CN117070609A - 一种评价亚硫酸氢盐处理dna样品转化效率及核酸回收率的方法 - Google Patents

一种评价亚硫酸氢盐处理dna样品转化效率及核酸回收率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种评价亚硫酸氢盐处理DNA样品转化效率及核酸回收率的方法，该方法包括设计并合成一条外源且无甲基化的标准品DNA，以及引物探针组；向DNA样品中加入标准品DNA，得到DNA混合物，对DNA混合物中的标准品DNA模板进行荧光定量PCR扩增，得到Ct值；对DNA混合物进行亚硫酸氢盐转化处理并纯化得到bisDNA，再对bisDNA中转化后的标准品DNA模板及未发生转化的标准品DNA模板分别进行荧光定量PCR扩增，得到Ct值；按照公式分别计算亚硫酸氢盐处理DNA样品的转化效率和核酸回收率。本申请通过标准品DNA、引物探针组、检测方法及计算公式，实现了对亚硫酸氢盐处理DNA样品的转化效率及核酸回收率的同时检测。

Description

一种评价亚硫酸氢盐处理DNA样品转化效率及核酸回收率的 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种评价亚硫酸氢盐处理DNA样品转化效率及核酸回收率的方法。
背景技术
DNA甲基化是DNA上化学修饰中的一种形式，它能够在不改变DNA序列的前提下，使得遗传表型发生变化。DNA甲基化的过程指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，将基因组DNA上胞嘧啶(C)的5号位碳原子加上一个甲基变成5-甲基胞嘧啶(5mC)。DNA甲基化是表观遗传学中研究较为深入的一种形式，它在细胞内具有多方面的生物学意义。DNA甲基化可以作为一个分子开关来控制转录，从而实现对基因表达的调控。众多研究表明，DNA甲基化与细胞分化、胚胎发育、基因组印记及X染色体失活等众多生物学事件密切相关，并参与癌症等疾病的发生与发展过程。
鉴于DNA甲基化的重要功能，研究人员开发出了许多特异性检测DNA甲基化位点的方法和技术。5-甲基胞嘧啶(5mC)与非甲基化的胞嘧啶(C)仅存在一个甲基的差异，但这并不影响二者与鸟嘌呤(G)进行正常的碱基配对，所以常规的测序技术或依靠DNA链杂交互补的检测方法无法直接实现对5mC的检测。目前，绝大多数的甲基化检测技术都基于亚硫酸氢盐处理(Bisulfite Conversion)转化DNA的原理，即：在亚硫酸氢盐溶液中，DNA上正常的胞嘧啶(C)脱氨基被转变成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶(5mC)则保持不变，这样原始DNA序列中本来无法进行区分的5mC与C碱基就可以通过上述化学处理产生碱基配对性质的变化；由于尿嘧啶与胸腺嘧啶(T)的结构相似，这些位点后续在芯片杂交、测序及PCR反应中会被识别为T，而发生甲基化的胞嘧啶位点仍会被识别为C，这样就实现了对DNA序列上5-甲基胞嘧啶的精准检测。基于亚硫酸氢盐转化技术的原理，人们开发了甲基化特异性PCR(MSP)、定量甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性高分辨率熔解技术(MS-HRM)、靶向亚硫酸氢盐测序(Targeted bisulfite sequencing)、简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)及全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)等技术，使得特定基因或者全基因组甲基化水平的检测及研究成为现实。
迄今为止，基于亚硫酸氢盐转化来检测5-甲基胞嘧啶(5mC)的方法已经被广泛应用到表观遗传学研究及肿瘤诊断相关的临床方向。在使用亚硫酸氢盐处理DNA样本的过程中，有两个关键的技术指标会影响下游的甲基化检测实验，即转化效率和DNA回收率。转化效率就是转化后DNA样本中胞嘧啶转变为尿嘧啶的比例，它决定了后续甲基化位点检测的准确性；亚硫酸氢盐转化要求序列中所有的胞嘧啶(C)彻底或接近全部地转变为尿嘧啶(U)，如果转化不完全就会造成假阳性结果。DNA回收率是指亚硫酸氢盐处理后获得的DNA量占起始投入DNA样本量的比例，这将直接影响下游甲基化检测的灵敏度，合理评估DNA回收率对于cfDNA等小量珍贵样本的甲基化研究尤其重要。众多文献结果表明，亚硫酸氢盐处理流程会造成DNA链的降解，如果在这一过程中对核酸的保护不充分将会导致转化后有效DNA模板的减少，最终使得甲基化检测结果产生假阴性。考虑到亚硫酸氢盐处理对转化时间、温度、核酸保护剂及转化试剂浓度等要求较为苛刻，在使用商业化转化试剂或实施转化试剂研究开发的同时，需要重点对转化效率及回收率这两个指标进行系统评估，以保证其能够适配下游的甲基化检测实验，使得最终的结果更加稳健、精准。
