构域的工程化融合蛋白。MegaTAL保留TAL的靶特异性工程化的简易性，同时减少脱靶效应和总酶大小并增加活性。在例如Boissel等人2014Nucleic Acids Research 42(4):259l-60l和Boissel 2015Methods Mol Biol1239:171-196中更详细地描述了MegaTAL的构建和使用。megaTAL介导的基因敲除和基因编辑的方案是本领域已知的，参见例如Sather等人Science Translational Medicine2015 7(307):ral56和Boissel等人2014Nucleic Acids Research 42(4):259l-60l。在本文所述的任何方法和组合物中，MegaTAL可用作替代性核酸内切酶。
标记/报告基因
示例性标记基因包括但不限于荧光报告基因，例如GFP、RFP等，以及生物发光报告基因中的任何一种。示例性标记基因包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、祖母绿(Emerald)、生明绿(AzamiGreen)、单体生明绿、CopGFP、AceGFP、ZsGreenl)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(例如，YFP、EYFP、Citrine、Venus YPet、PhiYFP、ZsYellowl)、青色荧光蛋白(例如，ECFP、Cerulean、CyPet AmCyanl、Midoriishi-Cyan)、红色荧光蛋白(例如，mKate、mKate2、mPlum、DsRed monomer、mCherry、mRFPl、DsRed-Express、DsRed2、HcRed-Tandem、HcRed 1、AsRed2、eqFP6l 1、mRaspberry、mStrawberry、Jred)、橙色荧光蛋白(例如mOrange、mKO、Kusabira-Orange、单体Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)和包括蓝色荧光蛋白(BFP)的自体荧光蛋白。
标记基因也可包括但不限于编码β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和本领域熟知的其他酶的DNA序列。当与驱动其表达的调控元件缔合时，报告序列提供通过常规方式可检测的信号，所述方式包括酶促、放射照相、比色、荧光或其他光谱测定、荧光活化细胞分选测定和免疫学测定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学。例如，当标记序列是LacZ基因时，携带信号的载体的存在通过测定β-半乳糖苷酶活性来检测。在一些实施方案中，当标记基因是绿色荧光蛋白或荧光素酶时，携带信号的载体可以分别基于可见光吸光度或光度计中的光产量进行比色测量。例如，此类报告基因可用于验证核酸的组织特异性靶向能力和组织特异性启动子调控活性。
标记基因包括但不限于编码介导抗生素抗性(例如，氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白质的序列；编码有色或荧光或发光蛋白质(例如，绿色荧光蛋白、增强的绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶)的序列；以及介导细胞代谢从而导致细胞生长率和/或基因扩增增强的蛋白质(例如，二氢叶酸还原酶)。
核酸
非编码RNA和编码RNA
在一些实施方案中，所关注的核酸编码受体、毒素、激素、酶、由标记基因(参见上文)编码的标记蛋白、或细胞表面蛋白或治疗性蛋白质、肽或抗体或其片段。在一些实施方案中，用于如本文公开的载体组合物的所关注的核酸编码需要在细胞中表达的任何多肽，包括但不限于抗体、抗原、酶、受体(细胞表面或细胞核)、激素、淋巴因子、细胞因子、报告多肽、生长因子和上述任一者的功能性片段。
在一些实施方案中，用于如本文公开的重组病毒体的所关注的核酸编码在患有疾病(包括但不限于本文所述的任何疾病)的受试者中缺乏或无功能的多肽。在一些实施方案中，疾病是遗传疾病。
在一些方面，如本文定义的所关注的核酸编码用于以下方法中的核酸：预防或治疗哺乳动物的一种或多种遗传缺陷或功能障碍，例如哺乳动物的多肽缺陷或多肽过量，并且特别是用于预防、治疗表现出一种或多种与细胞和组织中此类多肽的缺陷相关的病症的人的缺陷或降低缺陷的严重性或程度。所述方法涉及以足以预防或治疗患有这种病症的受试者的缺陷或疾病的量和时间向受试者施用编码一种或多种治疗性肽、多肽、siRNA、微小RNA、反义核苷酸等的所关注的核酸(例如，如本公开所述的核酸)，所述核酸包装在本文所述的重组病毒体中，优选地包装在药学上可接受的组合物中。
因此，在一些实施方案中，用于如本文公开的载体组合物的所关注的核酸可以编码一种或多种肽、多肽或蛋白质，其可用于治疗或预防哺乳动物受试者的疾病。
用于本文公开的组合物和方法的示例性所关注的核酸包括但不限于：BDNF、CNTF、CSF、EGF、FGF、G-SCF、GM-CSF、促性腺激素、IFN、IFG-1、M-CSF、NGF、PDGF、PEDF、TGF、VEGF、TGF-B2、TNF、催乳素、生长激素、XIAP1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-10(187A)、病毒IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、VEGF、FGF、SDF-1、联接蛋白40、联接蛋白43、SCN4a、HIFia、SERCa2a、ADCYl和ADCY6。
在一些实施方案中，核酸可包含选自由以下组成的组的编码序列或其片段：哺乳动物β珠蛋白基因(例如HBA1、HBA2、HBB、HBG1、HBG2、HBD、HBE1和/或HBZ)、α-血红蛋白稳定蛋白(AHSP)、B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)基因、Kruppel样因子1(KLF1)基因、CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(AAVS1)基因、次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)基因、白蛋白基因、因子VIII基因、因子IX基因、富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)基因、亨廷顿蛋白(HTT)基因、视紫红质(RHO)基因、囊性纤维化跨膜传导调控因子(CFTR)基因、F8或其片段(例如，编码B结构域缺失多肽(例如，VIII SQ、p-VIII)的片段)、表面活性蛋白B基因(SFTPB)、T细胞受体α(TRAC)基因、T细胞受体β(TRBC)基因、程序性细胞死亡1(PD1)基因、细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA-4)基因、人白细胞抗原(HLA)A基因、HLA B基因、HLA C基因、HLA-DPA基因、HLA-DQ基因、HLA-DRA基因、LMP7基因、抗原加工相关性转运蛋白(TAP)1基因、TAP2基因、TAP相关蛋白基因(TAPBP)、II类主要组织相容性复合物反式活化因子(CUT A)基因、肌营养不良蛋白基因(DMD)、糖皮质激素受体基因(GR)、IL2RG基因、RFX5基因、FAD2基因、FAD3基因、ZP15基因、KASII基因、MDH基因和/或EPSPS基因。
在一些实施方案中，用于本文公开的重组病毒体的所关注的核酸可用于恢复受试者中表达减少、沉默或功能障碍的基因的表达。类似地，在一些实施方案中，用于本文公开的重组病毒体的所关注的核酸也可用于敲低在受试者中异常表达的基因的表达。
在一些实施方案中，功能障碍基因是在患有癌症的受试者中已经沉默的肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，功能障碍基因是在患有癌症的受试者中异常表达的致癌基因。与癌症相关的示例性基因(致癌基因和肿瘤抑制基因)包括但不限于：AARS、ABCB 1、ABCC4、ABI2、ABL1、ABL2、ACK1、ACP2、ACY1、ADSL、AK1、AKR1C2、AKT1、ALB、ANPEP、ANXAS、ANXA7、AP2Ml、APC、ARHGAPS、ARHGEFS、ARID4A、ASNS、ATF4、ATM、ATPSB、ATPSO、AXL、BARD1、BAX、BCL2、BHLHB2、BLMH、BRAF、BRCA1、BRCA2、BTK、CANX、CAP1、CAPN1、CAPNS1、CAV1、CBFB、CBLB、CCL2、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CCTS、CCYR61、CD24、CD44、CD59、CDC20、CDC25、CDC25A、CDC25B、CDC2LS、CDK10、CDK4、CDK5、CDK9、CDKL1、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2D、CEBPG、CENPC1、CGRRF1、CHAF1A、CIB1、CKMT1、CLK1、CLK2、CLK3、CLNS1A、CLTC、COL1A1、COL6A3、COX6C、COX7A2、CRAT、CRHR1、CSF1R、CSK、CSNK1G2、CTNNA1、CTNNB1、CTPS、CTSC、CTSD、CUL1、CYR61、DCC、DCN、DDX10、DEK、DHCR7、DHRS2、DHX8、DLG3、DVL1、DVL3、E2F1、E2F3、E2F5、EGFR、EGR1、EIF5、EPHA2、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC3、ETV1、ETV3、ETV6、F2R、FASTK、FBN1、FBN2、FES、FGFR1、FGR、FKBP8、FN1、FOS、FOSL1、FOSL2、FOXG1A、FOXO1A、FRAP1、FRZB、FTL、FZD2、FZDS、FZD9、G22P1、GAS6、GCNSL2、GDF1 S、GNA13、GNAS、GNB2、GNB2Ll、GPR39、GRB2、GSK3A、GSPT1、GTF21、HDAC1、HDGF、HMMR、HPRT1、HRB、HSPA4、HSPAS、HSPA8、HSPB1、HSPH1、HYAL1、HYOU1、ICAM1、ID1、ID2、IDUA、IER3、IFITM1、IGF1R、IGF2R、IGFBP3、IGFBP4、IGFBPS、IL1B、ILK、ING1、IRF3、ITGA3、ITGA6、ITGB4、JAK1、JARID1A、JUN、JUNB、JUND、K-ALPHA-1、KIT、KITLG、KLK10、KPNA2、KRAS2、KRT18、KRT2A、KRT9、LAMB1、LAMP2、LCK、LCN2、LEP、LITAF、LRPAP1、LTF、LYN、LZTR1、MADH1、MAP2K2、MAP3K8、MAPK12、MAPK13、MAPKAPK3、MAPRE1、MARS、MAS1、MCC、MCM2、MCM4、MDM2、MDM4、MET、MGST1、MICB、MLLT3、MME、MMP1、MMP14、MMP17、MMP2、MNDA、MSH2、MSH6、MT3、MYB、MYBL1、MYBL2、MYC、MYCLI、MYCN、MYD88、MYL9、MYLK、NEO1、NF1、NF2、NFKB I、NFKB2、NFSF7、NID、NINJ1、NMBR、NME1、NME2、NME3、NOTCH 1、NOTCH2、NOTCH4、NPM1、NQO1、NRlD1、NR2Fl、NR2F6、NRAS、NRG1、NSEP1、OSM、PA2G4、PABPC1、PCNA、PCTK1、PCTK2、PCTK3、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDPK1、PEAl5、PFDN4、PFDN5、PGAM1、PHB、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIM1、PKM2、PKMYT1、PLK2、PPARD、PPARG、PPIH、PPP1CA、PPP2RSA、PRDX2、PRDX4、PRKAR1A、PRKCBP1、PRNP、PRSS15、PSMA1、PTCH、PTEN、PTGS1、PTMA、PTN、PTPRN、RABSA、RAC1、RADSO、RAF1、RALBP1、RAP1A、RARA、RARB、RASGRF1、RB1、RBBP4、RBL2、REA、REL、RELA、RELB、RET、RFC2、RGS19、RHOA、RHOB、RHOC、RHOD、RIPK1、RPN2、RPS6KB 1、RRM1、SARS、SELENBP1、SEMA3C、SEMA4D、SEPP1、SERPINH1、SFN、SFPQ、SFRS7、SHB、SHH、SIAH2、SIVA、SIVA TP53、SKI、SKIL、SLC16A1、SLC1A4、SLC20Al、SMO、SMPD1、SNAI2、SND1、SNRPB2、SOCS1、SOCS3、SOD1、SORT1、SPINT2、SPRY2、SRC、SRPX、STAT1、STAT2、STAT3、STAT5B、STC1、TAF1、TBL3、TBRG4、TCF1、TCF7L2、TFAP2C、TFDP1、TFDP2、TGFA、TGFB1、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、THBS1、TIE、TIMP1、TIMP3、TJP1、TK1、TLE1、TNF、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF6、TNFSF7、TNK1、TOB1、TP53、TP53BP2、TP5313、TP73、TPBG、TPT1、TRADD、TRAM1、TRRAP、TSG101、TUFM、TXNRD1、TYR03、UBC、UBE2L6、UCHL1、USP7、VDAC1、VEGF、VHL、VIL2、WEE1、WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNTSA、WT1、XRCC 1、YES1、YWHAB、YWHAZ、ZAP70和ZNF9。
在一些实施方案中，功能障碍基因是HBB。在一些实施方案中，HBB包含至少一个减少或消除β-珠蛋白产生的无义突变、移码突变或剪接突变。在一些实施方案中，HBB包含在HBB的启动子区域或聚腺苷酸化信号中的至少一个突变。在一些实施方案中，HBB突变是c.17A>T、c.-1360G、c.92+1G>A、c.92+6T>C、c.93-21G>A、c.1180T、c.316-106OG、c.25_26delAA、c.27_28insG、c.92+5G>C、c.1180T、c.l35delC、c.315+lG>A、c.-78A>G、c.52A>T、c.59A>G、c.92+5G>C、c.l24_127delTTCT、c.316-1970T、c.-78A>G、c.52A>T、c.l24_127delTTCT、c.316-197C>T、C.-1380T、c.-79A>G、c.92+5G>C、c.75T>A、c.316-2A>G和c.316-2A>C中的至少一种。
在某些实施方案中，通过基因疗法(例如干细胞基因疗法)改善镰状细胞病，所述基因疗法引入了包含一个或多个包含抗镰状细胞病活性的突变的HBB变体。在一些实施方案中，HBB变体可以是双突变体(βAS2；T87Q和E22A)。在其他实施方案中，HBB变体可以是三突变β-珠蛋白变体(βAS3；T87Q、E22A和G16D)。β16上甘氨酸到天冬氨酸的修饰在与α链结合方面比镰状珠蛋白(βS，HbS)具有竞争优势。β22上谷氨酸到丙氨酸的修饰部分增强了与α20组氨酸的轴向相互作用。这些修饰产生了比单一T87Q修饰变体更大且与胎儿珠蛋白相当的抗镰状特性。在SCD鼠模型中，用携带βAS3的SIN慢病毒转导的骨髓干细胞的移植逆转了红细胞生理学和SCD临床症状。因此，该变体正在临床试验中进行测试(识别号：NCT02247843)，Cytotherapy(2018)20(7):899–910。
在一些实施方案中，功能障碍基因是CFTR。在一些实施方案中，CFTR包含选自以下的突变：ΔF508、R553X、R74W、R668C、S977F、L997F、K1060T、A1067T、R1070Q、R1066H、T3381、R334W、G85E、A46D、I336K、H1054D、M1V、E92K、V520F、H1085R、R560T、L927P、R560S、N1303K、M1101K、L1077P、R1066M、R1066C、L1065P、Y569D、A561E、A559T、S492F、L467P、R347P、S341P、I507del、G1061R、G542X、W1282X和2184InsA。
在一些实施方案中，如本文定义的所关注的核酸编码抑制与癌症相关的基因产物(例如致癌基因)表达的小干扰核酸(例如shRNA、miRNA)，可用于预防或治疗癌症。在一些实施方案中，如本文定义的所关注的核酸编码与癌症相关的基因产物(或抑制与癌症相关的基因表达的功能性RNA)，用于例如研究目的，例如研究癌症或鉴定预防或治疗癌症的治疗剂。
本领域普通技术人员还了解，所关注的核酸可以包含一个或多个导致保守氨基酸取代的突变，这可以提供蛋白质或多肽的功能等同的变体或同源物。本公开中还考虑了本文所述的重组病毒体中具有显性负突变的所关注的核酸。例如，所关注的核酸可以编码突变蛋白，所述突变蛋白与和野生型蛋白相同元件相互作用，从而阻断野生型蛋白功能的某些方面。
在一些实施方案中，本文公开的重组病毒体中所关注的核酸包括miRNA。miRNA和其他小干扰核酸通过靶RNA转录物切割/降解或靶信使RNA(mRNA)的翻译抑制来调控基因表达。miRNA是天然表达的，通常表达为最终19-25个非翻译RNA产物。miRNA通过与靶mRNA的3’非翻译区(UTR)的序列特异性相互作用来表现其活性。这些内源性表达的miRNA形成发夹前体，所述发夹前体随后被加工成miRNA双链体，并进一步被加工成“成熟的”单链miRNA分子。此成熟的miRNA指导多蛋白复合体miRISC，它基于与成熟miRNA的互补性来识别靶mRNA的靶位点，例如在3’UTR区域。图5A和图5B公开了miRNA基因及其同源物的非限制性列表，或者作为由本文所述的核酸编码的小干扰核酸(例如，miRNA海绵、反义寡核苷酸、TuD RNA)的靶标。
miRNA抑制其所靶向的mRNA的功能，并因此抑制由mRNA编码的多肽的表达。因此，阻断(部分或全部)miRNA的活性(例如，使miRNA沉默)可以有效地诱导或恢复表达受到抑制的多肽的表达(对多肽去阻遏)。在一些实施方案中，对由miRNA的mRNA靶标编码的多肽的去阻遏通过多种方法中的任一种抑制细胞中的miRNA活性来实现。例如，阻断miRNA的活性可以通过与同miRNA互补或基本上互补的小干扰核酸(例如，反义寡核苷酸、miRNA海绵、TuDRNA)杂交来实现，从而阻断miRNA与其靶mRNA的相互作用。如本文所用，与miRNA基本上互补的小干扰核酸是能够与miRNA杂交并阻断miRNA活性的核酸。在一些实施方案中，与miRNA基本上互补的小干扰核酸是与miRNA在除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个碱基之外的所有碱基处互补的小干扰核酸。在一些实施方案中，与miRNA基本上互补的小干扰核酸序列是与miRNA至少在一个碱基处互补的小干扰核酸序列。
调控序列
本文公开的重组病毒体的核酸也可包含转录或翻译调控序列，例如启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽和/或聚腺苷酸化信号的序列。
在一些实施方案中，调控序列包括合适的启动子序列，其能够指导与启动子序列可操作地连接的基因，例如如本文所述的所关注的核酸的转录。在实施方案中，在启动子的上游提供增强子序列，以增加启动子的效力。在一些实施方案中，调控序列包括增强子和启动子，其中第二核苷酸序列包含编码核酸酶的核苷酸序列上游的内含子序列，其中内含子包含一个或多个核酸酶切割位点，并且其中启动子与编码核酸酶的核苷酸序列可操作地连接。
适合的启动子(包括本文所述的那些启动子)可源自病毒并且可因此称为病毒启动子，或它们可源自任何生物包括原核生物或真核生物。在一些实施方案中，启动子源自昆虫细胞或哺乳动物细胞。适合的启动子可用来通过任何RNA聚合酶(例如，pol I、pol II、pol III)驱动表达。示例性启动子包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复(LTR)启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子区(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、人U6小核启动子(Miyagishi等人,Nature Biotechnology 20,497-500(2002))、增强的U6启动子(例如，Xia等人,
Nucleic Acids Res.2003年9月1日；31(17))、人H l启动子(Hl)等。在一些实施方案中，这些启动子被改变成包含一个或多个核酸酶切割位点。
启动子可包括一个或多个特异性转录调控序列以进一步增强所述基因的表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可包括远端增强子或阻遏物元件，所述元件可位于距离转录起始位点多达数千个碱基对处。启动子可来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子对于其中表达发生的组织或器官，对于表达发生所处的发育阶段或响应于外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，可组成型地或差异地调控基因组件的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子以及下文列出的启动子。此类启动子和/或增强子可用于表达任何所关注的基因，例如基因编辑分子、供体序列、治疗性蛋白质等)。例如，核酸可包含与DNA核酸内切酶或基于CRISPR/Cas9的系统可操作地连接的启动子。与基于CRISPR/Cas9的系统或位点特异性核酸酶编码序列可操作地连接的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、CAG启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子(诸如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子)、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(诸如CMV立即早期启动子)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子还可以是来自人基因的启动子，所述人基因如人泛素C(hUbC)、人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。启动子还可以是组织特异性启动子，诸如天然或合成的肝特异性启动子。在一个实施方案中，可使用包含载体的组合物经由存在于肝细胞表面上的低密度脂蛋白(LDL)受体对肝细胞的内源性ApoE特异性靶向来实现向肝脏的递送。在一些实施方案中，使用具有调控元件组件的计算机设计的合成启动子。这些合成启动子不是天然存在的，并且被设计用于在靶组织中最佳表达、受调控表达或适应病毒衣壳。
在一些实施方案中，启动子可选自：(a)与核酸异源的启动子，(b)促进核酸的组织特异性表达的启动子，优选地其中启动子促进造血细胞特异性表达或红细胞谱系特异性表达，(c)促进核酸的组成型表达的启动子，和(d)可诱导性表达的启动子，任选响应代谢物或小分子或化学实体来表达。诱导型启动子的实例包括受四环素、cumate、雷帕霉素、FKCsA、ABA、他莫昔芬、蓝光和核糖开关调控的启动子。在例如Kallunki等人(2019)Cells 8:E796中提供了额外细节，所述文献以引用方式并入本文。在一些实施方案中，启动子选自CMV启动子、β-珠蛋白启动子、CAG启动子、AHSP启动子、MND启动子、Wiskott-Aldrich启动子和PKLR启动子。
序列
如本文所用，编码区是指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区域，而非编码区是指不翻译成氨基酸的核苷酸序列区域。转录的非编码序列可以是上游(5’-UTR)、下游(3’-UTR)或内含子。非转录的非编码序列可具有顺式作用的调控功能，例如增强子和启动子，或充当“间隔区”，用于分离DNA中的功能基团的非转录DNA，例如用于增加载体基因组大小的多接头或“填充”DNA。
互补序列或互补是指两条核酸链的区域之间或同一条核酸链的两个区域之间序列互补性的广义概念。已知第一核酸区域的腺嘌呤残基能够与第二核酸区域的残基形成特异性氢键(碱基配对)，如果该残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，则第二核酸区域与第一区域反向平行。类似地，已知第一条核酸链的胞嘧啶残基能够与第二条核酸链的残基进行碱基配对，如果残基是鸟嘌呤，则第二条核酸链与第一条链反向平行。如果当两个区域以反向平行方式排列时，第一区域的至少一个核苷酸残基能够与第二区域的残基碱基配对，则核酸的第一区域与同一核酸或不同核酸的第二区域互补。在一些实施方案中，第一区域包含第一部分并且第二区域包含第二部分，由此，当第一部分和第二部分以反向平行方式排列时，第一部分的至少约50％和优选地至少约75％、至少约90％或至少约95％的核苷酸残基能够与第二部分的核苷酸残基碱基配对。在其他实施方案中，第一部分的所有核苷酸残基都能够与第二部分的核苷酸残基进行碱基配对。
当核酸被置于与另一核酸序列具有功能关系时，核酸被可操作地连接。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作地连接。关于转录调控序列，可操作地连接意指被连接的DNA序列是连续的，并且在必要时连接连续的并在阅读框内的两个蛋白质编码区。
特定蛋白质的氨基酸序列与编码所述蛋白质的核苷酸序列之间存在已知且明确的对应关系，如遗传密码所定义的(如下所示)。同样，在特定核酸的核苷酸序列和由该核酸编码的氨基酸序列之间存在已知且明确的对应关系，如遗传密码所定义的。
遗传密码
遗传密码的重要且熟知的特征是其简并性，因此，对于用于制成蛋白质的大多数氨基酸来说，可以使用超过一个编码核苷酸三联体(如上所示)。因此，许多不同的核苷酸序列可以编码给定的氨基酸序列。遗传密码的普遍性表明此类核苷酸序列被认为是功能等同的，因为它们导致在所有生物中产生相同的氨基酸序列，尽管线粒体和质体以及类似的共生细胞器具有稍微不同的遗传密码。虽然不是所有的密码子都以相似的翻译效率利用，但由于tRNA库有限，稀有密码子可能会降低蛋白质产量。此外，偶尔，在给定的核苷酸序列中可以发现嘌呤或嘧啶的甲基化变体。此类甲基化不影响三核苷酸密码子与相应氨基酸之间的编码关系。
在改变多肽的氨基酸序列时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用性生物学功能中的重要性是本领域普遍理解的。公认的是，氨基酸的相对亲水特性促成所得蛋白质的二级结构，这又定义了蛋白质与其他分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。每种氨基酸在其疏水性和电荷特征的基础上被分配亲水指数，这些为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(<RTI 3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。
本领域已知，某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或得分的其他氨基酸取代，并且仍产生具有相似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能等同的蛋白质。
如上所概述，因此氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员熟知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本领域还已知编码多肽的核酸可以针对某些宿主细胞进行密码子优化，而不改变氨基酸序列。密码子优化描述了使用同义密码子改变来增加蛋白质产量的基因工程化方法。这是可能的，因为大多数氨基酸由多于一个密码子编码。用常用密码子替换稀有密码子已显示出增加蛋白质的表达。
鉴于前述内容，编码本文所述的核酸(或其任何部分)(例如，治疗性核酸)的DNA或RNA的核苷酸序列可用于推导出多肽氨基酸序列，使用遗传密码将DNA或RNA翻译成氨基酸序列。同样，对于多肽氨基酸序列，可编码所述多肽的相应核苷酸序列可从遗传密码中推导(由于其冗余性，对于任何给定的氨基酸序列将产生多个核酸序列)。因此，本文对编码多肽的核苷酸序列的描述和/或公开应被认为也包括对由该核苷酸序列编码的氨基酸序列的描述和/或公开。类似地，本文对多肽氨基酸序列的描述和/或公开应该被认为也包括对可以编码所述氨基酸序列的所有可能的核苷酸序列的描述和/或公开。
最后，可用于本发明中的核酸和多肽分子的核酸和氨基酸序列信息是本领域熟知的，并且容易在公开数据库，例如国家生物技术信息中心(NCBI)中获得。
表4：序列
如上所述，普通技术人员了解病毒序列的基因型变异。因此，本文中呈现的序列代表示例性分离株的序列。
SEQ ID NO:1、2和3代表AAV ITR的实例。–末端解析位点(trs)；/> –A和A’茎；实线下划线–B/B'和C/C'茎。
SEQ ID NO:1AAV2 ITR“内翻”构象异构体核酸序列
SEQ ID NO:2AAV2 ITR“外翻”构象异构体核酸序列
SEQ ID NO:3AAV2 ITR“内翻”构象异构体核酸序列
SEQ ID NO:4犬细小病毒(CTG-VP1-3-Leu-VP2)(UniProtKB-P12930(CAPSD_PAVCN))
*SEQ ID NO:4包含CPV-N株的VP1和VP2的序列。整个序列对应于VP1，而VP2序列从粗体的“M”开始，该粗体的“M”标记VP2的第一个甲硫氨酸。
加下划线的残基限定了影响内化和转胞吞作用的受体结合结构域。这些区域内的突变改变受体的相互作用并调节转胞吞作用。
VP2的氨基酸93(从粗体的“M”开始编号)和相邻残基涉及TfR相互作用和宿主范围。
氨基酸300和VP2的相邻残基(从粗体的“M”开始)影响宿主范围(与TfR的相互作用)。
氨基酸323和VP2的相邻残基(从粗体的“M”开始)参与TfR相互作用和宿主范围。
SEQ ID NO:5犬细小病毒VP1氨基酸序列(GenBank AXQ00350)
SEQ ID NO:6犬细小病毒VP2氨基酸序列(Genbank CAA86612)
SEQ ID NO:7猫泛白细胞减少症病毒(CTG-VP1-3-Leu-VP2)
SEQ ID NO:7包含这种猫泛白细胞减少症病毒株的VP1和VP2的序列。整个序列对应于VP1，而VP2序列从粗体的“M”开始，该粗体的“M”标记VP2的第一个甲硫氨酸。
SEQ ID NO:8猫泛白细胞减少症病毒VP1氨基酸序列(GenBank AKI88071)
SEQ ID NO:9猫泛白细胞减少症病毒VP2氨基酸序列(GenBank ACI31203)
SEQ ID NO:10布法病毒(CTG-VP1-3-Leu-VP2)
SEQ ID NO:10包含该布法病毒株的VP1和VP2的序列。整个序列对应于VP1，而VP2序列从粗体的“M”开始，该粗体的“M”标记VP2的第一个甲硫氨酸。
SEQ ID NO:11布法病毒VP1氨基酸序列(GenBank AFN44271)
SEQ ID NO:12布法病毒VP2氨基酸序列(GenBank AFN44272)
SEQ ID NO:13图萨病毒(CTG-VP1-3-Leu-VP2)
SEQ ID NO:13包含该图萨病毒株的VP1和VP2的序列。整个序列对应于VP1，而VP2序列从粗体的“M”开始，该粗体的“M”标记VP2的第一个甲硫氨酸。
SEQ ID NO:14图萨病毒VP1氨基酸序列(GenBank AIT18930)
SEQ ID NO:15图萨病毒VP2氨基酸序列(GenBank AIT18929)
SEQ ID NO:16库塔病毒(CTG-VP1-3-Leu-VP2)
SEQ ID NO:16包含这种库塔病毒株的VP1和VP2的序列。整个序列对应于VP1，而VP2序列从粗体的“M”开始，该粗体的“M”标记VP2的第一个甲硫氨酸。
SEQ ID NO:17库塔病毒VP1氨基酸序列(GenBank YP_009508805)
SEQ ID NO:18库塔病毒VP2氨基酸序列(GenBank YP_009508807)
SEQ ID NO:19Wuharv细小病毒(CTG-VP1-3-Leu-VP2)
SEQ ID NO:19包含该Wuharv细小病毒株的VP1和VP2的序列。整个序列对应于VP1，而VP2序列从粗体的“M”开始，该粗体的“M”标记VP2的第一个甲硫氨酸。
SEQ ID NO:20Wuharv细小病毒VP1氨基酸序列(GenBank YP_009508803)
SEQ ID NO:21Wuharv细小病毒VP2氨基酸序列(GenBank YP_009508803.1)
SEQ ID NO:22人细小病毒4VP1氨基酸序列(GenBank AEE69129)
SEQ ID NO:23人细小病毒4VP2氨基酸序列(GenBank AEE69130)
SEQ ID NO:24人细小病毒4NS1氨基酸序列(GenBank AEE69128.1)
代表性GSH序列
SEQ ID NO:25PAX5基因组安全港序列>NG_033894.1:184716-186382智人配对盒5(PAX5)，在9号染色体上的RefSeqGene(LRG_1384)
SEQ ID NO:26KIF6基因组安全港序列>NG_054928.1:303712-305348智人驱动蛋白家族成员6(KIF6)，6号染色体上的RefSeqGene
其他代表性AAV ITR序列
如同SEQ ID NOs:1、2和3，本文进一步提供了AAV2 ITR的代表性序列。线–末端解析位点(trs)；实线下划线–B/B'和C/C'茎。
SEQ ID NO:28AAV2 ITR“外翻”构象异构体核酸序列
B/B'和C/C'茎从5'至3'的取向：B->B'->C->C'
SEQ ID NO:29AAV2 ITR“外翻”构象异构体核酸序列
B/B'和C/C'茎从5'至3'的取向：rB’->rB->rC’->rC。“r”代表B/B’和C/C’茎的反向序列。
SEQ ID NO:30AAV2 ITR“内翻”构象异构体核酸序列
B/B'和C/C'茎从5'至3'的取向：C->C’->B->B’
SEQ ID NO:31AAV2 ITR“内翻”构象异构体核酸序列
B/B'和C/C'茎从5'至3'的取向：rC’->rC->rB’->rB。“r”代表B/B’和C/C’茎的反向序列。
AAV2和其他AAV血清型的其他代表性ITR序列是本领域已知的。此类序列的实例可以至少在以下文献中找到：国际公布号WO 2017/152149；Lusby等人(1980)J Virol34:402–409；Berns(2020)Human Gene Therapy,31:518-523；Samulski等人(2020)Human GeneTherapy,31:151-162；以及Tyson等人(1990)J theor Biol 144:155-169；其各自以引用方式并入本文。
功能性AAV ITR含有的核酸序列包含(i)p5 Rep蛋白的结合位点，(ii)切口位点(trs)序列，和(iii)由如图1A所示的间断回文序列形成的能量稳定的二级结构。
普通技术人员应了解，AAV ITR序列可以是可变但功能等同的，因为所述序列保留了功能方面：p5 Rep蛋白的结合位点、trs序列和由间断回文序列形成的二级结构。值得注意的是，出于上述原因，包含互补、反向或反向互补的功能序列的AAV ITR序列具有相同的功能。
原细小病毒和四细小病毒ITR序列
与AAV ITR相似，功能性原细小病毒或四细小病毒ITR含有的核酸序列包含(i)NS蛋白(Rep)的结合位点、(ii)切口位点(TR)序列和(iii)由间断回文序列形成的能量稳定的二级结构。代表性序列是本领域已知的。
普通技术人员知道，原细小病毒或四细小病毒ITR序列可以是可变但功能等同的，因为这些序列保留了以下功能方面：NS蛋白的结合位点、trs序列和由间断回文序列形成的二级结构。值得注意的是，由于上述原因，包含互补、反向或反向互补的功能序列的原细小病毒或四细小病毒ITR序列具有相同的功能。
上文包括cDNA、ssDNA和RNA核酸分子(例如，用尿苷替换的胸苷)，编码所编码蛋白质的直向同源物或变体的核酸分子，以及包含在其全长上与上文列出的任何SEQ ID NO的核酸序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高同一性的核酸序列的核酸序列，或其部分。此类核酸分子可以具有如本文进一步描述的全长核酸的功能。
