CN117074373A - 一种基于Csm6的脱氧核酶传感器及其对铅检测的应用 - Google Patents

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CN117074373A CN202210502498.6A CN202210502498A CN117074373A CN 117074373 A CN117074373 A CN 117074373A CN 202210502498 A CN202210502498 A CN 202210502498A CN 117074373 A CN117074373 A CN 117074373A
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杨森
杨淏
夏许寒
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Abstract

本发明提供了一种基于Csm6的脱氧核酶传感器，其特征在于，包括如下部分：（1）脱氧核酶酶链和脱氧核酶底物链，所述脱氧核酶底物链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示，所述脱氧核酶酶链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.10所示；（2）Csm6蛋白酶；（3）被荧光与猝灭基团修饰的单链RNA报告探针，所述被荧光与猝灭基团修饰的单链RNA报告探针序列如序列表中SEQ ID No.16所示。本发明还提供了一种该脱氧核酶传感器对铅检测的应用。本发明提供的脱氧核酶传感器可以提高现有生物传感器在铅离子检测中的灵敏度和高选择性。

Description

一种基于Csm6的脱氧核酶传感器及其对铅检测的应用
技术领域
本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及一种基于Csm6的脱氧核酶传感器及其对铅检测的应用。
背景技术
作为生态环境中分布最广的有毒金属污染物之一，铅离子广泛来源于采矿业和汽车尾气的排放，美国环境保护署（EPA）已将其确定为人类可能的致癌因子。而铅离子作为一种不可生物降解的元素，不仅具有较长的生物半衰期，还往往会在人体内生物累积，对免疫和神经系统造成不可逆转的损害，严重威胁儿童健康。即使在超痕量水平的接触下，铅离子也会对公众健康造成深远的负面影响。土壤和水等环境中的铅污染很容易转移到畜禽肉、蛋、奶等食品中，通过生物富集、生物放大等作用，严重威胁人体健康。
考虑到铅离子的普遍性、高毒性和低阈值性，因此迫切需要开发对铅离子能可靠地在复杂基质中进行高灵敏、高准确度的定量检测的方法来确保食品和环境安全。然而，传统的铅离子分析技术如电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、原子吸收/荧光光谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）等虽然提供了令人满意的性能，但是需要价格高昂且组装复杂的设备、要求高的样品预处理步骤和具备科研素质的操作员，使得它们很难广泛普及并进一步开发为便携式检测设备。
脱氧核酶作为一种理想的识别元件，已被广泛用于各种纳米材料和分子工具的开发，其中也包括检测铅离子的应用。脱氧核酶由两个寡脱氧核苷酸链组成，即脱氧核酶酶链和带有RNA碱基的脱氧核酶底物链。铅离子可以嵌入脱氧核酶复合物中，然后催化脱氧核酶底物链在RNA碱基位点上磷酸二酯键的裂解，产生两个短的底物片段。这种构象变化可以通过多种手段来监测，比如荧光标记探针、核酸染料等。
新兴的CRISPR工具在开发针对核酸生物标记物的分析方面展现了强大的功能性，通过结合合适的生物识别和信号转导元件，也能在针对非核酸生物标记物方面也将发挥同样的作用。Csm6是来自Ⅲ-A型CRISPR/Cas系统的一种亚基效应器，可作为RNA内切酶来提高RNA检测的准确性。Csm6作为一种核糖核酸内切酶，可以被A4＞p或A6＞p激活，被激活的Csm6偏向切割富含腺苷或胞苷的RNA分子。与单独使用Cas13a相比，在Cas13a反应中级联使用Csm6可以实现显著的信号放大、更短的样本响应时间和更高的检测灵敏度。另外，脱氧核酶可产生含有2',3'-环核苷酸的线性寡腺苷酸链（A4＞p或A6＞p），这为利用Csm6构建用于金属离子检测的生物传感器开辟了一条新途径。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术上的不足，提供一种基于Csm6的脱氧核酶传感器及其对铅检测的应用，以及其在实际样本检测中的应用，以提高现有生物传感器法检测铅离子的灵敏度和稳定性。
本发明首先提供一种基于Csm6的脱氧核酶传感器及其对铅检测的应用，包括如下部分：
（1） 脱氧核酶酶链和脱氧核酶底物链；
（2）Csm6蛋白；当(1)所述底物链被裂解后产生A4＞p时，所述Csm6蛋白酶为TtCsm6；当（1）所述底物链被裂解后产生A6＞p时，所述Csm6蛋白酶为EiCsm6、SeCsm6或MtCsm6；
（3） 被荧光与猝灭基团修饰的单链RNA报告探针。