然而，针对亚硫酸氢盐处理流程中DNA转化效率及回收率的评估，相关的方法或技术开发仍较为滞后。刘洋洋等(《遗传》，2015,37(9):6)报道了一种DNA甲基化分析中重亚硫酸盐处理DNA转化效率的评估技术，使用内参基因β-actin的序列片段分别设计针对转化前后模板的特异性引物探针，最终通过绘制两条标准曲线以绝对定量的方式计算待测DNA样本的转化效率；类似地，申请号为202211114282.9的发明专利通过常规引物设计，利用SybrGreen染料法来检测人源核酸样本中GNAS、GPR1、PAX6和Actin共4个基因甲基化及未甲基化的ΔCt值，依靠公式来计算待测样本的转化效率。这两种方法的操作均存在一定的繁琐性，且仅适用于人源DNA样本，无法直接应用于其他物种。除此之外，申请号为CN201610015862.0的发明专利公开了使用2种外源核酸标准品及标准曲线以绝对定量的方式来实现对亚硫酸氢盐转化效率的评估，但该方法操作费时，需对拷贝数进行较为复杂地计算，且依靠Sybr Green试剂定量容易受到非特异性扩增的影响。申请号为201710941702.3的发明专利提供了一种检测亚硫酸氢盐转化效率的组合物，通过向待处理核酸样本中掺入两条不同长度的外源核酸片段，利用Taqman探针法及相对定量的方式对转化效率进行计算。然而，该方法的序列掺入操作较为复杂，且用于检测转化前后序列的引物完全重合，仅靠两条具有极个别碱基差异的探针来区分转化前后的DNA片段，使得检测的特异性难以得到较好地保证；此外该公开所使用的参考品核酸其序列组成上仅含有3个C碱基，与真实序列存在较大的差异，因而以此计算的转化效率很难具备代表性。更为重要的是，上述这些方法都只是针对亚硫酸氢盐处理的转化效率进行评估，并没有涉及转化流程中同时评价DNA回收率的相关技术。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种评价亚硫酸氢盐处理DNA样品转化效率及核酸回收率的方法，该方法通过测定样本中掺入外源DNA片段的未转化及转化后序列所对应的Ct值，利用公式简单、快速且准确地评估所处理的未知DNA样品的转化效率以及DNA回收率，为后续甲基化分析的准确性提供坚实的基础。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种评价亚硫酸氢盐处理DNA样品转化效率及核酸回收率的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)设计并合成一条外源且无甲基化的标准品DNA，以及设计并合成针对标准品DNA及其亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组；
(b)向DNA样品中加入标准品DNA，得到DNA混合物，采用引物探针组对DNA混合物中标准品DNA模板进行荧光定量PCR扩增，得到Ct值，记为Ct1；
(c)对DNA混合物进行亚硫酸氢盐转化处理，纯化后得到bisDNA，再采用引物探针组对bisDNA中标准品DNA转化后的模板及未发生转化的模板分别进行荧光定量PCR扩增，得到Ct值，分别记为Ct2和Ct3；
(d)按照和/>分别计算亚硫酸氢盐处理DNA样品的转化效率和核酸回收率。
优选地，所述步骤(a)中，标准DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述步骤(a)中，针对标准品DNA进行荧光定量PCR扩增的引物探针组选自引物探针组1、引物探针组2和引物探针组3中的一种；
所述引物探针组1中上游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物的序列如SEQID NO：3所示，探针引物的序列如SEQ ID NO：4所示；
所述引物探针组2中上游引物的序列如SEQ ID NO：5所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：6所示，所述探针引物的序列如SEQ ID NO：7所示；
所述引物探针组3中上游引物的序列如SEQ ID NO：8所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：9所示，所述探针引物的序列如SEQ ID NO：10所示。
优选地，所述步骤(a)中，针对标准品DNA的亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组选自引物探针组4、引物探针组5和引物探针组6中的一种；