上文包括蛋白质的直向同源物或变体，以及包含在其全长上与上文列出的任何SEQ ID NO的氨基酸序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更大同一性的氨基酸序列的多肽分子，或其部分。此类多肽可具有如本文进一步描述的全长多肽的功能。
脉冲式基因表达和可调基因表达
在某些方面，本公开的重组病毒体、药物组合物和/或方法利用了脉冲式基因表达和/或可调基因表达。如本文所用，可调基因表达允许随意调控转基因表达，例如使用小分子或寡核苷酸(例如，分别为四环素或反义寡核苷酸(ASO或AON))来开启或关闭转基因的表达。虽然可调基因表达通常是使用诱导型启动子或阻抑型启动子实现的，但可调调控旨在包括转录之外的基因表达的调控。
因此，可调基因表达旨在涵盖转录、转录后、翻译和/或翻译后水平的时间调控。可调表达与基因表达的空间控制相容。例如，可以通过将转基因置于组织特异性启动子下，然后与介导时间控制的表达调节剂(例如，四环素或ASO)组合来促进转基因的空间控制。
脉冲式基因表达是指以规则间隔开启和关闭转基因的产生。任何可调基因表达系统都可以用于脉冲式基因表达。此外，本文预期本文所述的任何基因表达的调节可以与脉冲式基因表达组合使用。
脉冲式基因表达对于基因疗法的成功非常重要。获得生理和长期蛋白质表达水平仍是基因疗法应用中的主要挑战。转基因的高水平表达可以在治疗后几个月诱导ER应激和未折叠蛋白反应，从而导致促炎状态和细胞死亡，危及疗法的益处。脉冲式转基因表达策略(PTES)可以使靶细胞免于过表达压力，并允许转基因长期表达，而不会使表达随着时间逐渐减少。此外，脉冲式表达和/或可调表达可以提高例如转基因编码的蛋白质的生产效率和/或稳定性。
在一些实施方案中，本文所述的PTES是可调表达系统，其中默认状态是关闭的，直到试剂开启表达或解除表达抑制，从而允许校准剂量以满足患者的特定需求，提供更大的安全性和长期益处。脉冲的时间可以由所关注的蛋白质的初始血清水平(t0)和半衰期(t1/2)来确定(参见实施例11)。
示例性可调表达系统
四环素控制的操纵子系统
细菌调控元件，大肠杆菌的Tn10特异性四环素抗性操纵子，可用于调控基因表达。例如，该系统有三种示例性构型：(1)基于阻遏的构型，其中Tet操纵子(TetO)插入组成型启动子与所关注基因之间，并且其中Tet阻遏子(TetR)与操纵子的结合抑制下游基因表达。在这个系统中，四环素的添加导致TetR和TetO之间的缔合的破坏，从而触发TetO依赖性基因表达。(2)Tet-off构型，其中串联TetO序列位于最小组成型启动子上游，其后是所关注基因的cDNA。在此，由TetR和VP16(tTA)组成的嵌合蛋白是来源于1型单纯疱疹病毒的真核反式活化因子，被转化为转录活化因子，并且表达质粒与操纵子质粒一起被转染。因此，用四环素培养细胞关闭了外源基因的表达，而去除四环素则打开了所述表达。(3)Tet-on构型，其中当生长培养基中添加四环素时，外源基因发生表达。尽管四环素在调控TetO依赖性基因表达所需的低浓度下对哺乳动物细胞无毒，但它的持续存在可能不是所希望的。因此，通过tTA的随机诱变，开发了具有四个氨基酸取代的突变体tTA，称为rtTA。与tTA不同，rtTA在四环素存在下与TetO序列结合，从而活化沉默的最小启动子。
Cumate控制的操纵子系统
cumate控制的操纵子来源于恶臭假单胞菌中的p-cmt操纵子和p-cym操纵子。相应阻遏物包含N-末端DNA结合结构域，识别启动子与对伞花烃降解途径中第一基因的起点之间的不完全重复。类似于四环素控制的操纵子系统，cumate操纵子(CuO)及其阻遏物(CymR)可以被工程化为三种构型：(1)阻遏物构型，其通过将CuO置于组成型启动子的下游来实现，其中CymR与CuO的结合有效地抑制下游基因表达。添加cumate来释放CymR，从而触发下游基因表达。(2)活化因子构型，其中嵌合分子(cTA)通过CymR和VP16的融合来形成。在该构型中，最小启动子被置于多聚化操纵子结合位点(6xCuO)下游。(3)反向活化子构型，在随机诱变和筛选后，产生了在添加cumate后与CuO结合的cTA突变体(rcTA)。在这种构型中，添加cumate来触发下游基因的表达。
基于蛋白质-蛋白质相互作用的嵌合系统
1.通过控制FKBP12和mTOR之间的相互作用诱导靶基因
雷帕霉素及其类似物FK506与胞质蛋白FKBP12结合。该复合物进一步结合mTOR，从而形成三结合复合物。因此，将FKBP12和mTOR分别与ZFHD1的DNA结合结构域和NF-κB p65蛋白的活化结构域融合，桥接两个结构域，以雷帕霉素依赖性方式驱动所关注基因的表达。由于FK506和雷帕霉素的免疫抑制和细胞周期抑制作用，开发了一种新的合成化合物FKCsA，它是FK506和环孢菌素A(与蛋白质亲环蛋白复合的免疫抑制剂)的异二聚体，并且显示出既没有毒性也没有免疫抑制作用。为了触发基因表达，向细胞中添加FKCsA使FKBP12与Gal4DNA结合结构域(Gal4DBD)融合，并使亲环蛋白与VP16融合，从而活化上游活化序列(UAS、Gal4DBD结合位点)下游的所关注基因的表达。
2.通过控制PYL1和ABI1之间的相互作用诱导靶基因
脱落酸(ABA)调控的两种植物蛋白之间的相互作用用于以时间和数量的方式调控哺乳动物细胞中的基因表达。这两种蛋白是PYL1(脱落酸受体)和ABI1(蛋白磷酸酶2C56)，它们是植物应激反应和发育决策所需的ABA信号传导途径的重要参与者。根据PYL1-ABA-ABI1复合物的晶体结构，选择PYL1(氨基酸33至209)和ABI1(氨基酸126至423)的相互作用互补表面用于嵌合蛋白构建。类似地，Gal4DBD与ABI1融合，并且VP16与PYL1融合。因此，在将此ABA活化因子盒和UAS驱动的报告基因转染进哺乳动物细胞后，ABA显著诱导了报告基因的产生。与雷帕霉素系统相比，ABA系统具有两个引人注目的优势：首先，ABA存在于许多含有植物提取物和油的食物中，其无毒性得到了环境保护局(EPA)的广泛评估的支持，其次，由于ABA信号传导途径不存在于哺乳动物细胞中，因此不应该存在如雷帕霉素系统中的竞争性内源结合蛋白。为了进一步避免ABI1对可能的意外底物的任何催化，将对其磷酸酶活性至关重要的突变引入到嵌合蛋白中。
3.光敏蛋白质-蛋白质相互作用对靶基因的诱导
通过利用光诱导的蛋白质-蛋白质相互作用，开发了两种光可切换的转基因系统。第一种光可切换的转基因系统是在真菌昼夜节律的分子基础上得出的。Vivid(VVD)为来自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的光感受器和含光-氧-电压(LOV)结构域的蛋白质，在蓝光活化时形成快速交换的二聚体。因此，由VVD和Gal4残基1-65组成的嵌合蛋白在蓝光照射下二聚化并成为转录活化因子，而活性二聚体在蓝光不存在时解离。这意味着UAS下游报告基因的表达可以利用蓝光以时空方式开启和关闭。此外，VVD的诱变优化进一步将背景表达降低到最低水平，使得所述系统更加可行。另一种光可切换的转基因系统(光可活化(PA)-Tet-OFF/ON)利用了拟南芥来源的蓝光响应性异二聚体的形成，其由隐花色素2(Cry2)光感受器和隐花色素相互作用的碱性螺旋-环-螺旋1(CIB1)组成。Cry2的N端部分的光解酶同源区(PHR)是通过非共价键与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合的发色团结合结构域。CIB1以蓝光依赖性方式与Cry2相互作用。因此，为了制备诱导型表达系统，将PHR与p65的转录活化结构域融合，并将CIB1与TetR的DNA结合结构域、二聚化结构域和四环素结合结构域(残基1-206)融合。因此，报告基因可以在蓝光照射下开启，而关闭可以两种方式通过缺少蓝光或者添加四环素来实现。同时，建立了四环素不敏感突变H100Y，使其完全依赖于照射。应用相同的嵌合结构，但是用rtTA代替TetR，报告基因可以用蓝光照射或四环素打开，并且通过缺少蓝光或去除四环素来关闭。通常，光可转换的转基因系统的两个优势压倒了所有其他系统。一个优点是它们快速的开关周期。由于昼夜节律的性质，上述两种蛋白质-蛋白质相互作用是动态的，导致快速反应和更新。即使是1-2分钟的短脉冲光也足以诱导荧光素酶表达，已显示荧光素酶表达在1.1小时后达到峰值，并在3h后降至背景水平。另一个优势是精准的空间感应。在受限区域或细胞群体内的照射可以用先进照射源来实现，通过所述照射源可以在某些所关注的细胞或亚细胞区域中选择性地诱导报告基因的表达。这些独特的特征不仅将极大地促进未来的细胞-细胞行为研究，而且为临床基因疗法提供了巨大的潜力。
4.他莫昔芬控制的系统
他莫昔芬诱导系统是最具特征的“可逆开关”模型之一，具有许多有益的特征(例如Whitfield等人(2015)Cold Spring Harb Protoc.2015(3):227-234综述)。在该系统中，哺乳动物雌激素受体的激素结合结构域被用作异源调控结构域。配体结合后，受体从其抑制性复合物中释放并且融合蛋白变成具有功能的。例如，雌激素受体(ER)的配体结合结构域(LBD)可以与转基因融合，所述转基因的产物是可以被抗雌激素他莫昔芬或其衍生物4-OH他莫昔芬(4-OH-TAM)活化的嵌合蛋白。
该系统已与重组酶组合使用，以产生修饰基因组的可调控重组酶。例如，可以使用单个或两个质粒系统来实现诱导型基因表达。第一个成功的案例是在小鼠胚胎细胞中完成的。两个质粒一起转染。一个是Cre-ER组成型表达质粒，另一个含有侧接LoxP的基因诱捕序列，随后为β-半乳糖苷酶(LacZ)开放阅读框。因此，仅当Cre-loxP介导的重组被触发并且基因诱捕序列被切除时，LacZ的表达才能恢复。通过这些方法，报告基因不仅可以在未分化的胚胎干细胞和拟胚体中被诱导，而且可以在10天龄的嵌合胎儿的所有组织或特定分化的成人组织中被诱导。在另一个实例中，为了在幼仓鼠肾(BHK)细胞中诱导增强的绿色荧光蛋白(EGFP)表达并简化质粒构建，将侧接LoxP位点的Cre-ER cDNA插入到磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和EGFP编码序列之间。在该系统中，Cre-ER充当基因诱捕来阻断没有4-OH-TAM的EGFP的转录。4-OH-TAM对重组酶活性的激活使Cre-ER盒熔化，并恢复由PGK启动子驱动的EGFP表达。为了排除内源性类固醇所发挥的作用，主要利用三种不同的ER：(1)具有G525R突变的小鼠ERTM、(2)具有G521R突变的人ERT和(3)含有三种突变G400V/M543/L544A的人ERT2。
5.核糖开关可调控的表达系统
核糖开关可调控的表达系统利用与锤头状核酶(适体核酶)连接的细菌来源的RNA适体。适体充当整个装置的分子传感器和换能器，而核酶通过构象变化和mRNA切割来响应于信号。例如，革兰氏阳性菌的适体核酶(aptazyme)可以直接感测过量的葡糖胺-6-磷酸(GlcN6P)并切割glms基因的mRNA，其蛋白产物是将果糖-6-磷酸(Fru6P)和谷氨酰胺转化为GlcN6P的酶。这些适体核酶对四环素、茶碱、鸟嘌呤等有反应，被工程化以敲低并过表达所关注基因(如例如Yokobayashi等人(2019)Curr Opin Chem Biol 52:72-78所综述)。
6.ASO(反义寡核苷酸)调控表达系统
ASO可以与DNA或RNA结合。ASO已证明在RNA水平上的有效基因调控作用，活化RISC复合物并降解mRNA，或者干扰顺式作用元件的识别。ASO通常被制成脂质纳米粒子，其可有效转染细胞。ASO用于“敲低”应用、功能获得(即显性阴性)、转录物或纯合隐性疾病。在其中ASO对来自突变等位基因的转录物不具有特异性的由显性负突变引起的疾病例如亨廷顿氏病(Huntington’s disease)和其他聚谷氨酰胺扩张疾病中，正常细胞功能的恢复可以通过使用载体递送的转基因的基因置换来实现，所述转基因具有减少与外源性ASO的序列互补性的替代性同义密码子。因此，ASO耗尽了内源性等位基因的转录物，但载体驱动的转录物不受影响。
如图11所示，ASO可以调控剪接以负向或正向调控基因表达(也参见Havens和Hastings(2016)Nucleic Acids Research 44:6549-6563)。图11的实施例I显示，ASO(反义寡核苷酸ASO或AON)可以负向调控转录后的基因表达。没有ASO，主要转录物被剪接成可翻译的mRNA。在内含子的3’末端/外显子2的5’末端添加与剪接受体互补的ASO(红线)会干扰剪接。因此，在ASO存在下，内含子保留在转录物中。包含内含子的该未加工RNA是不可翻译的或者在翻译后产生无功能蛋白质。
图11的实施例II也说明ASO可以积极影响转录后的基因表达。初级转录物(左)含有4个外显子：外显子1、外显子3和外显子4编码治疗性蛋白质，并且外显子2含有无义突变或框外突变(OOF)。这种外显子2可以被工程化成任何转基因。在没有ASO的情况下，转录物被加工成包含4个外显子，即保留具有无义突变或OOF突变的外显子2的成熟mRNA。因此，所得mRNA翻译成截短的或无功能的蛋白质。相比之下，ASO的添加干扰剪接，并且成熟mRNA由外显子1、外显子3和外显子4组成，即具有无义突变或OOF突变的外显子2被剪接掉。因此，在默认状态(无ASO)，不产生治疗性蛋白质。仅在添加ASO后，才产生治疗性蛋白质，从而产生正调控。
这些方法允许敲低组成型活性转基因表达，即默认开启。在一些实施方案中，默认开启状态是优选的。在其他实施方案中，默认关闭条件是优选的。
血友病A的示例性脉动式基因表达
在某些方面，本文提供的重组病毒体、药物组合物和方法使用脉冲式基因表达对患有血友病A的受试者进行基因疗法。在一些实施方案中，使用ASO调控的表达系统将编码人凝血因子VIII(FVIII)的基因转导至患有血友病A的受试者的肝细胞中。在一些实施方案中，使用脉冲式基因表达(编码FVIII的转基因以特定间隔开启和关闭)来调控产生的FVIII的量(参见实施例11)。编码FVIII或其活性片段(例如，其B结构域缺失)的转基因的递送和调控、本文所述的组合物和方法解决了长期感觉到的医学需要，对此仍无解决方案。
在2020年，FDA没有批准Valoctocogene Roxaparvovec(或BMN270)作为血友病A(HemA)治疗的Biomarin生物制品许可申请(BLA)。重组腺相关病毒5型(rAAV5)将人凝血因子VIII(FVIII)基因的衍生物递送至HemA患者的肝脏。在较高剂量下，FVIII以等于或高于生理水平的水平被表达并分泌到患者的循环中，从而有效地“治愈”所治疗的患者。然而，在三年随访期间，长期表达水平每年下降0.5至0.33。虽然FVIII表达维持在临床上有益的水平下，但FDA担心如果表达继续以同样的速度下降，患者会恢复到他们的血友病表型。对于表达递减模式没有明确的解释：以前对血友病B型的临床研究确定FIX表达丧失主要归因于由加工的AAV衣壳抗原引起的急性炎症。然而，预防性类固醇治疗减弱或消除了衣壳免疫反应，并且现在是肝脏定向rAAV治疗的常规方法。本文考虑了造成FVIII表达丧失的几种可能的解释。
FVIII已是难以在微生物或真核生物表达系统中产生的重组蛋白。FVIII的“B结构域”缺失形式的开发减小开放阅读框的大小，并且提高表达水平。然而，FVIII的表达水平仍明显低于其他蛋白质。为了克服这些低水平，Biomarin在临床研究中增加了载体剂量。用6E+13载体颗粒(称为载体基因组，或vg)/kg治疗患者。基于大型动物模型，一小部分肝细胞摄取rAAV5-FVIII(用其转导)，并且由于大量的vg/细胞，然后表达相对大量的FVIII。FVIII表达的代谢需求可能破坏肝细胞蛋白表达的正常需求。正常参与蛋白质折叠和分泌的肝细胞隔室可能因FVIII而充血。产生FVIII的内皮细胞可能专门用于此活性，并在高度调控的天然FVIII启动子的转录控制下，由单一X染色体上的等位基因产生FVIII。
因此，为了防止编码FVIII的转基因的表达逐渐减少，转基因以规则的间隔打开和关闭，以实现长期功效。脉冲的时间基于FVIII蛋白的血清水平和半衰期来确定(详情参见实施例11)。对于用于血友病A型的预防或治疗的FVIII，理想状态是关闭，直到暂时活化。ASO可用于通过干扰初级转录物中的顺式作用元件来引发负效应或正效应，从而为脉冲式基因表达的调控提供灵活性。
预防或治疗疾病的方法
在某些方面，本文提供了使用本文所述的重组病毒体或药物组合物预防或治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开的重组病毒体向受试者瞬时提供所关注的核酸(例如，编码治疗性蛋白质或其片段的核酸)，例如由重组病毒体转导的核酸最终在表达一定时间后丢失。在优选的实施方案中，由重组病毒体转导的核酸在细胞内稳定整合。
在一些实施方案中，本文提供了预防或治疗疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本公开的重组病毒体或药物组合物。在一些实施方案中，核酸编码蛋白质。在一些实施方案中，核酸降低或消除内源性基因的表达。在一些实施方案中，本文提供了预防或治疗疾病的方法，其包括：(a)向有需要的受试者施用有效量的本文所述的重组病毒体，所述重组病毒体包含增加或恢复内源性表达异常地低于健康受试者的表达的基因的表达的核酸；或(b)向有需要的受试者施用有效量的本文所述病毒体，所述病毒体包含降低或消除内源表达异常地高于健康受试者的表达的基因的表达的核酸。
在一些实施方案中，本文提供了预防或治疗疾病的方法，其包括：(a)从患有疾病的受试者获得大量细胞，(b)用本文所述的病毒体转导细胞，任选地进一步选择或筛选转导细胞，和(c)向受试者施用有效量的转导细胞。在一些实施方案中，细胞对于受试者是自体的。在其他实施方案中，细胞对受试者是同种异体的。在体外或离体制备转导细胞具有优势。首先，在向患者施用转基因之前，可以验证转基因在靶细胞基因组中的存在和位置，从而避免干扰细胞功能或脱靶效应。这提高了安全性，即使不使用GSH。其次，转导细胞可以在没有重组病毒体的情况下向有需要的受试者施用。这消除了引发免疫反应或诱导使重组病毒体失活的中和抗体的任何顾虑。因此，转导细胞可以被安全地再给药或剂量可以在没有任何副作用的情况下滴定。
在一些实施方案中，通过血管内、脑内、肠胃外、腹膜内、静脉内、硬膜外、椎管内、胸骨内、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心内、肌内、鼻内、肺内、皮肤移植或口服施用来施用本公开的至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞。
在一些实施方案中，所述疾病选自内皮功能障碍、囊性纤维化、心血管疾病、肾病、癌症、血红蛋白病、贫血、血友病、骨髓增殖性疾病、凝血病、镰状细胞病、α-地中海贫血、β-地中海贫血、血友病(例如血友病A)、范可尼贫血(Fanconi anemia)、家族性肝内胆汁淤积、大疱性表皮松解症、法布里病、戈谢病、尼曼-匹克病(Nieman-Pick)A、尼曼-匹克病B、GM1神经节苷脂沉积症、粘多糖贮积症(MPS)I(赫勒综合征、谢伊综合征、赫勒/谢伊综合征)、MPSII(Hunter),MPS VI(马-拉米综合征)、血液癌症、血色沉着病、遗传性血色沉着病、幼年型血色沉着病、肝硬化、肝细胞癌、胰腺炎、糖尿病、心肌病、关节炎、性腺机能减退、心脏病、心脏病发作、甲状腺功能减退、葡萄糖不耐受、关节病、肝纤维化、威尔逊氏病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、泰-萨二氏病、神经退行性病症、1型脊髓性肌萎缩症、亨廷顿氏病、卡纳万氏病(Canavan’s disease)、溶酶体贮积症、类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病关节炎、青少年慢性关节炎、银屑病和强直性脊柱炎以及自身免疫疾病、神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、共济失调)、炎性疾病、炎症性肠病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化、慢性阻塞性肺病/COPD、肺纤维化、干燥综合征、高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、胰岛素抵抗性糖尿病(例如，门登霍尔综合征、沃纳综合征、矮怪病和脂肪缺乏性糖尿病)、血脂异常、高脂血症、低密度脂蛋白(LDL)升高、高密度脂蛋白(HDL)降低、甘油三酯升高、代谢综合征、肝病、肾病、心血管疾病、局部缺血、中风、再灌注期间的并发症、肌肉退化、萎缩、衰老症状(例如，肌肉萎缩、虚弱、代谢障碍、低度炎症、动脉粥样硬化、中风、年龄相关性痴呆和散发形式的阿尔茨海默氏病、癌前状态和包括抑郁症在内的精神疾病)、脊髓损伤、动脉粥样硬化、传染病(例如，细菌、真菌、病毒)、AIDS、结核病、胚胎发育缺陷、不育症、溶酶体贮积病、活化因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷脂贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸病、达农病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病(I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积症(婴儿型、晚期婴儿型/青少年型和成人型/慢性)、亨特综合征(MPS II)、I-细胞病/粘脂贮积症II、婴儿游离唾液酸贮积症(ISSD)、青少年己糖胺酶A缺乏症、克拉贝病、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、赫勒综合征、谢伊综合征、赫-谢二氏综合征、桑菲里波综合征、A型和B型莫尔基奥病(Morquio)、马-拉米综合征、斯莱综合征、粘脂贮积症、多发性硫酸盐缺乏症、神经元蜡样脂褐质沉积症、CLN6病、詹-比二氏病、庞贝病、致密性成骨不全症、桑德霍夫病、辛德勒病和沃尔曼病。
在一些实施方案中，本文提供了预防或治疗血红蛋白病的方法，其包括：(a)向有需要的受试者施用有效量的包含编码血红蛋白亚基的核酸的本文所述的病毒体，或(b)从有需要的受试者获得红系细胞或骨髓细胞，用包含编码血红蛋白亚基的核酸的本文所述的病毒体转导细胞，任选地进一步选择或筛选转导细胞；以及向受试者施用有效量的细胞。在一些实施方案中，血红蛋白病是β-地中海贫血或镰状细胞病。
在某些方面，本文提供了使用至少一种重组病毒体或药物组合物预防或治疗疾病的方法，所述重组病毒体或药物组合物包含原细小病毒或其基因型变体的至少一种衣壳蛋白或其变体。
犬细小病毒(CPV)是研究最多的原细小病毒种之一。CPV感染野狗和家养狗。CPV的基因组大小为约5.3kb，比AAV大600bp。大基因组使得CPV对于在人细胞中转移不能容纳在AAV源性载体中的基因特别有吸引力。因为CPV通常不感染人，所以在人群中不存在针对CPV的预先存在的体液免疫，即，人对于CPV衣壳抗原呈血清阴性。这与AAV形成鲜明对比；人对AAV衣壳抗原呈血清阳性，使得中和性AAV抗体的存在排除了大部分符合AAV基因疗法条件的患者。因此，人中缺乏针对CPV抗原的中和抗体使得CPV病毒颗粒或包含CPV的至少一种衣壳蛋白或其变体的重组病毒体特别可用于高效基因疗法应用，以预防或治疗不能用AAV源性载体有效治疗的不同人遗传疾病。CPV使用犬转铁蛋白受体(TfR或CD71)作为细胞受体进入细胞，所述犬转铁蛋白受体是在犬宿主细胞外膜中表达的蛋白质(Goodman,Lyi等人2010)。CPV也可以与人TfR对应物相互作用，从而内化和转导人细胞。此外，如上所述，CPV的VP2衣壳蛋白可以被工程化成包含一个或多个突变，所述突变改变靶细胞相互作用的嗜性和特异性/亲和力，并最终改变靶细胞转导的效率。
如本文所述，原细小病毒通过其与靶细胞上表达的转铁蛋白受体(TfR)的相互作用来转导细胞。TfR或CD71在血脑屏障(BBB)的主要成分脑微血管内皮细胞(BMVEC)中表达(Navone,Marfia等人2013)。BBB是可溶性物质和细胞性物质从血液进入大脑的主要限制。CD71已成为驱动受体特异性转胞吞并将大分子诸如抗体递送至脑实质的替代物。因此，原细小病毒(例如，CPV)可利用CD71的用途，通过全身施用易位至大脑并转导脑细胞，以预防或治疗不同的神经退行性病症和神经肌肉病症，所述病症包括但不限于1型脊髓性肌萎缩症、亨廷顿氏病、卡纳万氏病和溶酶体贮积症。TfR或CD71也在分化早期的红系祖细胞以及B淋巴母细胞中高度表达。在分化为淋巴系或红系细胞之前，CD71表达与祖细胞中的CD34表达短暂重叠。因此，原细小病毒(例如，CPV)可以转导干细胞，并在从干细胞分化后用于T细胞、B细胞或NK细胞源性疗法。这些用途中的一些用于癌症疗法、抗微生物疗法或自身免疫相关性疗法。在HSC分化为骨髓祖细胞谱系后，CD71/TfR在红细胞生成期间在嗜碱性地方性伯基特淋巴瘤(EBL)、多染性成红细胞和正染性成红细胞中高度表达，之后进行产生无核红细胞的最后步骤，因此原细小病毒(例如CPV)载体可用于通过表达血红蛋白基因的抗镰状细胞形式来治疗或预防非恶性血红蛋白病，例如镰状细胞病。
在某些方面，本文提供了使用至少一种重组病毒体预防或治疗疾病的方法，所述重组病毒体包含布法病毒、库塔病毒或图萨病毒的至少一种衣壳蛋白或其变体。布法病毒、库塔病毒、图萨病毒或包含任一种所述病毒的至少一种衣壳蛋白或其变体的重组病毒体对于胃肠病症和其他靶组织具有广泛的应用。例如，已从患有皮肤T细胞淋巴瘤和黑素瘤的患者的皮肤样品中分离出库塔病毒，显示出对T细胞和B细胞的嗜性。此种嗜性使得库塔病毒对于淋巴祖细胞中的基因转移应用和在以下中的后续应用具有吸引力：(i)分化的T细胞诸如CAR-T和相关癌症疗法，或(ii)分化的B细胞及其表达针对入侵病原体、肿瘤细胞(例如肿瘤抗原或新抗原)或慢性自身免疫疾病的治疗性人抗体的应用。
在一些实施方案中，至少一种重组病毒体包含库塔病毒的衣壳蛋白或其变体。在一些实施方案中，至少一种重组病毒体或药物组合物靶向T细胞、B细胞和/或淋巴祖细胞。在一些实施方案中，至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗癌症。
在某些方面，本文提供了使用至少一种重组病毒体预防或治疗疾病的方法，所述重组病毒体包含四细小病毒(例如人细小病毒4(PARV4))的至少一种衣壳蛋白或其变体。四细小病毒属含有人细小病毒4(PARV4)、猪细小病毒2、黄毛果蝠细小病毒、牦牛细小病毒、猪香港病毒和绵羊香港病毒。人细小病毒4(PARV4)最初是在处于通过注射药物使用而感染HIV的风险下的人的血浆中检测到的(Jones,Kapoor等人2005)。PARV4的基因组为约5.3Kb，比AAV大900个核苷酸。PARV4的衣壳高度耐高温，这使其成为非常通用且稳定的病毒载体。PARV4在某些地理区域流行，但发现在其他地方仅限于某些高危群体，诸如在注射药物的个人情况下具有HIV、HBV或HCV感染的患者(PWID)以及具有多次输血史的那些患者。目前尚不确定PARV4实际上是导致观察到的疾病，或者是在高度暴露的高危(病毒感染)群体中检测到的非致病性机会性病毒。在世界不同地区，普通群体中PARV4的血清阳性率为0％至25％不等(Sharp,Lail等人2009)。尽管据报告，在世界不同地区，患有慢性病毒感染的患者中的抗PARV4抗体流行率在15-35％之间，但来自其他西方国家的健康个体中的流行率已显示低于1％。对英国献血者进行的PARV4 IgG筛查确定血清阳性率为4.8％，显著低于灵长类AAV抗原的血清阳性率(Matthews,Sharp等人2017)。这突出了使用PARV4作为基因疗法载体的主要益处之一。在包括美国在内的几个西方国家群体中，中和抗体血清阳性率降低，以及对特定靶组织的嗜性，使其成为通用的基因疗法载体。PARV4的嗜性和潜伏位置尚未完全了解，但令人信服的数据表明，骨髓、呼吸道、肝脏和肠道代表了病毒复制的潜在位置，并且可能是潜伏或持续感染个体中病毒的储库。因此，PARV4载体特别可用于递送治疗性基因以预防或治疗广泛的人疾病，包括血液疾病。
在一些实施方案中，至少一种重组病毒体或药物组合物包含编码选自以下的蛋白质或其片段的核酸：血红蛋白基因(HBA1、HBA2、HBB、HBG1、HBG2、HBD、HBE1和/或HBZ)、α-血红蛋白稳定蛋白(AHSP)、凝血因子VIII、凝血因子IX、冯·维勒布兰德因子、肌营养不良蛋白或截短的肌营养不良蛋白、微肌营养不良蛋白、抗肌萎缩蛋白相关蛋白或截短的抗肌萎缩蛋白相关蛋白、微抗肌萎缩蛋白相关蛋白、usherin(USH2A)、CEP290、INS、F8或其片段(例如编码B结构域缺失多肽(例如VIII SQ、p-VIII)的片段)以及囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)。
在一些实施方案中，至少一种重组病毒体或药物组合物转导(a)CD34+干细胞，任选离体转导；(b)间充质干细胞，任选地离体转导；(c)肝脏细胞，(d)小肠细胞，和/或(e)肺细胞。
例如，在一些实施方案中，包含四细小病毒(例如PARV4)的至少一种衣壳蛋白的重组病毒体用于CD34+干细胞中的离体修饰(例如，递送治疗性基因和/或下调疾病相关突变基因的剂)。在一些实施方案中，包含四细小病毒(例如PARV4)的至少一种衣壳蛋白的重组病毒体用于间充质干细胞中的离体修饰(例如，递送治疗性基因和/或下调疾病相关突变基因的剂)。在一些实施方案中，包含四细小病毒(例如PARV4)的至少一种衣壳蛋白的重组病毒体优选地通过口服施用递送至小肠。在一些实施方案中，通过全身静脉内施用向肝脏细胞施用重组病毒体。在一些实施方案中，优选通过肝动脉或门静脉向肝脏细胞施用重组病毒体。
在一些实施方案中，至少一种重组病毒体或药物组合物包含编码以下的核酸：：(a)CFTR或其片段，(b)至少一种靶向CFTR的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，(c)靶向CFTR的内源性突变形式的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。在一些实施方案中，至少一种重组病毒体或药物组合物通过鼻内或肺内施用递送至肺。在一些实施方案中，至少一种重组病毒体或药物组合物(a)增加CFTR或其片段的表达；和/或(b)降低所述转导细胞中CFTR的内源性突变形式的表达。在一些实施方案中，至少一种重组病毒体或药物组合物预防或治疗囊性纤维化。
在一些实施方案中，预防或治疗疾病的方法还包括再施用至少一个额外量的病毒体、药物组合物或转导细胞。在一些实施方案中，在施用初始有效量的病毒体、药物组合物或转导细胞后在治疗中减毒之后，再施用至少一个额外量。在一些实施方案中，至少一个额外量与初始有效量相同。在一些实施方案中，至少一个额外量大于初始有效量。在一些实施方案中，至少一个额外量小于初始有效量。在某些实施方案中，基于重组病毒体的内源基因和/或核酸的表达，增加或减少至少一个额外量。内源基因包括生物标记基因，其表达例如指示疾病的诊断和/或预后或与其相关。
在某些方面，预防或治疗疾病的方法还包括向受试者施用调节核酸表达的剂或使细胞与所述剂接触。在一些实施方案中，剂选自小分子、代谢物、寡核苷酸、核糖开关、肽、肽模拟物、激素、激素类似物和光。在一些实施方案中，剂选自四环素、cumate、他莫昔芬(tamoxifen)、雌激素和反义寡核苷酸(ASO)。在一些实施方案中，所述方法还包括以一定间隔再施用所述剂一次或多次。在一些实施方案中，剂的再施用导致核酸的脉冲式表达。在一些实施方案中，基于从核酸表达的蛋白质的血清浓度和/或半衰期，增加或减少间隔时间和/或剂的量。
在某些方面，本文还提供了调节细胞中(i)基因表达或(ii)蛋白质的功能和/或结构的方法，所述方法包括用本文所述的病毒体或药物组合物转导细胞，所述病毒体或药物组合物包含调节细胞中的基因表达或蛋白质的功能和/或结构的核酸。在一些实施方案中，此种核酸包含编码CRISPRi或CRISPRa剂的序列。在一些实施方案中，基因表达或蛋白质的功能和/或结构增加或恢复。在一些实施方案中，基因表达或蛋白质的功能和/或结构降低或消除。
示例性疾病
在某些方面，本文所述的方法、重组病毒体和/或药物组合物可用于预防和/或治疗各种疾病。
包含原细小病毒或四细小病毒的至少一种衣壳蛋白的重组病毒体和/或药物组合物可用于转导造血细胞、造血祖细胞、造血干细胞、红系细胞、巨核细胞、红系祖细胞(EPC)、CD34+细胞、CD36+细胞、间充质干细胞、神经细胞、肠细胞、肠干细胞、肠上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、肠上皮细胞、肝脏细胞(例如肝细胞、肝星状细胞(HSC)、库弗氏细胞(KC)、肝窦内皮细胞(LSEC))、脑微血管内皮细胞(BMVEC)、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、B淋巴母细胞、T细胞、B细胞、嗜碱性地方性伯基特淋巴瘤(EBL)、多染性成红细胞和/或正染性成红细胞。
此外，本文所述的方法、重组病毒体和/或药物组合物特别可用于在体内(例如，直接向受试者施用，例如通过病毒嗜性靶向特定组织)以及体外或离体(从受试者获得多个细胞，用重组病毒体转导所述细胞，以及向受试者施用有效数量的转导细胞)递送核酸(例如治疗性核酸)。
血色沉着病
口服施用的原细小病毒基因疗法载体的生物分布受肠上皮中TfR介导的转胞吞作用支配。基因疗法载体对肠道上皮屏障的易位可以扩大其生物分布。通过对如本文所述的原细小病毒衣壳(例如，VP2)的合理修饰，本发明涵盖使用此种工程化病毒载体，该病毒载体由于不能从肠上皮的管腔转胞吞到固有层而具有局限于或主要靶向肠上皮细胞的嗜性。使用此类工程化病毒体的基因疗法提供了预防或治疗肠上皮中的遗传性疾病诸如遗传性血色素沉着症的理想方法。
遗传性血色沉着病(HH)是常染色体隐性遗传病症，并且是白种人中最普遍的遗传病(疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Preventions)；World WideWeb at cdc.gov)。在美国估计有一百万人患有遗传性血色沉着病，超过了囊性纤维化和肌营养不良的患病率总和(Bacon,Powell等人1999)。HH的特征在于铁吸收失调。在HH患者中，铁吸收是有缺陷的，并且身体吸收过量的铁。高水平的细胞内铁沉积诱导了遗传毒性氧自由基的形成和脂质过氧化，这建立了导致许多器官慢性损伤的促炎性反应。所述疾病的临床特征是由于铁在肝脏、心脏和胰腺的实质细胞中持续积累数十年而产生的。在最严重的形式中，HH表现为肝硬化、肝细胞癌、糖尿病、性腺机能减退、心肌病、关节炎和皮肤色素沉着。肠绒毛中的肠上皮细胞介导铁从肠腔的顶端摄取；然后铁从细胞中输出到循环中。顶端二价金属转运蛋白1(DMT1)将铁从管腔转运到细胞中，而基底外侧膜结合转运蛋白即铁转运蛋白将铁从肠上皮细胞输出到循环中(Ezquer,Nunez等人2006)。HH患者表现出跨上皮铁摄取增加，这导致身体铁积累和后续慢性并发症(肝硬化、肝细胞癌、胰腺炎、心肌病、关节炎和糖尿病)。
遗传性血色沉着病最常见的原因是在6号染色体上鉴定的人稳态铁调控因子(HFE)基因的突变。HFE的突变导致几乎90％的HH病例。HFE基因编码主要组织相容性复合物MHC I类样分子。HFE与β2-微球蛋白结合，所述β2-微球蛋白决定其在质膜上的定位(Waheed,Parkkila等人1997)。对于与HH相关的HFE描述的主要突变是外显子4中的单个核苷酸改变，导致未加工的HFE蛋白的位置282(C282Y)的半胱氨酸氨基酸被酪氨酸取代(Feder,Gnirke等人1996)。这种突变影响其在高尔基体中的恰当翻译后加工，破坏其与β2-微球蛋白的相互作用及其随后在细胞膜中的定位。(Feder,Tsuchihashi等人1997，Waheed,Parkkila等人1997)。还报告了HFE基因中的第二突变，其中天冬氨酸部分替换了HFE蛋白位置63的组氨酸(H63D)(Gochee,Powell等人2002)。然后，突变和未折叠的蛋白在ER-高尔基网络中积累，诱导未折叠蛋白反应(UPR)的活化，从而加剧促炎性程序和疾病的后续结果(de Almeida和de Sousa 2008，Liu,Lee等人2011)。HFE协调肠细胞中铁输入和铁输出机制的活性，并且是参与肝脏中铁调素基因转录调控的多蛋白复合物的一部分。HFE功能的丧失也与铁摄取负向调控因子，即铁调素表达的急剧减少相关。因此，缺乏HFE或铁调素会导致膳食铁的摄入和在不同器官中的积累增加。
所述疾病的另一种更严重的形式是幼年型血色沉着病(JH)。此类型的血色沉着病是遗传的，并被描述为II型血色沉着病。根据受影响的基因，II型血色素沉着症分类为IIa型或IIb型。在IIa型和IIb型中，早期铁过载发作发生在30岁之前。其后果是严重的心脏病或心脏病发作、甲状腺功能减退、很少或没有月经或性腺功能减退。IIa型血色素沉着症由19号染色体的铁调素基因的常染色体隐性突变引起。
幼年型血色沉着病的特征在于通常在生命的第一个十年至第三个十年出现严重的铁过载。男性和女性受到同等影响。突出的临床特征包括低促性腺激素性功能减退症、心肌病、葡萄糖耐受不良和糖尿病、关节病和肝纤维化或肝硬化。肝细胞癌偶尔有报告，而心脏受累是发病率和死亡率的主要原因。