所述脱氧核酶酶链可被嵌入的铅离子激活，催化脱氧核酶底物链在RNA碱基位点上磷酸二酯键的裂解，产生含有2',3'-环核苷酸的线性寡腺苷酸（A4＞p或A6＞p）的底物片段分子，所述脱氧核酶底物链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示，所述脱氧核酶酶链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.10所示。
所述Csm6为一种核糖核酸内切酶，可以被A4＞p或A6＞p激活，被激活的Csm6偏向切割富含腺苷或胞苷的RNA分子。
所述被荧光与猝灭基团修饰的单链RNA报告探针由富含腺苷或胞苷RNA组成，所述被荧光与猝灭基团修饰的单链RNA报告探针序列如序列表中SEQ ID No.16所示。
进一步地，所述的脱氧核酶传感器对铅检测的应用。
根据权利要求2所述的脱氧核酶传感器的应用，其特征在于包括如下步骤：
步骤一、以待测样品中的铅离子为辅因子，在4~40℃下反应，激活脱氧核酶酶链切割脱氧核酶底物链，分别产生5'端片段和3'端片段；
步骤二、向步骤一的反应混合液中加入CRISPR体系在20~50℃下进行CRISPR报告反应，CRISPR体系包括Csm6蛋白和被荧光与猝灭基团修饰的单链RNA报告探针。
进一步地，所述的脱氧核酶传感器的应用，其特征在于，共存体系中脱氧核酶酶链的浓度为0.01-10μM、脱氧核酶底物链的浓度为0.01-10μM、Csm6的浓度为0.01-2μM，报告探针的浓度为0.01-5μM。
进一步地，所述的脱氧核酶传感器的应用，其特征在于，反应程序为：脱氧核酶切割过程在4~40℃下反应1min以上，CRISPR报告过程在20~50℃下反应5min以上。
进一步地，所述的脱氧核酶传感器，其特征在于，报告探针上所修饰的荧光基团可以是Alexa flour系列、6-FAM、ATTO系列、cy3、cy5、cy5.5、cy7、TAMRA等，另外，所修饰的猝灭基团可以是BHQ1系列、Dabcyl等。
进一步地，所述的脱氧核酶传感器，其特征在于，Csm6蛋白可以是Thermus thermophilus Csm6 (TtCsm6)、Staphylococcus epidermidis (SeCsm6)、Methanothermobacter thermautotrophicus (MtCsm6)和Enterococcus italicus Csm6(EiCsm6)等。
本发明通过实验证实，应用本发明提供的具有内源双扩增的脱氧核酶传感器，具有极高的检测灵敏度；同时，采用该传感器对铅离子检测，不会受到其他重金属离子的干扰，对铅离子具有高度特异选择性。
本发明的基本原理为：如图1所示，所述的Csm6的脱氧核酶传感器及其对铅检测的应用的整个工作流程分为两部分：（1）用于铅离子识别和靶循环放大的脱氧核酶酶切反应过程；（2）进一步内源信号放大的CRISPR荧光报告过程。此双重扩增使对铅离子的检测具有高灵敏度，特别是能够实现无核苷酸聚合参与的扩增。所述的脱氧核酶切割区由两条链组成，具体为：一条在5'-末端用4或6个核糖腺苷修饰的脱氧核酶底物链，以及一条没有任何修饰的脱氧核酶酶链。所述脱氧核酶底物链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1或SEQID No.2所示，所述脱氧核酶酶链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.10所示。在这一阶段中，脱氧核酶可以产生可作为Csm6激活配体的A4＞p，以触发随后的CRISPR荧光报告。被激活的Csm6表现出极高的酶活性，可以任意切割被荧光与猝灭基团修饰的单链RNA报告探针，所述被荧光与猝灭基团修饰的单链RNA报告探针序列如序列表中SEQ ID No.16所示。最后，通过荧光检测，实现对铅离子的定量分析。
与现有技术相比，本发明的技术方案产生了以下有益的技术效果：
（1）本法还提供了一种上述基于Csm6的脱氧核酶传感器在铅离子检测中的应用，应用本发明提供的传感器实现铅离子检测，利用便携式手持荧光光谱仪便可进行铅离子的快速定量分析，具有简易操作、高特异性、高灵敏度、成本低廉等优点。
（2）本发明所采用的脱氧核酶传感器可实现无需核苷酸聚合的内源性双重扩增，显著提高对铅离子的检测灵敏度。
（3）本发明所采用的脱氧核酶传感器操作简单、响应速度快、可靠性高。
（4）本发明所采用的脱氧核酶传感器对铅离子具有极高的选择特异性，能够很好地抵抗检测环境中其他金属的干扰。
本发明提出一种基于Csm6的脱氧核酶传感器及其对铅检测的应用，建立、完善和发展了铅离子污染物的生物传感分析方法，不仅可为环境健康风险评价提供参考，比如将其应用于分析水和淡水中的铅污染，还可以进一步分析食品健康风险评价提供参考，比如鸡蛋样本的铅含量，还可以进一步分析生物毒理学风险评估，比如铅离子对小鼠的毒理学影响。同时开发一种新的快速、高灵敏、低成本的检测方法，对完善现有检测技术手段具有重要意义和较好的应用价值。本发明建立了一种基于Csm6的脱氧核酶传感器及其对铅检测的应用，该荧光法具有制备简单、检测快速、成本低、样品用量少、灵敏性高等优点，为食品健康风险评估及生物毒理学风险评估提供了一种新的检测方法，这在完善现有铅离子污染物检测技术方面具有重要意义。
附图说明
图1为本发明提供的脱氧核酶传感器的工作原理。
图2是实施例1、2中脱氧核酶酶链与脱氧核酶底物链杂交稳定性对荧光强度影响的信噪比测试结果。
