CN117070662B - 一种甜瓜果型的snp标记、检测方法及应用 - Google Patents

一种甜瓜果型的snp标记、检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甜瓜果型的SNP标记、检测方法及应用，属于分子标记技术领域。本发明公开的一种甜瓜果型的SNP标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列与甜瓜长果性状紧密连锁，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与甜瓜圆果性状紧密连锁。本发明开发的分子标记SNP_FS与甜瓜果型紧密连锁，因而对甜瓜果型性状分子标记辅助育种体系的建立更有帮助。本发明的分子标记可以简便、快速、高通量地应用于甜瓜果型育种实践。

Description

一种甜瓜果型的SNP标记、检测方法及应用
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，更具体的说是涉及一种甜瓜果型的SNP标记、检测方法及应用。
背景技术
甜瓜(Cucumis melo L.)被誉为全球十大水果之一，一直以来都是我国重要的经济作物，根据联合国粮农组织统计数据显示，2020年中国甜瓜的栽培面积为38.78万公顷，占全球甜瓜栽培面积36.30％，位居世界第一；年度总产量高达1386.54万吨，占全球甜瓜总产量48.71％，同样位居世界第一(FAOSTAT 2020，www.fao.org)。因此，甜瓜产业对我国农业经济发展以及乡村振兴具有重要的作用。
甜瓜果实外观为消费者购买选择的首要依据，因此果型作为甜瓜重要的外观品质之一，对改良甜瓜的商品性具有重要的作用。甜瓜生长周期长，因此通过传统育种方法开展其果实形状的选择，需要在分离后代中进行筛选，效率低且费时费力。随着科学技术的发展，以SNP为代表的第三代分子标记时代，为高效分子标记辅助育种技术体系的建立奠定基础。因此，开发与甜瓜果型相关的分子标记并应用于育种中，即可在苗期完成对果型性状的有效筛选，省时省力，成本低且效率高，对提高育种效率和加速育种进程具有重要意义。
随着研究的深入，有关甜瓜果实性状的报道逐渐增加，目前已报道的相关QTL位点多达200余个，分布在甜瓜12条染色体上。例如，甜瓜果面沟调控基因位于11号染色体末端。Ma等通过图位克隆的方法，将甜瓜果型调控基因CmFSI8/CmOFP13精细定位于8号染色体53.7kb(Chr08:28217299..28271033bp)区间范围内，并通过序列和表达分析确定候选基因，进一步在拟南芥中进行功能验证。然而，Boualem等研究表明，位于2号染色体上的乙烯合成相关基因CmACS-7(1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶)不仅可以调控甜瓜花性型，而且可调控甜瓜果型的长或圆。上述研究均表明，甜瓜果型发育较为复杂，涉及多个基因或通路，因此开发更多与甜瓜果型紧密连锁的分子标记，可为更系统的建立甜瓜果型分子标记辅助育种技术体系奠定基础。
因此，提供一种甜瓜果型的SNP标记、检测方法及应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种甜瓜果型的SNP标记、检测方法及应用，主要目的是提供一个与甜瓜果型性状紧密连锁的分子标记SNP_FS，用该分子标记在苗期可准确检测出甜瓜植株的果型是长果型或圆果型，为甜瓜果型分子标记辅助技术体系的建立提供帮助。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种甜瓜果型的SNP标记，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示；其中，SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列与甜瓜长果性状紧密连锁，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与甜瓜圆果性状紧密连锁。
进一步，一种用于检测所述的SNP标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
进一步，一种用于检测所述的SNP标记的试剂盒，所述试剂盒包含所述的引物对。
进一步，检测所述的SNP标记的试剂、所述的引物对或所述的试剂盒在甜瓜果型性状育种中的应用。
进一步，一种检测甜瓜果型性状的方法，通过检测待测甜瓜是否含有所述的SNP标记来确定所述甜瓜果型性状；
具体包括：
(1)提取待测甜瓜的基因组DNA；
(2)利用所述的引物对对甜瓜基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果，对比所述测序结果与所述的SNP标记来确定所述待测甜瓜果型性状；
或对所述PCR扩增产物用限制性内切酶EcoR I进行酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳显示结果来确定所述待测甜瓜的果型性状；
