CN117070534A - 一种预防和治疗动物传染性腹膜炎的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种治疗、预防动物传染性腹膜炎的药物组合物，主要由包含FCoV病毒株的M蛋白、N蛋白、S蛋白构成，主要用于预防和治疗猫传染性腹膜炎，经过实验验证，本发明设计的新型药物组合物，能够有效起到在动物体中的保护作用，用于预防FIP具有重要的意义。

Description

一种预防和治疗动物传染性腹膜炎的药物组合物

技术领域

本发明涉及一种预防和治疗动物传染性腹膜炎的药物组合物。

背景技术

传染性腹膜炎常指结核性腹膜炎，以及肝炎所导致的肝硬化腹水引起来的腹膜炎这两种情况，一般是通过口鼻进行传播。其中，猫传染性腹膜炎(Feline InfectionPeritonitis，FIP)是由猫冠状病毒(Feline Coronavirus，FCoV)感染引起的一种全身性、致死性传染病。其发病的主要特征为腹膜炎、大量腹水积聚和致死率较高。初期症状不明显，主要表现为食欲减退、精神差、体重下降和持续发烧。后期症状明显，可分成渗出型(湿型)和非渗出型(干型)2种形式：渗出型以体腔(尤其是腹腔)内体液蓄积为特征；非渗出型以各种脏器出现肉芽肿病变以及与此相关的临床症状(如共济失调、轻度瘫痪等)为特征。FIP好发于3-9个月的年轻猫，尤其常发于群聚饲养的猫群，一旦发病，死亡率几乎是100％，因此是近些年造成猫死亡最常见的疾病之一。

猫冠状病毒(FCoV)有两种生物型：猫肠道冠状病毒(FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)，其中FIPV是由FECV突变而来，是引起FIP的病毒株。FCoV是一种具有囊膜的正链RNA病毒，属于尼多病毒目冠状病毒科，冠状病毒属。基因组大小约29kb，包含2个非结构基因分别编码复制酶1a和1b；4个结构基因分别编码S蛋白、包膜蛋白E、膜蛋白M和核衣壳蛋白N；5个辅助基因：3a、3b、3c、7a和7b。其中S全长蛋白由S1和S2两部分组成，S1主要负责与ACE2的结合，由N端结构域(NTD)和受体结合域(RBD)组成，S2主要负责与猫细胞膜的融合，完成遗传物质的释放；M和E蛋白主要参与病毒的组装和装配；N蛋白在冠状病毒中含量丰富，是一种高度免疫原性蛋白，参与基因组复制和细胞信号通路调节。

针对FIP，目前尚无切实有效的治疗方法，只能通过一些药物来延长寿命和改善生活质量，因此预防FIP的发生显得尤为重要。目前国外已有商业化的FCoV滴鼻疫苗，即辉瑞公司的减毒活疫苗Primucell FIP，可用于16周龄以上的幼猫，但是其主要针对的是Ⅱ型FCoV突变株DF2-FIPV，然而Ⅰ型FCoV在世界更普遍流行，因此该疫苗的保护效果颇受争议，然而目前尚无上市的针对Ⅰ型FIPV的有效疫苗。

mRNA疫苗是根据不同疾病构建特异性抗原的mRNA序列，由新型脂质纳米载体颗粒(LNP)包裹运送至宿主细胞内，再利用宿主体内的核糖体翻译mRNA序列产生疾病的抗原蛋白，刺激机体产生特异性免疫反应，从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。mRNA疫苗相较于传统疫苗具有多种优势：例如安全、有效、生产速度快、生产成本低和能够对付病毒变异等。

综上所述，研究并开发用于预防FIP的mRNA疫苗具有重要的意义。

发明内容

定义

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语，具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。

一般术语定义

在权利要求和/或说明书中，当与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。

如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。术语“等”表示在列举范围内可合理预期的可替换的特征。

虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。

在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。

本发明所述的术语“同一性”“同源性”是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的相似度，且依然具有与原氨基酸序列或核苷酸序列相同的功能。

关于肽或多肽使用的术语“变体”是指氨基酸序列因氨基酸的插入、缺失或保守取代而不同但保留至少一种生物学活性的肽或多肽。变体还可以指具有与参考蛋白质基本相同的氨基酸序列的蛋白质，参考蛋白质具有保留至少一种生物学活性的氨基酸序列。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来识别(Kyte等人，1982年，J.Mol.生物学.157:105-132)。氨基酸的亲水指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知类似亲水指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。一方面，氨基酸具有±2的亲水指数的被替代。氨基酸的亲水性也可用于揭示导致蛋白质保留生物学功能的取代。在肽的上下文中考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是一种有用的测量，据报道与抗原性和免疫原性密切相关。美国专利号4,554,101，通过引用全部并入本文。取代具有相似亲水性值的氨基酸可导致保留生物学活性的肽，例如免疫原性，如本领域所理解的。可用亲水性值彼此相差在±2以内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水指数和亲水值均受该氨基酸特定侧链的影响。与该观察结果一致，与生物学功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸的相对相似性，尤其是那些氨基酸的侧链，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他属性。

如本文所用的关于核酸的术语“变体”是指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列基本相同的核酸；(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其基本相同的序列杂交的核酸。变体可以是在整个基因序列或其片段的全长上基本上相同的核酸序列。核酸、蛋白序列可以是66％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％在基因、蛋白序列或其片段的全长上相同。

在本文中，术语“同一性”、“同源性”或“相似性”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。

在本文中，术语“片段”是指目标蛋白或多肽，以及具有N-末端(N端)或C-末端(C端)截短、和/或内部删除的目标蛋白或多肽。

“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性，可作为生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，这些聚合物和大分子具有定义的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)均可称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

mRNA疫苗术语定义

本文所用的术语“免疫原”旨在表示一种物质，其能够在个体中诱导适应性免疫反应，其中所述适应性免疫反应能够诱导免疫反应，其显着参与免疫原共享免疫学特征的病原体。“免疫原”是指引入体内以产生免疫反应的任何物质。该物质可以是物理分子，例如蛋白质，也可以由载体编码，例如DNA、mRNA或病毒。