所述引物探针组4中上游引物的序列如SEQ ID NO：11所示，下游引物的序列如SEQID NO：12所示，探针引物的序列如SEQ ID NO：13所示；
所述引物探针组5中上游引物的序列如SEQ ID NO：14所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：15所示，所述探针引物的序列如SEQ ID NO：16所示；
所述引物探针组6中上游引物的序列如SEQ ID NO：17所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：18所示，所述探针引物的序列如SEQ ID NO：19所示。
优选地，所述步骤(a)中，针对标准品DNA进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组1时；针对标准品DNA的亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组4；
针对标准品DNA进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组2时；针对标准品DNA的亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组5；
针对标准品DNA进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组3时；针对标准品DNA的亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组6。
优选地，所述步骤(a)中，PCR扩增效率为95％～105％。
优选地，所述步骤(b)中，标准品DNA的添加终浓度为102～104copies/μL。
优选地，所述步骤(b)中，标准品DNA的添加终浓度为4×103copies/μL。
优选地，所述步骤(c)中，亚硫酸氢盐转化处理时投入的DNA混合物体积与纯化后的bisDNA体积相同。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明采用与真实序列组成及性质相接近的外源标准品DNA，通过将其掺入到待处理的DNA样品中，使用荧光定量PCR来同时检测该标准品DNA的亚硫酸氢盐转化效率及核酸回收率，从而实现对亚硫酸氢盐处理流程的评估。特别地，本发明仅需测定转化前后样本中相关标准品DNA的三个Ct值，利用公式即可快速计算出亚硫酸氢盐处理的转化效率及核酸回收率，无需其它繁琐的定量评估实验。本发明操作简便易行，可以兼容包括人源基因组在内的其它存在甲基化修饰的物种DNA，所述核酸序列及试剂均可通过常规渠道获得，相关仪器设备也均为实验室常规配置，这将在未来大大提高相关技术方法的适用性及可推广性。
通过本发明的方法，可以快速、有效且准确地评估亚硫酸氢盐处理流程的DNA转化效率及回收率，从而在进行下游甲基化检测等实验之前对转化的过程进行客观评价和质量控制。相关人员在进行甲基化研究时能够快速鉴别出转化效率低的样本，尽早发现由于实验操作失误或试剂过期等原因所造成的转化失败，通过及时进行问题分析可避免不必要的成本损失。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实施例1中引物探针组的标准曲线。
图2为本发明实施例3中评价亚硫酸氢盐处理DNA样品转化效率及核酸回收率的方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施过程进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。本发明采用的所有DNA序列均从上海百力格生物技术有限公司订购合成。
本发明实施例提供了一种评价亚硫酸氢盐处理DNA样品转化效率及核酸回收率的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)设计并合成一条外源且无甲基化的标准品DNA，以及设计并合成针对标准品DNA及其亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组；
(b)向DNA样品中加入标准品DNA，得到DNA混合物，采用引物探针组对DNA混合物中标准品DNA模板进行荧光定量PCR扩增，得到Ct值，记为Ct1；
(c)对DNA混合物进行亚硫酸氢盐转化处理，纯化后得到bisDNA，再采用引物探针组对bisDNA中标准品DNA转化后的模板及未发生转化的模板分别进行荧光定量PCR扩增，得到Ct值，分别记为Ct2和Ct3；