通过所述测序结果来确定甜瓜果型性状的具体操作为：当所述PCR扩增产物的核苷酸序列和SEQ ID NO.1序列一致，表示该植株的甜瓜果型为长果；当所述PCR扩增产物的核苷酸序列和SEQ ID NO.2序列一致，表示该植株的甜瓜果型为圆果；
通过所述凝胶电泳显示结果来确定甜瓜果型性状的具体操作为：当所述PCR扩增产物经酶切后，仅有两条192bp和241bp的小片段，则该植株果型为圆果；当所述PCR扩增产物经酶切后，为433bp的单条带或433bp、192bp和241bp的三条带，则该植株的果型为长果。
进一步，所述PCR扩增程序如下：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃60s，29cycles；72℃5min。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种甜瓜果型的SNP标记、检测方法及应用，已经开发的分子标记SNP_FS与甜瓜果型紧密连锁，因而对甜瓜果型性状分子标记辅助育种体系的建立更有帮助。本发明的分子标记可以简便、快速、高通量地应用于甜瓜果型育种实践。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明甜瓜圆果型种质Y101和长果型种质M0426的果型性状；
其中，A：圆果型种质Y101；B：长果型种质M0426；
图2附图为本发明分子标记SNP_FS在圆果型种质Y101、长果型种质M0426、F2中的多态性电泳图谱；
1：Y101；2：M0426；M：marker；
4-16：F2群体中，圆果型的单株，共13株；
17-32：F2群体中，长果型的单株，共16株。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示，选择甜瓜圆果型种质Y101和长果型种质M0426为材料。本发明以Y101和M0426为亲本，杂交获得F1代植株，F1代植株自交构建F2分离群体。
用CTAB法提取亲本、F1及F2分离群体的叶片总DNA：取上部幼嫩叶片在液氮中快速研磨成粉末状，放于1.5ml的离心管中；加入预热的800μlCTAB提取缓冲液，65℃水浴30min；加入等体积氯仿异戊醇，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1，混匀后12000r/min离心15min；将上清液转入新的离心管，加等体积异丙醇，轻轻混匀，冰浴1h以上；12000r/min离心15min；倒去上清液，用体积分数为75％的乙醇冲洗沉淀两次，干燥后，加入TE缓冲液200μl溶解后，加入10μg/ml的RNA酶去除RNA，37℃水浴30min；在0.8％琼脂糖凝胶电泳，以50ng/μl的λDNA为标准，估计所得DNA的浓度；后用TE稀释终浓度为100ng/μl，存于-20℃备用；
根据亲本Y101和M0426基因组重测序数据鉴定的SNP位点，调取其在参考基因组的侧翼序列设计分子标记，并利用亲本DNA鉴定其多态性后扫描F2分离群体，完成果型调控基因的定位。其中，分子标记SNP_FS是根据Chr08:5414851处的SNP设计，且连锁分析发现标记SNP_FS与甜瓜果型性状紧密连锁，引物序列分别是SNP_FS-F(23bp)和SNP_FS-R(26bp)。
SNP_FS-F：5’-CGCATGGGCCATTGGAAGAGACC-3’；SEQ ID NO.3；
SNP_FS-R：5’-TGTCATATTCCTTGTAGGACCGGACT-3’；SEQ ID NO.4。
PCR扩增程序为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃60s，29cycles；72℃5min。PCR扩增后，用相应的限制性内切酶(EcoR I)对PCR产物进行切割，使用2％琼脂糖凝胶电泳显示结果。
亲本和F2子代的多态性条带具体参见图2，从长果型种质M0426中扩增的PCR产物长度为433bp(序列为SEQ ID NO.1)，且不可被限制性内切酶EcoR I切开；而从圆果型种质Y101中扩增的PCR长度为433bp(序列为SEQ ID NO.2)，但是经限制性内切酶EcoR I酶切后，可被切成两个小片段，192bp和241bp的条带，两个片段长度加起来与无法被酶切的长度相同。在F2子代中，若植株中扩增的PCR产物经酶切后，仅有两条小片段(192bp和241bp)，则该植株果型为圆果；而若植株中扩增的PCR产物经酶切后，为单条带(433bp)或三条带(433bp、192bp和241bp)，则该植株的果型为长果。因此，利用分子标记SNP_F即可在苗期得到区分甜瓜果型为长果或圆果的多态性分子标记。
CGCATGGGCCATTGGAAGAGACCCAAATTCTCGGATTGACCCTCATAAGTTCGATCCTGAAAGGTTCATCGGTAGTCAAGTGGATGTGAAAGGAAGAGATTTTCAATTGATTCCGTTTGGATCTGGTCGAAGAGGCTGCCCCGGAATGCAATTGGGCTTAACTTTGGTTCAATTCGTGTTGGCTCAACTTGTGCATTGTTTTGATTGGACGCTTCCGAATGGTATGTCGGCTTCTGAATTGGATAGGACTGAAGTGTTAAGTTTAACTTGCCTTTAACTACTAAATGTTGTTACGTGACTTATTTTTAAAGAAAAATGAATGTCACGACCATTTAAAAGAGAGGACAAAAAAATTAAAGTAGGATCTTTCAATGTCCTACTTGCAAGGAAATGAGTGAATATATTGTAGTCCGGTCCTACAAGGAATATGACA；SEQ ID NO.1。