图3是实施例3中铅离子浓度与荧光强度关系的标准曲线的制备。
图4是实施例4中相对于其他重金属离子，对铅离子检测的特异性选择的测试结果。
图5是实施例6中铅离子对小鼠的毒理学效应的测试结果。
图6是对比例1中不同宿主物种的Csm6对铅离子的应答能力的信噪比测试结果。
具体实施方式
以下实施例可以用于进一步解释本发明，但不能用来限制本发明的范围。所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例所述的脱氧核酶底物链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1-2所示，所述的脱氧核酶酶链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3-13所示，所述的TtCsm6的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.14所示，所述EiCsm6的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.15所示，所述的C5报告探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.16所示。
以下实施例所述的Csm6蛋白的表达及纯化的具体方法：首先，分别构建含有编码TtCsm6和EiCsm6的DNA序列的质粒，并对其进行了测序，所述TtCsm6的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.14所示，所述EiCsm6的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.15所示。然后，将对应于TtCsm6和EiCsm6的质粒分别转化到大肠杆菌感受态细胞（BL21 Rosetta2（DE3））中，在添加了适当浓度的氯霉素和卡那霉素的LB培养基中生长，直到600nm处的吸光度达到0.6。通过添加0.2mM IPTG（异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷）触发蛋白质表达，并在18℃下培养16h。收集已表达蛋白质的细胞，并将其重新悬浮在含有20mM Tris-HCl(pH=8.0)、300mMKCl和10%甘油的裂解缓冲液中。通过超声波裂解细胞悬浮液，并以15000 rpm的转速离心溶解液30分钟，以去除细菌细胞。其次，在5mL Ni NTA柱（GE Healthcare）上过滤不需要的细菌裂解物，用10倍体积的裂解缓冲液清洗，再分别用5倍体积的一系列浓度（10、20、50、100、200mM；pH=8.0）的咪唑裂解缓冲液洗脱结合蛋白。在加入TEV蛋白酶的条件下，使用含有20mM HEPES（pH=7.5）、300mM KCl、5mM MgCl2和10%甘油的裂解缓冲液对洗脱蛋白质进行过夜透析。将透析后的蛋白质在5mL Ni NTA柱过滤，获得的滤液使用S200（16/600）色谱柱进行进一步浓缩和纯化。最后，在分子量为30000的截止离心过滤器上浓缩纯化的蛋白质，达到5-75mg/mL，随后在液氮中快速冷冻并储存在-80℃冰箱中。
实施例1
本实施例中，研究在所述脱氧核酶传感器中脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链杂交稳定性对荧光强度的影响，步骤如下：
首先，脱氧核酶酶切反应在36uL体积的溶液中进行，所述溶液含有1×缓冲液（20mM HEPES (pH=7.5)、50mM KCl、5mM MgCl2）、400nM 脱氧核酶底物链（Sub-C）、400nM脱氧核酶酶链（Dz-C）和150nM铅离子，在25℃下反应1h。其次，将含有100nM TtCsm6和500nMC5报告探针的4μL CRISPR报告溶液添加到所述的脱氧核酶酶切反应溶液中，然后在37℃下培养30min。最后，测定荧光强度，激发波长为480nm，发射范围为510-600nm，步长为1nm。
其特征在于，设计11条脱氧核酶酶链，其t端和非t端的臂长各不相同，包括Dz-C9-4t、Dz-C 9-6t、Dz-C 9-8t、Dz-C 9-10t、Dz-C 9-12t、Dz-C 9-14t和Dz-C 8-10t、Dz-C10-10t、Dz-C 11-10t、Dz-C 12-10t、Dz-C 13-10t，分别混合于共存体系中，测定荧光强度数据。所述的脱氧核酶底物链（Sub-C）的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，所述的脱氧核酶酶链Dz-C 9-4t、Dz-C 9-6t、Dz-C 9-8t、Dz-C 9-10t、Dz-C 9-12t、Dz-C 9-14t和Dz-C 8-10t、Dz-C 10-10t、Dz-C 11-10t、Dz-C 12-10t、Dz-C 13-10t的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.3-13所示。