有趣的是，此疾病唯一被接受的治疗是中世纪的，并且涉及定期出血(放血)以减少铁负荷，铁负荷主要是通过与红细胞中的血红素分子非共价配位来携带的。目前，最初每周取出一个或两个单位的血液(500-1000ml)，每个单位含有200-250mg的铁，直到血清铁蛋白水平降低到低于50ng/ml，并且转铁蛋白饱和度下降到低于30％(需要2至3年)。然后强制进行攻击性较小的出血，但终身维持疗法，以保持转铁蛋白饱和度值低于50％并且血清铁蛋白水平低于100ng/ml(Wojcik,Speechley等人2002)。
用于不同病因的血色素沉着症的一种疗法是通过在肠上皮细胞中使用siRNA来抑制DMT1蛋白的合成，这显著抑制肠上皮细胞对顶端铁的摄取(Ezquer,Nunez等人2006)。最近显示二价金属转运蛋白DMT-1也转运铜离子(Arredondo等人,2003)，因此抑制DMT-1基因表达具有减少威尔逊氏病中的肝损伤的价值，所述威尔逊氏病是细胞铜输出减少的疾患。减少HH患者肠上皮细胞中不受控制的铁摄取将限制几个受影响器官中的铁积累。
另一种控制铁负荷的方法是通过抑制肠上皮细胞中铁转运蛋白基因的表达来减少基底外侧铁的输出。在此情况下，吸收的铁仅在肠上皮细胞内积累。此外，铁的积累应导致通过IRE/IRP机制进行的顶端DMT-1转运蛋白基因的表达减少，从而产生双重抑制作用。此外，任何积累的铁会由于肠上皮细胞的正常脱落而流失到肠腔中。
使用包含原细小病毒或四细小病毒的至少一种衣壳蛋白或其变体的重组病毒体在肠上皮细胞中表达野生型HFE，可以恢复HFE活性，并且还可以正向调节DMT-1和铁转运蛋白的表达，从而具有广泛的治疗作用。使用共表达和/或共施用野生型HFE和siRNA以使DMT-1沉默的一种或多种本文所述的重组病毒体的组合策略也可增强临床益处。
肽铁调素是铁代谢的关键性调控因子。它主要在肝脏中合成并作为20-25个氨基酸的肽分泌。铁调素基因的突变是幼年型血色沉着病的原因(Roetto,Papanikolaou等人2003)。HFE调节肝脏中铁调素的表达。铁调素负向调控来自网状内皮巨噬细胞和介导铁肠吸收的肠上皮细胞的铁释放(Nemeth,Tuttle等人2004，Nemeth,Roetto等人2005，Rivera,Liu等人2005)。使用本文所述的重组病毒体在肝脏中递送并表达铁调素可减少身体对铁的摄取，并减少与铁过载相关的毒性，从而预防所有形式的血色素沉着症。
遗传性血色素沉着症的主要特征之一(例如，由于缺乏功能性HFE蛋白)是肠上皮细胞中铁稳态所涉及的因子，诸如DMT-1、铁转运蛋白和/或转铁蛋白受体(TfR)的上调。如上所述，TfR或CD71是原细小病毒(例如，犬细小病毒)的细胞受体，其促进原细小病毒或包含其至少一种衣壳蛋白的重组病毒体的转导。因此，在患有遗传性血色素沉着症的受试者中TfR的上调提供了靶向和富集治疗性基因和/或剂的极好机会，所述治疗性基因和/或剂使用包含原细小病毒(例如，犬细小病毒)的至少一种衣壳蛋白或其变体的重组病毒体调节肠上皮细胞中铁稳态所涉及的各种蛋白质的表达。原细小病毒或包含其至少一种衣壳蛋白的重组病毒体的较大基因组大小另外提供了包装较大基因和/或用于基因疗法的剂以预防或治疗血色素沉着症的灵活性。
在某些方面，本文提供了使用至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗疾病的方法，所述重组病毒体、药物组合物或转导细胞包含编码以下的核酸：(a)铁调素或其片段和/或稳态铁调控因子(HFE)或其片段；(b)至少一种靶向DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)；(c)靶向DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
在一些实施方案中，所述片段是生物活性片段。
在一些实施方案中，向受试者施用至少一种重组病毒体或药物组合物，所述重组病毒体或药物组合物包含编码以下的核酸：
a)铁调素或其片段，其中向所述受试者静脉内施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肝细胞；
b)HFE或其片段，其中向所述受试者静脉内施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肝细胞；
c)HFE或其片段，其中向所述受试者口服施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肠上皮细胞；
d)至少一种靶向HFE的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，其中向所述受试者静脉内施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肝细胞；
e)至少一种靶向HFE的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，其中向所述受试者口服施用至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肠上皮细胞；
f)至少一种靶向DMT-1的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，其中向所述受试者口服施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肠上皮细胞；
g)至少一种靶向铁转运蛋白的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，其中向所述受试者口服施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述重组病毒体或药物组合物转导肠上皮细胞；或者
h)a)至g)中任一项的两种或多种的组合。
在一些实施方案中，所述方法包括b)至e)中任一者的两个或更多个的组合。
在一些实施方案中，重组病毒体或药物组合物a)增加转导细胞中HFE或其片段和/或铁调素或其片段的表达；和/或b)降低所述转导细胞中DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的表达。在一些实施方案中，至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗血色沉着病、遗传性血色沉着病、幼年型血色沉着病和/或威尔逊氏病。
炎症性肠病(IBD)
炎症性肠病(IBD)包括一系列涉及人消化道的慢性炎症的病症。IBD的最常见形式是溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。这些是特征在于慢性复发性肠道炎症的复杂的多因素病症。尽管病因学在很大程度上仍然未知，但最近的研究表明，遗传因素、环境、微生物群和自身免疫反应是发病机制中的促成因素(Hendrickson,Gokhale等人2002)。据估计，美国已有300万人被诊断患有IBD(万维网cdc.gov/ibd/data-statistics.htm)，其中每年诊断出70,000例新的克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。目前还没有治愈这些疼痛性疾病的方法，并且所述治疗代表估计每63亿美元的医疗保健财政负担(Limanskiy,Vyas等人。2019)。与IBD相关的多因素成分汇聚于促炎程序的活化，基本上由NFkB途径活化的基因介导。IBD期间诱导的介导IBD病理生物学的主要促炎性细胞因子是TNFα、IL-1β、IL-12和IL-6。鉴于不同的原细小病毒和四细小病毒源性病毒体对低pH的高抗性以及这些病毒载体转导人肠上皮细胞的能力，本公开的重组病毒体构成了调节各种细胞因子的表达和/或功能以及随后维持胃肠上皮屏障完整性的新型治疗方法。
在一些实施方案中，使用包含原细小病毒或四细小病毒的至少一种衣壳蛋白的重组病毒体或包含工程化衣壳蛋白的病毒体来表达TNFα受体的可溶形式、IL-6受体的可溶形式、IL-12受体的可溶形式和/或IL-1β受体的可溶形式。所述受体的这些可溶形式可以分泌到小肠固有层，在那里它们特异性中和配体(例如促炎性细胞因子)。
膜结合受体的可溶形式可以通过递送编码所述受体的可溶性分泌形式的基因来表达。例如，已知TNFα的17-kDa可溶性部分在TNFα转化酶(TACE；ADAM-17)蛋白切割26-kDaII型跨膜同种型之后从细胞中释放(Kriegler等人(1988)Cell 53:45-53)。因此，包含编码17-kDa部分(或细胞外结构域的任何所需部分，例如与待拮抗/中和的配体相互作用的部分)与信号肽(例如，IL-2信号肽；例如参见Ardestani等人(2013)Cancer Res.73:3938–3950)的融合物的基因的本公开的重组病毒体可在体内递送至有需要的受试者(例如，患有IBD或其他炎性病症的受试者)以在所述受试者中表达TNFα的可溶形式。或者，自体或同种异体细胞可在体外或离体用包含编码膜蛋白的分泌性可溶形式的基因的病毒体转导，并且所述细胞可被转移至有需要的受试者以治疗该受试者。类似策略可用于任何膜结合蛋白。
在某些方面，本文提供了至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞，其包含编码以下的核酸：(a)TNFα受体的可溶形式、IL-6受体的可溶形式、IL-12受体的可溶形式和/或IL-1β受体的可溶形式；(b)至少一种靶向TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体和/或IL-1β受体的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)；(c)靶向TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体和/或IL-1β受体的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
在一些实施方案中，所述至少一种重组病毒体或药物组合物a)增加转导细胞中TNFα受体的可溶形式、IL-6受体的可溶形式、IL-12受体的可溶形式或IL-1β受体的可溶形式的表达；和/或b)降低所述转导细胞中TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体或IL-1β受体的表达。
在一些实施方案中，所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病关节炎、幼年型慢性关节炎、银屑病和/或强直性脊柱炎。
因此，包含所述治疗基因和/或剂的本公开的重组病毒体调节受试者的慢性炎症，并通过降低T细胞、NK细胞和其他效应免疫细胞的活化提供治疗益处，并允许随后修复受损的上皮屏障。通过本文提供的组合策略可以进一步增强治疗益处。
自噬相关疾病
本公开的方法、重组病毒体和/或药物组合物可用于调节自噬-溶酶体途径的关键组分。自噬在分化和发育、细胞和组织稳态、蛋白质和细胞器质量控制、代谢、免疫以及预防衰老和各种疾病中起到至关重要的作用。自噬的大自噬形式(以下简称自噬)是进化上保守的溶酶体降解途径，控制细胞生物能学(通过使胞质组分循环)和胞质质量(通过消除蛋白质聚集体、受损细胞器、脂滴和胞内病原体)(Levine,Packer等人2015)。此外，独立于溶酶体降解，自噬机制可以部署在吞噬作用、凋亡尸体清除、分泌、胞吐、抗原呈递和炎症信号传导调控的过程中。由于广泛的细胞功能，自噬途径在预防衰老和某些癌症、感染、神经退行性病症、代谢性疾病、炎性疾病和肌肉疾病中起到关键作用(Levine,Packer等人2015)。
许多疾病与不期望的、潜在细胞毒性的细胞碎片，例如错误折叠的蛋白质聚集物、核酸和/或受损细胞器诸如线粒体的碎片的积聚相关。自噬还降解脂质，从而允许分解代谢利用脂肪酸，并对脂肪酸代谢疾病诸如神经节苷脂病，例如GM1、泰-萨二氏病产生深远影响。一些罕见的常染色体疾病诸如溶酶体贮积症，与未能降解积累的“细胞垃圾”相关，后者通常导致低水平但慢性的炎症程序的启动，具有多种破坏性后果，诸如组织损伤和癌症。
积累的细胞质物质，称为损伤相关分子模式(DAMP)，被认为是大量模式识别受体(PRR)的配体，包括炎症体蛋白的TLR 1-10、cGAS、IFI16、RIG-I、MDA5、NLRP家族。在感测外来分子和自身分子时，PRR诱导具有自分泌和旁分泌能力的多种信号传导级联，以执行基本的细胞过程，例如NFkB信号传导途径、IFN-I途径、IFN-II途径、IFN-III途径和自噬途径(包括AMPK、Beclin-I、PI3K途径)的活化。已提出了不同的事件来启动自噬程序，例如营养饥饿条件或运动。已知AMPK活化剂，诸如血糖调控药物二甲双胍，可活化自噬并延长实验动物的寿命。自噬活化的第一分子事件是通过不同的级联事件形成细胞内的、细胞溶质的双层膜结构(自噬体)，所述级联事件触发蛋白质，例如Atg蛋白质家族的聚集。自噬体包围存在于细胞中的DAMP和/或PAMP，这种现象被称为膜成核阶段。自噬途径的下一步是自噬体的延伸和关闭。最后，这种成熟且完全形成的自噬体与溶酶体融合，所述溶酶体在低pH环境中含有广泛作用的核酸酶和蛋白酶，从而形成自溶体，在自溶体中货物被降解成可溶的和无毒的组成组分，因此降低了DAMP的细胞质丰度。
在包括肝脏、中枢神经系统(CNS)或肠道在内的特定组织中诱导自噬可以极大地有益于患有大量不同慢性疾病的患者。因此，本文提供了至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞，其包含编码选自以下的蛋白质或其片段的核酸：IRGM、NOD2、ATG2B、ATG9、ATG5、ATG7、ATG16L1、BECN1、EI24/PIG8、TECPR2、WDR45/WIP14、CHMP2B、CHMP4B、Dynein、EPG5、HspB8、LAMP2、LC3bUVRAG、VCP/p97、ZFYVE26、PARK2/Parkin、PARK6/PINK1、SQSTM1/p62、SMURF、AMPK和ULK1。在一些实施方案中，至少一种重组病毒体或药物组合物增加转导细胞中所述蛋白质或其片段的表达。在一些实施方案中，至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞调节自噬。在一些实施方案中，至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗自噬相关疾病。
在一些实施方案中，自噬相关疾病选自癌症、神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、共济失调)、炎性疾病、炎症性肠病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化、慢性阻塞性肺病/COPD、肺纤维化、囊性纤维化、干燥综合征、高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、胰岛素抵抗性糖尿病(例如，门登霍尔综合征、沃纳综合征、矮怪病和脂肪缺乏性糖尿病)、血脂异常、高脂血症、低密度脂蛋白(LDL)升高、高密度脂蛋白(HDL)降低、甘油三酯升高、代谢综合征、肝病、肾病、心血管疾病、局部缺血、中风、再灌注期间的并发症、肌肉退化、萎缩、衰老症状(例如，肌肉萎缩、虚弱、代谢障碍、低度炎症、动脉粥样硬化、中风、年龄相关性痴呆和散发形式的阿尔茨海默氏病、癌前状态和包括抑郁症在内的精神疾病)、脊髓损伤、动脉粥样硬化、传染病(例如，细菌、真菌、病毒)、AIDS、结核病、胚胎发育缺陷、不育症、溶酶体贮积病、活化因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷脂贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸病、达农病、法布里病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病(I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积症(婴儿型、晚期婴儿型/青少年型和成人型/慢性)、亨特综合征(MPS II)、I-细胞病/粘脂沉积症II、婴儿游离唾液酸贮积症(ISSD)、青少年己糖胺酶A缺乏症、克拉贝病、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、赫勒综合征、谢伊综合征、赫-谢二氏综合征、桑菲里波综合征、A型和B型莫尔基奥、马-拉米综合征、斯莱综合征、粘脂贮积病、多发性硫酸盐缺乏症、尼曼匹克病、神经元蜡样脂褐质沉积症、CLN6病、詹-比二氏病、庞贝病、致密性成骨不全症、桑霍夫病、辛德勒病、泰-萨二氏病和沃尔曼病。
如本文所用，术语“自噬相关疾病”是指由自噬或细胞自我消化的破坏引起的疾病。自噬功能障碍与癌症、神经变性、微生物感染和衰老以及许多其他疾病状态和/或病症相关。尽管自噬作为细胞的保护过程起主要作用，但它也在细胞死亡中起作用。通过自噬介导的疾病状态和/或疾患(是指疾病状态或疾患本身可能表现为待治疗的患者或受试者中自噬的增加或减少的事实，并且治疗或预防需要在患者或受试者中施用自噬的抑制剂或激动剂)包括例如癌症，包括癌症的转移、溶酶体贮积病(下文讨论)、神经变性(包括例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病；其他共济失调)、免疫反应(T细胞成熟、B细胞和T细胞稳态、对抗损伤性炎症)和慢性炎性疾病(当自噬有缺陷时可促进细胞因子过量)，包括例如炎症性肠病，包括克罗恩氏病、类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化、慢性阻塞性肺病/COPD、肺纤维化、囊性纤维化、干燥综合征；高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病、影响脂质代谢的胰岛功能和/或结构、过度自体免疫可能导致胰腺b细胞死亡和相关高血糖症，包括严重胰岛素抵抗、高胰岛素血症、胰岛素抵抗性糖尿病(例如门登霍尔综合征、沃纳综合征、矮怪病和脂肪缺乏性糖尿病)和血脂异常(例如由肥胖受试者表现的高脂血症、低密度脂蛋白(LDL)升高、高密度脂蛋白(HDL)降低和甘油三酯升高)以及代谢综合征、肝病(细胞实体-内质网的过量自噬性去除)、肾病(斑块中的细胞凋亡、肾小球疾病)、心血管疾病(尤其包括缺血、中风、压力超负荷和再灌注期间的并发症)、肌肉退化和萎缩、衰老症状(包括衰老相关症状和慢性疾患的发作或严重性或频率的改善或延迟，所述衰老相关症状和慢性疾患包括肌肉萎缩、虚弱、代谢病症、低度炎症、动脉粥样硬化和相关疾患，例如心脏和神经的中枢和外周表现，包括中风、年龄相关痴呆和阿尔茨海默氏病的散发形式、癌前状态和包括抑郁症在内的精神病学病症)、中风和脊髓损伤、动脉硬化、感染性疾病(微生物感染、去除微生物、对微生物产物提供保护性炎症反应、限制宿主的自噬对微生物的适应以增强微生物生长、调控先天免疫)，包括细菌、真菌、细胞和病毒(包括与感染性疾病相关的继发性疾病状态或疾患)，包括AIDS和结核病以及其他疾病，发育(包括红细胞分化)、胚胎发生/生育/不育(胚胎植入和终止经胎盘营养供应后的新生儿存活、在程序性细胞死亡期间死亡细胞的清除)和衰老(自噬增加导致受损细胞器或聚集的大分子的清除以增加健康并延长寿命，但儿童/年轻人自噬水平增加可能导致肌肉和器官消耗，从而导致衰老/早衰)。
术语“溶酶体贮积症”是指由溶酶体贮积缺陷引起的疾病状态或疾患。这些疾病状态或疾患通常发生在溶酶体功能障碍时。溶酶体贮积症是由溶酶体功能障碍引起的，通常是脂质、糖蛋白或粘多糖代谢所需的酶缺乏的结果。溶酶体贮积症(统称)的发病率为约1:5,000-1:10,000。溶酶体通常被称为细胞的回收中心，因为它将不需要的物质加工成细胞可以利用的物质。溶酶体通过高度特化酶来分解这些不需要的物质。溶酶体病症通常是在特定酶含量过少或完全缺失时触发的。当这种情况发生时，物质在细胞中积累。换句话说，当溶酶体功能不正常时，过量的分解和回收产物就会储存在细胞中。溶酶体贮积症是遗传性疾病，但这些疾病可以用本文所述的自噬调节剂(autostatin)来治疗。所有这些疾病都共享共同的生物化学特征，即所有溶酶体病症都源于溶酶体内物质的异常积累。溶酶体贮积病主要影响儿童，他们因此往往在生命早期死亡，许多儿童在出生后几个月或几年内死亡。许多其他儿童在遭受其特定病症的各种症状多年后死于这种疾病。
溶酶体贮积症的实例包括例如活化因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷脂贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸病、达农病、法布里病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病(I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积症(包括婴儿型、晚期婴儿型/青少年型和成人型/慢性)、亨特综合征(MPS II)、I-细胞病/粘脂沉积症II、婴儿游离唾液酸贮积症(ISSD)、青少年己糖胺酶A缺乏症、克拉贝病、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、赫勒综合征、谢伊综合征、赫-谢二氏综合征、桑菲里波综合征、A型和B型莫尔基奥、马-拉米综合、斯莱综合征、粘脂贮积病、多发性硫酸盐缺乏症、尼曼匹克病、神经元蜡样脂褐质沉积症、CLN6病、詹-比二氏病、庞贝病、致密性成骨不全症、桑霍夫病、辛德勒病、泰-萨二氏病和沃尔曼病以及其他疾病。
炎症性疾病
本文所述的方法、重组病毒体和/或药物组合物可用于例如预防或治疗自身免疫疾病(部分或完全减少其副作用)，所述疾病例如慢性炎症性肠病、系统性红斑狼疮、银屑病、穆-韦两氏综合征(muckle-wells syndrome)、类风湿性关节炎、多发性硬化或桥本氏病(Hashimoto's disease)；过敏性疾病，诸如食物过敏、花粉症或哮喘；传染病，例如艰难梭菌的感染；炎性疾病，诸如TNF-介导的炎性疾病(例如，胃肠道炎性疾病诸如结肠袋炎，心血管炎性疾病诸如动脉粥样硬化，或炎性肺病诸如慢性阻塞性肺病)；用于抑制器官移植或其他可能发生组织排斥的情况中的排斥的药物组合物；用于提高免疫功能的药物组合物；或用于抑制免疫细胞增殖或功能的药物组合物。
在一些实施方案中，本文提供的方法可用于治疗或预防炎症。在某些实施方案中，身体任何组织和器官的炎症，包括肌肉骨骼炎症、血管炎症、神经炎症、消化系统炎症、眼部炎症、生殖系统炎症和其他炎症，如下所述。
肌肉骨骼系统的免疫病症包括但不限于影响骨骼关节，包括手、腕、肘、肩、颌、脊柱、颈、髋、knew、踝和足的关节的那些疾患，以及影响连接肌肉和骨骼的组织诸如肌腱的疾患。可用本文所述的方法和组合物治疗的此类免疫疾病的实例包括但不限于关节炎(包括例如骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、急性和慢性感染性关节炎、与痛风和假痛风相关的关节炎以及幼年特发性关节炎)、肌腱炎、滑膜炎、腱鞘炎、滑囊炎、纤维组织炎(纤维肌痛)、上髁炎、肌炎和骨炎(包括例如佩吉特病(Paget's disease)、耻骨骨炎和囊性纤维性骨炎)。
眼部免疫病症是指影响眼睛的任何结构(包括眼睑)的免疫病症。可用本文所述的方法和组合物治疗的眼部免疫病症的实例包括但不限于：睑缘炎、眼睑松弛、结膜炎、泪腺炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎(干眼)、巩膜炎、倒睫和葡萄膜炎。
可用本文所述的方法和组合物治疗的神经系统免疫病症的实例包括但不限于脑炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、脑膜炎、神经性肌强直、发作性睡病、多发性硬化、脊髓炎和精神分裂症。可用本文所述的方法和组合物治疗的脉管系统或淋巴系统炎症的实例包括但不限于关节硬化、关节炎、静脉炎、血管炎和淋巴管炎。
可用本文所述的方法和药物组合物治疗的消化系统免疫疾病的实例包括但不限于胆管炎、胆囊炎、肠炎、小肠结肠炎、胃炎、胃肠炎、炎症性肠病、回肠炎和直肠炎。炎症性肠病包括例如一组相关疾患的某些本领域公认的形式。已知炎症性肠病的几种主要形式，其中克罗恩氏病(局部性肠病，例如非活动和活动形式)和溃疡性结肠炎(例如非活动和活动形式)是这些病症中最常见的。此外，炎症性肠病包括肠易激综合征、显微镜下结肠炎、淋巴细胞-浆细胞性肠炎、乳糜泻、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和嗜酸性小肠结肠炎。IBD的其他不太常见的形式包括不明原因结肠炎、假膜性结肠炎(坏死性结肠炎)、缺血性炎症性肠病、白塞氏病(Behcet’s disease)、结节病、硬皮病、IBD相关发育异常、发育异常相关肿块或病变以及原发性硬化性胆管炎。
可用本文所述的方法和药物组合物治疗的生殖系统免疫病症的实例包括但不限于宫颈炎、绒毛膜羊膜炎、子宫内膜炎、附睾炎、脐炎、卵巢炎、睾丸炎、输卵管炎、输卵管卵巢脓肿、尿道炎、阴道炎、外阴炎和外阴痛。
本文所述的方法和组合物可用于预防或治疗具有炎症组分的自身免疫疾患。此类疾病包括但不限于急性播散性全身性脱发、白塞氏病、查加斯氏病(Chagas'disease)、慢性疲劳综合征、自主神经异常、脑脊髓炎、强直性脊柱炎、再生障碍性贫血、化脓性汗腺炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎、乳糜泻、克罗恩氏病、1型糖尿病、2型糖尿病、巨细胞动脉炎、古德帕斯彻综合征(goodpasture's syndrome)、格雷夫斯病(Grave's disease)、格林-巴利综合征、桥本氏病、肯诺克-肖林紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、川崎病(Kawasaki's disease)、红斑狼疮、显微镜下结肠炎、显微镜下多发性血管炎、混合型结缔组织病、穆-韦两氏综合征、多发性硬化、重症肌无力、眼阵挛-肌阵挛综合征、视神经炎、奥德甲状腺炎(ord's thyroiditis)、天疱疮、结节性多动脉炎、多肌痛、类风湿性关节炎、赖特综合征(Reiter's syndrome)、干燥综合征、颞动脉炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、温热自身免疫性溶血性贫血、间质性膀胱炎、莱姆病(Lyme disease)、硬斑病、银屑病、结节病、硬皮病、溃疡性结肠炎和白癜风。
本文所述的方法和组合物可用于预防或治疗具有炎性组分的T细胞介导的过敏性疾病。此类疾患包括但不限于接触性过敏、接触性皮炎(包括由毒藤引起的接触性皮炎)、荨麻疹、皮肤过敏、呼吸道过敏(花粉热、过敏性鼻炎、屋尘螨过敏)和谷蛋白敏感性肠病(乳糜泻)。
可用所述方法和药物组合物治疗的其他免疫疾病包括例如阑尾炎、皮炎、皮肌炎、心内膜炎、纤维组织炎、牙龈炎、舌炎、肝炎、化脓性汗腺炎、虹膜炎、喉炎、乳腺炎、心肌炎、肾炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心外膜炎、腹膜炎、咽炎、胸膜炎、肺炎、前列腺炎、肾盂肾炎和造口炎、移植排斥(涉及器官诸如肾、肝、心、肺、胰腺(例如胰岛细胞)、骨髓、角膜、小肠、皮肤同种异体移植物、皮肤同种移植物和心脏瓣膜异种移植、血清病和移植物抗宿主病)、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性呼吸窘迫综合征、塞克斯氏综合征(Sexary's syndrome)、先天性肾上腺增生、非化脓性甲状腺炎、与癌症相关的高钙血症、天疱疮、疱疹样大疱性皮炎、重度多形红斑、剥脱性皮炎、脂溢性皮炎、季节性或常年性过敏性鼻炎、支气管哮喘、接触性皮炎、特应性皮炎、药物过敏反应、过敏性结膜炎、角膜炎、带状疱疹性眼炎、虹膜炎和虹膜睫状体炎(oiridocyclitis)、脉络膜视网膜炎、视神经炎、症状性结节病、暴发性或播散性肺结核化疗、成人特发性血小板减少性紫癜、成人继发性血小板减少症、获得性(自身免疫性)溶血性贫血、局限性回肠炎、自身免疫性血管炎、多发性硬化、慢性阻塞性肺病、实体器官移植排斥、败血症。优选的治疗包括治疗移植排斥、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、多发性硬化、1型糖尿病、哮喘、炎症性肠病、系统性红斑狼疮、银屑病、慢性阻塞性肺病和炎症伴感染疾患(例如败血症)。
神经退行性病症和神经炎症性病症
本文所述的方法、重组病毒体和/或药物组合物可用于预防或治疗神经退行性疾病和神经疾病。在某些实施方案中，神经退行性疾病和/或神经性疾病是帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、朊病毒病、亨廷顿氏病、运动神经元疾病(MND)、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、肌张力障碍、特发性颅内压增高、癫痫、神经系统疾病、中枢神经系统疾病、运动障碍、多发性硬化、脑病、周围神经病、术后认知功能障碍、额颞叶痴呆、中风、短暂性脑缺血发作、血管性痴呆、克-雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)、多发性硬化、朊病毒病、皮克病(Pick's disease)、皮质基底节变性、帕金森氏病、路易体痴呆、进行性核上性麻痹、拳击员痴呆(慢性创伤性脑病)、额颞叶痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结主导型痴呆(Tangle-predominant dementia)、神经节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅脑病、结节性硬化、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、嗜银颗粒病和额颞叶变性。
本文所述的方法、重组病毒体和/或药物组合物可用于预防或治疗神经炎症和/或神经炎性疾病，例如使用本公开的重组病毒体递送包含编码一种或多种缓解炎症的细胞因子的基因的核酸。神经炎性疾病包括但不限于自身免疫疾病、炎性疾病、神经退行性疾病、神经肌肉疾病或精神疾病。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物可用于治疗或预防中枢神经系统炎症，包括脑部炎症、外周神经炎症、神经炎症、脊髓炎症、眼部炎症和/或其他炎症。
可用本文所述的方法和组合物治疗的与神经炎症相关的病症或神经炎症性病症的实例包括但不限于脑炎(脑部炎症)、脑脊髓炎(脑部和脊髓炎症)、脑膜炎(脑部和脊髓周围的膜炎症)、格林-巴利综合征、神经性肌强直、发作性睡病、多发性硬化、脊髓炎、精神分裂症、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性视神经炎(AON)、横贯性脊髓炎、视神经脊髓炎(NMO)、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、额颞叶痴呆、视神经炎、视神经脊髓炎谱系病症(NMOSD)、自身免疫性脑炎、抗NMDA受体脑炎、Rasmussen氏脑炎、儿童急性坏死性脑病(ANEC)、视阵挛-肌阵挛共济失调综合征、创伤性脑损伤、亨廷顿氏病、抑郁、焦虑、偏头痛、重症肌无力、急性缺血性中风、癫痫、突触核蛋白病、额颞叶痴呆、进行性非流利性失语、语义性痴呆、点头综合征、脑缺血、神经性疼痛、自闭症谱系障碍、纤维肌痛综合征、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、系统性红斑狼疮、朊病毒病、运动神经元病(MND)、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、肌张力障碍、特发性颅内压增高、神经系统疾病、中枢神经系统疾病、运动障碍、脑病、周围神经病变或术后认知功能障碍。
癌症
癌症、肿瘤或过度增殖性疾病是指存在具有致癌细胞典型特征的细胞，所述典型特征例如不受控制的增殖、永生、转移潜能、快速生长和增殖速率以及某些特征性形态学特征。癌细胞通常呈肿瘤形式，但是此类细胞可以单独存在于动物体内，或者可以是非致瘤性癌细胞，例如白血病细胞。癌症包括但不限于B细胞癌(例如多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、瓦登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、毛细胞白血病、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性眼内淋巴瘤、重链疾病(例如α链疾病、γ链疾病和μ链疾病)、良性单克隆丙球蛋白病和免疫细胞淀粉样变性)、T细胞癌(例如，T淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病、非霍奇金淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(例如，蕈样肉芽肿、塞扎里综合征(Sezarysyndrome))、成人T细胞白血病/淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤、肠病相关肠T细胞淋巴瘤(EATL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、尿膀胱癌、脑癌或中枢神经系统癌、周围神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫癌或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠癌或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织癌等。适于本发明所涵盖的方法的癌症类型的其他非限制性实例包括人肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing'stumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌(bileduct carcinoma)、肝癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯氏瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、骨癌、脑肿瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病(成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病)；以及真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链病。在一些实施方案中，癌症本质上是上皮性的，并且包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其他实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在其他实施方案中，上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以以各种其他方式表征，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞、移行细胞(Brenner)或未分化。
家族性肝内胆汁淤积
本文所述的方法、重组病毒体和/或药物组合物可用于预防或治疗家族性肝内胆汁淤积症(PFIC)，其为与分别导致1型、2型和3型PFIC的ATPB1、ATPB11和ABCB4基因突变相关的遗传病。这种罕见的常染色体隐性疾病驱动胆汁分泌途径的中断，特征在于肝脏中的小管增生和进行性肝内胆汁淤积，伴有γ-谷氨酰转肽酶(GGT)活性升高。ABCB4突变是所述疾病的最常见形式。ABCB4基因位于染色体7q21.1上，并且编码脂质内翻酶(floppase)MDR3蛋白，参与引起PFIC3。MDR3主要在肝脏的小管膜处表达，并充当磷脂转运蛋白，即磷脂酰胆碱(PC)。MDR3保护肝细胞膜免于胆汁盐的洗涤剂活性。PFIC3缺陷的特征在于磷脂酰胆碱(PC)向胆汁中的分泌减少，从而损害了胆汁分泌转运系统(Davit-Spraul等人,PMID:20422496)。PC分泌减少引起肝脏毒性，导致促炎性程序活化，伴随肝细胞破坏，后者进一步发展为肝内肝硬化。其他不太流行的疾病形式由导致类似结果的ATPB1和ATPB11基因突变引起。在各种实施方案中，本文所述的重组病毒体通过直接注射至需要基因疗法的受试者的细胞、组织或器官而在体内施用。
威尔逊病
本文所述的方法、重组病毒体和/或药物组合物可用于预防或治疗威尔逊病(WD)。WD是一种单基因的常染色体隐性遗传疾病，与编码铜转运P型ATP酶的ATP7B基因的突变相关。已在ATP7B中鉴定了超过600种致病性变体，其中单核苷酸错义和无义突变是最常见的，其次是插入/缺失，以及罕见的剪接位点突变。ATPB7在肝脏中表达最高，但也在肾脏、胎盘、乳腺、脑和肺中发现。ATPB7破坏导致细胞内铜水平增加。人膳食摄入的铜为约1.5–2.5mg/天，它在胃和十二指肠中被吸收，与循环白蛋白结合，并被运输到肝脏中进行调控和排泄。抗氧化蛋白1(ATOX1)通过铜依赖性蛋白质-蛋白质相互作用将铜递送至ATPB7。在肝细胞内，ATP7B在反面高尔基网(TGN)或细胞质囊泡中执行两种重要功能。在TGN中，ATP7B通过将六个铜分子包装到原血浆铜蓝蛋白中来活化血浆铜蓝蛋白，然后将血浆铜蓝蛋白分泌到血浆中。在细胞质中，ATP7B将过量的铜螯合到囊泡中，并通过胞吐作用穿过顶端小管膜分泌到胆汁中(Bull等人,1993；Tanzi等人,1993；Yamaguchi等人,1999；Cater等人,2007)。由于ATP7B转运蛋白在铜的合成和排泄中的双重作用，其功能缺陷导致铜积累，从而引发氧化应激和自由基形成以及独立于氧化应激而引起的线粒体功能障碍。所述组合效应导致在肝和脑组织以及其他器官中诱发促炎性状态和后续细胞死亡。在各种实施方案中，本文所述的重组病毒体通过直接注射至需要基因疗法的受试者的细胞、组织或器官而在体内施用。