(d)按照和/>分别计算亚硫酸氢盐处理DNA样品的转化效率和核酸回收率。
DNA甲基化修饰普遍存在于植物及哺乳动物等高等真核生物细胞内，所选取的标准品DNA在序列上应避免与这些物种的基因组存在同源性，这样可以保证所建立的评估方法具备广泛的适用性，最大限度地兼容不同物种来源的DNA样品。由于Lambda噬菌体基因组上并不存在任何DNA甲基化修饰，在满足上述非同源性要求的前提下可以作为设计标准品DNA的参考序列；在一实施方式中，标准品DNA序列可以如SEQ ID NO:1所示，长度为167bp，来源于ID号为NC_001416.1的Lambda噬菌体基因组，定位在16,349至16,515。
经过亚硫酸氢盐处理后，双链DNA内的胞嘧啶(C)脱氨基被转变成尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶(5mC)则保持不变，这将会导致转化后的DNA序列其正负两条链丢失原有的反向互补性。在进行荧光定量PCR检测时，针对未转化标准品DNA序列所设计的引物探针对其模板中的两条链均能产生扩增，而对于转化后标准品DNA序列所设计的引物探针则只能够特异性扩增相应模板正负链中的一条。因此，在计算转化后标准品DNA及未转化标准品DNA的相对量时，需考虑上述引物探针扩增时的偏向性差异并在公式计算时进行适当校正，这样才能对亚硫酸氢盐处理DNA时的转化效率及核酸回收率进行准确评估。
在一实施方式中，所述步骤(a)中，针对标准品DNA进行荧光定量PCR扩增的引物探针组选自引物探针组1、引物探针组2和引物探针组3中的一种；
所述引物探针组1中上游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物的序列如SEQID NO：3所示，探针引物的序列如SEQ ID NO：4所示；
所述引物探针组2中上游引物的序列如SEQ ID NO：5所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：6所示，所述探针引物的序列如SEQ ID NO：7所示；
所述引物探针组3中上游引物的序列如SEQ ID NO：8所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：9所示，所述探针引物的序列如SEQ ID NO：10所示。
在另一实施方式中，所述步骤(a)中，针对标准品DNA的亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组选自引物探针组4、引物探针组5和引物探针组6中的一种；
所述引物探针组4中上游引物的序列如SEQ ID NO：11所示，下游引物的序列如SEQID NO：12所示，探针引物的序列如SEQ ID NO：13所示；
所述引物探针组5中上游引物的序列如SEQ ID NO：14所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：15所示，所述探针引物的序列如SEQ ID NO：16所示；
所述引物探针组6中上游引物的序列如SEQ ID NO：17所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：18所示，所述探针引物的序列如SEQ ID NO：19所示。
本发明中采用的各序列如表1所示：
表1
在一实施方式中，所述步骤(a)中，针对标准品DNA进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组1时；针对标准品DNA的亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组4；
针对标准品DNA进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组2时；针对标准品DNA的亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组5；
针对标准品DNA进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组3时；针对标准品DNA的亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组6。
在一实施方式中，所述步骤(a)中，PCR扩增效率为95％～105％。当扩增效率介于95％～105％之间时，可使用引物探针组1～3中的任一项特异性地检测未发生转化的标准品DNA序列，使用引物探针组4～6中的任一项扩增转化后的标准品DNA片段，最后利用二者检测Ct值的差异进行两种模板的相对定量。