各混合体系测定的荧光强度如图2（A和B）所示。结果表明，将t端的臂长从14缩短至10个核苷酸，将非t端的臂长从13缩短至10个核苷酸，将产生最优的信噪比，而进一步缩短将降低脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链杂交稳定性。这表明脱氧核酶酶链与脱氧核酶底物链结合的稳定性过小或过大都会限制裂解反应的多重翻转切割。以下实施例2-6均采用t端和非t端链长均为10t的脱氧核酶酶链（Dz-C），即所述的脱氧核酶酶链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.10所示。
实施例2
本实施例中，研究在所述脱氧核酶传感器中脱氧核酶底物链浓度以及脱氧核酶底物链和脱氧核酶酶链的比率对荧光强度的影响，步骤如下：
采用实施例1中的检测步骤，其特征在于，其中脱氧核酶底物链（Sub-C）的浓度为50、100、200、400、600、800nM，脱氧核酶酶链（Dz-C）的浓度为400nM，分别混合于共存体系中，测定荧光强度数据。然后根据荧光数据最优的脱氧核酶底物链浓度，按照脱氧核酶底物链：脱氧核酶酶链=1：2、1：1、2：1、4：1、6：1、8：1的比率分别混合于共存体系中，测定荧光强度数据。
各混合体系测定的荧光强度如图2（C和D）所示。结果表明，当底物浓度为400nM，脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链的比例为1:1时，将产生最优的信噪比。
实施例3
本实施例中，研究在所述脱氧核酶传感器中铅离子浓度与荧光强度关系的标准曲线的制备，步骤如下：
采用实施例1中的检测步骤，其特征在于，使用大量标准浓度的铅离子溶液（0、0.1、1、5、10、25、50、100、150、200nM）分别混合于共存体系中，测定荧光强度数据。
各混合体系测定的荧光强度如图3所示。结果表明，随着铅离子含量（0-200nM）的增加，荧光强度逐渐增加。当铅离子浓度在0.1-100nM范围内时，可获得铅离子浓度与荧光强度关系的线性回归方程：y=553.06x+3192.90，R2=0.9971，其中y、x和R2代表荧光强度、铅离子浓度和相关系数，检测限（LOD）为212pM，可显著满足中国国家卫生健康委员会在《生活饮用水卫生标准（GB 5749-2022）》规定的饮用水中最大铅离子污染水平0.01mg/L（48nM）的要求。
实施例4
本实施例中，研究在所述脱氧核酶传感器中相对于其他重金属离子，对铅离子检测的特异性，步骤如下：
采用实施例1中的检测步骤，其特征在于，其中设计包括铅离子在内的七种金属离子（Mn2+、Ni2+、Cd2+、Al3+、Cu2+、Co2+和Pb2+），在3个梯度浓度（10、100、1000nM）下分别混合于共存体系中，测定荧光强度数据。
各混合体系测定的荧光强度如图4所示。结果表明，与空白对照组相比，除铅离子外，没有任何金属离子产生明显的荧光强度变化，这表明所述的脱氧核酶传感器在干扰环境中依旧具有对铅离子良好的辨别能力。
实施例5
本实施例中，通过所述脱氧核酶传感器对食品样品中铅离子的检测，步骤如下：
采用实施例1中的检测步骤，其特征在于，分别以自来水和新鲜鸡蛋作溶剂制作出铅离子含量分别为10、30、50nM的样品试剂，然后分别代替铅离子溶液混合于共存体系中，测定荧光强度数据。其中，所述的以新鲜鸡蛋作溶剂的样品试剂在使用所述的脱氧核酶传感器之前，需要先进行消化。
所述消化的具体步骤为：取0.1-0.5g含有不同计量铅离子的样品，加入含有10mL浓HNO3和5mL HClO4的酸性溶液中，放入通风柜中，先在180℃反应40min，再在200℃反应4h，最后在220℃反应1h。将消化后的固体溶解在8 mL体积的超纯水中，并使用1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl调节pH值至7，最后使其恒定体积为13mL，得到消化液以供后面分析。
各混合体系测定的荧光强度如表1所示。结果表明，水和鸡蛋中铅离子测定的回收率在90.09%到112.18%之间，相对标准偏差（RSD）保持在3.14%以内，这表明所述的脱氧核酶传感器在食品和环境中等复杂基质的铅污染检测中具有潜在的应用价值。
表1 在新鲜鸡蛋和自来水样品中添加的铅离子的检测。
实施例6
本实施例中，通过所述脱氧核酶传感器估计铅离子对小鼠的毒理学效应，步骤如下：
(1) 将所有实验动物（10只小鼠）分为两组：5只对照组（用无菌PBS处理）和5只实验组（用无菌1000 mg/kg的铅离子溶液处理）。首先，对无致病性感染的健康小鼠（BALB/c，6-8周龄）适应性喂养3天。然后，用无菌1000 mg/kg的铅离子溶液或无菌PBS口服灌胃3天。最后，对感染小鼠实施安乐死后，收集其肾脏、肝脏、结肠和粪便并称重，再对其消化以供分析。所述的消化过程采用实施例5中的消化步骤。
(2) 采用实施例1中的检测步骤，其特征在于，其中以不同部位的实验小鼠的消化液分别代替铅离子溶液混合于共存体系中，测定荧光强度数据。我们使用所述的脱氧核酶传感器和ICP来平行评估铅离子对小鼠的毒理学效应。
各混合体系测定的荧光强度如图5所示。图5（A）为小鼠实验研究方案示意图。图5（B和C）分别为使用所述的脱氧核酶传感器和ICP方法对不同感染组小鼠中铅离子含量的测定。结果表明，急性铅离子中毒导致铅离子在所有实验组小鼠的组织中积累。体内组织（25-280μg/g湿组织）的累积水平顺序为：结肠>肾脏>肝脏，显著低于粪便排泄（20000-30000μg/g湿组织）。所述的荧光传感检测结果与ICP检测结果一致，表明所述的脱氧核酶传感器可用于研究铅离子在生物体内的毒理学效应。