溶酶体贮积症
本文所述的方法、重组病毒体和/或药物组合物可用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)。这些疾病是遗传性代谢疾病，其特征在于由于酶缺乏而导致身体细胞中各种有毒物质的异常积累。本文所述的方法和组合物可用于预防或治疗氨甲酰磷酸合成酶1缺乏症(CPS1D)，其为一种罕见的常染色体隐性病症，其特征在于以影响多个器官的严重高氨血症为主的破坏性代谢疾病，在某些情况下包括脑白质的变化。CPS1在肝脏尿素生成中起到至关重要的作用，因为它催化尿素循环的第一步骤和限速步骤，这是人体内氮处理的主要途径。CPS1缺乏导致尿素循环障碍和氨积累。因此，在患有CPS1缺乏症的患者中可以观察到明显的高氨血症和尿素循环下游产物的减少。过量的氨会进入中枢神经系统，并对大脑产生毒性作用。氨的积累诱导毒性并导致细胞死亡。在各种实施方案中，本文所述的重组病毒体通过直接注射至需要基因疗法的受试者的细胞、组织或器官而在体内施用。
大疱性表皮松解症
本文所述的方法、重组病毒体和/或药物组合物可用于预防或治疗皮肤遗传疾病。人的表皮主要由角质细胞组成，这些角质细胞组织成不同的分层细胞层。基底角质细胞与表皮基底膜的粘附是由半桥粒(HD)介导的，半桥粒是连接上皮中间丝网络与真皮锚定纤维的多蛋白复合物。半桥粒由几种细胞质和跨膜蛋白的成簇而形成。包括HD1/网蛋白和大疱性类天疱疮抗原1(BP230)在内的细胞质HD斑块组分在质膜的胞质表面处充当细胞骨架元件的接头。HD的跨膜成分包括α6β4整合素和大疱性类天疱疮抗原2(BP180)，充当连接细胞内部和细胞外基质蛋白的细胞受体。半桥粒介导的粘附依赖于α6β4整合素与层粘连蛋白-5的结合，所述层粘连蛋白-5是由不同的多肽α3、β3和γ2形成的主要基底膜组分，分别由称为LAMA3、LAMB3和LAMC2的3种不同的基因编码。层粘连蛋白-5与表皮角质细胞基底表面上的α6β4整合素物理地相互作用，促进HD形成，并与真皮锚定纤维中VII型胶原的氨基末端NC-1结构域相互作用，以增强基底膜区的完整性。这些蛋白质在维持皮肤完整性方面的相关性已通过鉴定存在于患有大疱性表皮松解症(EB)的患者中的体细胞突变得到证实。各种基因(例如KRT5、KRT14、PLEC1、Col7A1、ITGB4、ITGA6、LAMA3、LAMB3、LAMC2和KIND1)中的至少16种基因突变与不同类型的EB相关。由于角质细胞负责合成参与维持真皮-表皮接合的蛋白质，因此预防或治疗此疾病的基因治疗干预需要对这些细胞进行基因修饰。
在某些方面，本文所述的方法、重组病毒体和/或药物组合物可用于针对不同皮肤病症诸如EB特异性修饰皮肤干细胞。例如，库塔病毒源性重组病毒体(例如，包含库塔病毒的至少一种衣壳蛋白的重组病毒体)可用于将治疗性转基因递送到表皮干细胞中。在一些实施方案中，表皮干细胞是全克隆形成细胞。在一些实施方案中，全克隆形成细胞是具有最大增殖能力的P63阳性角质细胞源性干细胞，并因此被认为是上皮干细胞。在一些实施方案中，治疗性转基因还包含GSH序列，其有助于通过同源重组稳定整合到已知的基因组位置。使用GSH允许在皮肤细胞的整个分化过程中进行稳定且持久的转基因表达。在一些实施方案中，表皮干细胞、P63阳性角质细胞源性干细胞或角质细胞通过本公开的重组病毒体和药物组合物进行体外修饰。在一些此类实施方案中，将修饰的表皮干细胞、P63阳性角质细胞源性干细胞或角质细胞作为皮肤移植物应用于皮肤表面。
因此，在某些方面，本文提供了预防或治疗大疱性表皮松解症的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞包含编码KRT5、KRT14、PLEC1、Col7A1、ITGB4、ITGA6、LAMA3、LAMB3、LAMC2和/或KIND1的核酸。在一些实施方案中，重组病毒体包含原细小病毒的至少一种衣壳蛋白。在一些实施方案中，重组病毒体包含库塔病毒的至少一种衣壳蛋白。在一些实施方案中，至少一种重组病毒体转导表皮干细胞、P63阳性角质细胞源性干细胞或角质细胞。在一些实施方案中，转导的表皮细胞是干细胞、P63阳性角质细胞源性干细胞或角质细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括将转导细胞移植到受试者的皮肤上。在一些实施方案中，本公开的至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗大疱性表皮松解症。
血液疾病
在某些方面，除了下文所述的血液疾病之外，本文所述的方法、重组病毒体和/或药物组合物可用于治疗或预防疾病，例如内皮功能障碍、囊性纤维化、心血管疾病、外周血管疾病、中风、心脏病(例如，包括先天性心脏病)、糖尿病、胰岛素抵抗、慢性肾衰竭、动脉粥样硬化、肿瘤生长(例如，包括内皮细胞的肿瘤生长)、转移、高血压(例如，肺动脉高血压、其他形式的肺高血压)、动脉粥样硬化、再狭窄、丙型肝炎、肝硬化、高脂血症、高胆固醇血症、代谢综合征、肾病、炎症和静脉血栓形成。
在某些方面，血液疾病包括以下任一种：血红蛋白病(例如，镰状细胞病、地中海贫血、高铁血红蛋白血症)、贫血(缺铁性贫血、巨幼红细胞性贫血、溶血性贫血、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、中性粒细胞减少症、粒细胞缺乏症、格兰兹曼氏血小板无力症(Glanzmann’s thrombasthenia)、血小板减少症、威－奥二氏综合征(Wiskott-Aldrichsyndrome)、骨髓增生性病症(例如，真性红细胞增多症、红细胞增多症、白细胞增多症、血小板增多症)、凝血病、血液癌症、血色沉着病、无脾、脾机能亢进(例如戈谢病)、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、tempi综合征和AIDS。
在一些实施方案中，示例性溶血性贫血包括：遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、先天性红细胞生成异常性贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(G6PD)、丙酮酸激酶缺乏症、自身免疫性溶血性贫血(例如，特发性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)、埃文斯综合征(Evans syndrome)、冷凝集素病、阵发性冷血红蛋白尿症、传染性单核细胞增多症)、同种免疫性溶血性贫血(例如，新生儿溶血病，诸如Rh病、新生儿ABO溶血病、新生儿抗-Kell溶血病、新生儿恒河猴c溶血病、新生儿恒河猴E溶血病)、阵发性夜间血红蛋白尿、微血管病溶血性贫血、范可尼贫血(Fanconi anemia)、Diamond-Blckfan综合征和获得性纯红细胞发育不全。
在一些实施方案中，示例性凝血病包括：血小板增多症、弥散性血管内凝血、血友病(例如，血友病A、血友病B、血友病C)、血管性血友病(von Willebrand disease)和抗磷脂综合征。
在一些实施方案中，示例性血液学癌症包括：霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤(例如，肝脾T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、瓦登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓细胞白血病(AML)、急性巨核细胞白血病、慢性特发性骨髓纤维化、慢性髓细胞性白血病(CML)、T细胞幼淋巴细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、慢性中性粒细胞白血病、毛细胞白血病、大颗粒T淋巴细胞白血病、AIDS相关性淋巴瘤、塞扎里综合征、瓦登斯特伦巨球蛋白血症、慢性骨髓增生性肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、骨髓增生异常综合征和侵袭性NK细胞白血病。
如本文所用，血红蛋白病包括涉及血液中异常血红蛋白分子的存在的任何疾病。血红蛋白病的实例包括但不限于血红蛋白C病、血红蛋白镰状细胞病(SCD)、镰状细胞贫血和地中海贫血。还包括如下血红蛋白病，其中血液中存在异常血红蛋白的组合(例如镰状细胞/Hb-C病)。
如本文所用，地中海贫血是指特征在于血红蛋白的缺陷性产生的遗传性疾病。地中海贫血的实例包括α-地中海贫血和β-地中海贫血。β-地中海贫血由β珠蛋白链突变引起的，并且可以以主要或次要形式出现。在β-地中海贫血的主要形式中，儿童在出生时是正常的，但在出生后的第一年中会发生贫血。β-地中海贫血的轻度形式产生小红细胞，并且地中海贫血由珠蛋白链中的一个或多个基因缺失引起，α-地中海贫血通常由涉及HBA1基因和HBA2基因的缺失引起。这两个基因都编码α-珠蛋白，所述α-珠蛋白是血红蛋白的组分(亚基)。每个细胞基因组中有两个HBA1基因拷贝和两个HBA2基因拷贝。因此，有四个等位基因产生α-珠蛋白。不同类型的地中海贫血由这些等位基因中的一些或全部的缺失造成。HbBart综合征是地中海贫血的最严重形式，由所有四个α珠蛋白等位基因的缺失引起。HbH疾病由四个α-珠蛋白等位基因中三个的缺失引起。在这两种情况下，α-珠蛋白的缺乏会阻止细胞产生正常的血红蛋白。相反，细胞产生异常形式的血红蛋白，称为血红蛋白Bart(HbBart)或血红蛋白H(HbH)。这些异常的血红蛋白分子不能有效地将氧气携带到身体组织。用Hb Bart或HbH取代正常血红蛋白会导致贫血和与地中海贫血相关的其他严重健康问题。
如本文所用，镰状细胞病是指一组常染色体隐性遗传性血液疾病，其由珠蛋白基因突变引起并且特征在于在缺氧条件下红细胞从典型的双凹形转变为异常的、僵硬的、不能穿过毛细血管的镰刀形状，从而加剧缺氧。它们由编码β-珠蛋白链变体的βs基因的存在来定义，其中谷氨酸在肽的氨基酸位置6被缬氨酸取代，并且第二β基因具有突变mat，允许HbS结晶，从而产生临床表型。镰状细胞贫血是指患者的镰状细胞病的一种特殊形式，所述患者对于导致HbS突变是纯合子的。镰状细胞病的其他常见形式包括HbS/β-地中海贫血、HbS/HbC和HbS/HbD。
在某些实施方案中，本文提供了治疗、预防或改善血红蛋白病的方法和组合物，所述血红蛋白病选自由以下组成的组：血红蛋白C病、血红蛋白镰状细胞病(SCD)、镰状细胞贫血、遗传性贫血、地中海贫血、β-地中海贫血、重型地中海贫血、中间型地中海贫血、α-地中海贫血和血红蛋白H病。在一些实施方案中，血红蛋白病是β-地中海贫血。在一些实施方案中，血红蛋白病是镰状细胞贫血。在各种实施方案中，本文所述的重组病毒体通过直接注射至需要基因疗法的受试者的细胞、组织或器官而在体内施用。在各种其他实施方案中，用本文所述的重组病毒体在体外或离体转导细胞。然后向需要基因疗法的受试者施用转导细胞，例如在本文公开的药物制剂中。
如上所述，本文提供了预防或治疗受试者的血红蛋白病的方法。在各种实施方案中，所述方法包括向受试者施用有效量的用本文所述的重组病毒体转导的细胞或所述转导细胞群体(例如，HSC、CD34+或CD36细胞、红系细胞、胚胎干细胞或iPSC)。对于治疗或预防，施用量可以是有效产生所需临床益处的量。可以在一次或一系列施用中提供有效量。有效量可以通过快速注射或连续灌注来提供。可以一个或多个剂量向受试者施用有效量。就治疗或预防而言，有效量是指足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓疾病进程，或另外减轻疾病的病理后果的量。有效量通常由医生根据具体情况确定，并且在本领域普通技术人员的能力范围内。当确定达到有效量的适当剂量时，通常应考虑几个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的疾患、疾患的严重性。
I型糖尿病
在某些方面，本文所述的方法、重组病毒体和/或药物组合物可用于治疗或预防I型糖尿病。小肠中的肠内分泌细胞，尤其是十二指肠和空肠中的肠内分泌细胞，是用于预防或治疗患有1型糖尿病的患者的胰岛素基因转移策略的有吸引力的靶标。肠的K细胞和L细胞天生专门对管腔中的营养物质，尤其是葡萄糖作出反应。它们通过向血液中分泌GIP和GLP-1来作出反应，从而增强葡萄糖诱导的胰岛素反应。在正常个体中，餐后获得的GIP、GLP-1和胰岛素的动力学和血浆浓度高度相似，并且因此患有1型糖尿病的患者中GIP和GLP-1的动力学和血浆浓度也高度相似(等人,2003)。K细胞和L细胞合成PC1/3和PC2肽酶，允许胰岛素原加工成成熟胰岛素。重要的是，患有1型糖尿病的患者的免疫系统不会破坏K细胞和L细胞以及胰腺β细胞(/>等人,2003)。由于其共同的发育起源，胰腺β细胞、K细胞和L细胞表现出显著的相似性，包括：(i)胰岛素原转化为胰岛素所需的PC1/3和PC2肽酶的表达，(ii)GLUT-2葡萄糖转运蛋白的存在，(iii)激素分泌的葡萄糖依赖性机制，其颗粒可以储存并容易地分泌相应激素(Spooner等人,1970，Baggio和Drucker 2007)。因此，预期如果患有1型糖尿病的患者的胃肠道内分泌细胞天生能够表达前胰岛素原基因(例如通过引入编码前胰岛素原蛋白或其转录物变体的胰岛素基因INS，例如NP_000198.1、NP_001172026.1、NP_001172027.1和/或NP_001278826.1，它们促成餐后血液葡萄糖的归一化。肠干细胞位于肠上皮细胞中。这些细胞在细胞膜上表达转铁蛋白受体(TfR)，使它们易于被犬或猫细小病毒源性载体转导。因此，本文呈现的重组病毒体和/或药物组合物提供整合由GIP调控元件驱动的前胰岛素原基因的有吸引力的工具。此外，定点整合到所述基因组安全港湾中，允许安全的干细胞分化为胰岛素生产K和L细胞。
血友病A
血友病A是血液不能正常凝结的遗传性出血病症。血友病A患者在受伤、手术或牙科手术后会比正常人出血更多。此病症可以是严重的、中度的或轻度的。在严重病例中，轻伤后或甚至无损伤时出现大出血(自发性出血)。关节、肌肉、大脑或器官出血会导致疼痛和其他严重并发症。在较轻形式下，没有自发性出血，并且所述病症可能仅在手术或严重损伤后才能诊断出来。血友病A由低水平的称为因子VIII的蛋白质引起。因子VIII是形成血凝块所需要的。所述病症以X连锁隐性方式遗传，并且由F8基因的变化(突变)引起。血友病A的诊断通过临床症状和特定实验室测试测量血液中凝血因子的量来进行。主要预防或治疗是替代疗法，在此期间，凝血因子VIII被缓慢地滴入或注射到静脉中。血友病A主要影响男性。通过预防或治疗，大多数患有此病症的人都表现良好。由于存在其他健康状况和罕见的病症并发症，一些患有严重血友病A的人可能会缩短寿命。
患有血友病A的患者将受益于基因疗法，所述基因治疗引入了编码全长因子VIII(FVIII)或B结构域缺失的FVIII(例如FVIII-SQ、p-VIII、p-VIII-LMW；Sandberg等人(2001)Thromb Haemost 85:93-100)的F8转基因，其保留了为人提供治疗益处所必需的活性(Rangarajan等人(2017)N Engl J Med 377:2519-30)。本公开的重组病毒体、药物组合物和方法为患有血友病A的患者提供了改进的病毒载体和预防/治疗方法，部分是因为与AAV相比重组病毒体包装更大基因的能力、低免疫原性和脉冲式基因调控(参见实施例9和章节“脉冲式基因表达或诱导型基因表达”)。
在一些实施方案中，所治疗的疾病包括选自表5中呈现的疾病。
表5
在一些实施方案中，在施用一种或多种本发明公开的转导细胞后，收集受试者的外周血并测量血红蛋白水平。施用重组病毒体或用重组病毒体转导的细胞后，产生治疗相关水平的血红蛋白。血红蛋白的治疗相关水平是以下血红蛋白水平：足以(1)改善贫血、(2)改善或恢复受试者产生含有正常血红蛋白的红细胞的能力、(3)改善或纠正受试者无效的红细胞生成、(4)改善或纠正髓外造血(例如脾和肝髓外造血)、和/或(S)减少例如外周组织和器官中的铁积累。血红蛋白的治疗相关水平可以是至少约7g/dL Hb、至少约7.5g/dL Hb、至少约8g/dL Hb、至少约8.5g/dL Hb、至少约9g/dL Hb、至少约9.5g/dL Hb、至少约10g/dLHb、至少约10.5g/dL Hb、至少约11g/dL Hb、至少约11.5g/dL Hb、至少约12g/dL Hb、至少约12.5g/dL Hb、至少约13g/dL Hb、至少约13.5g/dL Hb、至少约14g/dL Hb、至少约14.5g/dLHb或至少约15g/dL Hb。另外地或可选地，血红蛋白的治疗相关水平可以是约7g/dL Hb至约7.5g/dL Hb、约7.5g/dL Hb至约8g/dL Hb、约8g/dL Hb至约8.5g/dL Hb、约8.5g/dL Hb至约9g/dL Hb、约9g/dL Hb至约9.5g/dL Hb、约9.5g/dL Hb至约10g/dL Hb、约10g/dL Hb至约10.5g/dL Hb、约10.5g/dL Hb至约1 1g/dL Hb、约1 1g/dL Hb至约1 1.5g/dL Hb、约11.5g/dL Hb至约12g/dLHb、约12g/dL Hb至约12.5g/dL Hb、约12.5g/dL Hb至约13g/dL Hb、约13g/dL Hb至约13.5g/dL Hb、约13.5g/dL Hb至约14g/dL Hb、约14g/dL Hb至约14.5g/dLHb、约14.5g/dL Hb至约15g/dL Hb、约7g/dL Hb至约8g/dL Hb、约8g/dL Hb至约9g/dL Hb、约9g/dL Hb至约10g/dL Hb、约10g/dL Hb至约11g/dL Hb、约11g/dL Hb至约12g/dL Hb、约12g/dL Hb至约13g/dL Hb、约13g/dL Hb至约14g/dL Hb、约14g/dL Hb至约15g/dLHb、约7g/dL Hb至约9g/dL Hb、约9g/dL Hb至约11g/dL Hb、约1 1g/dL Hb至约13g/dL Hb或约13g/dLHb至约15g/dL Hb。在某些实施方案中，血红蛋白的治疗相关水平在受试者中维持至少3天、至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少4个月、至少约6个月、至少约12个月(或1年)、至少约24个月(或2年)。在某些实施方案中，血红蛋白的治疗相关水平在受试者中维持长达约6个月、长达约12个月(或1年)、长达约24个月(或2年)。在某些实施方案中，血红蛋白的治疗相关水平在受试者中维持约3天、约1周、约2周、约1个月、约2个月、约4个月、约6个月、约12个月(或1年)、约24个月(或2年)。在某些实施方案中，血红蛋白的治疗相关水平在受试者中维持约6个月至约12个月(例如，约6个月至约8个月、约8个月至约10个月、约10个月至约12个月)、约12个月至约18个月(例如，约12个月至约14个月、约14个月至约16个月或约16个月至约18个月)或者约18个月至约24个月(例如，约18个月至约20个月、约20个月至约22个月或约22个月至约24个月)。
在某些实施方案中，转导细胞对于施用所述细胞的受试者是自体的。在一些实施方案中，转导细胞来自骨髓或外周循环中的动员细胞，对于施用所述细胞的受试者是自体的。在一些实施方案中，转导细胞对于施用所述细胞的受试者是同种异体的。在一些实施方案中，转导细胞来自对于施用所述细胞的受试者自体的骨髓。
本公开还提供了一种增加受试者中红细胞或红血球相对于白细胞或白血球的比例的方法。在各种实施方案中，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的重组病毒体或用重组病毒体转导的细胞(例如，HSC、CD34+或CD36细胞、红系细胞、胚胎干细胞或iPSC)，其中造血干细胞的红细胞子代细胞与受试者中造血干细胞的白细胞子代细胞相比的比例增加。
待施用的转导细胞的量将因受试者和/或所预防或治疗的疾病而异。在一些实施方案中，向受试者施用约1x 104至约1x 105个细胞/kg、约1x 105至约1x 106个细胞/kg、约1x 106至约1x 107个细胞/kg、约1x 107至约1x 108个细胞/kg、约1x 108至约1x 109个细胞/kg或约1x 109至约1x 1010个细胞/kg的本文公开的转导细胞。根据需要，受试者可能需要多个剂量的转导细胞。应考虑的有效剂量的精确确定可以基于每个受试者的个体因素，包括他们的体型、年龄、性别、体重和特定受试者的状况。本领域技术人员从本公开和本领域的知识中可以容易地确定剂量。
不受任何特定理论的束缚，本文所述的组合物和方法提供的重要优势是治疗患有任何疾病(例如血红蛋白病、囊性纤维化、血色素沉着症)的受试者或预防受试者中的任何疾病(例如处于发展此种疾病风险下的受试者)的有效方式。此类处于风险下的受试者可以通过他们携带的某些基因突变和/或环境或身体因素(例如，受试者的性别、年龄)来鉴别。通过使用本文所述的组合物和方法(例如，包含原细小病毒或四细小病毒的至少一种衣壳蛋白的重组病毒体)实现了高效且安全的基因疗法。例如，核酸(例如治疗性核酸)向GSH的靶向整合减少了转导细胞中细胞基因的有害突变、转化或致癌基因活化的机会。此外，重组病毒体的特异性嗜性允许靶向特定细胞类型。
用于产生重组病毒体的组合物和方法
在某些方面，本文提供了产生本文所述的重组病毒体的方法。可以通过将结构和/或非结构基因整合到一个或多个载体中来合并下文所述的载体的数量。某些原细小病毒或四细小病毒基因组序列也可以整合到杆状病毒基因组中，以包含结构基因(例如，编码VP蛋白)和/或非结构基因。
在某些方面，产生重组病毒体的方法包括：(1)提供至少一种载体，其包含(i)包含至少一个ITR核苷酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列任选地还包含与用于在靶细胞中表达的启动子可操作地连接的异源核酸，(ii)包含编码原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1和/或VP2的至少一个基因的核苷酸序列，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和(iii)包含以下的核苷酸序列：(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或(C)(A)和(B)的组合；(2)将所述至少一种载体引入到昆虫细胞中；和(3)在产生本文所述的重组病毒体的条件下维持所述昆虫细胞。在优选的实施方案中，载体是昆虫细胞相容性载体，其包含促进核酸在昆虫细胞中表达的启动子。
在一些实施方案中，提供了两种载体：(a)第一载体，其包含含有至少一个ITR核苷酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列任选地还包含与用于在靶细胞中表达的启动子可操作地连接的异源核酸，和(b)第二载体，其包含(i)如下核苷酸序列，其包含编码所述原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1和/或VP2的至少一个基因，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和(ii)如下核苷酸序列，其包含(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的所述至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或(C)(A)和(B)的组合。
在一些实施方案中，提供了三种载体：(a)第一载体，其包含含有至少一个ITR核苷酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列任选地还包含与用于在靶细胞中表达的启动子可操作地连接的异源核酸，(b)第二载体，其包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列包含编码所述原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1和/或VP2的基因，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和(c)第三载体，其包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列包含(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的所述至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或(C)(A)和(B)的组合。
在一些实施方案中，本文提供了在昆虫细胞中产生本文所述的重组病毒体的方法，所述方法包括：(1)提供昆虫细胞，其包含(i)含有至少一个ITR核苷酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列任选地还包含与用于在靶细胞中表达的启动子可操作地连接的异源核酸，(ii)包含编码原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1和/或VP2的至少一个基因的核苷酸序列，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和(iii)包含以下的核苷酸序列：(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或(C)(A)和(B)、任选地至少一种载体的组合，其中(i)、(ii)、(iii)(A)、(iii)(B)和(iii)(C)中的至少一种稳定整合到昆虫细胞基因组中，并且当存在时，所述至少一种载体包含未稳定整合到昆虫细胞基因组中的(i)、(ii)、(iii)(A)、(iii)(B)和(iii)(C)核苷酸序列的剩余部分，以及(2)将昆虫细胞保持在产生重组病毒体的条件下。
在一些实施方案中，本文提供了产生具有原细小病毒或其基因型变体的至少一种衣壳蛋白的重组病毒体的方法，其中原细小病毒是选自以下的种：食肉动物原细小病毒、食肉动物原细小病毒1、翼手目原细小病毒1、劳亚食虫目原细小病毒1、灵长类原细小病毒1、灵长类原细小病毒2、灵长类原细小病毒3、灵长类原细小病毒4、啮齿类原细小病毒1、啮齿类原细小病毒2、啮齿类原细小病毒3、有蹄类原细小病毒1和有蹄类原细小病毒2。在一些实施方案中，原细小病毒或其基因型变体选自犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、人布法病毒1、人布法病毒2、人布法病毒3、人图萨病毒、人库塔病毒、Wuharv细小病毒、猪细小病毒、小鼠微小病毒、果蝠布法病毒及其基因型变体。
在一些实施方案中，本文提供了产生具有至少一种四细小病毒或其基因型变体的衣壳蛋白的重组病毒体的方法，其中四细小病毒是选自以下的种：翼手目四细小病毒1、灵长类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒2、有蹄类四细小病毒3和有蹄类四细小病毒4。在一些实施方案中，四细小病毒或其基因型变体选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3、黑猩猩细小病毒4、黄毛果蝠细小病毒、牛香港病毒1、牛香港病毒2、猪香港病毒、猪cn病毒、牦牛细小病毒、绵羊香港病毒1、负鼠四细小病毒、啮齿类四细小病毒、四细小病毒某个种及其基因型变体。在一些实施方案中，四细小病毒或其基因型变体选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3及其基因型变体。
在一些实施方案中，原细小病毒的至少一种复制蛋白是犬细小病毒、布法病毒、库塔病毒或其基因型变体的NS-1蛋白。
在一些实施方案中，四病毒的至少一种复制蛋白是人细小病毒4或其基因型变体的NS-1蛋白。
在一些实施方案中，昆虫细胞来源于鳞翅目的种，例如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9。在一些实施方案中，至少一种载体是杆状病毒载体、病毒载体或质粒。在一些实施方案中，至少一种载体是杆状病毒载体。在一些实施方案中，使用基于每个细胞或每个体积证明载体产率增强的鳞翅目细胞系的亚克隆。在一些实施方案中，单独或组合使用具有NS1、Rep、VP和/或载体基因组的整合拷贝的修饰的鳞翅目细胞系。在一些实施方案中，昆虫细胞系被“消除”了内源性或污染性或外来昆虫病毒，例如灰翅夜蛾属弹状病毒。
在一些实施方案中，VP1包含与选自SEQ ID NO:4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20和22的序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VP2包含与选自SEQ ID NO:4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21和23的序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含结构蛋白VP1和VP2。VP2的存在量可以超过VP1。
在一些实施方案中，ITR包括(a)依赖性细小病毒ITR，(b)AAV ITR，任选地AAV2ITR，(c)原细小病毒ITR，和/或四细小病毒ITR。在某些实施方案中，ITR是具有Rep结合元件和trs的末端回文序列，其结构类似于野生型ITR。在一些实施方案中，ITR来自AAV1、AAV2、AAV3等。在某些实施方案中，ITR具有AAV2 RBE和trs。在一些实施方案中，ITR是不同AAV的嵌合体。在一些实施方案中，ITR和Rep蛋白来自AAV5。在一些实施方案中，ITR是合成的，并且包含RBE基序和trs GGTTGG、AGTTGG、AGTTGA、RRTTRR。由B/B’茎和C/C’茎组成的末端回文序列的典型T形结构也可以通过取代和插入进行合成修饰，以保持基于折叠预测的整体二级结构(可从URL(http)unafold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form获得)。ITR二级结构的稳定性由吉布斯自由能δG表示，其值越低，即越负，表明稳定性越高。全长145nt ITR具有计算的ΔG＝-69.91kcal/mol。B茎和C茎：
GCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCG具有ΔG＝-22.44kcal/mol。导致结构具有ΔG＝-15kcal/mol至-30kcal/mol的取代和插入在功能上是等同的，并且与野生型依赖性细小病毒ITR没有不同。
在一些实施方案中，用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列包含：(a)启动子，和/或(b)Kozak样表达控制序列。在一些实施方案中，启动子包括：(a)动物DNA病毒的立即早期启动子，(b)昆虫病毒的立即早期启动子，或(c)昆虫细胞启动子。在一些实施方案中，动物DNA病毒是巨细胞病毒(CMV)、原细小病毒、四细小病毒或AAV。在一些实施方案中，昆虫病毒是鳞翅目病毒或杆状病毒，任选地其中杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾(AutographaCalifornia)核多角体病毒(AcMNPV)。在一些实施方案中，启动子是多角体蛋白(polh)或立即早期1基因(IE-1)启动子。在一些实施方案中，包含AAV的至少一种复制蛋白的核苷酸序列(例如AAV2)包含编码Rep52和/或Rep78的核苷酸序列。
在某些方面，本文提供了包含至少一种载体的昆虫细胞，所述载体包含：(i)包含至少一个ITR核苷酸序列的核苷酸序列，(ii)包含编码原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1和/或VP2的至少一个基因的核苷酸序列，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和(iii)核如下苷酸序列，其包含(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(B)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或(C)(A)和(B)的组合。在一些实施方案中，载体是昆虫细胞相容性载体，其包含促进核酸在昆虫细胞中表达的启动子。在一些实施方案中，(i)、(ii)、(iii)(A)、(iii)(B)和(iii)(C)中的至少一者稳定整合到昆虫细胞基因组中。
在一些实施方案中，昆虫细胞包含编码原细小病毒衣壳蛋白的至少一种基因，其中原细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：食肉动物原细小病毒、食肉动物原细小病毒1、翼手目原细小病毒1、劳亚食虫目原细小病毒1、灵长类原细小病毒1、灵长类原细小病毒2、灵长类原细小病毒3、灵长类原细小病毒4、啮齿类原细小病毒1、啮齿类原细小病毒2、啮齿类原细小病毒3、有蹄类原细小病毒1和有蹄类原细小病毒2。在一些实施方案中，原细小病毒或其基因型变体选自犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、人布法病毒1、人布法病毒2、人布法病毒3、人图萨病毒、人库塔病毒、Wuharv细小病毒、猪细小病毒、小鼠微小病毒、果蝠布法病毒及其基因型变体。在一些实施方案中，昆虫细胞包含编码四细小病毒衣壳蛋白的至少一种基因，其中四细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：翼手目四细小病毒1、灵长类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒2、有蹄类四细小病毒3和有蹄类四细小病毒4。在一些实施方案中，四细小病毒或其基因型变体选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3、黑猩猩细小病毒4、黄毛果蝠细小病毒、牛香港病毒1、牛香港病毒2、猪香港病毒、猪cn病毒、牦牛细小病毒、绵羊香港病毒1、负鼠四细小病毒、啮齿类四细小病毒、四细小病毒某个种及其基因型变体。在一些实施方案中，四细小病毒是人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3或其基因型变体。
在一些实施方案中，原细小病毒的至少一种复制蛋白是犬细小病毒、布法病毒、库塔病毒或其基因型变体的NS-1蛋白。
在一些实施方案中，四病毒的至少一种复制蛋白是人细小病毒4或其基因型变体的NS-1蛋白。
在一些实施方案中，昆虫细胞来源于鳞翅目的种，例如草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、甜菜夜蛾或粉纹夜蛾。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9。在一些实施方案中，至少一种载体是杆状病毒载体、病毒载体或质粒。在一些实施方案中，至少一种载体是杆状病毒载体。
在一些实施方案中，VP1包含与选自SEQ ID NO:4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20和22的序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VP2包含与选自SEQ ID NO:4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21和23的序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含结构蛋白VP1和VP2。VP2的存在量可以超过VP1。
在一些实施方案中，ITR包括(a)依赖性细小病毒ITR，(b)AAV ITR，任选地AAV2ITR，(c)原细小病毒ITR，和/或(d)四细小病毒ITR。在一些实施方案中，用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列包含：(a)启动子，和/或(b)Kozak样表达控制序列。在一些实施方案中，启动子包括：(a)动物DNA病毒的立即早期启动子，(b)昆虫病毒的立即早期启动子，或(c)昆虫细胞启动子。在一些实施方案中，动物DNA病毒是巨细胞病毒(CMV)、原细小病毒、四细小病毒或AAV。在一些实施方案中，昆虫病毒是鳞翅目病毒或杆状病毒，任选地其中杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾(Autographa California)核多角体病毒(AcMNPV)。在一些实施方案中，启动子是多角体蛋白(polh)或立即早期1基因(IE-1)启动子。在一些实施方案中，包含AAV的至少一种复制蛋白的核苷酸序列(例如AAV2)包含编码Rep52和/或Rep78的核苷酸序列。