术语“免疫反应”，如本文所用术语，是指涉及激活和/或诱导效应子功能的过程，作为非限制性示例，T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、和/或抗原呈递细胞(APC)。因此，如本领域技术人员所理解的，免疫应答包括但不限于辅助性T细胞或细胞毒性T细胞活性或应答的任何可检测的抗原特异性激活和/或诱导、抗体的产生、抗原呈递细胞活性或浸润、巨噬细胞活性或浸润、中性粒细胞活性或浸润等。

术语“疫苗”是指在接种到受试者体内后诱导免疫反应的组合物。在一些实施方案中，诱导的免疫反应提供保护性免疫。

术语“抗原”或“Ag”定义为激发适应性免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体的产生，或特定免疫原性细胞的激活，或两者兼而有之。技术人员将理解任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可源自重组或基因组DNA或RNA。技术人员将理解，包含编码引发适应性免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA或RNA因此编码本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用一种以上基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发所需的免疫反应。此外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以源自生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。

在本文中，术语“载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，例如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸质粒或包含在脂质体中)RNA和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

所述的mRNA为单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA。所述的双顺反子或多顺反子mRNA即含有两个及以上编码区的mRNA。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的双顺反子或多顺反子mRNA的编码区可通过至少一种内部核糖体进入位点(IRES)序列分开，可使用的IRES序列包括但不限于：小RNA病毒(例如FMDV)、瘟病毒(例如CFFV)、脊髓灰质炎病毒(例如PV)、脑心肌炎病毒(例如ECMV)、口蹄疫病毒(例如FMDV)、丙肝病毒(例如HCV)、古典猪瘟病毒(例如CSFV)、小鼠角膜白斑病毒(例如MLV)、猿免疫缺陷病毒(例如SIV)或蟋蟀麻痹病毒(例如CrPV)等。所述编码区亦可以通过“2A连接子”进行分割，所述“2A连接子”是来源于病毒的短肽(18-25个氨基酸)，又称“自我剪切”肽，能使一条转录产物产生多种蛋白，包括但不限于P2A/T2A/E2A/F2A等。

优选的，所述的mRNA由若干个结构元件组成，即所述的mRNA除包含上述编码区外还可以包括5’帽子结构，启动子、5’非编码区(5’UTR)，信号肽，3’非编码区(3’UTR)和/或多聚腺苷酸尾(polyA)的mRNA序列，但并不仅限于上述元件，只要对于mRNA构建有必要，都在本发明的保护范围之内。

所述的M蛋白是FCoV的膜蛋白，可与其他结构蛋白相互作用促进病毒粒子组装；N蛋白是FCoV的核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)，可结合FCoV基因组，将病毒基因组RNA包装到核糖核蛋白复合物中，且能增加病毒形成病毒样颗粒(VLP)组装效率；S蛋白是刺突蛋白(Spike，S)，介导病毒附着和进入宿主细胞，可决定宿主范围，S蛋白的S1区域负责与宿主细胞上的受体结合，S2区域负责病毒与宿主细胞膜融合；E蛋白是小包膜蛋白(Envelope，E)，参与病毒组装和出芽。

治疗相关术语定义

在本文中，术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是猫的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。

术语“对象”“个体”、“患者”或“受试者”包括(根据是否存在治疗用途选择添加)哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。

本发明所述的“预防”指在疾病开始发展之前或之后通过施用本发明所述的产品来避免症状或者延缓特定症状紧张的所有行为。

本发明所述的“有效量”是指在以单个或多个剂量给予患者或器官之后提供所希望的治疗或预防的本发明所述产品的量或剂量。

在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、细碎固体载体或这两者相结合，制备组合物。

本发明所述的mRNA或组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是载体、稀释剂、佐剂或编码佐剂核苷酸序列、增溶剂、粘合剂、润滑剂、助悬剂、转染促进剂等。

所述转染促进剂包括但不限于表面活性剂如免疫刺激复合物、弗氏不完全佐剂、完全弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、乳佐剂、脂质体佐剂、微生物佐剂、LPS类似物(例如单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、钙离子、病毒蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚-L-谷氨酸(LGS))或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。

所述的编码佐剂的核苷酸序列为编码如下至少一种佐剂的核苷酸序列：GM-CSF、IL-17、IFNγ、IL-15、IL-21、抗PD1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INF-α、INF-γ、Lymphotoxin-α、hGH、MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。

在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。

递送系统

术语“转化、转染、转导、导入”，具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的核酸(DNA，RNA等)导入宿主的过程。所述转化、转染、转导的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO₄)沉淀法、氯化钙(CaCl₂)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。

本发明所述的组合物可以为脂质、脂质复合物或脂质纳米粒子。所述的脂质可以为以下形式制备得到的脂质：1，2-二油烯基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DODMA)脂质、1，2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2，2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)脂质。所述脂质复合物或脂质纳米粒子可以由选自以下的脂质形成：DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、聚乙二醇化脂质和氨基醇脂质。

本发明所述的“LNP”为脂质纳米颗粒。

本发明所述的mRNA、mRNA疫苗、蛋白或多肽疫苗、载体疫苗、偶联物或药物组合物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

剂型

本发明的mRNA、mRNA疫苗、蛋白或多肽疫苗、载体疫苗或药物组合物可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物中。这些药物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)或冻干粉。

给药途径

术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的抗体或抗原结合片段、重组蛋白、多特异性抗体、偶联物或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、滴鼻或吸入等等，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。优选地，本发明的组合物采用肌肉注射、静脉注射或皮下注射方式，尤其是肌肉注射被给药。

所述吸入的施用方式选自粉末吸入和雾化吸入中的至少一种。

根据本申请的实施例，所述施用的次数为1～20次，优选为1～10次，更优选为1、2、3、4、5或6次。

本发明第一方面提供了DNA元件

一种DNA元件，由包含FCoV病毒株的M蛋白、N蛋白、S蛋白三个元件中至少一个元件的核苷酸连接得到；

进一步的，元件可以通过或不通过连接肽连接，当连接肽数量大于一个时，多个连接肽可以相同也可以不同，但优选相同；

进一步的，所述元件的数量优选为1-3个或2-3个，可以是1或2或3个；

进一步的，所述重组DNA分子的结构可以是，M蛋白、N蛋白、S蛋白单元件，也可以是M+N、N+M、M+S、S+M、N+S、S+N的双元件核苷酸序列顺序连接，也可以是N+M+S、N+S+M、S+N+M、M+N+S、M+S+N、S+M+N的三元件的核苷酸序列顺序连接进行组合中任意一个；所述“顺序”是指5’端到3’端的顺序。