对比例1
本对比例中，研究在所述脱氧核酶传感器中不同宿主物种的Csm6对铅离子的应答能力，步骤如下：
采用实施例1中的检测步骤，其特征在于，所述的Csm6分别为TtCsm6和EiCsm6，分别与脱氧核酶底物链（Sub-C）和脱氧核酶底物链（Sub-CE）相对应地混合于共存体系，测定荧光强度数据。所述的脱氧核酶底物链（Sub-C）的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，所述的脱氧核酶底物链（Sub-CE）的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，所述的TtCsm6的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.14所示，所述的EiCsm6的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.15所示。
各混合体系测定的荧光强度如图6所示。结果表明，使用TtCsm6得到的信噪比为26.7，是EiCsm6的3.5倍。
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种基于Csm6的脱氧核酶传感器及其对铅检测的应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 8
gttaccactg aagtagcgcc gccgtttttt tttttttt 38
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
ttaccactga agtagcgccg ccgttttttt ttt 33
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
cgttaccact gaagtagcgc cgccgttttt ttttt 35
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
acgttaccac tgaagtagcg ccgccgtttt tttttt 36
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 12
gacgttacca ctgaagtagc gccgccgttt ttttttt 37
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 13
tgacgttacc actgaagtag cgccgccgtt tttttttt 38
<210> 14
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 14
atggaagatc tggatgcact gtgggaacgt taccgtgaag cggttcgtgc aggcggtaac 60
ccgcaggcgc tgtatcagga aatggtttgg ccggcgctgc tggcgctgtg gcgtgaaaaa 120
ccgcgtgttt acccgttccc gcaggccttc gctgtctctg ttcacaccct gggtaccagc 180
ccggaagcga ccgcgctggc catcctgggc gcgggcgctg aacgtgttta cgtgctgcac 240
accccggaat ccgcgcgctt cctgccgcgc ctgcgccagg acaccggtaa agacctgtac 300
ccggtggaaa tcggtaaatc tgatgtggaa gcgatttatc gcgaagttaa acgtctgctg 360
gaaaaacacc cggaagttcc ggtggcactg gatctgacca gcgggactaa agctatgtcc 420
gctggcctgg cggcagccgg cttcttcttc cagcgttttt atccgaaagt tcgtgttgtt 480
tacgtggata acgaggacta cgatccggaa ctgcgccgtc cgcgtgctgg taccgaaaaa 540
ctgcgcatcc tgccgaaccc gcacgaagcg ctggcggaag tagatgcgct gttcgcaaaa 600
gaactctatg gcaaaggtga attcggccag gccgcagcgt acttccgcgg tatggttggc 660
cgcaccggta accaggcgta cgcactgtat gcgctgctgg cagaaatgta ccgtgcatgg 720
cgtgcactgg actttggtga agccctgaaa gcgggccgta aacttctggg ccagctgagc 780
cagaacgtgt ggctgaacca cccgctgaac gcccgccgtg aagcgctgga agcgcaggtt 840