CGCATGGGCCATTGGAAGAGACCCAAATTCTCGGATTGACCCTCATAAGTTCGATCCTGAAAGGTTCATCGGTAGTCAAGTGGATGTGAAAGGAAGAGATTTTCAATTGATTCCGTTTGGATCTGGTCGAAGAGGCTGCCCCGGAATGCAATTGGGCTTAACTTTGGTTCAATTCGTGTTGGCTCAACTTGTGCATTGTTTTGATTGGACGCTTCCGAATGGTATGTCGGCTTCTGAATTCGATAGGACTGAAGTGTTAAGTTTAACTTGCCTTTAACTACTAAATGTTGTTACGTGACTTATTTTTAAAGAAAAATGAATGTCACGACCATTTAAAAGAGAGGACAAAAAAATTAAAGTAGGATCTTTCAATGTCCTACTTGCAAGGAAATGAGTGAATATATTGTAGTCCGGTCCTACAAGGAATATGACA；SEQ ID NO.2。
本发明的得到的核苷酸序列SEQ ID NO.1与甜瓜长果性状紧密连锁；
本发明的得到的核苷酸序列SEQ ID NO.2与甜瓜圆果性状紧密连锁。
利用本发明的分子标记检测甜瓜果型性状的方法：提取待测甜瓜的基因组DNA；利用上述设计的引物对对甜瓜基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；进行测序或EcoR I酶切后进行琼脂糖凝胶电泳。
通过测序结果来确定甜瓜果型性状的具体操作为：当PCR扩增产物的核苷酸序列和SEQ ID NO.1序列一致，表示该植株的甜瓜果型为长果；当PCR扩增产物的核苷酸序列和SEQ ID NO.2序列一致，表示该植株的甜瓜果型为圆果；
通过凝胶电泳显示结果来确定甜瓜果型性状的具体操作为：当PCR扩增产物经酶切后，仅有两条小片段(192bp和241bp)，则该植株果型为圆果；当PCR扩增产物经酶切后，为单条带(433bp)或三条带(433bp、192bp和241bp)，则该植株的果型为长果。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一种甜瓜果型的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；其中，SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列与甜瓜长果性状紧密连锁，SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列与甜瓜圆果性状紧密连锁。
2.用于检测权利要求1所述的SNP标记的引物对在甜瓜果型性状育种中的应用；所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
3.一种检测甜瓜果型性状的方法，其特征在于，通过检测待测甜瓜是否含有权利要求1所述的SNP标记来确定所述甜瓜果型性状；
具体包括：
（1）提取待测甜瓜的基因组DNA；
（2）利用引物对对甜瓜基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
（3）对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果，对比所述测序结果与权利要求1所述的SNP标记来确定所述待测甜瓜果型性状；
或对所述PCR扩增产物用限制性内切酶EcoR I进行酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳显示结果来确定所述待测甜瓜的果型性状；
通过所述测序结果来确定甜瓜果型性状的具体操作为：当所述PCR扩增产物的核苷酸序列和SEQ ID NO.1序列一致，表示该植株的甜瓜果型为长果；当所述PCR扩增产物的核苷酸序列和SEQ ID NO.2序列一致，表示该植株的甜瓜果型为圆果；
通过所述凝胶电泳显示结果来确定甜瓜果型性状的具体操作为：当所述PCR扩增产物经酶切后，仅有两条192bp和241 bp的小片段，则该植株果型为圆果；当所述PCR扩增产物经酶切后，为433 bp的单条带或433 bp、192bp和241 bp的三条带，则该植株的果型为长果。
4.根据权利要求3所述的一种检测甜瓜果型性状的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序如下：94℃ 5 min； 94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 60s，29cycles；72℃ 5 min。
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