虽然不如本文所述的方法有效，但重组病毒体也可使用哺乳动物细胞产生，例如Grieger等人(2016)Mol Ther 24:287–297)。
示例性实施方案
本公开的方面也可以描述如下：
1.一种重组病毒体，其包含(1)原细小病毒或其基因型变体的至少一种衣壳蛋白或其变体；和(2)核酸，其中所述核酸包含异源核酸。
2.一种重组病毒体，其包含(1)四细小病毒或其基因型变体的至少一种衣壳蛋白或其变体；和(2)核酸，其中所述核酸包含异源核酸。
3.如1所述的重组病毒体，其中所述原细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：食肉动物原细小病毒、食肉动物原细小病毒1、翼手目原细小病毒1、劳亚食虫目原细小病毒1、灵长类原细小病毒1、灵长类原细小病毒2、灵长类原细小病毒3、灵长类原细小病毒4、啮齿类原细小病毒1、啮齿类原细小病毒2、啮齿类原细小病毒3、有蹄类原细小病毒1和有蹄类原细小病毒2。
4.如1或3所述的重组病毒体，其中所述原细小病毒或其基因型变体选自犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、人布法病毒1、人布法病毒2、人布法病毒3、人图萨病毒、人库塔病毒、Wuharv细小病毒、猪细小病毒、小鼠微小病毒、果蝠布法病毒及其基因型变体。
5.如2所述的重组病毒体，其中所述四细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：翼手目四细小病毒1、灵长类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒2、有蹄类四细小病毒3和有蹄类四细小病毒4。
6.如2或5所述的重组病毒体，其中所述四细小病毒或其基因型变体选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3、黑猩猩细小病毒4、黄毛果蝠细小病毒、牛香港病毒1、牛香港病毒2、猪香港病毒、猪cn病毒、牦牛细小病毒、绵羊香港病毒1、负鼠四细小病毒、啮齿类四细小病毒、四细小病毒某个种及其基因型变体。
7.如6所述的重组病毒体，其中所述四细小病毒是人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3或其基因型变体。
8.如1-7中任一项所述的重组病毒体，其中所述病毒体为二十面体。
9.如1-8中任一项所述的重组病毒体，其中所述衣壳蛋白或其变体包含结构蛋白VP1和/或VP2。
10.如9所述的重组病毒体，其中VP2的存在量超过VP1。
11.如9或10所述的重组病毒体，其中VP1包含与选自SEQ ID NO:4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20和22的序列具有至少约60％同一性、约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性、约95％同一性、约96％同一性、约97％同一性、约98％同一性、约99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
12.如9-11中任一项所述的重组病毒体，其中VP2包含与选自SEQ ID NO:4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21和23的序列具有至少约60％同一性、约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性、约95％同一性、约96％同一性、约97％同一性、约98％同一性、约99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
13.如1-12中任一项所述的重组病毒体，其中所述异源核酸包含与靶细胞的核酸序列具有至少约60％同一性的核酸序列。
14.如1-13中任一项所述的重组病毒体，其中所述异源核酸与哺乳动物的核酸具有至少约60％的同一性，优选地其中所述哺乳动物是人。
15.如1-14中任一项所述的重组病毒体，其中所述异源核酸不与原细小病毒或四细小病毒启动子可操作地连接。
16.如1-15中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸包含至少一个反向末端重复(ITR)。
17.如16所述的重组病毒体，其中所述至少一个ITR包括：
(a)依赖性细小病毒ITR，
(b)AAV ITR，任选地AAV2 ITR，
(c)原细小病毒ITR，或
(d)四细小病毒ITR。
17a.如16所述的重组病毒体，其中所述至少一个ITR包括AAV2 ITR，并且所述AAV2ITR为“外翻”构象异构体、“内翻”构象异构体或其组合。
17b.如16所述的重组病毒体，其中所述至少一个ITR包括AAV2 ITR，其中所述AAV2ITR包含与SEQ ID NO:1-3和SEQ ID NO:28-31中任一项所列出的核酸序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的核酸序列；或其互补序列、反向序列或反向互补序列，
任选地，SEQ ID NO:28-31中的任一者或它们的互补序列、反向序列或反向互补序列。
17c.如16所述的重组病毒体，其中所述至少一个ITR包括两个AAV2 ITR，其中所述AAV2 ITR包含与SEQ ID NO:28-31的任何组合中列出的核酸序列具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的核酸序列，例如,
(a)SEQ ID NO:28(例如，两个外翻构象异构体；或它们的互补序列或反向互补序列)；
(b)SEQ ID NO:29(例如，两个外翻构象异构体；或它们的互补序列或反向互补序列)；
(c)SEQ ID NO:30(例如，两个内翻构象异构体；或它们的互补序列或反向互补序列)；
(d)SEQ ID NO:31(例如，两个内翻构象异构体；或它们的互补序列或反向互补序列)；
(e)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29(例如，两个外翻构象异构体；或它们的互补序列或反向互补序列)；
(f)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31(例如，两个内翻构象异构体；或它们的互补序列或反向互补序列)；
(g)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30(例如，一个外翻构象异构体和一个内翻构象异构体；或它们的互补序列或反向互补序列)；
(h)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:31(例如，一个外翻构象异构体和一个内翻构象异构体；或它们的互补序列或反向互补序列)；
(i)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30(例如，一个外翻构象异构体和一个内翻构象异构体；或它们的互补序列或反向互补序列)；或者
(j)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31(例如，一个外翻构象异构体和一个内翻构象异构体；或它们的互补序列、反向序列或反向互补序列)；
18.如17所述的重组病毒体，其中所述原细小病毒ITR选自犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、人布法病毒1、人布法病毒2、人布法病毒3、人图萨病毒、人库塔病毒、Wuharv细小病毒、猪细小病毒、小鼠微小病毒、果蝠布法病毒及其基因型变体的ITR。
19.如17所述的重组病毒体，其中所述四细小病毒ITR选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3、黑猩猩细小病毒4、黄毛果蝠细小病毒、牛香港病毒1、牛香港病毒2、猪香港病毒、猪cn病毒、牦牛细小病毒、绵羊香港病毒1、负鼠四细小病毒、啮齿类四细小病毒、四细小病毒某个种及其基因型变体的ITR。
20.如17或19所述的重组病毒体，其中所述四细小病毒ITR选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3及其基因型变体的ITR。
21.如1-20中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
22.如21所述的重组病毒体，其中所述DNA是单链或自身互补双链体。
23.如1-22中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸包含Rep蛋白依赖性复制起点(ori)。
24.如1-23中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸包含与启动子可操作地连接的核酸，所述启动子任选地位于两个ITR之间。
25.如24所述的重组病毒体，其中所述启动子选自：
(a)与同其可操作连接的所述核酸异源的启动子；
(b)促进所述核酸的组织特异性表达的启动子，优选地其中所述启动子促进造血细胞特异性表达或红细胞谱系特异性表达；
(c)促进所述核酸的组成型表达的启动子；和
(d)可诱导性表达的启动子，任选地响应于代谢物或小分子或化学实体来表达。
26.如24或25所述的重组病毒体，其中所述启动子选自CMV启动子、β-珠蛋白启动子、CAG启动子、AHSP启动子、MND启动子、Wiskott-Aldrich启动子和PKLR启动子。
27.如1-26中任一项所述的重组病毒体，其中所述异源核酸编码编码RNA和/或非编码RNA。
28.如25所述的重组病毒体，其中编码编码RNA的所述异源核酸包含：
(a)编码蛋白质或其片段，优选地人蛋白质或其片段的基因；
(b)编码核酸酶，任选地转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、megaTAL或CRISPR核酸内切酶(例如，Cas9核酸内切酶或其变体)的核酸；
(c)编码报告蛋白，例如荧光素酶或GFP的核酸；和/或
(d)编码药物抗性蛋白，例如新霉素抗性蛋白的核酸。
29.如27或28所述的重组病毒体，其中编码编码RNA的所述异源核酸被密码子优化用于在靶细胞中表达。
30.如27-29中任一项所述的重组病毒体，其中所述异源核酸包含编码选自以下的多肽或其片段的基因：(HBA1、HBA2、HBB、HBG1、HBG2、HBD、HBE1和/或HBZ)、α-血红蛋白稳定蛋白(AHSP)、凝血因子VIII、凝血因子IX、冯·维勒布兰德因子、肌营养不良蛋白或截短的肌营养不良蛋白、微肌营养不良蛋白、抗肌萎缩蛋白相关蛋白或截短的抗肌萎缩蛋白相关蛋白、微抗肌萎缩蛋白相关蛋白、usherin(USH2A)、CEP290、ATPB1、ATPB11、ABCB4、CPS1、ATP7B、KRT5、KRT14、PLEC1、Col7A1、ITGB4、ITGA6、LAMA3、LAMB3、LAMC2、KIND1、INS、F8或其片段(例如编码B结构域缺失多肽(例如VIII SQ、p-VIII)的片段)以及囊性纤维化跨膜转导调控因子(CFTR)。
31.如27所述的重组病毒体，其中所述非编码RNA包括lncRNA、piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA和/或指导RNA。
32.如27-31中任一项所述的重组病毒体，其中所述编码RNA、所述蛋白质或所述非编码RNA增加或恢复靶细胞的内源基因的表达。
33.如27-31中任一项所述的重组病毒体，其中所述编码RNA、所述蛋白质或所述非编码RNA降低或消除靶细胞的内源基因的表达。
34.如27-33中任一项所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体包含编码以下的核酸：(a)铁调素或其片段和/或稳态铁调控因子(HFE)或其片段；(b)至少一种靶向DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)；(c)靶向DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
35.如34所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体(a)增加所述转导细胞中HFE和/或铁调素的表达；和/或(b)降低所述转导细胞中DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的表达。
36.如34或35所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体预防或治疗血色沉着病、遗传性血色沉着病、幼年型血色沉着病和/或威尔逊氏病。
37.如27-33中任一项所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体包含编码以下的核酸：(a)TNFα受体的可溶形式、IL-6受体的可溶形式、IL-12受体的可溶形式和/或IL-1β受体的可溶形式；(b)至少一种靶向TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体和/或IL-1β受体的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)；(c)靶向TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体和/或IL-1β受体的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
38.如37所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体(a)增加所述转导细胞中TNFα受体的可溶形式、IL-6受体的可溶形式、IL-12受体的可溶形式或IL-1β受体的可溶形式的表达；和/或(b)降低所述转导细胞中TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体或IL-1β受体的表达。
39.如37或38所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体预防或治疗类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病关节炎、幼年型慢性关节炎、银屑病和/或强直性脊柱炎。
40.如27-33中任一项所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体包含编码选自以下的蛋白质或其片段的核酸：IRGM、NOD2、ATG2B、ATG9、ATG5、ATG7、ATG16L1、BECN1、EI24/PIG8、TECPR2、WDR45/WIP14、CHMP2B、CHMP4B、Dynein、EPG5、HspB8、LAMP2、LC3b UVRAG、VCP/p97、ZFYVE26、PARK2/Parkin、PARK6/PINK1、SQSTM1/p62、SMURF、AMPK和ULK1。
41.如40所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体增加所述转导细胞中所述蛋白质或其片段的表达。
42.如40或41所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体调节自噬。
43.如40-42中任一项所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体预防或治疗自噬相关疾病。
44.如43所述的重组病毒体，其中所述自噬相关疾病选自癌症、神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、共济失调)、炎性疾病、炎症性肠病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化、慢性阻塞性肺病/COPD、肺纤维化、囊性纤维化、干燥综合征、高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、胰岛素抵抗性糖尿病(例如，门登霍尔综合征、沃纳综合征、矮怪病和脂肪缺乏性糖尿病)、血脂异常、高脂血症、低密度脂蛋白(LDL)升高、高密度脂蛋白(HDL)降低、甘油三酯升高、代谢综合征、肝病、肾病、心血管疾病、局部缺血、中风、再灌注期间的并发症、肌肉退化、萎缩、衰老症状(例如，肌肉萎缩、虚弱、代谢障碍、低度炎症、动脉粥样硬化、中风、年龄相关性痴呆和散发形式的阿尔茨海默氏病、癌前状态和包括抑郁症在内的精神疾病)、脊髓损伤、动脉粥样硬化、传染病(例如，细菌、真菌、病毒)、AIDS、结核病、胚胎发育缺陷、不育症、溶酶体贮积病、活化因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷脂贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸病、达农病、法布里病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病(I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积症(婴儿型、晚期婴儿型/青少年型和成人型/慢性)、亨特综合征(MPS II)、I-细胞病/粘脂沉积症II、婴儿游离唾液酸贮积症(ISSD)、青少年己糖胺酶A缺乏症、克拉贝病、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、赫勒综合征、谢伊综合征、赫-谢二氏综合征、桑菲里波综合征、A型和B型莫尔基奥、马-拉米综合征、斯莱综合征、粘脂贮积病、多发性硫酸盐缺乏症、尼曼匹克病、神经元蜡样脂褐质沉积症、CLN6病、詹-比二氏病、庞贝病、致密性成骨不全症、桑霍夫病、辛德勒病、泰-萨二氏病和沃尔曼病。
45.如27-33中任一项所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体包含编码以下的核酸：(a)CFTR或其片段，(b)至少一种靶向CFTR的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，(c)靶向CFTR的内源性突变形式的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
46.如45所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体(a)增加CFTR或其片段的表达；和/或(b)降低转导细胞中CFTR的内源性突变形式的表达。
47.如45或46所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体预防或治疗囊性纤维化。
48.如1-47中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸包含非编码DNA。
49.如48所述的重组病毒体，其中所述非编码DNA包含：
(a)转录调控元件(例如，增强子、转录终止序列、非翻译区(5’UTR或3’UTR)、近端启动子元件、基因座控制区、聚腺苷酸化信号序列)，和/或
(b)翻译调控元件(例如，Kozak序列，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)。
50.如49所述的重组病毒体，其中所述转录调控元件是基因座控制区，任选地是β-珠蛋白LCR或β-珠蛋白LCR的DNA酶超敏感位点(HS)。
51.如1-50中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸包含与所述靶细胞的基因组安全港(GSH)的核酸序列具有至少约80％同一性的核酸序列。
52.如51所述的重组病毒体，其中将与GSH具有至少约80％同一性的核酸置于待整合的所述核酸的5’和3’端，从而允许通过同源重组整合到靶基因组中的特定基因座。
53.如51或52所述的重组病毒体，其中所述GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5、NUPL2的基因间区域、胶原、HTRP、HI 1(HI 1基因座处的胸苷激酶编码核酸)、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR、RUNX1、KLHL7、mir684、KCNH2、GPNMB、MIR4540、MIR4475、MIR4476、PRL32P21、LOC105376031、LOC105376032、LOC105376030、MELK、EBLN3P、ZCCHC7或RNF38。
54.如53所述的重组病毒体，其中所述GSH为AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5或NUPL2的基因间区域。
55.如1-54中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸在转导后整合到靶细胞的基因组中。
56.如55所述的重组病毒体，其中所述核酸在转导后整合到靶细胞的基因组的GSH中。
57.如1-56中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸包含编码至少一种复制蛋白和衣壳蛋白或其变体的核酸序列。
58.如1-57中任一项所述的重组病毒体，其中所述病毒体是自主复制的。
59.如1-58中任一项所述的重组病毒体，其中所述病毒体结合和/或转导癌细胞或非癌细胞。
60.如1-59中任一项所述的重组病毒体，其中所述病毒体结合和/或转导干细胞(例如，造血干细胞、CD34+干细胞、CD36+干细胞、间充质干细胞、癌症干细胞)。
61.如1、3、4、8-18和21-60中任一项所述的重组病毒体，其中所述病毒体结合和/或转导表达转铁蛋白受体(CD71)的细胞。
62.如1-61中任一项所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体结合和/或转导造血细胞、造血祖细胞、造血干细胞、红系细胞、巨核细胞、红系祖细胞(EPC)、CD34+细胞、CD36+细胞、间充质干细胞、神经细胞、肠细胞、肠干细胞、肠上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、肠上皮细胞、肝脏细胞(例如，肝细胞、肝星状细胞(HSC)、库弗氏细胞(KC)、肝窦内皮细胞(LSEC))、脑微血管内皮细胞(BMVEC)、红系祖细胞、淋巴祖细胞、B淋巴母细胞、B细胞、T细胞、嗜碱性地方性伯基特淋巴瘤(EBL)、多染性成红细胞、表皮干细胞、P63阳性角质细胞源性干细胞、角质细胞、胰腺β细胞、K细胞、L细胞和/或正染性成红细胞。
63.如1-62中任一项所述的重组病毒体，其中所述至少一种衣壳蛋白或其变体包含相对于犬细小病毒N株(UniProtKB-P12930)或氨基酸序列SEQ ID NO:27具有一个或多个突变的VP2序列。
64.如63所述的重组病毒体，其中所述一个或多个突变位于具有氨基酸残基(i)91-95、(ii)297-301和/或(iii)320-324的VP2区域。
65.如63或64所述的重组病毒体，其中所述一个或多个突变包含取代、缺失和/或插入。
66.如63-65中任一项所述的重组病毒体，其中所述一个或多个突变改变了所述重组病毒体对参与使所述重组病毒体内化的至少一种细胞受体的亲和力和/或特异性，任选地其中所述至少一种细胞受体是转铁蛋白受体。
67.如63-66中任一项所述的重组病毒体，其中所述一个或多个突变改变：
a)所述重组病毒体对细胞的嗜性或亲和力；
b)所述重组病毒体转导细胞的能力；和/或
c)重组病毒体穿过细胞转胞吞的能力。
68.如1-67中任一项所述的重组病毒体，其中所述至少一种衣壳蛋白或其变体包含异源肽标签。
69.如68所述的重组病毒体，其中所述异源肽标签允许使用抗体、抗体的抗原结合片段或纳米抗体进行亲和纯化。
70.如68或69所述的重组病毒体，其中所述异源肽标签包含选自血凝素、His(例如6X-His)、FLAG、E-标签、TK15、Strep-标签II、AU1、AU5、Myc、Glu-Glu、KT3和IRS的表位/标签。
71.一种药物组合物，其包含1-70中任一项所述的重组病毒体；和载剂和/或稀释剂。
72.一种预防或治疗疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的如1-71中任一项所述的至少一种重组病毒体或药物组合物。
73.一种预防或治疗疾病的方法，其包括：
(a)获得多个细胞；
(b)用如1-71中任一项所述的至少一种重组病毒体或药物组合物转导细胞，任选地进一步选择或筛选所述转导细胞；和
(c)向有需要的受试者施用有效量的所述转导细胞。
74.如73所述的方法，其中所述细胞对所述受试者而言是自体的或同种异体的。
75.如72-74中任一项所述的方法，其中
(a)所述核酸编码蛋白质；或者
(b)所述核酸降低或消除内源基因的表达。
76.如72-75中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞经由血管内、脑内、肠胃外、腹膜内、静脉内、硬膜外、椎管内、胸骨内、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心内、肌内、鼻内、肺内、皮肤移植或口服施用来施用。
77.如72-76中任一项所述的方法，其中所述疾病选自内皮功能障碍、囊性纤维化、心血管疾病、肾病、癌症、血红蛋白病、贫血、血友病(例如血友病A)、骨髓增殖性疾病、凝血病、镰状细胞病、α-地中海贫血、β-地中海贫血、范可尼贫血、家族性肝内胆汁淤积、大疱性表皮松解症、法布里病、戈谢病、尼曼-匹克病(Nieman-Pick)A、尼曼-匹克病B、GM1神经节苷脂沉积症、粘多糖贮积症(MPS)I(赫勒综合征、谢伊综合征、赫勒/谢伊综合征)、MPS II(Hunter),MPS VI(马-拉米综合征)、血液癌症、血色沉着病、遗传性血色沉着病、幼年型血色沉着病、肝硬化、肝细胞癌、胰腺炎、糖尿病、心肌病、关节炎、性腺机能减退、心脏病、心脏病发作、甲状腺功能减退、葡萄糖不耐受、关节病、肝纤维化、威尔逊氏病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、泰-萨二氏病、神经退行性病症、1型脊髓性肌萎缩症、亨廷顿氏病、卡纳万氏病、类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病关节炎、幼年型慢性关节炎、银屑病和强直性脊柱炎以及自身免疫疾病、神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、共济失调)、炎性疾病、炎症性肠病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化、慢性阻塞性肺病/COPD、肺纤维化、干燥综合征、高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、胰岛素抵抗性糖尿病(例如，门登霍尔综合征、沃纳综合征、矮怪病和脂肪缺乏性糖尿病)、血脂异常、高脂血症、低密度脂蛋白(LDL)升高、高密度脂蛋白(HDL)降低、甘油三酯升高、代谢综合征、肝病、肾病、心血管疾病、局部缺血、中风、再灌注期间的并发症、肌肉退化、萎缩、衰老症状(例如，肌肉萎缩、虚弱、代谢障碍、低度炎症、动脉粥样硬化、中风、年龄相关性痴呆和散发形式的阿尔茨海默氏病、癌前状态和包括抑郁症在内的精神疾病)、脊髓损伤、动脉粥样硬化、传染病(例如，细菌、真菌、病毒)、AIDS、结核病、胚胎发育缺陷、不育症、溶酶体贮积病、活化因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷脂贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸病、达农病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病(I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积症(婴儿型、晚期婴儿型/青少年型和成人型/慢性)、亨特综合征(MPS II)、I-细胞病/粘脂贮积症II、婴儿游离唾液酸贮积症(ISSD)、青少年己糖胺酶A缺乏症、克拉贝病、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、赫勒综合征、谢伊综合征、赫-谢二氏综合征、桑菲里波综合征、A型和B型莫尔基奥病、马-拉米综合征、斯莱综合征、粘脂贮积症、多发性硫酸盐缺乏症、神经元蜡样脂褐质沉积症、CLN6病、詹-比二氏病、庞贝病、致密性成骨不全症、桑德霍夫病、辛德勒病和沃尔曼病。
78.如72-77中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物包含原细小病毒或其基因型变体的至少一种衣壳蛋白或其变体。
79.如78所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞包含编码以下的核酸：(a)铁调素或其片段和/或稳态铁调控因子(HFE)或其片段；(b)至少一种靶向DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)；(c)靶向DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
80.如78或79所述的方法，其中向所述受试者施用所述至少一种包含编码以下的核酸的重组病毒体或药物组合物：
a)铁调素或其片段，其中向所述受试者静脉内施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肝细胞；
b)HFE或其片段，其中向所述受试者静脉内施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肝细胞；
c)HFE或其片段，其中向所述受试者口服施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肠上皮细胞；
d)至少一种靶向HFE的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，其中向所述受试者静脉内施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肝细胞；
e)至少一种靶向HFE的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，其中向所述受试者口服施用至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肠上皮细胞；
f)至少一种靶向DMT-1的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，其中向所述受试者口服施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肠上皮细胞；
g)至少一种靶向铁转运蛋白的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，其中向所述受试者口服施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述重组病毒体或药物组合物转导肠上皮细胞；或者
h)a)至g)中任一项的两种或多种的组合。
81.如80所述的方法，其中所述组合包括b)至e)中任一项的两种或多种。
82.如78-81中任一项所述的方法，其中所述重组病毒体或药物组合物a)增加所述转导细胞中HFE或其片段和/或铁调素或其片段的表达；和/或b)降低所述转导细胞中DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的表达。
83.如78-82中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗血色沉着病、遗传性血色沉着病、幼年型血色沉着病和/或威尔逊氏病。
84.如78所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞包含编码以下的核酸：(a)TNFα受体的可溶形式、IL-6受体的可溶形式、IL-12受体的可溶形式和/或IL-1β受体的可溶形式；(b)至少一种靶向TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体和/或IL-1β受体的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)；(c)靶向TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体和/或IL-1β受体的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
85.如84所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物a)增加所述转导细胞中TNFα受体的可溶形式、IL-6受体的可溶形式、IL-12受体的可溶形式或IL-1β受体的可溶形式的表达；和/或b)降低所述转导细胞中TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体或IL-1β受体的表达。
86.如78、84和85中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病关节炎、幼年型慢性关节炎、银屑病和/或强直性脊柱炎。
87.如78所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞包含编码选自以下的蛋白质或其片段的核酸：IRGM、NOD2、ATG2B、ATG9、ATG5、ATG7、ATG16L1、BECN1、EI24/PIG8、TECPR2、WDR45/WIP14、CHMP2B、CHMP4B、Dynein、EPG5、HspB8、LAMP2、LC3bUVRAG、VCP/p97、ZFYVE26、PARK2/Parkin、PARK6/PINK1、SQSTM1/p62、SMURF、AMPK和ULK1。
88.如87所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物增加所述转导细胞中所述蛋白质或其片段的表达。
89.如78、87和88中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞调节自噬。
90.如78和87-89中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗自噬相关疾病。
91.如90所述的方法，其中所述自噬相关疾病选自癌症、神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、共济失调)、炎性疾病、炎症性肠病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化、慢性阻塞性肺病/COPD、肺纤维化、囊性纤维化、干燥综合征、高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、胰岛素抵抗性糖尿病(例如，门登霍尔综合征、沃纳综合征、矮怪病和脂肪缺乏性糖尿病)、血脂异常、高脂血症、低密度脂蛋白(LDL)升高、高密度脂蛋白(HDL)降低、甘油三酯升高、代谢综合征、肝病、肾病、心血管疾病、局部缺血、中风、再灌注期间的并发症、肌肉退化、萎缩、衰老症状(例如，肌肉萎缩、虚弱、代谢障碍、低度炎症、动脉粥样硬化、中风、年龄相关性痴呆和散发形式的阿尔茨海默氏病、癌前状态和包括抑郁症在内的精神疾病)、脊髓损伤、动脉粥样硬化、传染病(例如，细菌、真菌、病毒)、AIDS、结核病、胚胎发育缺陷、不育症、溶酶体贮积病、活化因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷脂贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸病、达农病、法布里病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病(I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积症(婴儿型、晚期婴儿型/青少年型和成人型/慢性)、亨特综合征(MPS II)、I-细胞病/粘脂沉积症II、婴儿游离唾液酸贮积症(ISSD)、青少年己糖胺酶A缺乏症、克拉贝病、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、赫勒综合征、谢伊综合征、赫-谢二氏综合征、桑菲里波综合征、A型和B型莫尔基奥、马-拉米综合征、斯莱综合征、粘脂贮积病、多发性硫酸盐缺乏症、尼曼匹克病、神经元蜡样脂褐质沉积症、CLN6病、詹-比二氏病、庞贝病、致密性成骨不全症、桑霍夫病、辛德勒病、泰-萨二氏病和沃尔曼病。