gctctgctgg aagcggtaga tcgtttcctg aaagcccgcg acttcgctct gaaagaaggt 900
gtttacggcc tggcgcgtac gctgctgcac ctggcacagg aagctaaaga agaagcggcg 960
gtgctggccg cactgtatgc ataccgcgct ctggaactgc tgctgcagga acgtctggcg 1020
ctgctgggcc gtcgtgctga agctccgggt ctgagcccgg aagaagccga agccctgcgt 1080
aaagctctgg cggaactgct gggcgtcctg ccggaagaag tgcgcctgcc ggcgaaactg 1140
ggtctgctgg acctgctggc attcctgcgc ctgaaaggcg acgaagctct gggccgcctg 1200
agcctggctg aactgcgcgg tcttgcaggc gcgctgaaag gtcgtaactc cgcgctgctg 1260
gtgcacggct ttgacgtgcc gagcccgaaa gcagtagaag gcatcgcacg cctggcgcag 1320
ggcctgctgc aggacctgga agcgcgcacc gcgctgggtc cgctgtctcc ggaaccggtg 1380
ccgctgggtt tctaa 1395
<210> 15
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 15
catatgaaaa ttctattttc acccatagga aatacggacc cgtggcgtaa cgaccgcgac 60
ggcgcaatgc tgcacattgt tcgtcactat cagccagaca gagtcgtgct gtttttcacc 120
gagagcatct ggcagggtaa tcagcatttt agcggccagc aagcgtttga ttgggttaag 180
attatccaaa gtatcaacga gaactgccaa atcgaaatca agtgcgatac tattgaagtt 240
gagaacgact ttgacgcata taaggacctg ttccaccagt acttggtgga ggaaaaacgt 300
aaatacccga atgcggaaat tttcctgaat gttacctctg gtacaccgca gatggaaacc 360
accctgtgtc tggaatacgt aacctatccc gacaagatgc gttgcattca ggttagcacc 420
ccgctgaaaa cgagcaatgc taaaaccaaa tatgctcagg ctgattgtca agaggttgat 480
ttggagattg ttaatgagga agagagccag cagccgagcc gttgccataa aatcgccatc 540
ctgagcttcc gcgaagccat cgtccgtaac cagattaagt ccctgctgga caattatgat 600
tatgaagccg cgttacaact ggttgcgtcg caaaagagct tccgtaacgg caaagagatc 660
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atcaagcagt acccgcgtaa cgagaagctg cagaaagcgc tgttgcacac cattttgtta 780
gaaatgcgtc accaacgtgg tgatatcgcg gaaactctga tccgtgtgaa atccatcgcg 840
gaatatatcg tggagcagta cattcaaaaa aactacccgt acctgatcat ttataaagaa 900
gataagccgt acttcaacgt gtcctacagc caagagctga ccgaatctta cttggcgctg 960
atggattcac gcaacaagaa gacgaacaag aagatgaccg tcgatagcct ggaccgtatt 1020
ctcggttttc cggcataccg cgacttcctg caactgctcg aggcgtcgaa cgaaatgacg 1080
aacgagatga ataaggtcaa tgagattaac aacctgcgta ataaagttgc acataattta 1140
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<210> 16
<211> 5
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> modified_base
<222> (1,5)
<222> 分别在5'-端和3'-端用FAM和BHQ1修饰
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<210> 18
<211> 6