在一实施方式中，所述步骤(b)中，DNA样品的来源可以是任何来源，包括且不限于人源细胞系、新鲜组织、石蜡切片、唾液、脑脊液、胸腔积液、肺泡灌洗液、鼻咽拭子、宫颈拭子、粪便、尿液、血浆、血清、血液等样本类型，或基因组上带有甲基化修饰的其它物种来源的DNA。
在一实施方式中，所述步骤(b)中，标准品DNA的添加终浓度为102～104copies/μL。
进一步地，标准品DNA的添加终浓度为4×103copies/μL。
在一实施方式中，所述步骤(c)中，亚硫酸氢盐转化处理时投入的DNA混合物体积与纯化后的bisDNA体积相同。
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1
本实施例为对上述引物探针组1～6的扩增效率的验证：
将标准品DNA进行梯度稀释，浓度分别为2.0×104copies/μl、4.0×103copies/μl、8.0×102copies/μl、1.6×102copies/μl、3.2×101copies/μl以及6.4copies/μl，使用引物探针组1～3分别对上述梯度稀释的未经重亚硫酸氢盐处理的模板进行检测，建立标准曲线并计算扩增效率，标准曲线如图1所示。
类似地，对于浓度为2.0×104copies/μl的标准品DNA，使用亚硫酸氢盐试剂对其处理后再按照上述方法进行5倍梯度稀释，使用引物探针组4～6即可分别针对亚硫酸氢盐处理后的标准品DNA模板建立相应的标准曲线，标准曲线如图1所示。
标准曲线的绘制及扩增效率计算结果如表2所示；
表2
由图1以及表2可知，所有引物探针的扩增效率均接近100％且处于95％～105％之间，标准曲线线性R方数值大于0.99。因此，引物探针组1～3中的任一项可与引物探针组4～6中的任一项进行搭配，用于对未发生转化及转化后的标准品DNA模板进行相对定量，进而实现对亚硫酸氢盐处理DNA转化效率及核酸回收率的评估。
实施例2
本实施例为检测不同亚硫酸氢盐转化试剂盒处理DNA的效果：
1)材料、试剂与仪器
本实施例采用的DNA提取试剂盒为血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304，天根生化科技(北京)有限公司)；三种亚硫酸盐转化试剂盒分别为EpiTect Bisulfite Kit(59104，Qiagen)、EpiArt DNA Methylation Bisulfite Kit(EM101-02，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(D5006，Zymo)；标准品DNA及引物探针从上海百力格生物技术有限公司订购合成；2×qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司(Q112-02)；荧光定量PCR仪为ABI7500。
2)基因组DNA提取及样品混合液的制备
按照厂家说明书，使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取PC-3人前列腺癌细胞系(苏州海星生物科技有限公司)的基因组DNA。以人工合成的标准品核酸稀释基因组DNA来制备样品混合溶液，最终混合液内标准品DNA的终浓度为4×103copies/μl，PC-3基因组DNA的终浓度为10ng/μl。
3)亚硫酸氢盐处理DNA样品混合液并纯化回收核酸
使用EpiTect Bisulfite Kit、EpiArt DNA Methylation Bisulfite Kit以及EZDNA Methylation-GoldTM Kit分别处理40μl的样本混合液，纯化并回收洗脱得到40μl转化后的bisDNA。相关操作严格按照各个厂家的说明书进行。对于每种试剂盒，设定并同时操作3个样本混合液作为技术重复。
除了按照上述标准的亚硫酸氢盐处理流程，本实施例同时使用超过有效期的EZDNA Methylation-GoldTM Kit(D5006，Zymo)处理DNA样本混合液，以评估转化试剂过效期对亚硫酸氢盐处理效果的影响。
4)荧光定量PCR检测
经过亚硫酸氢盐转化后，DNA中发生了甲基化的C碱基仍然保持为C碱基，而没有发生甲基化的C碱基则变成了U碱基，最后得到转化后的bisDNA。在处理过程中，有极少量的序列并没有转化成功，其序列中的C碱基并没有变成U而是保持原来的C不变。使用分别针对上述两种模板的特异性的引物探针，利用荧光定量PCR实验即可实现相对定量。
在本实施例中，由引物探针组2及引物探针组5实现所述荧光定量PCR反应。其中利用引物探针组2对原始DNA样品混合液进行PCR检测，扩增得到Ct值记为Ct1；使用引物探针组5及引物探针组2对转化后的样品混合液bisDNA进行PCR扩增，得到Ct值分别记为Ct2和Ct3。