仅为示例，作为优选可以选择M+N、N+M、N+M+S、N+S+M、S+N+M、M+N+S、M+S+N、S+M+N的顺序连接组合；更优选为N+M、N+M+S、N+S+M的顺序连接组合。

进一步的，所述重组DNA分子的元件之间可通过连接肽进行连接；所述连接肽可以为内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)或自剪切多肽2A(self-cleaving 2Apeptide，2A)，2A连接肽包含P2A连接肽、T2A连接肽、E2A连接肽和F2A连接肽；优选P2A连接肽或T2A连接肽。

其中所述S蛋白可以为S全长、S1蛋白、S2蛋白中任意一个，但优选S全长和S2蛋白；

所述DNA元件优选M+N(T2A)、N+M(T2A)、M+N(P2A)、N+M(P2A)、N+M+S(T2A)、N+S+M(T2A)、N+M+S2(T2A)、N+S2+M(T2A)、N+M+S(P2A)、N+S+M(P2A)、N+M+S2(P2A)、N+S2+M(P2A)中至少一种。

更优选的，所述核苷酸、蛋白序列可以如表1所示，以及能够实现相同功能的66％以上或75％以上或85％以上或95％以上同一性的序列。

例如，所述元件的DNA序列为SEQ ID NO：7-23所示，氨基酸序列为SEQ ID NO：60-76所示；所述连接肽的DNA序列为SEQ ID NO：4-5所示，氨基酸序列为SEQ ID NO：58-59所示；以及能够实现相同功能同一性66％以上或75％以上或85％以上或95％以上的序列。

本发明第二方面提供了一种重组核酸分子

一种重组核酸分子，其结构为5’端非翻译区、Kozak序列区、至少一个抗原编码区、3’端非翻译区和polyA的多个元件连接组成；所述顺序并不特别限定，但优选从5’到3’顺序连接；

所述抗原编码区即为上述多个元件组合的重组DNA分子；所述核酸分子可以是DNA或RNA分子，也包含具体的各种亚类型。

所述polyA为不同数量的A连接而成，包括1-200个A连接，具体的，可以是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200个A连接而成，优选50-150个A连接，更优选100个A连接。

进一步的，在5’端非翻译区的5’端可以进一步包括启动子；所述模板DNA的启动子可以为能够启动翻译的启动子，包括但不限于T7、CMV或SP6启动子；

进一步的，在5’端非翻译区的3’端可以进一步包含信号肽编码区，所述信号肽可以选自TPA、IgE、自身信号肽等，但值得注意的是，DNA分子可以包含或不包含信号肽，事实上，不包含信号肽并不影响分子的翻译表达；

所述linker的氨基酸序列如2A连接肽(P2A、T2A、E2A和F2A)、IRES中的至少一种，优选的，所述连接肽的DNA序列为SEQ ID NO：4-5所示，氨基酸序列为SEQ ID NO：58-59所示；

所述核苷酸、蛋白序列如表1和表2所示，以及能够实现相同功能的66％以上或75％以上或85％以上或95％以上同一性的序列。

例如重组DNA分子，所述5’端非翻译区序列为SEQ ID NO:1所示；所述Kozak序列为SEQ ID NO:2所示；所述3’端非翻译区为SEQ ID NO:3所示；所述polyA序列为SEQ ID NO:6所示；所述的重组DNA分子，DNA序列为SEQ ID NO:24-40；以及能够实现相同功能同一性66％以上或75％以上或85％以上或95％以上同一性序列。

前述DNA分子转录得到的mRNA分子，优选的，可以是SEQ ID NO：41-57所示的mRNA。

本发明第三方面涉及包含前述DNA元件、重组核酸分子的结构

一种包含前述重组DNA元件或重组DNA分子的重组载体；所述载体可以使用现有技术已知的载体，包括但不限于pUC57、pTZ19R、PMD18T、PQE30、pUC18和pUC19等；

一种mRNA，由前述重组DNA分子转录得到的mRNA；

一种蛋白，由前述重组DNA分子翻译得到的蛋白；以及能够表达该蛋白的各种DNA分子，其含义为，本发明保护范围包含了只要能够通过密码子表达规律推算得到的所有的DNA分子，不仅仅是实施例中所示的DNA序列。

一种重组细胞，导入前述重组载体；所述细胞包括但不限于人源、动物源细胞系，如CRFK猫肾细胞、PG-4(S+L-)猫脑细胞、F81猫肾细胞、FCA-S1猫皮肤细胞、CATK1猫肾细胞、MDCK(NBL-2)犬肾细胞、SCBN犬十二指肠细胞、DH82犬肾恶性组织增生症细胞、HEK293T、HEK293、BHK、CHO、3T3、NS0、Hela、HT-1080，PERC6、CAP、HKB-11、Huh-7等；

所述导入方法包括但不限于脂质体转染、微囊泡转染、外泌体转染、电穿孔、纳米载体转染、采用转染试剂进行化学转染；纳米载体包括脂质、聚合物或脂质-聚合物杂化物。

一种递送系统，用于递送上述重组DNA分子、重组核酸载体、mRNA。

所述mRNA可存在适度的修饰，包括但不限于假尿苷(Ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)、5-甲氧基-尿苷(5moU)、N6-甲基-腺苷(m6A)、5-甲基-胞苷(5m5C)等。