92.如78所述的方法，其中所述原细小病毒是库塔病毒。
93.如92所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物靶向T细胞、B细胞和/或淋巴祖细胞。
94.如78、92和93中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗癌症。
95.如78或92所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞包含编码KRT5、KRT14、PLEC1、Col7A1、ITGB4、ITGA6、LAMA3、LAMB3、LAMC2和/或KIND1的核酸。
96.如95所述的方法，其中所述转导细胞是表皮干细胞、P63阳性角质细胞源性干细胞或角质细胞。
97.如95或96所述的方法，其还包括将所述转导细胞移植到所述受试者的皮肤上。
98.如95-97中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗大疱性表皮松解症。
99.如72-77中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物包含四细小病毒或其基因型变体的至少一种衣壳蛋白或其变体。
100.如99所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物包含编码选自以下的蛋白质或其片段的核酸：血红蛋白基因(HBA1、HBA2、HBB、HBG1、HBG2、HBD、HBE1和/或HBZ)、α-血红蛋白稳定蛋白(AHSP)、凝血因子VIII、凝血因子IX、冯·维勒布兰德因子、肌营养不良蛋白或截短的肌营养不良蛋白、微肌营养不良蛋白、抗肌萎缩蛋白相关蛋白或截短的抗肌萎缩蛋白相关蛋白、微抗肌萎缩蛋白相关蛋白、usherin(USH2A)、CEP290、ATPB1、ATPB11、ABCB4、CPS1、ATP7B、KRT5、KRT14、PLEC1、Col7A1、ITGB4、ITGA6、LAMA3、LAMB3、LAMC2、KIND1、INS、F8或其片段(例如编码B结构域缺失多肽(例如VIII SQ、p-VIII)的片段)以及囊性纤维化跨膜转导调控因子(CFTR)。
101.如99或100所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导(a)CD34+干细胞，任选地离体转导；(b)间充质干细胞，任选地离体转导；(c)肝脏细胞(例如肝细胞)，(d)小肠细胞，和/或(e)肺细胞。
102.如99-101中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物通过肝动脉、门静脉或静脉内施用递送至肝脏。
103.如99-101中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物通过口服施用递送至小肠。
104.如99-101中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物包含编码以下的核酸：(a)CFTR或其片段的核酸，(b)至少一种靶向CFTR的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，(c)靶向CFTR的内源性突变形式的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
105.如104所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物通过鼻内或肺内施用递送至肺部。
106.如99-101、104和105中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物(a)增加CFTR或其片段的表达；和/或(b)降低所述转导细胞中CFTR的内源性突变形式的表达。
107.如99-101和104-106中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物预防或治疗囊性纤维化。
108.如72-107中任一项所述的方法，其中所述方法还包括再施用至少一个额外量的所述病毒体、药物组合物或转导细胞。
109.如108所述的方法，其中在所述施用有效量的所述病毒体、药物组合物或转导细胞后在治疗中减毒之后，再施用所述至少一个额外量。
110.如108或109所述的方法，其中所述至少一个额外量与所述有效量相同。
111.如108或109所述的方法，其中所述方法还包括与所述有效量相比增加或减少至少一个额外量。
112.如111所述的方法，其中所述至少一个额外量基于所述重组病毒体的内源基因和/或核酸的表达而增加或减少。
113.如72-112中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用调节核酸表达的剂或使所述细胞与所述剂接触。
114.如113所述的方法，其中所述剂选自小分子、代谢物、寡核苷酸、核糖开关、肽、肽模拟物、激素、激素类似物和光。
115.如113或114所述的方法，其中所述剂选自四环素、cumate、他莫昔芬、雌激素和反义寡核苷酸(ASO)、雷帕霉素、FKCsA、蓝光、脱落酸(ABA)和核糖开关。
116.如72-115中任一项所述的方法，其还包括以一定间隔再施用所述剂一次或多次。
117.如116所述的方法，其中所述剂的再施用导致所述核酸的脉冲式表达。
118.如116或117所述的方法，其中基于由核酸表达的所述蛋白质的血清浓度和/或半衰期，增加或减少间隔之间的时间和/或剂的量。
119.一种调节细胞中的(i)基因表达或(ii)蛋白质的功能和/或结构的方法，所述方法包括用如1-71中任一项所述的病毒体或药物组合物转导细胞，所述病毒体或药物组合物包含调节所述细胞中的基因表达或蛋白质的功能和/或结构的核酸。
120.如119所述的方法，其中所述核酸包含编码CRISPRi或CRISPRa剂的序列。
121.如119或120所述的方法，其中所述基因表达或所述蛋白质的功能和/或结构得到增加或恢复。
122.如119或120所述的方法，其中所述基因表达或所述蛋白质的功能和/或结构得到降低或消除。
123.一种将异源核酸整合到细胞中的GSH的方法，其包括
(a)用根据1-71中任一项所述的一种或多种病毒体或药物组合物转导所述细胞，所述病毒体或药物组合物包含异源核酸，所述异源核酸在5’末端和3’末端侧接与靶GSH核酸具有至少约80％同一性的供体核酸序列；或者
(b)用根据1-71中任一项的一种或多种病毒体或药物组合物转导所述细胞，所述病毒体或药物组合物包含(i)异源核酸，所述异源核酸在5’末端和3’末端侧接与靶GSH核酸具有至少约80％同一性的供体核酸序列，和(ii)编码核酸酶(例如，Cas9或其变体、ZFN、TALEN)和/或指导RNA的核酸，其中所述核酸酶或所述核酸酶/gRNA复合物在GSH处形成DNA断裂，所述断裂用所述供体核酸修复，从而在GSH处整合异源核酸。
124.如123所述的方法，其中(i)侧接与靶GSH核酸具有至少约80％同一性的供体核酸的所述异源核酸在一个病毒体中转导，并且(ii)编码核酸酶和/或gRNA的核酸在不同的病毒体中转导。
125.如123或124所述的方法，其中所述GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5、NUPL2的基因间区域、胶原、HTRP、HI 1(HI 1基因座处的胸苷激酶编码核酸)、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR、RUNX1、KLHL7、mir684、KCNH2、GPNMB、MIR4540、MIR4475、MIR4476、PRL32P21、LOC105376031、LOC105376032、LOC105376030、MELK、EBLN3P、ZCCHC7或RNF38。
126.如123-125中任一项所述的方法，其中所述GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5或NUPL2的基因间区域。
127.一种产生根据1-70中任一项所述的重组病毒体的方法，其包括：
(1)提供至少一个载体，所述载体包含
(i)包含至少一个ITR核苷酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列任选地还包含与用于在靶细胞中表达的启动子可操作地连接的异源核酸，
(ii)包含编码所述原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和/或其变体的至少一个基因的核苷酸序列，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和
(iii)包含以下的核苷酸序列：
(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，
(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的所述至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或
(C)(A)和(B)的组合，
(2)将所述至少一种载体引入到昆虫细胞中，和
(3)在产生根据1-70中任一项所述的重组病毒体的条件下维持所述昆虫细胞。
128.如127所述的方法，其中提供了两种载体，
(a)包含如下核苷酸序列的第一载体，所述核苷酸序列包含至少一个ITR核苷酸序列，任选地还包含与用于在靶细胞中表达的启动子可操作地连接的异源核酸，和
(b)第二载体，其包含
(i)包含编码所述原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和/或其变体的至少一个基因的核苷酸序列，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和
(ii)如下核苷酸序列，其包含
(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，
(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的所述至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或
(C)(A)和(B)的组合。
129.如127所述的方法，其中提供了三种载体，
(a)包含如下核苷酸序列的第一载体，所述核苷酸序列包含至少一个ITR核苷酸序列，任选地还包含与用于在靶细胞中表达的启动子可操作地连接的异源核酸，
(b)包含如下核苷酸序列的第二载体，所述核苷酸序列包含编码所述原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和/或其变体的基因，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和
(c)包含如下核苷酸序列的第三载体，所述核苷酸序列包含
(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，
(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的所述至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或
(C)(A)和(B)的组合。
130.一种在昆虫细胞中产生根据1-70中任一项所述的重组病毒体的方法，所述方法包括：
(1)提供昆虫细胞，其包含
(i)包含至少一个ITR核苷酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列任选地还包含与用于在靶细胞中表达的启动子可操作地连接的异源核酸，
(ii)包含编码所述原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和/或其变体的至少一个基因的核苷酸序列，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和
(iii)包含以下的核苷酸序列：
(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，
(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的所述至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或
(C)(A)和(B)的组合，
其中(i)、(ii)、(iii)(A)、(iii)(B)和(iii)(C)中的至少一者被稳定整合到昆虫细胞基因组中，并且如果存在的话，至少一个载体包含(i)、(ii)、(iii)(A)、(iii)(B)和(iii)(C)核苷酸序列中未稳定整合到昆虫细胞基因组中的剩余者，以及
(2)在产生所述重组病毒体的条件下维持所述昆虫细胞。
131.如127-130中任一项所述的方法，其中所述原细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：食肉动物原细小病毒、食肉动物原细小病毒1、翼手目原细小病毒1、劳亚食虫目原细小病毒1、灵长类原细小病毒1、灵长类原细小病毒2、灵长类原细小病毒3、灵长类原细小病毒4、啮齿类原细小病毒1、啮齿类原细小病毒2、啮齿类原细小病毒3、有蹄类原细小病毒1和有蹄类原细小病毒2。
132.如127-131中任一项所述的方法，其中所述原细小病毒或其基因型变体选自犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、人布法病毒1、人布法病毒2、人布法病毒3、人图萨病毒、人库塔病毒、Wuharv细小病毒、猪细小病毒、小鼠微小病毒、果蝠布法病毒及其基因型变体。
133.如127-130中任一项所述的方法，其中所述四细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：翼手目四细小病毒1、灵长类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒2、有蹄类四细小病毒3和有蹄类四细小病毒4。
134.如127-130和133中任一项所述的方法，其中所述四细小病毒或其基因型变体选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3、黑猩猩细小病毒4、黄毛果蝠细小病毒、牛香港病毒1、牛香港病毒2、猪香港病毒、猪cn病毒、牦牛细小病毒、绵羊香港病毒1、负鼠四细小病毒、啮齿类四细小病毒、四细小病毒某个种及其基因型变体。
135.如127-130、133和134中任一项所述的方法，其中所述四细小病毒是人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3或其基因型变体。
136.如127-135中任一项所述的方法，其中原细小病毒的所述至少一种复制蛋白是犬细小病毒、布法病毒、库塔病毒或其基因型变体的NS-1蛋白。
137.如127-135中任一项所述的方法，其中四病毒的所述至少一种复制蛋白是人细小病毒4或其基因型变体的NS-1蛋白。
138.如127-137中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞来自鳞翅目的种。
139.如138所述的方法，其中所述鳞翅目的种是草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、甜菜夜蛾或粉纹夜蛾。
140.如127-139中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞是Sf9。
141.如127-140中任一项所述的方法，其中所述至少一种载体是杆状病毒载体、病毒载体或质粒。
142.如127-141中任一项所述的方法，其中所述至少一种载体是杆状病毒载体。
143.如127-142中任一项所述的方法，其中VP1包含与选自SEQ ID NO:4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20和22的序列具有至少约60％同一性的氨基酸序列。
144.如127-143中任一项所述的方法，其中VP2包含与选自SEQ ID NO:4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21和23的序列具有至少约60％同一性的氨基酸序列。
145.如127-144中任一项所述的方法，其中所述至少一个ITR包括：
(a)依赖性细小病毒ITR，
(b)AAV ITR，任选地AAV2 ITR，
(c)原细小病毒ITR，和/或
(d)四细小病毒ITR。
146.如127-145中任一项所述的方法，其中用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列包含：
(a)启动子，和/或
(b)Kozak样表达控制序列。
147.如146所述的方法，其中所述启动子包括：
(a)动物DNA病毒的立即早期启动子，
(b)昆虫病毒的立即早期启动子，或
(c)昆虫细胞启动子。
148.如147所述的方法，其中所述动物DNA病毒是巨细胞病毒(CMV)、原细小病毒、四细小病毒或AAV。
149.如147所述的方法，其中所述昆虫病毒是鳞翅目病毒或杆状病毒，任选地其中所述杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)。
150.如146-149中任一项所述的方法，其中所述启动子是多角体蛋白(polh)或立即早期1基因(IE-1)启动子。
151.如127-150中任一项所述的方法，其中包含AAV的至少一种复制蛋白的核苷酸序列包含编码Rep52和/或Rep78的核苷酸序列。
152.如127-151中任一项所述的方法，其中所述AAV是AAV2。
153.一种昆虫细胞，其包含至少一种载体，所述载体包含：
(i)包含至少一个ITR核苷酸序列的核苷酸序列，
(ii)包含编码所述原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和/或其变体的至少一个基因的核苷酸序列，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和
(iii)包含以下的核苷酸序列：
(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，
(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的所述至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或
(C)(A)和(B)的组合。
154.如153所述的昆虫细胞，其中(i)、(ii)、(iii)(A)、(iii)(B)和(iii)(C)中的至少一者被稳定整合到昆虫细胞基因组中。
155.如153或154所述的昆虫细胞，其中所述原细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：食肉动物原细小病毒、食肉动物原细小病毒1、翼手目原细小病毒1、劳亚食虫目原细小病毒1、灵长类原细小病毒1、灵长类原细小病毒2、灵长类原细小病毒3、灵长类原细小病毒4、啮齿类原细小病毒1、啮齿类原细小病毒2、啮齿类原细小病毒3、有蹄类原细小病毒1和有蹄类原细小病毒2。
156.如153-155中任一项所述的昆虫细胞，其中所述原细小病毒或其基因型变体选自犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、人布法病毒1、人布法病毒2、人布法病毒3、人图萨病毒、人库塔病毒、Wuharv细小病毒、猪细小病毒、小鼠微小病毒、果蝠布法病毒及其基因型变体。
157.如153或154所述的昆虫细胞，其中所述四细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：翼手目四细小病毒1、灵长类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒2、有蹄类四细小病毒3和有蹄类四细小病毒4。
158.如153、154和157中任一项所述的昆虫细胞，其中所述四细小病毒或其基因型变体选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3、黑猩猩细小病毒4、黄毛果蝠细小病毒、牛香港病毒1、牛香港病毒2、猪香港病毒、猪cn病毒、牦牛细小病毒、绵羊香港病毒1、负鼠四细小病毒、啮齿类四细小病毒、四细小病毒某个种及其基因型变体。
159.如153、154、157和158中任一项所述的昆虫细胞，其中所述四细小病毒是人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3或其基因型变体。
160.如153-159中任一项所述的昆虫细胞，其中原细小病毒的所述至少一种复制蛋白是犬细小病毒、布法病毒、库塔病毒或其基因型变体的NS-1蛋白。
161.如153-159中任一项所述的昆虫细胞，其中四病毒的所述至少一种复制蛋白是人细小病毒4或其基因型变体的NS-1蛋白。
162.如153-161中任一项的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞来自鳞翅目的种。
163.如162所述的昆虫细胞，其中所述鳞翅目的种是草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、甜菜夜蛾或粉纹夜蛾。
164.如153-163中任一项所述的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞是Sf9。
165.如153-164中任一项所述的昆虫细胞，其中所述至少一种载体是杆状病毒载体、病毒载体或质粒。
166.如153-165中任一项所述的昆虫细胞，其中所述至少一种载体是杆状病毒载体。
167.如153-166中任一项所述的昆虫细胞，其中VP1包含与选自SEQ ID NO:4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20和22的序列具有至少约60％同一性的氨基酸序列。
168.如153-167中任一项所述的昆虫细胞，其中VP2包含与选自SEQ ID NO:4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21和23的序列具有至少约60％同一性的氨基酸序列。
169.如153-168中任一项所述的昆虫细胞，其中所述至少一个ITR包括：
(a)依赖性细小病毒ITR，
(b)AAV ITR，任选地AAV2 ITR，
(c)原细小病毒ITR，和/或
(d)四细小病毒ITR。
170.如153-169中任一项所述的昆虫细胞，其中用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列包含：
(a)启动子，和/或
(b)Kozak样表达控制序列。
171.如170所述的昆虫细胞，其中所述启动子包括：
(a)动物DNA病毒的立即早期启动子，
(b)昆虫病毒的立即早期启动子，或
(c)昆虫细胞启动子。
172.如171所述的昆虫细胞，其中所述动物DNA病毒是巨细胞病毒(CMV)、原细小病毒、四细小病毒或AAV。
173.如171所述的昆虫细胞，其中所述昆虫病毒是鳞翅目病毒或杆状病毒，任选地其中所述杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)。
174.如170-173中任一项所述的昆虫细胞，其中所述启动子是多角体蛋白(polh)或立即早期1基因(IE-1)启动子。
175.如153-174中任一项所述的昆虫细胞，其中包含AAV的至少一种复制蛋白的所述核苷酸序列包含编码Rep52和/或Rep78的核苷酸序列。
176.如153-175中任一项所述的昆虫细胞，其中所述AAV是AAV2。
实施例
实施例1：含有犬细小病毒或人细小病毒4衣壳蛋白的重组病毒体的构建
重组病毒体的核酸
载体基因组设计由反向末端重复序列(ITR)，例如AAV末端回文序列的ITR构象异构体和表达或转录盒组成。基因表达盒由调控元件组成，所述调控元件通常表征为增强子和启动子元件。由RNA聚合酶复合物转录的区域由顺式作用调控元件(例如TATA盒)和5’非翻译外显子序列、内含子序列、翻译外显子序列、3’非翻译区、聚腺苷酸化信号序列组成。转录后元件包括翻译起始的Kozak基序和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。通过商业服务提供商化学合成特定载体，并将其连接到质粒中，以用于在大肠杆菌中繁殖。所述质粒最低限度地含有多个克隆位点、至少一个抗生素抗性基因、质粒复制起点和便于重组到杆状病毒基因组中的序列。两种常用的方法是：1.一种细菌系统，其中大肠杆菌携带杆状病毒基因组(bacmid)，其使用转座酶介导的重组将质粒基因转移到bacmid中。可通过在用选择性培养基制备的琼脂平板上生长来检测具有重组bacmid的大肠杆菌。将“阳性”菌落在悬浮培养基中扩增，接种后约3天收获bacmid。然后用bacmid转染Sf9细胞，所述bacmid在允许的昆虫细胞中产生感染性重组杆状病毒颗粒。2.或者，将载体DNA插入到穿梭质粒中，所述质粒具有侧接插入片段的几百个碱基对的杆状病毒DNA。用穿梭质粒和线性化杆状病毒亚基因组DNA共转染Sf9细胞恢复了缺失的杆状病毒元件，从而产生感染性重组杆状病毒。≤6kb的载体DNA存在于杆状病毒基因组(约135kb)中，并作为杆状病毒繁殖，除非Sf9细胞表达细小病毒非结构蛋白或Rep蛋白。然后Rep蛋白作用于ITR，允许解析载体和杆状病毒基因组，其中载体基因组然后自主复制杆状病毒基因组(图1B)。
由DNA组成的核酸
DNA可以是单链的或自身互补的(即分子内双链体)。如图1B所示，载体DNA的Rep-介导的复制通过几个中间体进行。这些复制中间体被加工成单链病毒体基因组，然而，产物的繁殖力可能压倒加工成单链病毒体基因组。在这种情况下，由分子内双链体分子组成的复制中间体，表示为RFm(图1B)，被包装到细小病毒衣壳中。尽管存在功能性ITR，但自身互补载体基因组的包装仍会发生。
DNA可以具有Rep蛋白依赖性复制起点(ori)。ori可以由Rep结合元件(RBE)组成，并且位于末端回文序列中。末端回文序列，被称为反向末端重复序列(ITR)，可以由完整回文序列和两个内部回文序列组成。ITR可以具有复制和衣壳中的衣壳化所需的顺式作用基序。
RBE表示Rep结合元件经典GCTC；RBE’表示非经典RBE、ITR交叉臂顶端的非配对的TTT；并且trs表示末端解析位点5’AGTTGG、GGTTGG等。Rep的催化酪氨酸(Y156)切割trs，并与可切割的5’胸苷形成共价连接。trs的突变导致切割效率低下或丧失，从而产生自身互补的DNA。或者，自身互补的病毒体基因组由RFm不完全加工的衣壳化引起。
包含犬细小病毒或人细小病毒4衣壳蛋白的重组病毒体的DNA复制
利用AAV ITR的复制-细小病毒DNA复制被称为“滚动发夹”复制。作为单链病毒体DNA，ITR形成能量稳定的T形结构(图1A)，其用作通过宿主细胞DNA聚合酶复合物进行DNA延伸的引物(图1B)。DNA合成是主导链的产生双链体中间体的加工过程，其中互补链通过ITR共价连接(图1B)。p5 Rep蛋白结合在结构上与滚环复制(RCR)蛋白相关，与ITR结合，从而形成多亚基复合物。Rep蛋白的解旋酶活性解开ITR，产生具有末端解析位点的单链泡(5’-GGT|TGA-3’)。胸苷之间的磷酸二酯键被Rep蛋白催化酪氨酸(AAV2＝Y156)的羟基攻击，从而与5’-胸苷形成酪氨酸-胸苷二酯。细胞DNA聚合酶复合物在末端解析位点延伸新产生的3-OH，将末端序列恢复到模板链上(图1B)。核蛋白复合物的解析通过未知过程发生。
将AAV ITR或同源ITR(例如细小病毒ITR)用于构建包含细小病毒衣壳蛋白的重组病毒体。
利用犬细小病毒(示例性原细小病毒)或人细小病毒4(示例性四细小病毒)末端重复序列和非结构(NS)蛋白-原细小病毒或四细小病毒的复制类似于AAV DNA复制，尽管末端回文序列是独特的，并且需要特定NS蛋白来加工复制中间体。重组犬细小病毒或人细小病毒4载体基因组可由末端侧接转基因盒的犬细小病毒或人细小病毒4组成。NS1依赖性滚动发夹复制过程类似于AAV Rep依赖性复制，并且衣壳含有任一极性的单链基因组。
衣壳化
将DNA衣壳化或包装到二十面体病毒衣壳中是需要能量源来克服将DNA压缩到有限体积中的反压力所产生的排斥力的主动过程。NS/Rep蛋白的ATP酶活性通过水解γ磷酸来转化三核苷酸的储存的化学能。所产生的反压力决定了衣壳中可容纳的DNA长度，即ATP酶/解旋酶的原动力可“推动”至高达12pN，例如一旦包装4,800个核苷酸，就可达到12pN。AAV p19 Rep蛋白是单体的、非加工性的解旋酶，其是有效衣壳化所必需的。虽然很少有数据支持Rep与衣壳之间的物理相互作用，但克服反压力需要在包装螺旋酶与衣壳之间形成稳定相互作用。这些相互作用的性质是未知的，并且核因子可以稳定或介导非结构蛋白与衣壳之间的相互作用。系统发育相关性原细小病毒/四细小病毒和依赖性细小病毒衣壳在序列水平上是不同的，因此，NS蛋白与异源属衣壳之间的相互作用可能不会产生有效衣壳化。
为了改善包含AAV2基因的基因组至犬细小病毒或人细小病毒4衣壳中的包装，使同源NS蛋白与AAV Rep蛋白在许可细胞中共表达：载体DNA复制需要AAV Rep78和Rep 52，并且犬细小病毒或人细小病毒4NS蛋白参与包装。
实施例2：产生制造包含犬细小病毒(CPV)衣壳蛋白的重组病毒体所必需的组分
使用杆状病毒表达载体(BEV)系统和Sf9细胞产生制造包含CPV衣壳蛋白的重组病毒体所必需的组分。
如图7所示，使用BEV表达重组CPV衣壳蛋白。通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE(图8A)和使用抗CPV VP2抗体进行的蛋白质印迹分析(图8B)证实过表达的CPV衣壳蛋白(VP1和VP2)。观察到表观分子量为大约80kDa和62kDa的条带，与预测的衣壳蛋白VP1(80.5kDa)和VP2(64.7kDa)的分子量一致。64.7kDa条带的轻微偏移可能是由于多肽的电荷或疏水性或其他因素。利用计算机设计来鉴定VP蛋白起始密码子。CPV衣壳蛋白的表达成功地适应了BEV表达系统。表达实现了CPV VP1/VP2比率的期望范围，其中VP2超过VP1。
产生具有侧接AAV2 ITR的GFP报告基因的转基因构建体(AAV2 ITR-GFP转基因；图9B)。使用BEV系统过表达AAV2 Rep蛋白，并通过蛋白质印迹分析确认其身份和量(图9A)。使用纯化的AAV2 Rep蛋白成功扩增AAV2 ITR-GFP转基因，从而证明AAV2ITR和Rep系统组分的功能性。图9C示出AAV2 ITR-GFP转基因的成功扩增，并证明AAV2 ITR和Rep系统组分的功能性。
实施例3：降低含有犬细小病毒衣壳蛋白的重组病毒体的转胞吞作用的衣壳修饰
受体介导的转胞吞作用是介导货物大分子穿过细胞内部的一种跨细胞转运。此细胞机制已被广泛研究，以介导生物分子转运到原本难以到达的组织，诸如脑实质。已知的介导细胞转胞吞作用的分子之一是转铁蛋白受体(TfR)。TfR在脑血屏障(BBB)和肠的M细胞中高度表达。犬细小病毒(CPV)利用犬转铁蛋白受体(TfR)内化靶细胞(PMCID:PMC2863798)并感染所述靶细胞。还据报告，CPV可以识别鼠和人的TfR对应物，并在表达人TfR的宿主细胞(PMCID:PMC114880)中内化。
货物蛋白或病毒颗粒转胞吞或保留在第一内化细胞中的能力依赖于蛋白质货物/病毒颗粒-TfR相互作用(PMCID:PMC6175443，PMCID:PMC3920563)的亲和力。CPV衣壳对TfR的高亲和力导致病毒颗粒从早期内质囊泡到晚期内体，增加酸化，促进内体逃逸，随后通过高尔基体逆向转运到细胞核，病毒DNA基因组被递送到细胞核，优先避免跨细胞转运。相反，弱的CPV颗粒-TfR相互作用促进了转胞吞作用，从而将货物分泌到对面。CPV和FPV VP2蛋白内的离散氨基酸变化调节衣壳转胞吞作用，从而提供具有明确组织嗜性的新型基因疗法工具。SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:27中加下划线的氨基酸残基限定了影响内化和转胞吞作用的VP2的受体结合结构域。这些残基的突变改变受体相互作用并调节转胞吞作用。例如，SEQID NO:4的氨基酸93和相邻残基参与TfR相互作用和宿主范围。CPV VP2(SEQ ID NO:4)的氨基酸300和相邻残基影响宿主范围(与TfR的相互作用)。此外，SEQ ID NO:4的氨基酸323和相邻残基参与TfR相互作用和宿主范围。
实施例4：增加病毒载体对推定细胞受体的亲和力和特异性的衣壳修饰
CPV和FPV VP2蛋白中的离散氨基酸变化调节衣壳对细胞受体TfR的亲和力，从而提供具有工程化组织嗜性的新型基因疗法工具。SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:27中加下划线的氨基酸残基限定了影响内化和转胞吞作用的受体结合结构域。这些残基的突变改变受体相互作用并调节转胞吞作用。例如，SEQ ID NO:4的氨基酸93和相邻残基参与TfR相互作用和宿主范围。CPV VP2(SEQ ID NO:4)的氨基酸300和相邻残基影响宿主范围(与TfR的相互作用)。此外，SEQ ID NO:4的氨基酸323和相邻残基参与TfR相互作用和宿主范围。
实施例5：犬细小病毒VP2示例性突变
构建了示例性重组犬细小病毒VP2，其具有SEQ ID NO:4中给出的氨基酸序列。SEQID NO:4或SEQ ID NO:27中加下划线的氨基酸残基限定了影响内化和转胞吞作用的受体结合结构域。在加下划线的残基中进行多个突变以改变受体相互作用并调节转胞吞作用(参见以下SEQ ID NO:27以及表4中的SEQ ID NO:4)。例如，SEQ ID NO:27的氨基酸93和相邻残基(氨基酸残基91-95)参与TfR相互作用和宿主范围。CPV VP2(SEQ ID NO:27)的氨基酸300和相邻残基(氨基酸残基297-301)影响宿主范围(与TfR的相互作用)。此外，SEQ ID NO:4的氨基酸323和相邻残基(氨基酸残基320-324)参与TfR相互作用和宿主范围。
SEQ ID NO:27犬细小病毒株N VP2
实施例6：使用昆虫细胞产生犬细小病毒或人细小病毒4重组病毒体
使Sf9细胞在无血清昆虫细胞培养基(HyClone SFX-昆虫细胞培养基)中生长，并从erlenmyer摇瓶(Corning)转移至Wave一次性生物反应器(GE Healthcare)中。使用Cellometer Autor 2000(Nexelcom)每天测定细胞密度和活力。调整体积以维持每毫升2百万至5百万个细胞的细胞密度。在最终体积(10L)和250万个细胞/ml的密度下，添加1:10,000(v:v)的杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)(冷冻保存的100倍浓缩细胞“塞”)。高度稀释的BIIC释放Rep-VP-Bac、NS-Bac和vg-Bac，它们处于非常低的感染复数(MOI)下，并且在初次感染期间几乎没有细胞被共感染。然而，后续感染循环释放大量的每种必需的杆状病毒，达到非常高的MOI，从而确保每个细胞被大量的病毒颗粒感染。将细胞在培养物中维持四天或直到活力下降至≤30％。
实施例7：犬细小病毒或人细小病毒4重组病毒体的纯化
重组犬细小病毒或人细小病毒4颗粒被分为细胞部分和细胞外部分。为了回收最大数量的颗粒，对包括细胞培养基在内的整个生物质进行处理。为了释放细胞内犬细小病毒或人细小病毒4颗粒，将Triton-X 100添加到生物反应器中，持续搅拌1h。将温度从27℃增加至37℃，然后在持续搅拌下向生物反应器中添加Benzonase(EMD Merck)或Turbonuclease(Accelagen,Inc.)(2u/ml)。使用分级深度过滤器净化生物质，然后过滤灭菌(0.2μm)并收集在无菌生物处理袋中。通过使用免疫亲和色谱介质进行的连续柱色谱以及Q-Sepharose阴离子交换来回收重组犬细小病毒或人细小病毒4颗粒。使用显示并记录UV吸收、pH和电导率的色谱图来确定洗涤和洗脱步骤的完成。每个步骤的相对效率通过蛋白质印迹分析来确定，并通过对输入材料(“装载”)、流过物、洗涤物和洗脱物的等分试样进行ddPCR或qPCR分析来定量确定。