上述PCR反应体系为20μl，具体组成如下：2μl模板DNA、10μl 2×qPCR MasterMix、0.6μl正向引物(10μM)、0.6μl反向引物(10μM)、0.4μl探针(10μM)、6.4μl ddH2O。所述PCR反应在荧光定量PCR仪(ABI7500)中进行，针对每个样本混合液转化前及转化后的产物，其检测反应均设置2个复孔用以后续计算Ct均值，反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性15秒，60℃退火及延伸40秒，共45个循环。
5)检测结果的分析计算
根据荧光定量PCR检测的Ct值信息，代入公式计算得到亚硫酸氢盐处理DNA样品的转化效率及核酸回收率，具体公式如下：
计算结果如表3所示；
表3评估三种不同重亚硫酸盐转化试剂盒处理DNA样品的转化效率及核酸回收率
由表3可知，当按照标准流程处理相同的DNA样品时，所测试的三种商业化试剂盒均具备较好的转化效率，即转化效率大于99.5％，满足常规的甲基化分析实验要求；对于DNA回收率，Zymo试剂盒的综合性能相较于其他两家商业化试剂表现更优。此外，对于转化试剂过效期等问题，检测结果中Ct2数值会有所延后而Ct3数值则大幅提前，从而导致转化效率的计算值降低，故利用本发明所述的方法能够及时对异常的亚硫酸氢盐处理流程进行鉴别及发现。
实施例3
本实施例为评估亚硫酸氢盐处理DNA样品的转化效率及核酸回收率的方法：
本实施例将对评价亚硫酸氢盐处理临床样本来源DNA的转化效率及核酸回收率的方法进行具体阐述，相应的方法流程图如图2所示。所用临床样本为医院收集的已明确病理分期的肝癌患者血浆及健康人志愿者血浆，其中肝癌患者(HCC)及健康人(Control)对照的样本各有10例。
本实施例的步骤如下：
1)血浆cfDNA提取
取1mL血浆，使用血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP339，天根生化科技(北京)有限公司)对所有血浆样本进行cfDNA提取及纯化。相关操作严格按照厂家说明书进行。
2)DNA样品混合液制备
将人工合成的标准品核酸掺入到提取的cfDNA中来制备样品混合溶液，最终混合液内标准品DNA的终浓度为4×103copies/μl，混合液的总体积为45μl。
3)亚硫酸氢盐处理DNA样品混合液并纯化回收核酸
按照EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(D5006，Zymo)说明书操作，对每个样本分别处理40μl的样品混合液，纯化并回收洗脱得到40μl转化后的bisDNA。
4)荧光定量PCR检测
按照表4所示的体系配制反应液。在本实施例中，由引物探针组2及引物探针组5实现所述荧光定量PCR反应；其中利用引物探针组2对原始DNA样品混合液进行PCR检测，扩增得到的Ct值记为Ct1；使用引物探针组5及引物探针组2对转化后的样品混合液bisDNA进行PCR扩增，得到Ct值分别记为Ct2和Ct3。
表4荧光定量PCR反应液配制
组分 加入体积μl/反应
2×qPCR Master Mix 10
正向引物(10μM) 0.6
反向引物(10μM) 0.6
荧光探针(10μM) 0.4
ddH2O 6.4
模板DNA 2.0
在ABI7500荧光定量PCR仪上运行如表5所示的反应程序。其中，在60℃设置荧光信号的收集；荧光通道设置为FAM及ROX分别对应检测转化前的标准品DNA模板及转化后的标准品DNA模板。参比荧光(Passive Reference)设置为None。针对每个临床血浆样本，其原始DNA样品混合液及转化后bisDNA的检测反应均设置2个复孔用以后续计算Ct均值。
表5荧光定量PCR的反应程序
5)结果分析及计算
根据荧光定量PCR检测结果计算Ct1、Ct2和Ct3的均值，代入公式即可得到各血浆样本的cfDNA在亚硫酸氢盐处理过程中的转化效率及核酸回收率，其中具体数据及计算结果如表6所示；
表6亚硫酸氢盐处理临床血浆样本DNA的转化效率及核酸回收率
由表6可知，不论是对肝癌HCC组血浆样本及健康人Control组样本，其血浆cfDNA经过亚硫酸氢盐处理后均具备较高的转化效率及DNA回收率，这也侧面印证了本发明中评价亚硫酸氢盐处理临床样本DNA效果的技术方法具备良好的稳健性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (9)