本发明第四方面提供了一种药物组合物

所述组合物包含前述DNA元件、重组DNA分子、mRNA、蛋白、重组细胞、重组载体、递送系统。

进一步的，所述组合物可以为药物组合物，例如可以是疫苗组合物、治疗性药物组合物，更优选可以是DNA疫苗、mRNA疫苗、蛋白疫苗、治疗性蛋白、治疗性核酸组合物等；

主料：

本发明中提供的DNA元件、重组核酸分子(DNA、RNA)、mRNA、蛋白等，可以为单独的组分，也可以以不同比例进行混合；混合所采用的组分可相同也可以不同；

仅为列举，例如可以制备N蛋白的mRNA疫苗与M蛋白的mRNA疫苗进行混合；也可以是N蛋白mRNA疫苗、M蛋白RNA疫苗、S2蛋白mRNA疫苗进行混合；也可以是前述多种元件组合后的重组载体表达得到的mRNA疫苗相互进行一定比例混合。。

当组分为两种时，所述混合比例可以为1：1、2：1、3：1、1：2、1：3、1：4、4：1等各种比例，但优选1：1的等比例混合；当组分为三种时，所述混合比例可以为1：1：1、1：1：2、2：1：1、1：2：1等，但优选为1：1：1的等比例混合。

辅料：

在主料的基础上，可选的，所述药物组合物还包含一种以上的药学可接受的赋形剂、载体、辅料、媒介物。赋形剂、载体、辅料、媒介物的实例包括但不限于抗粘剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料、滑润剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、芳香剂、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、吸附剂、悬浮或分散剂或甜味剂。例示性赋形剂、载体、辅料、媒介物包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(一氢)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、蛋氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、视黄醇棕榈酸酯、虫胶、二氧化硅、羧基甲基纤维素钠、柠檬酸钠、乙醇酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维他命A、维他命E、维他命C及木糖醇。

所述药物组合物可呈注射制剂的形式或口服制剂形式经制备。所述的注射制剂依据物态分类包括液体注射剂、注射用粉剂、注射用片剂；依据注射部位分类包括皮内注射剂、皮下注射剂、肌肉注射剂、静脉注射剂、脊椎腔注射剂；优选的所述注射制剂的溶剂包括注射用水或生理盐水。

用于口服使用的制剂包括含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纤维素、包括马铃薯淀粉的淀粉、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；制粒剂及崩解剂(例如，包括微晶纤维素的纤维素衍生物、包括马铃薯淀粉的淀粉、交联羧甲纤维素钠、藻酸盐或藻酸)；粘合剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯胶、藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸镁铝、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及润滑剂、助流剂及抗粘剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。用于口服使用的制剂也可呈可咀嚼片剂形式，或呈硬明胶胶囊形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或呈软明胶胶囊形式，其中活性成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。粉剂、颗粒剂及丸剂可以使用上文在片剂或胶囊下提到的成分以常规方式使用例如混合器、流化床设备或喷雾干燥设备来制备。

用于口服制剂的其他药学上可接受的赋形剂包括但不限于着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂及缓冲剂。用于口服使用的制剂也可呈可咀嚼片剂形式，或呈硬明胶胶囊形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或呈软明胶胶囊形式，其中活性成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。粉剂、颗粒剂及丸剂可以使用上文在片剂或胶囊下提到的成分以常规方式使用例如混合器、流化床设备或喷雾干燥设备来制备。

施用方法

在一些实施方案中，施用包括经肌肉内、静脉内(例如，呈无菌溶液形式且在适用于静脉内使用的溶剂系统中)、皮内、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、经表面、肿瘤内、经腹膜、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、经口(例如，片剂、胶囊、囊片、囊形片或糖浆)、经表面(例如，呈乳膏、凝胶、洗剂或软膏形式)、经局部、通过吸入、通过注射或通过输注(例如，以乳膏或脂质组合物形式连续输注、直接地浸泡靶标细胞的局部灌注、置管、灌洗)施用本文所述的组合物。

脂质体递送

组合物中还进一步可以包括阳离子或聚阳离子化合物。其中所述的阳离子或聚阳离子化合物游离或者与mRNA结合。为了使得所述组合物更稳定选择阳离子或聚阳离子化合物与所述mRNA结合的形式。

优选的，所述的组合物中还包含脂质。优选的，所述的脂质包括但不限于能够促进自组装形成病毒大小的颗粒(～100nm)的脂质、使得mRNA从内涵体中释放到胞内的脂质、支撑磷脂双分子层结构的脂质或用作稳定剂的脂质。。

更优选的，为了增加LNP的半衰期，所述的脂质还可以包含PEG化脂质。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的脂质包含阳离子脂质、PEG化脂质、胆固醇和/或磷脂。

所述脂质体结构可以为将磷脂质MC3、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和脂质-聚乙二醇(例如DMG-PEG2000)按一定比例与乙醇混合得到，例如按摩尔比50:10:38.5:1.5的比例与乙醇混合。

本发明第五方面提供了一种疫苗的制备方法

一种mRNA疫苗的制备方法，包括以下步骤

(1)DNA模板合成

(2)mRNA转录

进行mRNA的体外转录

(3)mRNA加帽步骤

所述步骤包括，mRNA溶解稀释，变性步骤，配制加帽反应体系。

所述溶解稀释步骤用无RNase水将上述回收的mRNA进行适度稀释；

所述变性步骤可采用加热后冷却的方法，例如65℃加热5分钟，迅速放至冰上5分钟；

所述加帽反应使用变性的RNA加入加帽酶进行孵育。

(4)mRNA纯化步骤

所述纯化方法包含但不限于寡聚(dT)-纤维素柱层析法、寡聚(dT)-纤维素液相离心法和寡聚(dT)-磁珠法等；电泳，包括但不限于变性凝胶电泳如变性琼脂糖凝胶电泳，和毛细管电泳等。

本发明第六方面提供了预防和治疗用途

前述的DNA元件、重组DNA分子、mRNA、重组载体、重组细胞、药物组合物在治疗和/或预防动物冠状病毒感染疾病中的用途，以及制备用于治疗和/或预防动物冠状病毒感染所引起疾病的药物中的用途。

进一步的，所述动物冠状病毒感染疾病为肠道冠状病毒感染所致疾病或传染性腹膜炎病毒感染所致疾病；

一种治疗和/或预防动物冠状病毒感染疾病的方法，所述方法为对需要接受治疗或预防的对象个体施用前述的DNA元件、重组核酸分子、mRNA、重组细胞、药物组合物；

所述施用方法为单次或多次施用，两次施用之间可间隔18-26天，例如18、19、20、21、22、23、24、25、26天，优选间隔20、21、22、23、24天，更优选间隔22天。每次施用的药物可相同可以不同；