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 18
aaaaaa 6
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种基于Csm6的脱氧核酶传感器及其对铅检测的应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(4)
<400> 1
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<400> 10
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<400> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgacgttacc actgaagtag cgccgccgtt tttttttt 38
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<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atggaagatc tggatgcact gtgggaacgt taccgtgaag cggttcgtgc aggcggtaac 60
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<210> 15
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1,5)
<223> 分别在5'-端和3'-端用FAM和BHQ1修饰
<400> 16
ccccc 5
<210> 17
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaaa 4
<210> 18
<211> 6
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaaaaa 6

Claims (10)

1.一种基于Csm6的脱氧核酶传感器及其对铅检测的应用，其特征在于，包括如下部分：
（1）脱氧核酶酶链和脱氧核酶底物链；
（2）Csm6蛋白；
（3）被荧光与猝灭基团修饰的单链RNA报告探针。
2.所述脱氧核酶酶链可被嵌入的铅离子激活，催化脱氧核酶底物链在RNA碱基位点上磷酸二酯键的裂解，产生含有2',3'-环核苷酸的线性寡腺苷酸链（A4＞p或A6＞p）的底物片段分子，所述脱氧核酶底物链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示，所述脱氧核酶酶链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.10所示，所述线性寡腺苷酸（A4＞p）的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.17所示，所述线性寡腺苷酸（A6＞p）的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.18所示。
3.所述Csm6为一种核糖核酸内切酶，可以被A4＞p或A6＞p激活，被激活的Csm6偏向切割富含腺苷或胞苷的RNA分子。
4.所述被荧光与猝灭基团修饰的单链RNA报告探针由富含腺苷或胞苷RNA组成，所述被荧光与猝灭基团修饰的单链RNA报告探针序列如序列表中SEQ ID No.16所示。
5.根据权利要求1所述的脱氧核酶传感器对铅检测的应用。
6.根据权利要求5所述的脱氧核酶传感器的应用，其特征在于包括如下步骤：
步骤一、以待测样品中的铅离子为辅因子，在4~40℃下反应，激活脱氧核酶酶链切割脱氧核酶底物链，分别产生5'端片段和3'端片段；
步骤二、向步骤一的反应混合液中加入CRISPR体系在20~50℃下进行CRISPR报告反应，CRISPR体系包括Csm6蛋白和被荧光与猝灭基团修饰的单链RNA报告探针。
7.根据权利要求6所述的脱氧核酶传感器的应用，其特征在于，共存体系中脱氧核酶酶链的浓度为0.01-10μM、脱氧核酶底物链的浓度为0.01-10μM、Csm6的浓度为0.01-2μM，报告探针的浓度为0.01-5μM。
8.根据权利要求6所述的脱氧核酶传感器的应用，其特征在于，反应程序为：脱氧核酶切割过程在4~40℃下反应1min以上，CRISPR报告过程在20~50℃下反应5min以上。
9.根据权利要求1所述的脱氧核酶传感器，其特征在于，报告探针上所修饰的荧光基团可以是Alexa flour系列、6-FAM、ATTO系列、cy3、cy5、cy5.5、cy7、TAMRA等，另外，所修饰的猝灭基团可以是BHQ1系列、Dabcyl等。
10.根据权利要求1所述的脱氧核酶传感器，其特征在于，Csm6蛋白可以是Thermus thermophilus Csm6 (TtCsm6)、Staphylococcus epidermidis (SeCsm6)、Methanothermobacter thermautotrophicus (MtCsm6)和Enterococcus italicus Csm6(EiCsm6)等。
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