免疫亲和色谱使用“纳米抗体”，即美洲驼和其他骆驼科的种中产生的单结构域免疫球蛋白的VhH区。为了产生纳米抗体，抗体供应商用犬细小病毒或人细小病毒4病毒样颗粒(即没有病毒体基因组的组装衣壳)免疫美洲驼。在用VP-Bac感染的Sf9细胞中制备犬细小病毒或人细小病毒4VLP，并使用氯化铯等密度梯度，随后使用尺寸排阻色谱法(Superdex200)来纯化。在初次(1x)/加强(2x)免疫方案之后，抗体服务提供商给美洲驼放血，并分离外周血单核细胞或从有核血细胞中提取的mRNA。使用对保守的VhH CDR侧翼区(FR1和FR 4)具有特异性的引物进行逆转录来产生cDNA，将其克隆到用于产生T7Select 10-3b噬菌体展示文库(EMD-Millipore)的质粒中。在几轮淘选以富集与犬细小病毒或人细小病毒4衣壳相互作用的噬菌体后，从噬斑中分离噬菌体克隆。将重组噬菌体感染的大肠杆菌混合到琼脂糖中，并作为覆盖层涂布到LB-琼脂平板上。使大肠杆菌生长至汇合，形成“菌苔”，在此溶解细菌，并在平板上出现为噬斑。为了鉴定与犬细小病毒或人细小病毒4结合的噬菌体，将硝酸纤维素滤膜置于琼脂平板表面上，以将蛋白质从噬斑转移至滤膜。将滤膜与用共价连接的辣根过氧化物酶(HRP)(EZLink Plus活化过氧化物酶试剂盒，ThermoFisher)修饰的犬细小病毒或人细小病毒4衣壳一起孵育，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤。可以用显色底物(NovexHRP显色底物，ThermoFisher)或化学发光底物(Pierce ECL蛋白质印迹底物，ThermoFisher)检测HRP活性。确定噬菌体中的cDNA序列，并将其连接到细菌表达质粒中，并用6xHis标签表达以进行纯化。将螯合柱纯化的纳米抗体共价连接到色谱介质，即NHS活化的Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare)。
通过结合、洗涤和从纳米抗体-琼脂糖凝胶柱洗脱，从澄清的Sf9细胞裂解物中回收犬细小病毒或人细小病毒4颗粒。通过对柱负载物和流过物进行蛋白质印迹来确定结合效率。当UV280nm吸光度恢复到基线(即预加载)值时，认为洗涤步骤完成。酸性pH偏移释放了从纳米抗体-琼脂糖凝胶介质中洗脱的病毒颗粒。将洗脱液收集在50nM Tris-Cl pH 7.2中以中和洗脱介质。
使用犬细小病毒或人细小病毒4特异性ELISA和qPCR来确定犬细小病毒或人细小病毒4载体颗粒的浓度，所述ELISA和qPCR可用于估计填充颗粒(即，含有载体基因组的颗粒)的百分比。
实施例8：CD34+细胞的纯化
用于所公开方法的CD34+细胞可以根据合适的方法进行纯化，例如在以下文章中描述的那些：Hayakama等人,Busulfan produces efficient human cell engraftment inNOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice,Stem Cells 27(1):175–182(2009)；Ochi等人,Multicolor Staining of Globin Subtypes Reveals Impaired Globin SwitchingDuring Erythropoiesis in Human Pluripotent Stem Cells,Stem CellsTranslational Medicine 3:792–800(2014)；以及McIntosh等人,Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ–l–KitW4l/W4l(NBSGW)Mice Support Multilineage Engraftment of HumanHematopoietic Cells,Stem Cell Reports 4:171–180(2015)。
实施例9：使用犬细小病毒重组病毒体对红系祖细胞进行体外或离体转导
犬细小病毒(CPV)的容量为野生型病毒体5.3kb基因组的大约110％，其长度为约5,855nt，其中约300nt为ITR所需要的，剩下5,555nt为“货物”所需要的。这表示比传统的腺相关病毒载体大1kb的容量。
重组CPV(rCPV)用于转导红系祖细胞。CPV对CD71(TfR)的亲和力提供了将治疗性转基因递送至红系祖细胞的改进方法，并且基因替换可以通过基因组编辑来完成。基因型校正细胞中的转基因表达有助于挽救分化细胞的表型，并导致临床改善。
由获得功能突变引起的血红蛋白病作为常染色体隐性性状遗传。杂合子个体倾向于为无症状的或受轻度影响，而两个等位基因都突变的个体受严重影响。因此，纠正或替换单个等位基因是临床上有益的。
由于β-地中海贫血和镰状细胞病(SCD)都是由表达血红蛋白β(HbB)的基因的不同突变引起的，因此基因替换策略有益于患有这两种疾病的患者。存在使用递送HbB表达盒的慢病毒载体(LV)的SCD临床研究。b-珠蛋白开放阅读框(ORF)受到珠蛋白等位基因座控制区(LCR)和b-珠蛋白启动子调控。为了适应LV，将最小LCR定位于三个抑制DNA甲基化和异染色质形成的DNA酶超敏感位点(HS)。随机整合的LV可整合到异染色质中，导致红细胞祖细胞(诸如成红细胞)中b-珠蛋白表达的关闭，因此没有表型纠正。
LCR元件HS维持LV DNA的开放式常染色质结构，无论整合位点如何。然而，与b-珠蛋白ORF(441bp和147个密码子)相比，最小化LCR相对较大，限制了病毒载体递送选项。
将HbB盒插入到基因组安全港(GSH)基因座中。与构成哺乳动物基因组大约45％的可转座元件相反，可遗传的整合型细小病毒基因组(或内源性病毒元件，EVE)出现在数百个物种的极少数基因座中。EVE是容许外源性DNA插入而不影响短时间线上的胚胎发生、发育、成熟等以及地质时间线上的进化/物种形成的位点的基因组标记。据推测，由于外源性DNA插入的破坏性影响，在许多不同物种中积累超过1亿年的EVE基因座非常少。尽管在高度多样化的系统发育分类群中有许多物种含有EVE，但似乎仅有限数量的基因组位点受到影响，这有助于在模型系统(诸如小鼠)中对EVE作为GSH进行经验分析。哺乳动物物种中EVE基因座的保守性允许我们确定人和小鼠基因组中的同源位点。然而，很可能不是所有的GSH都支持所有组织类型的长期稳定性表达。使用计算机分析，包括RNAeq和ATACseq数据库，可以将GSH基因座定位到在靶组织中主动表达的亚基因组区域。因此，对于β-血红蛋白病，成红细胞是特别令人所关注的。
利用GSH基因座，即成红细胞中主动表达染色质的主动染色质区域，避免了使用LCR元件以确保LV整合处的常染色质化的必要性。
使用靶向核酸酶的同源定向修复(HDR)过程改进重组的效率和特异性。侧接治疗基因的“同源臂”将载体DNA引导至靶向基因座。通过细胞DNA修复途径酶或人工过程(例如CRISPR/Cas9核酸酶)进行重组，将转基因整合到GSH中。
除了b-珠蛋白启动子之外，其他启动子也已用于在许多细胞类型和转基因小鼠品系中长期高水平表达。
例如，血红蛋白是由2x HbA链和2x HbB链组成的异四聚体。在不存在HbB的情况下，HbA链自我缔合并形成细胞毒性聚集物。α-血红蛋白稳定蛋白(AHSP)在前红细胞中共表达，以防止α-珠蛋白亚基的聚集。AHSP启动子在红细胞前体中具有高活性，并已被充分表征。
作为另一个实例，CAG启动子增强子是由巨细胞病毒增强子与鸡β-珠蛋白启动子和外显子1和内含子1以及外显子2的剪接受体的融合物工程化的合成启动子。
作为另一个实例，MND启动子是活性造血细胞
作为另一个实例，Wiskott-Aldrich启动子在造血细胞中具有活性。
作为另一个实例，PKLR启动子在造血细胞中具有活性。
通过白细胞单采术(leukophresis)分离外周血干细胞(PBSC)。
通过在37℃水浴中快速解冻来回收Hemofreeze袋中冷冻保存的外周血细胞。将这些解冻的细胞悬浮在4℃的4％ HSA中，并通过在4℃以450g离心5分钟来洗涤两次。通过覆盖在10％ HSA上并在4℃下以450g离心15分钟来将血小板去除两次。通过覆盖在Ficoll–Hypaque(FH；1.077g/cm3；Pharmacia Fine Chemicals,Piscataway,NJ,USA)上并在4℃下以400g离心25分钟来去除红细胞。收集界面单核细胞(Pl-,FH细胞)，在洗涤溶液中洗涤两次，并在4℃下重悬于4％ HSA中(MN细胞)。使用尼龙纤维注射器(NF-S)去除粘附细胞。将五克NF装入到50ml一次性注射器中。将单核细胞转移到另一个50ml注射器中，并且轻轻输注到NF-S中，然后在4℃下孵育5分钟。然后通过NF-S的活塞将MN细胞收集到50ml注射器中，并将细胞汇集在50ml锥形管中。将这些合并的细胞在4℃下以400g离心5分钟，并在4℃下重悬于4％ HSA中(NF细胞)。然后立即遵循制造商的说明在Isolex磁性细胞分离系统(Isolex50；Baxter Healthcare,Immunotherapy Division,Newbury,UK)上对细胞悬浮液进行处理以用于CD34+选择。简言之，将细胞与9C5鼠免疫球蛋白G1(IgG1)抗人CD34抗体(10m g/1×108个NF细胞)在4℃下孵育15分钟，缓慢头尾翻转旋转。致敏后，在4℃下用4％ HSA洗涤细胞，以去除任何过量/未结合的抗体。然后将Dynabeads(Oslo,Norway)以1:10最终珠粒/细胞比率添加到洗涤的致敏细胞中。在4℃下混合30分钟后，细胞结合的微球和游离的微球通过磁体(Dynal MPC-1,Dynal,Fort Lee,NJ,USA)附着到壁上，并且去除没有结合到微球的任何游离细胞。将该洗涤程序在4℃下用4％ HSA重复两次。在4℃下将Dynabead与CD34+细胞之间的连接用PR34+干细胞释放剂切割30分钟。通过磁铁从CD34+细胞中去除游离的Dynabeads。在25℃下使用含有1％ ACD-A和1％ HSA的D-PBS收集细胞。通过流式细胞术控制所得细胞产物。
实施例10：使用犬细小病毒重组病毒体或人细小病毒4重组病毒体的脉冲式基因表达
包含编码因子VIII(FVIII)的核酸、F8或编码B结构域缺失多肽的片段的犬细小病毒重组病毒体或人细小病毒4，用于转导肝细胞作为血友病A的疗法。FVIII是必需的凝血蛋白，也称为抗血友病因子(AHF)。在人中，因子VIII由F8基因编码。此基因的缺陷导致血友病A，其为隐性X连锁凝血障碍。因子VIII在全身肝脏外的肝窦细胞和内皮细胞中产生。
先前已尝试增加F8基因的表达以治疗血友病A。例如，在患有严重血友病A的患者中测试Valoctocogene Roxaparvovec(也称为BMN270 or)，其为腺病毒相关病毒(AAV5)载体介导的人因子VIII的基因转移(ClinicalTrials.gov Identifiers：NCT02576795；NCT03370913；NCT03392974；NCT03520712)。然而，FDA在2020年拒绝了它的批准，要求长期的安全性和有效性数据。可能需要长期数据来缓解对剂量增加的担忧，剂量增加可能随后导致转基因的逐渐基因表达。
FVIII已是难以在微生物或真核生物表达系统中产生的重组蛋白。缺失的“B结构域”的开发提高了表达水平并减少了开放阅读框的大小，然而，FVIII表达水平基本上低于其他蛋白质。为了克服这些低水平，增加了Valoctocogene Roxaparvovec病毒载体的临床剂量。用6E+13载体颗粒(称为载体基因组，或vg)/kg治疗患者。基于大型动物模型，用rAAV5-FVIII转导一小部分肝细胞。由于每个细胞有大量vg，转导细胞表达相对大量的FVIII。FVIII表达的代谢需求可能破坏肝细胞蛋白表达的正常需求。正常参与蛋白质折叠和分泌的肝细胞隔室可能因FVIII而充血。产生FVIII的内皮细胞可能专门用于此活性，并在高度调控的天然FVIII启动子的转录控制下，由单一X染色体上的等位基因产生FVIII。
因此，本文假设，肝细胞稳态的扰乱产生了诱导炎症状态的细胞应激。通过使用rAAV-FVIII载体中所用的组成型高活性启动子来加重代谢和蛋白质折叠/输出负担。炎症和细胞因子的产生可能导致细胞更新或细胞死亡。
为了回避此问题并为了解决对血友病A疗法的长期需求，对犬细小病毒重组病毒体或人细小病毒4载体进行工程化，使其包含(a)基因F8或(b)B结构域缺失的基因F8。犬细小病毒重组病毒体或人细小病毒4病毒载体包装更大基因组大小的能力提供了优于目前在临床试验中使用的rAAV5的优势，并且能够包装全长F8基因，这在AAV载体的情况下是不可能的。此外，与Valoctocogene Roxaparvovec在临床试验中使用的组成型高活性启动子相反，犬细小病毒重组病毒体或人细小病毒4重组载体是用诱导型表达系统制备的。
诱导型表达系统将F8基因保持在默认的转录关闭状态，直到试剂开启或解除表达抑制(参见例如图6)。脉冲式表达使肝细胞免于过表达应激。脉冲的时间(即开启基因表达的时间)可以由FVIII的初始血清水平(t0)和半衰期(t1/2)来确定。据估计t1/2为9至14天，因此使用14天(2周)t1/2，并且轻度血友病被定义为FVIII水平≥5％正常。
转基因表达＝150％
68天下降到5％
在此，每月诱导表达，产生治疗水平的FVIII。
已开发了多种ASO化学物质(反义寡核苷酸ASO或AON)来增加细胞中的t1/2。在此，使用具有相对短t1/2的ASO化学物质来实现FVIII表达的脉冲，所述脉冲随着ASO从细胞中清除而减少。凭经验确定最佳t1/2，尤其是基于转导细胞数量、启动子活性和转录物成熟的动力学来确定。
以引用方式并入
本文提及的所有出版物、专利和专利申请都以引入方式整体并入本文，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请都被具体和单独地指出以引用方式并入一样。在冲突的情况下，以本申请，包括本文的任何定义为准。
等效方案
本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文所描述的发明的具体实施方案的很多等效方案。所述等效方案意图由以下权利要求涵盖。
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Claims (176)

1.一种重组病毒体，其包含(1)原细小病毒或其基因型变体的至少一种衣壳蛋白或其变体；和(2)核酸，其中所述核酸包含异源核酸。
2.一种重组病毒体，其包含(1)四细小病毒或其基因型变体的至少一种衣壳蛋白或其变体；和(2)核酸，其中所述核酸包含异源核酸。
3.如权利要求1所述的重组病毒体，其中所述原细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：食肉动物原细小病毒、食肉动物原细小病毒1、翼手目原细小病毒1、劳亚食虫目原细小病毒1、灵长类原细小病毒1、灵长类原细小病毒2、灵长类原细小病毒3、灵长类原细小病毒4、啮齿类原细小病毒1、啮齿类原细小病毒2、啮齿类原细小病毒3、有蹄类原细小病毒1和有蹄类原细小病毒2。
4.如权利要求1或3所述的重组病毒体，其中所述原细小病毒或其基因型变体选自犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、人布法病毒1、人布法病毒2、人布法病毒3、人图萨病毒、人库塔病毒、Wuharv细小病毒、猪细小病毒、小鼠微小病毒、果蝠布法病毒及其基因型变体。
5.如权利要求2所述的重组病毒体，其中所述四细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：翼手目四细小病毒1、灵长类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒2、有蹄类四细小病毒3和有蹄类四细小病毒4。
6.如权利要求2或5所述的重组病毒体，其中所述四细小病毒或其基因型变体选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3、黑猩猩细小病毒4、黄毛果蝠细小病毒、牛香港病毒1、牛香港病毒2、猪香港病毒、猪cn病毒、牦牛细小病毒、绵羊香港病毒1、负鼠四细小病毒、啮齿类四细小病毒、四细小病毒某个种及其基因型变体。
7.如权利要求6所述的重组病毒体，其中所述四细小病毒是人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3或其基因型变体。
8.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述病毒体为二十面体。
9.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述衣壳蛋白或其变体包含结构蛋白VP1和/或VP2。
10.如权利要求9所述的重组病毒体，其中VP2的存在量超过VP1。
11.如权利要求9或10所述的重组病毒体，其中VP1包含与选自SEQ ID NO:4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20和22的序列具有至少约60％同一性、约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性、约95％同一性、约96％同一性、约97％同一性、约98％同一性、约99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
12.如权利要求9至11中任一项所述的重组病毒体，其中VP2包含与选自SEQ ID NO:4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21和23的序列具有至少约60％同一性、约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性、约95％同一性、约96％同一性、约97％同一性、约98％同一性、约99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
13.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述异源核酸包含与靶细胞的核酸序列具有至少约60％同一性的核酸序列。
14.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述异源核酸与哺乳动物的核酸具有至少约60％的同一性，优选地其中所述哺乳动物是人。
15.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述异源核酸不与原细小病毒或四细小病毒启动子可操作地连接。
16.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸包含至少一个反向末端重复(ITR)。
17.如权利要求16所述的重组病毒体，其中所述至少一个ITR包括：
(a)依赖性细小病毒ITR，
(b)AAVITR，任选地AAV2 ITR，
(c)原细小病毒ITR，或
(d)四细小病毒ITR。
18.如权利要求17所述的重组病毒体，其中所述原细小病毒ITR选自犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、人布法病毒1、人布法病毒2、人布法病毒3、人图萨病毒、人库塔病毒、Wuharv细小病毒、猪细小病毒、小鼠微小病毒、果蝠布法病毒及其基因型变体的ITR。
19.如权利要求17所述的重组病毒体，其中所述四细小病毒ITR选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3、黑猩猩细小病毒4、黄毛果蝠细小病毒、牛香港病毒1、牛香港病毒2、猪香港病毒、猪cn病毒、牦牛细小病毒、绵羊香港病毒1、负鼠四细小病毒、啮齿类四细小病毒、四细小病毒某个种及其基因型变体的ITR。
20.如权利要求17或19所述的重组病毒体，其中所述四细小病毒ITR选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3及其基因型变体的ITR。
21.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
22.如权利要求21所述的重组病毒体，其中所述DNA是单链或自身互补双链体。
23.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸包含Rep蛋白依赖性复制起点(ori)。
24.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸包含与启动子可操作地连接的核酸，所述启动子任选地位于两个ITR之间。
25.如权利要求24所述的重组病毒体，其中所述启动子选自：
(a)与同其可操作连接的所述核酸异源的启动子；
(b)促进所述核酸的组织特异性表达的启动子，优选地其中所述启动子促进造血细胞特异性表达或红细胞谱系特异性表达；
(c)促进所述核酸的组成型表达的启动子；和
(d)可诱导性表达的启动子，任选地响应于代谢物或小分子或化学实体来表达。
26.如权利要求24或25所述的重组病毒体，其中所述启动子选自CMV启动子、β-珠蛋白启动子、CAG启动子、AHSP启动子、MND启动子、Wiskott-Aldrich启动子和PKLR启动子。
27.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述异源核酸编码编码RNA和/或非编码RNA。
28.如权利要求25所述的重组病毒体，其中编码编码RNA的所述异源核酸包含：
(a)编码蛋白质或其片段，优选地人蛋白质或其片段的基因；
(b)编码核酸酶，任选地转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、megaTAL或CRISPR核酸内切酶(例如，Cas9核酸内切酶或其变体)的核酸；
(c)编码报告蛋白，例如荧光素酶或GFP的核酸；和/或
(d)编码药物抗性蛋白，例如新霉素抗性蛋白的核酸。
29.如权利要求27或28所述的重组病毒体，其中编码编码RNA的所述异源核酸被密码子优化用于在靶细胞中表达。
30.如权利要求27至29中任一项所述的重组病毒体，其中所述异源核酸包含编码选自以下的多肽或其片段的基因：(HBA1、HBA2、HBB、HBG1、HBG2、HBD、HBE1和/或HBZ)、α-血红蛋白稳定蛋白(AHSP)、凝血因子VIII、凝血因子IX、冯·维勒布兰德因子、肌营养不良蛋白或截短的肌营养不良蛋白、微肌营养不良蛋白、抗肌萎缩蛋白相关蛋白或截短的抗肌萎缩蛋白相关蛋白、微抗肌萎缩蛋白相关蛋白、usherin(USH2A)、CEP290、ATPB1、ATPB11、ABCB4、CPS1、ATP7B、KRT5、KRT14、PLEC1、Col7A1、ITGB4、ITGA6、LAMA3、LAMB3、LAMC2、KIND1、INS、F8或其片段(例如编码B结构域缺失多肽(例如VIII SQ、p-VIII)的片段)以及囊性纤维化跨膜转导调控因子(CFTR)。
31.如权利要求27所述的重组病毒体，其中所述非编码RNA包括lncRNA、piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA和/或指导RNA。
32.如权利要求27至31中任一项所述的重组病毒体，其中所述编码RNA、所述蛋白质或所述非编码RNA增加或恢复靶细胞的内源基因的表达。
33.如权利要求27至31中任一项所述的重组病毒体，其中所述编码RNA、所述蛋白质或所述非编码RNA降低或消除靶细胞的内源基因的表达。
34.如权利要求27至33中任一项所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体包含编码以下的核酸：(a)铁调素或其片段和/或稳态铁调控因子(HFE)或其片段；(b)至少一种靶向DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)；(c)靶向DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
35.如权利要求34所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体(a)增加所述转导细胞中HFE和/或铁调素的表达；和/或(b)降低所述转导细胞中DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的表达。
36.如权利要求34或35所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体预防或治疗血色沉着病、遗传性血色沉着病、幼年型血色沉着病和/或威尔逊氏病。
37.如权利要求27至33中任一项所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体包含编码以下的核酸：(a)TNFα受体的可溶形式、IL-6受体的可溶形式、IL-12受体的可溶形式和/或IL-1β受体的可溶形式；(b)至少一种靶向TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体和/或IL-1β受体的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)；(c)靶向TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体和/或IL-1β受体的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
38.如权利要求37所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体(a)增加所述转导细胞中TNFα受体的可溶形式、IL-6受体的可溶形式、IL-12受体的可溶形式或IL-1β受体的可溶形式的表达；和/或(b)降低所述转导细胞中TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体或IL-1β受体的表达。
39.如权利要求37或38所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体预防或治疗类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病关节炎、幼年型慢性关节炎、银屑病和/或强直性脊柱炎。
40.如权利要求27至33中任一项所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体包含编码选自以下的蛋白质或其片段的核酸：IRGM、NOD2、ATG2B、ATG9、ATG5、ATG7、ATG16L1、BECN1、EI24/PIG8、TECPR2、WDR45/WIP14、CHMP2B、CHMP4B、Dynein、EPG5、HspB8、LAMP2、LC3bUVRAG、VCP/p97、ZFYVE26、PARK2/Parkin、PARK6/PINK1、SQSTM1/p62、SMURF、AMPK和ULK1。
41.如权利要求40所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体增加所述转导细胞中所述蛋白质或其片段的表达。
42.如权利要求40或41所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体调节自噬。
43.如权利要求40至42中任一项所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体预防或治疗自噬相关疾病。
44.如权利要求43所述的重组病毒体，其中所述自噬相关疾病选自癌症、神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、共济失调)、炎性疾病、炎症性肠病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化、慢性阻塞性肺病/COPD、肺纤维化、囊性纤维化、干燥综合征、高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、胰岛素抵抗性糖尿病(例如，门登霍尔综合征、沃纳综合征、矮怪病和脂肪缺乏性糖尿病)、血脂异常、高脂血症、低密度脂蛋白(LDL)升高、高密度脂蛋白(HDL)降低、甘油三酯升高、代谢综合征、肝病、肾病、心血管疾病、局部缺血、中风、再灌注期间的并发症、肌肉退化、萎缩、衰老症状(例如，肌肉萎缩、虚弱、代谢障碍、低度炎症、动脉粥样硬化、中风、年龄相关性痴呆和散发形式的阿尔茨海默氏病、癌前状态和包括抑郁症在内的精神疾病)、脊髓损伤、动脉粥样硬化、传染病(例如，细菌、真菌、病毒)、AIDS、结核病、胚胎发育缺陷、不育症、溶酶体贮积病、活化因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷脂贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸病、达农病、法布里病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病(I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积症(婴儿型、晚期婴儿型/青少年型和成人型/慢性)、亨特综合征(MPS II)、I-细胞病/粘脂沉积症II、婴儿游离唾液酸贮积症(ISSD)、青少年己糖胺酶A缺乏症、克拉贝病、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、赫勒综合征、谢伊综合征、赫-谢二氏综合征、桑菲里波综合征、A型和B型莫尔基奥、马-拉米综合征、斯莱综合征、粘脂贮积病、多发性硫酸盐缺乏症、尼曼匹克病、神经元蜡样脂褐质沉积症、CLN6病、詹-比二氏病、庞贝病、致密性成骨不全症、桑霍夫病、辛德勒病、泰-萨二氏病和沃尔曼病。
45.如权利要求27至33中任一项所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体包含编码以下的核酸：(a)CFTR或其片段，(b)至少一种靶向CFTR的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，(c)靶向CFTR的内源性突变形式的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
46.如权利要求45所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体(a)增加CFTR或其片段的表达；和/或(b)降低转导细胞中CFTR的内源性突变形式的表达。
47.如权利要求45或46所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体预防或治疗囊性纤维化。
48.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸包含非编码DNA。
49.如权利要求48所述的重组病毒体，其中所述非编码DNA包含：
(a)转录调控元件(例如，增强子、转录终止序列、非翻译区(5’UTR或3’UTR)、近端启动子元件、基因座控制区、聚腺苷酸化信号序列)，和/或
(b)翻译调控元件(例如，Kozak序列，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)。
50.如权利要求49所述的重组病毒体，其中所述转录调控元件是基因座控制区，任选地是β-珠蛋白LCR或β-珠蛋白LCR的DNA酶超敏感位点(HS)。
51.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸包含与所述靶细胞的基因组安全港(GSH)的核酸序列具有至少约80％同一性的核酸序列。
52.如权利要求51所述的重组病毒体，其中将与GSH具有至少约80％同一性的核酸置于待整合的所述核酸的5’和3’端，从而允许通过同源重组整合到靶基因组中的特定基因座。
53.如权利要求51或52所述的重组病毒体，其中所述GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5、NUPL2的基因间区域、胶原、HTRP、HI 1(HI 1基因座处的胸苷激酶编码核酸)、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR、RUNX1、KLHL7、mir684、KCNH2、GPNMB、MIR4540、MIR4475、MIR4476、PRL32P21、LOC105376031、LOC105376032、LOC105376030、MELK、EBLN3P、ZCCHC7或RNF38。
54.如权利要求53所述的重组病毒体，其中所述GSH为AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5或NUPL2的基因间区域。
55.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸在转导后整合到靶细胞的基因组中。
56.如权利要求55所述的重组病毒体，其中所述核酸在转导后整合到靶细胞的基因组的GSH中。
57.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述核酸包含编码至少一种复制蛋白和衣壳蛋白或其变体的核酸序列。
58.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述病毒体是自主复制的。
59.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述病毒体结合和/或转导癌细胞或非癌细胞。
60.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述病毒体结合和/或转导干细胞(例如，造血干细胞、CD34+干细胞、CD36+干细胞、间充质干细胞、癌症干细胞)。
61.如权利要求1、3、4、8至18和21至60中任一项所述的重组病毒体，其中所述病毒体结合和/或转导表达转铁蛋白受体(CD71)的细胞。
62.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体结合和/或转导造血细胞、造血祖细胞、造血干细胞、红系细胞、巨核细胞、红系祖细胞(EPC)、CD34+细胞、CD36+细胞、间充质干细胞、神经细胞、肠细胞、肠干细胞、肠上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、肠上皮细胞、肝脏细胞(例如，肝细胞、肝星状细胞(HSC)、库弗氏细胞(KC)、肝窦内皮细胞(LSEC))、脑微血管内皮细胞(BMVEC)、红系祖细胞、淋巴祖细胞、B淋巴母细胞、B细胞、T细胞、嗜碱性地方性伯基特淋巴瘤(EBL)、多染性成红细胞、表皮干细胞、P63阳性角质细胞源性干细胞、角质细胞、胰腺β细胞、K细胞、L细胞和/或正染性成红细胞。
63.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述至少一种衣壳蛋白或其变体包含相对于犬细小病毒N株(UniProtKB-P12930)或氨基酸序列SEQ ID NO:27具有一个或多个突变的VP2序列。
64.如权利要求63所述的重组病毒体，其中所述一个或多个突变位于具有氨基酸残基(i)91-95、(ii)297-301和/或(iii)320-324的VP2区域。
65.如权利要求63或64所述的重组病毒体，其中所述一个或多个突变包含取代、缺失和/或插入。
66.如权利要求63至65中任一项所述的重组病毒体，其中所述一个或多个突变改变了所述重组病毒体对参与使所述重组病毒体内化的至少一种细胞受体的亲和力和/或特异性，任选地其中所述至少一种细胞受体是转铁蛋白受体。
67.如权利要求63至66中任一项所述的重组病毒体，其中所述一个或多个突变改变：
a)所述重组病毒体对细胞的嗜性或亲和力；
b)所述重组病毒体转导细胞的能力；和/或
c)所述重组病毒体穿过所述细胞转胞吞的能力。
68.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒体，其中所述至少一种衣壳蛋白或其变体包含异源肽标签。
69.如权利要求68所述的重组病毒体，其中所述异源肽标签允许使用抗体、抗体的抗原结合片段或纳米抗体进行亲和纯化。
70.如权利要求68或69所述的重组病毒体，其中所述异源肽标签包含选自血凝素、His(例如6X-His)、FLAG、E-标签、TK15、Strep-标签II、AU1、AU5、Myc、Glu-Glu、KT3和IRS的表位/标签。
71.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的重组病毒体；和载剂和/或稀释剂。
72.一种预防或治疗疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1至71中任一项所述的至少一种重组病毒体或药物组合物。
73.一种预防或治疗疾病的方法，其包括：
(a)获得多个细胞；
(b)用权利要求1至71中任一项所述的至少一种重组病毒体或药物组合物转导细胞，任选地进一步选择或筛选所述转导细胞；和
(c)向有需要的受试者施用有效量的所述转导细胞。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述细胞对所述受试者而言是自体的或同种异体的。
75.如权利要求72至74中任一项所述的方法，其中：
(a)所述核酸编码蛋白质；或者