所述施用剂量为1-50μg/kg，优选1-30μg/kg，更优选1-20μg/kg；

进一步的，所述感染的对象优选哺乳动物，包括但不限于人、猫、狗、鼠、马、牛、羊、猪、猴等；发明人使用上述哺乳动物的细胞系建立验证模型，并进行了动物体内攻毒验证实验，证明在哺乳动物体内的普适性和预防、治疗的有效性。

进一步的，可以优选用于预防和/或治疗猫冠状病毒(FcoV)所引起的猫传染性腹膜炎(FIP)；

根据本申请的实施例，所述施用的次数为1～20次，优选为1～10次，更优选为1、2、3、4、5或6次。

本发明第七方面提供了变体验证

为了进一步验证技术效果，发明人进一步对M蛋白、N蛋白、S全长、S1蛋白、S2蛋白以及本发明所记载的不同元件组合的重组DNA分子和蛋白结构，在本发明序列公开的基础上还做了多个变体的验证，在至少66％、67％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性的基础上，例如进行多种不同类型的、不同来源的内含子的验证、不同长度的间隔子的验证等，通过截短、突变、分割等方式保证66％以上同源性基础上，通过采用下述发明内容与具体实施方式中的验证方法，先合成重组核酸分子，体外制备成mRNA疫苗在多种细胞水平和动物水平上进行实施例中相同的方法进行验证，结果证明能够达到相同的技术效果，因此能够支持66％以上同一性的保护范围。更优选的，可以是75％以上同一性的保护范围，更更优选的，可以是85％以上同一性的保护范围，最优选的，可以是95％以上同一性的保护范围。

所述变体的验证方法，可采用新序列与查询序列进行比较的方式，确定序列相同性的百分数，普遍使用的比较两种核酸或多肽的相似性和氨基酸位置的标准方法可以用于进行这种比较。应用计算机程序，例如BLAST或FASTA，例如，可以排列两种多肽，进行各自氨基酸的最佳比对(可以沿着一种或两种序列的全长，或者沿着一种或两种序列的预先确定的局部)。这种程序提供“缺陷”开放罚分和“缺陷”空位罚分，可以结合计算机程序使用一种打分矩阵例如PAM250(一种标准打分矩阵；参见Dayhoff等，Atlas of Protein Sequenceand Structure，Vol.5，Supp.3(1978))或BLOSUM打分矩阵。然后计算相同性百分数。

附图说明

图1为1％的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定mRNA的完整性电泳图；

图2为mRNA在细胞中的表达水平鉴定图；

图3为mRNA在细胞中的表达水平鉴定图；

图4为ELISA法检测结合抗体和中和抗体水平；

图5为抗体滴度测定实验结果；

图6A为FCoV检测结果图；图6B为体温检测图；图6C为体重测量结果图；图6D为N和S2蛋白结合抗体检测；图6E为中和抗体检测；图6F为分组信息；

图7A为免疫后的反应观察，图7B和C分别为免疫后的体温和体重；

图8A和8B为结合抗体检测；图8C为中和抗体检测；图8D为淋巴细胞增殖实验；

图9A为攻毒后的体温检测，图9B为攻毒后的体重检测；

图10A为存活率统计结果；图10B为各组动物体内主要器官的猫传染性腹膜炎病毒的病毒滴度检测结果。

具体实施方式

实施例1 mRNA序列的合成

1)目的基因获取：

元件基因来源：在GenBank数据库中搜索FCoV病毒株rQS-79的M蛋白(MW030108.1:26093-26881)、N蛋白(MW030108.1:26894-28024)和S蛋白(MW030109.1:20437-24795)的DNA序列；5’-UTR序列(来源于猫DNAH2、猫血红蛋白或猫白蛋白基因)；3’UTR序列(来源于猫血红蛋白或猫白蛋白基因)，其中S蛋白包括S全长蛋白、S1蛋白、S2蛋白；具体序列见表1。

重组基因组合：将元件序列(如表1所示)进行组合，每个组合中序列从5’至3’端结构为：5’-UTR(SEQ ID NO:1)+Kozak(SEQ ID NO:2)+目的DNA序列(SEQ ID NO:7-23)+3’-UTR(SEQ ID NO:3)+100polyA(SEQ ID NO:6)。由基因合成公司进行DNA模板合成，将DNA模板连接至pUC57载体(金斯瑞，SD1176)中得到重组质粒。其中每个组合内的不同目的DNA序列通过连接子连接，选择两种不同的2A肽连接子，氨基酸序列分别为T2A肽：GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO.58)；P2A肽：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ IDNO.59)。

表1

将5’-UTR+Kozak+目的DNA序列+3’-UTR+100polyA结构(表2，SEQ ID NO:24-40)所示的重组质粒转化感受态细胞DH5α，通过克隆筛选和扩增获得大量菌体，利用无内毒素质粒大提试剂盒(天根，DP117)得到大量的重组质粒。利用限制性内切酶进行酶切线性化，经回收试剂盒回收得到合成mRNA的模板。

表2

2)mRNA转录：

采用mRNA体外转录试剂盒(NEB，E2050)进行mRNA的体外合成，反应体系如下表3所示：

表3

37℃反应2小时。利用mRNA回收试剂盒对mRNA进行回收。

3)mRNA加帽：

采用mRNA加帽试剂盒(NEB，M2080，M0366)进行mRNA的加帽反应，可加入Cap1结构，反应体系如下：

a)用无RNase水将10μg上述回收的mRNA稀释至13.5μL；

b)65℃加热5分钟，迅速放至冰上5分钟；

c)按下表4配制反应体系：

表4

d)37℃孵育1小时；

e)纯化加帽后的mRNA。

通过1％的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定mRNA的完整性和大小，电泳图如图1所示：图1A中的泳道1-6为表2中所示目的mRNA序列M、N、M+N(T2A)、N+M(T2A)、M+N(P2A)、N+M(P2A)(即SEQ ID NO:41、42、46-49)的mRNA，其对应目的DNA序列见SEQ ID NO:24、25、29-32；图1B中的泳道7-15为表2中所示目的mRNA序列S2、N+M+S(T2A)、N+S+M(T2A)、N+M+S2(T2A)、N+S2+M(T2A)、N+M+S(P2A)、N+S+M(P2A)、N+M+S2(P2A)、N+S2+M(P2A)(即SEQ ID NO:45、50-57)的mRNA，其对应目的DNA序列见SEQ ID NO:28、33-40。由检测结果可见，体外合成的mRNA分子量正确，基本无降解。