1.一种评价亚硫酸氢盐处理DNA样品转化效率及核酸回收率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)设计并合成一条外源且无甲基化的标准品DNA，以及设计并合成针对标准品DNA及其亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组；
(b)向DNA样品中加入标准品DNA，得到DNA混合物，采用引物探针组对DNA混合物中标准品DNA模板进行荧光定量PCR扩增，得到Ct值，记为Ct1；
(c)对DNA混合物进行亚硫酸氢盐转化处理，纯化后得到bisDNA，再采用引物探针组对bisDNA中标准品DNA转化后的模板及未发生转化的模板分别进行荧光定量PCR扩增，得到Ct值，分别记为Ct2和Ct3；
(d)按照分别计算亚硫酸氢盐处理DNA样品的转化效率和核酸回收率。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，标准DNA序列如SEQ IDNO：1所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，针对标准品DNA进行荧光定量PCR扩增的引物探针组选自引物探针组1、引物探针组2和引物探针组3中的一种；
所述引物探针组1中上游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物的序列如SEQ IDNO：3所示，探针引物的序列如SEQ ID NO：4所示；
所述引物探针组2中上游引物的序列如SEQ ID NO：5所示，所述下游引物的序列如SEQID NO：6所示，所述探针引物的序列如SEQ ID NO：7所示；
所述引物探针组3中上游引物的序列如SEQ ID NO：8所示，所述下游引物的序列如SEQID NO：9所示，所述探针引物的序列如SEQ ID NO：10所示。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，针对标准品DNA的亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组选自引物探针组4、引物探针组5和引物探针组6中的一种；
所述引物探针组4中上游引物的序列如SEQ ID NO：11所示，下游引物的序列如SEQ IDNO：12所示，探针引物的序列如SEQ ID NO：13所示；
所述引物探针组5中上游引物的序列如SEQ ID NO：14所示，所述下游引物的序列如SEQID NO：15所示，所述探针引物的序列如SEQ ID NO：16所示；
所述引物探针组6中上游引物的序列如SEQ ID NO：17所示，所述下游引物的序列如SEQID NO：18所示，所述探针引物的序列如SEQ ID NO：19所示。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，针对标准品DNA进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组1时；针对标准品DNA的亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组4；
针对标准品DNA进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组2时；针对标准品DNA的亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组5；
针对标准品DNA进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组3时；针对标准品DNA的亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量PCR扩增的引物探针组为引物探针组6。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，PCR扩增效率为95％～105％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，标准品DNA的添加终浓度为102～104copies/μL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，标准品DNA的添加终浓度为4×103copies/μL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，亚硫酸氢盐转化处理时投入的DNA混合物体积与纯化后的bisDNA体积相同。
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