(b)所述核酸降低或消除内源基因的表达。
76.如权利要求72至75中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞经由血管内、脑内、肠胃外、腹膜内、静脉内、硬膜外、椎管内、胸骨内、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心内、肌内、鼻内、肺内、皮肤移植或口服施用来施用。
77.如权利要求72至76中任一项所述的方法，其中所述疾病选自内皮功能障碍、囊性纤维化、心血管疾病、肾病、癌症、血红蛋白病、贫血、血友病(例如血友病A)、骨髓增殖性疾病、凝血病、镰状细胞病、α-地中海贫血、β-地中海贫血、范可尼贫血、家族性肝内胆汁淤积、大疱性表皮松解症、法布里病、戈谢病、尼曼-匹克病A、尼曼-匹克病B、GM1神经节苷脂沉积症、粘多糖贮积症(MPS)I(赫勒综合征、谢伊综合征、赫勒/谢伊综合征)、MPS II(Hunter),MPSVI(马-拉米综合征)、血液癌症、血色沉着病、遗传性血色沉着病、幼年型血色沉着病、肝硬化、肝细胞癌、胰腺炎、糖尿病、心肌病、关节炎、性腺机能减退、心脏病、心脏病发作、甲状腺功能减退、葡萄糖不耐受、关节病、肝纤维化、威尔逊氏病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、泰-萨二氏病、神经退行性病症、1型脊髓性肌萎缩症、亨廷顿氏病、卡纳万氏病、类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病关节炎、幼年型慢性关节炎、银屑病和强直性脊柱炎以及自身免疫疾病、神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、共济失调)、炎性疾病、炎症性肠病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化、慢性阻塞性肺病/COPD、肺纤维化、干燥综合征、高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、胰岛素抵抗性糖尿病(例如，门登霍尔综合征、沃纳综合征、矮怪病和脂肪缺乏性糖尿病)、血脂异常、高脂血症、低密度脂蛋白(LDL)升高、高密度脂蛋白(HDL)降低、甘油三酯升高、代谢综合征、肝病、肾病、心血管疾病、局部缺血、中风、再灌注期间的并发症、肌肉退化、萎缩、衰老症状(例如，肌肉萎缩、虚弱、代谢障碍、低度炎症、动脉粥样硬化、中风、年龄相关性痴呆和散发形式的阿尔茨海默氏病、癌前状态和包括抑郁症在内的精神疾病)、脊髓损伤、动脉粥样硬化、传染病(例如，细菌、真菌、病毒)、AIDS、结核病、胚胎发育缺陷、不育症、溶酶体贮积病、活化因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷脂贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸病、达农病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病(I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积症(婴儿型、晚期婴儿型/青少年型和成人型/慢性)、亨特综合征(MPS II)、I-细胞病/粘脂贮积症II、婴儿游离唾液酸贮积症(ISSD)、青少年己糖胺酶A缺乏症、克拉贝病、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、赫勒综合征、谢伊综合征、赫-谢二氏综合征、桑菲里波综合征、A型和B型莫尔基奥病、马-拉米综合征、斯莱综合征、粘脂贮积症、多发性硫酸盐缺乏症、神经元蜡样脂褐质沉积症、CLN6病、詹-比二氏病、庞贝病、致密性成骨不全症、桑德霍夫病、辛德勒病和沃尔曼病。
78.如权利要求72至77中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物包含原细小病毒或其基因型变体的至少一种衣壳蛋白或其变体。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞包含编码以下的核酸：(a)铁调素或其片段和/或稳态铁调控因子(HFE)或其片段；(b)至少一种靶向DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)；(c)靶向DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
80.如权利要求78或79所述的方法，其中向所述受试者施用所述至少一种包含编码以下的核酸的重组病毒体或药物组合物：
a)铁调素或其片段，其中向所述受试者静脉内施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肝细胞；
b)HFE或其片段，其中向所述受试者静脉内施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肝细胞；
c)HFE或其片段，其中向所述受试者口服施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肠上皮细胞；
d)至少一种靶向HFE的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，其中向所述受试者静脉内施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肝细胞；
e)至少一种靶向HFE的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，其中向所述受试者口服施用至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肠上皮细胞；
f)至少一种靶向DMT-1的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，其中向所述受试者口服施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导肠上皮细胞；
g)至少一种靶向铁转运蛋白的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，其中向所述受试者口服施用所述至少一种重组病毒体或药物组合物，任选地其中(i)所述核酸可操作地连接至启动子，和/或(ii)所述重组病毒体或药物组合物转导肠上皮细胞；或者
h)a)至g)中任一项的两种或多种的组合。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述组合包括b)至e)中任一项的两种或多种。
82.如权利要求78至81中任一项所述的方法，其中所述重组病毒体或药物组合物a)增加所述转导细胞中HFE或其片段和/或铁调素或其片段的表达；和/或b)降低所述转导细胞中DMT-1、铁转运蛋白和/或HFE的内源性突变形式的表达。
83.如权利要求78至82中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗血色沉着病、遗传性血色沉着病、幼年型血色沉着病和/或威尔逊氏病。
84.如权利要求78所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞包含编码以下的核酸：(a)TNFα受体的可溶形式、IL-6受体的可溶形式、IL-12受体的可溶形式和/或IL-1β受体的可溶形式；(b)至少一种靶向TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体和/或IL-1β受体的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)；(c)靶向TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体和/或IL-1β受体的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物a)增加所述转导细胞中TNFα受体的可溶形式、IL-6受体的可溶形式、IL-12受体的可溶形式或IL-1β受体的可溶形式的表达；和/或b)降低所述转导细胞中TNFα受体、IL-6受体、IL-12受体或IL-1β受体的表达。
86.如权利要求78、84和85中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病关节炎、幼年型慢性关节炎、银屑病和/或强直性脊柱炎。
87.如权利要求78所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞包含编码选自以下的蛋白质或其片段的核酸：IRGM、NOD2、ATG2B、ATG9、ATG5、ATG7、ATG16L1、BECN1、EI24/PIG8、TECPR2、WDR45/WIP14、CHMP2B、CHMP4B、Dynein、EPG5、HspB8、LAMP2、LC3b UVRAG、VCP/p97、ZFYVE26、PARK2/Parkin、PARK6/PINK1、SQSTM1/p62、SMURF、AMPK和ULK1。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物增加所述转导细胞中所述蛋白质或其片段的表达。
89.如权利要求78、87和88中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞调节自噬。
90.如权利要求78和87至89中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗自噬相关疾病。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述自噬相关疾病选自癌症、神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、共济失调)、炎性疾病、炎症性肠病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化、慢性阻塞性肺病/COPD、肺纤维化、囊性纤维化、干燥综合征、高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、胰岛素抵抗性糖尿病(例如，门登霍尔综合征、沃纳综合征、矮怪病和脂肪缺乏性糖尿病)、血脂异常、高脂血症、低密度脂蛋白(LDL)升高、高密度脂蛋白(HDL)降低、甘油三酯升高、代谢综合征、肝病、肾病、心血管疾病、局部缺血、中风、再灌注期间的并发症、肌肉退化、萎缩、衰老症状(例如，肌肉萎缩、虚弱、代谢障碍、低度炎症、动脉粥样硬化、中风、年龄相关性痴呆和散发形式的阿尔茨海默氏病、癌前状态和包括抑郁症在内的精神疾病)、脊髓损伤、动脉粥样硬化、传染病(例如，细菌、真菌、病毒)、AIDS、结核病、胚胎发育缺陷、不育症、溶酶体贮积病、活化因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷脂贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸病、达农病、法布里病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病(I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积症(婴儿型、晚期婴儿型/青少年型和成人型/慢性)、亨特综合征(MPS II)、I-细胞病/粘脂沉积症II、婴儿游离唾液酸贮积症(ISSD)、青少年己糖胺酶A缺乏症、克拉贝病、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、赫勒综合征、谢伊综合征、赫-谢二氏综合征、桑菲里波综合征、A型和B型莫尔基奥、马-拉米综合征、斯莱综合征、粘脂贮积病、多发性硫酸盐缺乏症、尼曼匹克病、神经元蜡样脂褐质沉积症、CLN6病、詹-比二氏病、庞贝病、致密性成骨不全症、桑霍夫病、辛德勒病、泰-萨二氏病和沃尔曼病。
92.如权利要求78所述的方法，其中所述原细小病毒是库塔病毒。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物靶向T细胞、B细胞和/或淋巴祖细胞。
94.如权利要求78、92和93中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗癌症。
95.如权利要求78或92所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞包含编码KRT5、KRT14、PLEC1、Col7A1、ITGB4、ITGA6、LAMA3、LAMB3、LAMC2和/或KIND1的核酸。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述转导细胞是表皮干细胞、P63阳性角质细胞源性干细胞或角质细胞。
97.如权利要求95或96所述的方法，其还包括将所述转导细胞移植到所述受试者的皮肤上。
98.如权利要求95至97中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体、药物组合物或转导细胞预防或治疗大疱性表皮松解症。
99.如权利要求72至77中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物包含四细小病毒或其基因型变体的至少一种衣壳蛋白或其变体。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物包含编码选自以下的蛋白质或其片段的核酸：血红蛋白基因(HBA1、HBA2、HBB、HBG1、HBG2、HBD、HBE1和/或HBZ)、α-血红蛋白稳定蛋白(AHSP)、凝血因子VIII、凝血因子IX、冯·维勒布兰德因子、肌营养不良蛋白或截短的肌营养不良蛋白、微肌营养不良蛋白、抗肌萎缩蛋白相关蛋白或截短的抗肌萎缩蛋白相关蛋白、微抗肌萎缩蛋白相关蛋白、usherin(USH2A)、CEP290、ATPB1、ATPB11、ABCB4、CPS1、ATP7B、KRT5、KRT14、PLEC1、Col7A1、ITGB4、ITGA6、LAMA3、LAMB3、LAMC2、KIND1、INS、F8或其片段(例如编码B结构域缺失多肽(例如VIIISQ、p-VIII)的片段)以及囊性纤维化跨膜转导调控因子(CFTR)。
101.如权利要求99或100所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物转导(a)CD34+干细胞，任选地离体转导；(b)间充质干细胞，任选地离体转导；(c)肝脏细胞(例如肝细胞)，(d)小肠细胞，和/或(e)肺细胞。
102.如权利要求99至101中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物通过肝动脉、门静脉或静脉内施用递送至肝脏。
103.如权利要求99至101中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物通过口服施用递送至小肠。
104.如权利要求99至101中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物包含编码以下的核酸：(a)CFTR或其片段，(b)至少一种靶向CFTR的内源性突变形式的非编码RNA(例如，piRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义RNA)，(c)靶向CFTR的内源性突变形式的CRISPR/Cas系统；和/或(d)(a)至(c)中列出的任一种核酸的任何组合。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物通过鼻内或肺内施用递送至肺部。
106.如权利要求99至101、104和105中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物(a)增加CFTR或其片段的表达；和/或(b)降低所述转导细胞中CFTR的内源性突变形式的表达。
107.如权利要求99至101和104至106中任一项所述的方法，其中所述至少一种重组病毒体或药物组合物预防或治疗囊性纤维化。
108.如权利要求72至107中任一项所述的方法，其中所述方法还包括再施用至少一个额外量的所述病毒体、药物组合物或转导细胞。
109.如权利要求108所述的方法，其中在所述施用有效量的所述病毒体、药物组合物或转导细胞后在治疗中减毒之后，再施用所述至少一个额外量。
110.如权利要求108或109所述的方法，其中所述至少一个额外量与所述有效量相同。
111.如权利要求108或109所述的方法，其中所述方法还包括与所述有效量相比增加或减少至少一个额外量。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述至少一个额外量基于所述重组病毒体的内源基因和/或核酸的表达而增加或减少。
113.如权利要求72至112中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用调节所述核酸表达的剂或使所述细胞与所述剂接触。
114.如权利要求113所述的方法，其中所述剂选自小分子、代谢物、寡核苷酸、核糖开关、肽、肽模拟物、激素、激素类似物和光。
115.如权利要求113或114所述的方法，其中所述剂选自四环素、cumate、他莫昔芬、雌激素和反义寡核苷酸(ASO)、雷帕霉素、FKCsA、蓝光、脱落酸(ABA)和核糖开关。
116.如权利要求72至115中任一项所述的方法，其还包括以一定间隔再施用所述剂一次或多次。
117.如权利要求116所述的方法，其中所述剂的再施用导致所述核酸的脉冲式表达。
118.如权利要求116或117所述的方法，其中基于由核酸表达的所述蛋白质的血清浓度和/或半衰期，增加或减少间隔之间的时间和/或剂的量。
119.一种调节细胞中的(i)基因表达或(ii)蛋白质的功能和/或结构的方法，所述方法包括用权利要求1至71中任一项所述的病毒体或药物组合物转导所述细胞，所述病毒体或药物组合物包含调节所述细胞中的所述基因表达或所述蛋白质的功能和/或结构的核酸。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述核酸包含编码CRISPRi或CRISPRa剂的序列。
121.如权利要求119或120所述的方法，其中所述基因表达或所述蛋白质的功能和/或结构得到增加或恢复。
122.如权利要求119或120所述的方法，其中所述基因表达或所述蛋白质的功能和/或结构得到降低或消除。
123.一种将异源核酸整合到细胞中的GSH的方法，其包括
(a)用根据权利要求1至71中任一项所述的一种或多种病毒体或药物组合物转导所述细胞，所述病毒体或药物组合物包含异源核酸，所述异源核酸在5’末端和3’末端侧接与靶GSH核酸具有至少约80％同一性的供体核酸序列；或者
(b)用根据权利要求1至71中任一项的一种或多种病毒体或药物组合物转导所述细胞，所述病毒体或药物组合物包含(i)异源核酸，所述异源核酸在5’末端和3’末端侧接与靶GSH核酸具有至少约80％同一性的供体核酸序列，和(ii)编码核酸酶(例如，Cas9或其变体、ZFN、TALEN)和/或指导RNA的核酸，其中所述核酸酶或所述核酸酶/gRNA复合物在GSH处形成DNA断裂，所述断裂用所述供体核酸修复，从而在GSH处整合异源核酸。
124.如权利要求123所述的方法，其中(i)侧接与所述靶GSH核酸具有至少约80％同一性的供体核酸的所述异源核酸在一个病毒体中转导，并且(ii)编码核酸酶和/或gRNA的核酸在不同的病毒体中转导。
125.如权利要求123或124所述的方法，其中所述GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5、NUPL2的基因间区域、胶原、HTRP、HI 1(HI 1基因座处的胸苷激酶编码核酸)、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR、RUNX1、KLHL7、mir684、KCNH2、GPNMB、MIR4540、MIR4475、MIR4476、PRL32P21、LOC105376031、LOC105376032、LOC105376030、MELK、EBLN3P、ZCCHC7或RNF38。
126.如权利要求123至125中任一项所述的方法，其中所述GSH是AAVS1、ROSA26、CCR5、Kif6、Pax5或NUPL2的基因间区域。
127.一种产生根据权利要求1至70中任一项所述的重组病毒体的方法，其包括：
(1)提供至少一个载体，所述载体包含
(i)包含至少一个ITR核苷酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列任选地还包含与用于在靶细胞中表达的启动子可操作地连接的异源核酸，
(ii)包含编码所述原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和/或其变体的至少一个基因的核苷酸序列，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和
(iii)包含以下的核苷酸序列：
(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，
(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的所述至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或
(C)(A)和(B)的组合，
(2)将所述至少一种载体引入到昆虫细胞中，和
(3)在产生根据权利要求1至70中任一项所述的重组病毒体的条件下维持所述昆虫细胞。
128.如权利要求127所述的方法，其中提供了两种载体，
(a)包含如下核苷酸序列的第一载体，所述核苷酸序列包含至少一个ITR核苷酸序列，任选地还包含与用于在靶细胞中表达的启动子可操作地连接的异源核酸，和
(b)第二载体，其包含
(i)包含编码所述原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和/或其变体的至少一个基因的核苷酸序列，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和
(ii)如下核苷酸序列，其包含
(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，
(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的所述至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或
(C)(A)和(B)的组合。
129.如权利要求127所述的方法，其中提供了三种载体，
(a)包含如下核苷酸序列的第一载体，所述核苷酸序列包含至少一个ITR核苷酸序列，任选地还包含与用于在靶细胞中表达的启动子可操作地连接的异源核酸，
(b)包含如下核苷酸序列的第二载体，所述核苷酸序列包含编码所述原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和/或其变体的基因，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和
(c)包含如下核苷酸序列的第三载体，所述核苷酸序列包含
(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，
(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的所述至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或
(C)(A)和(B)的组合。
130.一种在昆虫细胞中产生根据权利要求1至70中任一项所述的重组病毒体的方法，所述方法包括：
(1)提供昆虫细胞，其包含
(i)包含至少一个ITR核苷酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列任选地还包含与用于在靶细胞中表达的启动子可操作地连接的异源核酸，
(ii)包含编码所述原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和/或其变体的至少一个基因的核苷酸序列，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和
(iii)包含以下的核苷酸序列：
(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，
(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的所述至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或
(C)(A)和(B)的组合，
其中(i)、(ii)、(iii)(A)、(iii)(B)和(iii)(C)中的至少一者被稳定整合到昆虫细胞基因组中，并且如果存在的话，至少一个载体包含(i)、(ii)、(iii)(A)、(iii)(B)和(iii)(C)核苷酸序列中未稳定整合到昆虫细胞基因组中的剩余者，以及
(2)在产生所述重组病毒体的条件下维持所述昆虫细胞。
131.如权利要求127至130中任一项所述的方法，其中所述原细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：食肉动物原细小病毒、食肉动物原细小病毒1、翼手目原细小病毒1、劳亚食虫目原细小病毒1、灵长类原细小病毒1、灵长类原细小病毒2、灵长类原细小病毒3、灵长类原细小病毒4、啮齿类原细小病毒1、啮齿类原细小病毒2、啮齿类原细小病毒3、有蹄类原细小病毒1和有蹄类原细小病毒2。
132.如权利要求127至131中任一项所述的方法，其中所述原细小病毒或其基因型变体选自犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、人布法病毒1、人布法病毒2、人布法病毒3、人图萨病毒、人库塔病毒、Wuharv细小病毒、猪细小病毒、小鼠微小病毒、果蝠布法病毒及其基因型变体。
133.如权利要求127至130中任一项所述的方法，其中所述四细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：翼手目四细小病毒1、灵长类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒2、有蹄类四细小病毒3和有蹄类四细小病毒4。
134.如权利要求127至130和133中任一项所述的方法，其中所述四细小病毒或其基因型变体选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3、黑猩猩细小病毒4、黄毛果蝠细小病毒、牛香港病毒1、牛香港病毒2、猪香港病毒、猪cn病毒、牦牛细小病毒、绵羊香港病毒1、负鼠四细小病毒、啮齿类四细小病毒、四细小病毒某个种及其基因型变体。
135.如权利要求127至130、133和134中任一项所述的方法，其中所述四细小病毒是人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3或其基因型变体。
136.如权利要求127至135中任一项所述的方法，其中原细小病毒的所述至少一种复制蛋白是犬细小病毒、布法病毒、库塔病毒或其基因型变体的NS-1蛋白。
137.如权利要求127至135中任一项所述的方法，其中四病毒的所述至少一种复制蛋白是人细小病毒4或其基因型变体的NS-1蛋白。
138.如权利要求127至137中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞来自鳞翅目的种。
139.如权利要求138所述的方法，其中所述鳞翅目的种是草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、甜菜夜蛾或粉纹夜蛾。
140.如权利要求127至139中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞是Sf9。
141.如权利要求127至140中任一项所述的方法，其中所述至少一种载体是杆状病毒载体、病毒载体或质粒。
142.如权利要求127至141中任一项所述的方法，其中所述至少一种载体是杆状病毒载体。
143.如权利要求127至142中任一项所述的方法，其中VP1包含与选自SEQ ID NO:4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20和22的序列具有至少约60％同一性的氨基酸序列。
144.如权利要求127至143中任一项所述的方法，其中VP2包含与选自SEQ ID NO:4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21和23的序列具有至少约60％同一性的氨基酸序列。
145.如权利要求127至144中任一项所述的方法，其中所述至少一个ITR包括：
(a)依赖性细小病毒ITR，
(b)AAV ITR，任选地AAV2 ITR，
(c)原细小病毒ITR，和/或
(d)四细小病毒ITR。
146.如权利要求127至145中任一项所述的方法，其中用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列包含：
(a)启动子，和/或
(b)Kozak样表达控制序列。
147.如权利要求146所述的方法，其中所述启动子包括：
(a)动物DNA病毒的立即早期启动子，
(b)昆虫病毒的立即早期启动子，或
(c)昆虫细胞启动子。
148.如权利要求147所述的方法，其中所述动物DNA病毒是巨细胞病毒(CMV)、原细小病毒、四细小病毒或AAV。
149.如权利要求147所述的方法，其中所述昆虫病毒是鳞翅目病毒或杆状病毒，任选地其中所述杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)。
150.如权利要求146至149中任一项所述的方法，其中所述启动子是多角体蛋白(polh)或立即早期1基因(IE-1)启动子。
151.如权利要求127至150中任一项所述的方法，其中包含AAV的至少一种复制蛋白的核苷酸序列包含编码Rep52和/或Rep78的核苷酸序列。
152.如权利要求127至151中任一项所述的方法，其中所述AAV是AAV2。
153.一种昆虫细胞，其包含至少一种载体，所述载体包含：
(i)包含至少一个ITR核苷酸序列的核苷酸序列，
(ii)包含编码所述原细小病毒或四细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和/或其变体的至少一个基因的核苷酸序列，所述基因与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接，和
(iii)包含以下的核苷酸序列：
(A)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的原细小病毒或四细小病毒的至少一种复制蛋白，
(B)AAV的至少一种复制蛋白，任选地其中AAV的所述至少一种复制蛋白包含(a)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列，和/或(b)与用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列，或
(C)(A)和(B)的组合。
154.如权利要求153所述的昆虫细胞，其中(i)、(ii)、(iii)(A)、(iii)(B)和(iii)(C)中的至少一者被稳定整合到昆虫细胞基因组中。
155.如权利要求153或154所述的昆虫细胞，其中所述原细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：食肉动物原细小病毒、食肉动物原细小病毒1、翼手目原细小病毒1、劳亚食虫目原细小病毒1、灵长类原细小病毒1、灵长类原细小病毒2、灵长类原细小病毒3、灵长类原细小病毒4、啮齿类原细小病毒1、啮齿类原细小病毒2、啮齿类原细小病毒3、有蹄类原细小病毒1和有蹄类原细小病毒2。
156.如权利要求153至155中任一项所述的昆虫细胞，其中所述原细小病毒或其基因型变体选自犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、人布法病毒1、人布法病毒2、人布法病毒3、人图萨病毒、人库塔病毒、Wuharv细小病毒、猪细小病毒、小鼠微小病毒、果蝠布法病毒及其基因型变体。
157.如权利要求153或154所述的昆虫细胞，其中所述四细小病毒或其基因型变体是选自以下的种：翼手目四细小病毒1、灵长类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒1、有蹄类四细小病毒2、有蹄类四细小病毒3和有蹄类四细小病毒4。
158.如权利要求153、154和157中任一项所述的昆虫细胞，其中所述四细小病毒或其基因型变体选自人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3、黑猩猩细小病毒4、黄毛果蝠细小病毒、牛香港病毒1、牛香港病毒2、猪香港病毒、猪cn病毒、牦牛细小病毒、绵羊香港病毒1、负鼠四细小病毒、啮齿类四细小病毒、四细小病毒某个种及其基因型变体。
159.如权利要求153、154、157和158中任一项所述的昆虫细胞，其中所述四细小病毒是人细小病毒4、人细小病毒4基因型1、人细小病毒4基因型2、人细小病毒4基因型3或其基因型变体。
160.如权利要求153至159中任一项所述的昆虫细胞，其中原细小病毒的所述至少一种复制蛋白是犬细小病毒、布法病毒、库塔病毒或其基因型变体的NS-1蛋白。
161.如权利要求153至159中任一项所述的昆虫细胞，其中四病毒的所述至少一种复制蛋白是人细小病毒4或其基因型变体的NS-1蛋白。
162.如权利要求153至161中任一项的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞来自鳞翅目的种。
163.如权利要求162所述的昆虫细胞，其中所述鳞翅目的种是草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、甜菜夜蛾或粉纹夜蛾。
164.如权利要求153至163中任一项所述的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞是Sf9。
165.如权利要求153至164中任一项所述的昆虫细胞，其中所述至少一种载体是杆状病毒载体、病毒载体或质粒。
166.如权利要求153至165中任一项所述的昆虫细胞，其中所述至少一种载体是杆状病毒载体。
167.如权利要求153至166中任一项所述的昆虫细胞，其中VP1包含与选自SEQ ID NO:4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20和22的序列具有至少约60％同一性的氨基酸序列。
168.如权利要求153至167中任一项所述的昆虫细胞，其中VP2包含与选自SEQ ID NO:4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21和23的序列具有至少约60％同一性的氨基酸序列。
169.如权利要求153至168中任一项所述的昆虫细胞，其中所述至少一个ITR包括：
(a)依赖性细小病毒ITR，
(b)AAV ITR，任选地AAV2 ITR，
(c)原细小病毒ITR，和/或
(d)四细小病毒ITR。
170.如权利要求153至169中任一项所述的昆虫细胞，其中用于在昆虫细胞中表达的至少一个表达控制序列包含：
(a)启动子，和/或
(b)Kozak样表达控制序列。
171.如权利要求170所述的昆虫细胞，其中所述启动子包括：
(a)动物DNA病毒的立即早期启动子，
(b)昆虫病毒的立即早期启动子，或
(c)昆虫细胞启动子。
172.如权利要求171所述的昆虫细胞，其中所述动物DNA病毒是巨细胞病毒(CMV)、原细小病毒、四细小病毒或AAV。
173.如权利要求171所述的昆虫细胞，其中所述昆虫病毒是鳞翅目病毒或杆状病毒，任选地其中所述杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)。
174.如权利要求170至173中任一项所述的昆虫细胞，其中所述启动子是多角体蛋白(polh)或立即早期1基因(IE-1)启动子。
175.如权利要求153至174中任一项所述的昆虫细胞，其中包含AAV的至少一种复制蛋白的所述核苷酸序列包含编码Rep52和/或Rep78的核苷酸序列。
176.如权利要求153至175中任一项所述的昆虫细胞，其中所述AAV是AAV2。
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