实施例2细胞水平可表达性

为了检测表2中的部分mRNA组合，包括M、N、M+N(T2A)、N+M(T2A)、M+N(P2A)、N+M(P2A)，在细胞内的表达水平，使用猫肾细胞(CRFK)进行实验。按照表2中的序列组合，在M蛋白的C端融合HA标签，N蛋白的C端融合EGFP标签。将CRFK细胞接种于24孔板中，培养18小时；在转染前1小时将培养基更换为无血清的Opti-MEM培养基，利用lipofectamine2000分别转染M、N、M+N(T2A)、N+M(T2A)、M+N(P2A)、N+M(P2A)组合的mRNA，培养6小时后更换为新鲜的培养基，继续培养42小时；除去细胞上清液，将细胞消化并重悬于含1％FBS的PBS溶液中，加入带APC荧光蛋白标记的抗HA抗体，细胞于4℃孵育1小时，用冷的含1％FBS的PBS清洗两遍，重悬浮于200mL含1％FBS的PBS中。之后，用流式细胞仪(Beckman Coulter，CytoFLEX)进行FACS分析。

结果如图2所示：图2A为M蛋白的表达水平；图2B为N蛋白的表达水平。P2A肽连接组的表达水平均显著高于T2A肽连接组；且在P2A肽连接组合中，N+M串联组合的两个蛋白表达水平显著高于M+N串联组合，与单独M和N蛋白的表达水平相当。

由以上结果可知，N蛋白在2A肽的上游更有利于连接肽上下游蛋白的表达。因此我们设计了表2中所示目的RNA序列为S2、N+M+S(T2A)、N+S+M(T2A)、N+M+S2(T2A)、N+S2+M(T2A)、N+M+S(P2A)、N+S+M(P2A)、N+M+S2(P2A)、N+S2+M(P2A)(即SEQ ID NO:45、50-57)的组合，其中S2蛋白的C端融合MYC标签。利用上述流式细胞术实验方法进行了表达水平的检测，S2蛋白利用带PE-Cyanine7荧光蛋白标记的抗MYC进行检测，检测结果如图3所示。

与图2结果相似，P2A肽连接组的表达水平均显著高于T2A肽连接组；且在P2A肽连接组合中，不同串联组合之间M、N和S蛋白的表达水平均无显著差异，均与单独蛋白表达水平相当。

实施例3 mRNA疫苗的制备过程

根据mRNA组合在细胞水平的表达量水平，我们选择P2A肽连接的N+M、N+M+S、N+S+M、N+M+S2和N+S2+M组进行了脂质纳米颗粒的制备，同时制备了单独的M、N和S2 mRNA脂质纳米颗粒，制备过程如下：

1)负载mRNA：分别将FCoV-M-mRNA、FCoV-N-mRNA、FCoV-S2-mRNA、FCoV-N+M-mRNA、FCoV-N+M+S-mRNA、FCoV-N+S+M-mRNA、FCoV-N+M+S2-mRNA和FCoV-N+S2+M-mRNA按1:1的比例与柠檬酸缓冲液混合，在一定温度和时间下，使其充分交联形成合适的复合物。

2)制备脂质体：将磷脂质MC3、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和脂质-聚乙二醇(DMG-PEG2000)(艾伟拓医药科技有限公司)按摩尔比50:10:38.5:1.5的比例与乙醇混合，并且使用超声波等方法使原料溶解均匀。

3)混合脂质体和mRNA：将步骤1中的缓冲液和步骤2中的脂质体溶液混合，通过超声波或玻璃珠等剪切作用使两种物质充分混合。

4)纯化：将混合后的试剂进行纯化去除多余的脂质体、垃圾RNA、未负载的mRNA或杂质。

5)测定颗粒粒径及浓度：利用动态光散射仪测定脂质体颗粒的粒径及浓度。

需要注意的是，在制备过程中应该避免RNA水解酶及其它降解酶的污染，以保证mRNA的完整性和稳定性。

检测结果显示，包装后脂质纳米颗粒的直径大小均在70-100nM之间，且均一性良好。

实施例4猫传染性腹膜炎mRNA疫苗在小鼠体内抗体效价评价

取6-8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为8组(每组5只)：FCoV-M-mRNA+FCoV-N-mRNA、FCoV-M-mRNA+FCoV-N-mRNA+FCoV-S2-mRNA、FCoV-N+M-mRNA、FCoV-N+M+S-mRNA、FCoV-N+S+M-mRNA、FCoV-N+M+S2-mRNA、FCoV-N+S2+M-mRNA疫苗组和PBS空白对照组。通过肌肉注射免疫，在第1天进行初次免疫，第28天进行加强免疫，每组剂量均为10μg。在二免14天后分别进行尾部采血，收集血清，用ELISA法检测结合抗体和中和抗体水平。

结果如图4所示：与对照组相比，各疫苗组均能达到很高的结合抗体水平；且串联组合疫苗与不同疫苗混合免疫的结合抗体水平相当。(图中：N/M的含义是FCoV-N-mRNA疫苗和FCoV-N-mRNA疫苗两种疫苗1:1混合；N/M/S2的含义是FCoV-N-mRNA疫苗：FCoV-M-mRNA疫苗：FCoV-S2-mRNA疫苗3种疫苗1:1:1混合；加号的含义为两种或三种蛋白通过串联形式共表达，包装成一个疫苗。)

中和抗体效价表如下表5所示：与对照组相比，各疫苗组的中和抗体效价均显著升高；在串联组合疫苗中，中和抗体效价最高的前三个疫苗分别是FCoV-M+N+S2-mRNA疫苗组、FCoV-N+M-mRNA疫苗组和FCoV-N+M+S-mRNA疫苗组，其中FCoV-M+N+S2-mRNA疫苗组的中和抗体效价与FCoV-M-mRNA疫苗+FCoV-N-mRNA疫苗+FCoV-S2-mRNA疫苗混合组相当，FCoV-N+M-mRNA疫苗组与FCoV-M-mRNA疫苗+FCoV-N-mRNA疫苗混合组相当。

表5

抗体滴度测定实验结果如图5所示：FCoV-N+M-mRNA、FCoV-N+M+S-mRNA和FCoV-N+M+S2-mRNA疫苗组的抗体滴度均高于2⁶，且FCoV-M+N+S2-mRNA疫苗组的抗体滴度与FCoV-M-mRNA疫苗+FCoV-N-mRNA疫苗+FCoV-S2-mRNA疫苗混合组相当，FCoV-N+M-mRNA疫苗组与FCoV-M-mRNA疫苗+FCoV-N-mRNA疫苗混合组相当。

由以上结果可知，本发明制备的FCoV-N+M-mRNA、FCoV-N+M+S-mRNA和FCoV-N+M+S2-mRNA疫苗可以起到很好的保护作用，且与不同蛋白单独表达的疫苗混合免疫的保护效果相当。

实施例5猫传染性腹膜炎mRNA疫苗在靶动物体内的有效性评价

为了检测猫传染性腹膜炎mRNA疫苗在动物体内的有效性，利用猫传染性腹膜炎靶动物模型，检测了FCoV-N+M-mRNA、FCoV-N+M+S-mRNA和FCoV-N+M+S2-mRNA疫苗对猫传染性腹膜炎病毒病的保护效果。

具体实验流程及结果如下所述：

1)第一阶段-免疫前

选取身体结实、无外伤且精神状态好的一岁左右品种猫进行实验室检查，最终筛选出12只符合实验标准的受试动物。

筛选结果如图6所示：图6A为FCoV检测，结果均为阴性；图6B为体温检测，均在正常范围内(37.8℃～39.5℃)；图6C为体重测量，均在正常范围内；图6D为N和S蛋白结合抗体检测，均未检测到抗体；图6E为中和抗体检测，均未检测到中和抗体；图F为分组信息。

2)第二阶段-免疫及免疫后的反应观察

免疫前观察7天，在第8天进行第一次皮下免疫，第29天进行第二次皮下免疫，各疫苗组剂量均为15μg/只。每次免疫之后需每日记录动物体温、体重、进食量、皮下肿痛和其他异常指标。

记录结果如图7所示：7A为免疫后的反应观察，图7B和C分别为免疫后的体温和体重，其中FCoV-N+M+S-mRNA组在一免和二免后均出现了一次性的发热症状，其余组均正常。

3)第三阶段-免疫后相关检测

采集免疫前、一免后第14天、二免后第14天和第28天的血清进行N和S蛋白的结合抗体及中和抗体的检测。同时采集一免后第14天、二免后第14天和第28天的全血进行PBMC的分离，进行淋巴细胞增殖实验。

实验结果如图8所示：图8A和8B为结合抗体检测，各组均检测到结合抗体，且抗体水平无显著差异；图8C为中和抗体检测，中和抗体水平由高到低的组分别为N+M+S2组、N+M组和N+M+S组；图8D为淋巴细胞增殖实验，促进淋巴细胞增殖水平由高到低的组分别为N+M+S2组、N+M组和N+M+S组，与中和抗体检测结果一致。

4)第四阶段-攻毒

在第二次免疫之后观察28天，第29天开始攻毒。利用猫传染性腹膜炎病毒毒株rQS-79(10⁵TCID50，半数组织培养感染剂量)经口给与受试动物，之后进行28天的观察期，记录受试动物每日的体温、体重、饮水、食物消耗量和其他异常，并根据病情需要给与支持治疗。若发生实验动物在受试期间死亡，应及时进行尸体剖检并检测主要脏器内的猫传染性腹膜炎病毒的病毒滴度。

攻毒后的体温及体重检测如图9A和B所示：N+M+S2组全部正常；N+M组的11号猫在攻毒后持续发烧多天，其余两只正常；N+M+S组的3号和12号猫在攻毒后持续发烧多天，其中3号猫在攻毒18天后死亡；PBS组的3只猫在攻毒后均出现发烧症状，其中1号和6号猫在攻毒20天后死亡。

攻毒28天之后，第29天统计存活率，并对所有存活受试动物进行安乐死和剖检，检测主要脏器内的猫传染性腹膜炎病毒的病毒滴度。存活率统计结果如图10A所示：N+M+S2组和N+M组的存活率均为100％；N+M+S组的存活率次之；PBS组的存活率最低。各组动物体内主要器官的猫传染性腹膜炎病毒的病毒滴度检测结果如图10B所示：检测器官包括心脏(Heart)、肝脏(Liver)、脾脏(Spleen)、肺(Lung)、肾脏(Kidney)、肠系膜淋巴结(MLN)和腹水(Ascities)。其中N+M+S组的病毒滴度与对照组相当，N+M组的病毒滴度次之，N+M+S2组的病毒滴度最低。

综合以上结果可知：筛选到的N+M+S2串联表达的mRNA疫苗对猫传染性腹膜炎具有很好的保护效果，且猫接受免疫后没有明显的不良反应，安全有效；N+M串联表达的mRNA疫苗的保护效果次之，免疫后部分猫出现一过性的发烧症状；N+M+S串联表达的mRNA疫苗的保护效果最差。这对于临床预防猫传染性腹膜炎具有重要的意义。

实施例6猫传染性腹膜炎mRNA疫苗对已感染猫传染性腹膜炎病毒靶动物的治疗性评价

为了进一步评估猫传染性腹膜炎mRNA疫苗对已感染猫传染性腹膜炎病毒动物的治疗效果，我们选取身体结实、无外伤且精神状态好的一岁左右品种猫共12只，先将猫传染性腹膜炎病毒毒株rQS-79(10⁵TCID50)经口给与受试动物，6h后将受试动物分为4组，每组3只，分别接种3次(0d/7d/21d)以P2A为连接肽的FCoV-N+M-mRNA、FCoV-N+M+S-mRNA、FCoV-N+M+S2-mRNA疫苗和PBS，剂量均为20μg/只，进行临床观察，记录存活猫的数量并统计存活率。结果显示：N+M+S2组和N+M组的存活率均为100％。

进一步验证猫传染性腹膜炎mRNA疫苗的安全性，以获得靶动物猫的可耐受最大剂量，初步结果显示，疫苗安全性良好。

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Claims (26)

1.一种DNA元件，包含FCoV病毒株的M蛋白、N蛋白、S蛋白三个元件中至少一个元件的核苷酸连接得到。

2.根据权利要求1所述的DNA元件，所述DNA元件可以通过连接肽进行连接；优选的，当连接肽为大于一个时，多个连接肽可以相同也可以不同，但优选相同；优选的，所述连接肽可以为2A连接子或IRES序列；优选2A连接子(P2A/T2A/E2A/F2A)。

3.根据权利要求1所述的DNA元件，所述DNA元件的元件数量优选为2-3个。

4.根据权利要求1所述的DNA元件，所述重组DNA分子的结构可以是，M蛋白、N蛋白、S蛋白、M+N、N+M、M+S、S+M、N+S、S+N、N+M+S、N+S+M、S+N+M、M+N+S、M+S+N、S+M+N的核苷酸序列进行组合中任意一个；优选为M+N、N+M、N+M+S、N+S+M、S+N+M、M+N+S、M+S+N、S+M+N；更优选为N+M、N+M+S、N+S+M。

5.根据权利要求1-4之一所述的DNA元件，其中所述S蛋白可以为S全长、S1蛋白、S2蛋白中任意一个。

6.根据权利要求4所述的DNA元件，所述元件的DNA序列为SEQ ID NO：7-23所示，氨基酸序列为SEQ ID NO：60-76所示；所述连接肽的DNA序列为SEQ ID NO：4-5所示，氨基酸序列为SEQ ID NO：58-59所示；以及能够实现相同功能同一性66％或75％或85％或95％以上的序列。

7.一种重组核酸分子，其结构为包含5’端非翻译区、Kozak序列区、至少一个抗原编码区、3’端非翻译区和polyA的多个元件连接组成，所述抗原编码区为权利要求1-6所述的DNA元件；所述核酸分子可以为DNA分子或RNA分子。

8.根据权利要求7所述的重组核酸分子，所述5’端非翻译区序列来源于DNAH2、猫血红蛋白或猫白蛋白基因；所述3’端非翻译区序列来源于猫血红蛋白或猫白蛋白基因；所述polyA元件为1-200个A连接而成的序列。

9.根据权利要求7-8之一所述的重组核酸分子，其中在5’端非翻译区的5’端可以进一步包括启动子；5’端非翻译区的3’端可以进一步包含信号肽编码区。

10.根据权利要求9所述的重组核酸分子，所述5’端非翻译区序列为SEQ ID NO:1所示；所述Kozak序列为SEQ ID NO:2所示；所述3’端非翻译区为SEQ ID NO:3所示；所述polyA序列为SEQ ID NO:6所示；所述的重组核酸分子，DNA序列为SEQ ID NO:24-40；以及能够实现相同功能同一性66％或75％或85％或95％以上的序列。

11.一种重组载体，包含权利要求1-6所述的DNA元件或权利要求7-10所述的重组核酸分子。

12.一种mRNA，由权利要求7-10所述的重组核酸分子转录得到；优选的，可以是SEQ IDNO：41-57所示。

13.一种蛋白，由权利要求1-6所述的DNA元件或权利要求7-10所述的重组核酸分子翻译得到。

14.表达权利要求13所述蛋白的核苷酸序列。

15.一种重组细胞，由权利要求1-6所述的DNA元件或权利要求7-10所述的重组核酸分子或权利要求11所述的重组载体或权利要求12所述的mRNA导入细胞所得。

16.一种药物组合物，包含由权利要求1-6所述的DNA元件或权利要求7-10所述的重组核酸分子或权利要求11所述的重组载体或权利要求12所述的mRNA；所述药物组合物可以为治疗性组合物或疫苗组合物。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其形式可以为单组分或多组分的混合物，多组分可以为不同比例进行混合；混合物所采用的组分可相同也可以不同。

18.根据权利要求16所述的药物组合物，还进一步包含药学上接受的赋形剂、辅料、媒介物、脂质。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，所述脂质包含阳离子脂质、PEG化脂质、胆固醇和/或磷脂。

20.一种mRNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)DNA模板合成；(2)mRNA转录；(3)mRNA加帽；(4)mRNA纯化，所述DNA模板为权利要求1-6所述的DNA元件或权利要求7-10所述的重组DNA分子。

21.权利要求1-6所述的DNA元件、权利要求7-10所述的重组DNA分子、权利要求11所述的重组载体、权利要求12所述的mRNA、权利要求13-14所述的蛋白、权利要求15所述的重组细胞、权利要求16-19所述的药物组合物在治疗和/或预防动物冠状病毒感染疾病中的用途，或制备用于治疗和/或预防动物冠状病毒感染所引起疾病的药物中的用途。

22.根据权利要求21所述的用途，所述动物冠状病毒感染疾病为肠道冠状病毒感染所致疾病或传染性腹膜炎病毒感染所致疾病。

23.一种治疗治疗和/或预防动物冠状病毒感染疾病的方法，所述方法为对施用对象施加权利要求1-6所述的DNA元件、权利要求7-10所述的重组DNA分子、权利要求11所述的重组载体、权利要求12所述的mRNA、权利要求13-14所述的蛋白、权利要求15所述的重组细胞、权利要求16-19所述的药物组合物。

24.权利要求21-23所述的用途和方法，所述动物为哺乳动物，包括但不限于人、猫、狗、鼠、马、牛、羊、猪、猴等。

25.权利要求24所述的用途，所述用途进一步为用于治疗和/或预防猫冠状病毒(FcoV)所引起的猫传染性腹膜炎(FIP)。

26.根据权利要求25所述的方法，所述施用方法单次或多次，所述施用间隔为18-26天；当施用方法为多次时，两次施用的药物可相同或不同。