CN117069875A - 一种高酶解液相含量硫酸软骨素a寡糖铁的制备方法 - Google Patents
一种高酶解液相含量硫酸软骨素a寡糖铁的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖亚铁的制备方法，属于生物工程技术领域。本发明包括如下步骤：将动物软骨用水浸泡软化，利用微波将软化的软骨进行粉碎处理，粉碎的软骨硫酸软骨素裂解酶酶解，碟片离心机进行固液分离；滤过液用树脂柱进行硫酸软骨素吸附，再用铁盐水溶液对树脂柱进行洗脱，洗脱液经脱盐、浓缩、灭菌、干燥后得硫酸软骨素A寡糖亚铁成品，有效的保证了硫酸软骨素的天然结构、生物活性及物理化学性质。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁的制备方法。
背景技术
硫酸软骨素是从天然的动物软骨中获得的多糖化合物，是重要的生物化工原料，具有降血脂、抗血栓、抗肿瘤、治疗关节炎、动脉硬化、心脑血管疾病、听觉障碍、肾炎、肝炎以及神经痛等作用。但天然硫酸软骨素分子量较大，不容易透过细胞膜，存在生物利用率低的问题。而低分子量硫酸软骨素或硫酸软骨素寡糖药理活性强，对防治风湿性炎症以及伤口愈合等具有更好的疗效。
目前工业生产低分子硫酸软骨素和硫酸软骨素寡糖的方法有物理法、化学法、酶解法三种。虽然物理法工艺简单，但存在产品易变色、产品稳定性差、分子量较大等缺点。化学法包括氧化降解(次氯酸钠和双氧水)、酸水解和碱水解，化学降解反应条件复杂，存在产品活性差、生产污水多等缺点。而酶法降解由于其具有反应条件温和、产品生物活性好等特点，成为近年来低分子硫酸软骨素和硫酸软骨素寡糖研究的热点。
发明内容
发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁的制备方法，摒弃了传统蛋白酶酶解工艺，通过引入硫酸软骨素裂解酶实现了硫酸软骨素A寡糖铁一步法高效生产，简化了生产工艺，大大降低了生产成本。
技术方案：为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)软骨预处理：将动物软骨在蒸馏水中浸泡3～4h，水与软骨的配比为2：1～5：1，软化后再将动物软骨进行微波粉碎处理，软骨颗粒达到微米级；
(2)酶解：用6mol/L的氨水或6mol/L的盐酸调节步骤(1)得到的软骨粉粹液的pH为6.5～8.0；向其中加入硫酸软骨素裂解酶，使硫酸软骨素裂解酶的总酶活与软骨质量的比例为2×104～4×105U：1kg，酶解4～12h，优选8h；最后灭酶，得到混合体系A。
酶解完全的判定方法如下：硫酸软骨素A寡糖浓度不再增加，则证明酶解完全。
(3)固液分离：将步骤(2)中得到的混合体系A利用碟片离心机进行固液分离，其中轻液是骨油，重液是硫酸软骨素寡糖液，固体是骨渣、骨蛋白和失活的硫酸软骨素裂解酶，碟片离心机转速为2000～8000rpm，优选6000rpm；
(4)硫酸软骨素A寡糖制备
(4a)树脂吸附：将步骤(3)得到的硫酸软骨素寡糖液加入硫酸软骨素专用吸附树脂柱内，经吸附处理后，得到吸附了硫酸软骨素寡糖的树脂柱；
吸附完成的确定方法：检测被吸附液中无硫酸软骨素寡糖，即吸附完成。
(4b)硫酸软骨素寡糖洗脱：
用50～100g/L的铁盐水溶液以2～5BV/h的流速对吸附了硫酸软骨素寡糖的树脂柱进行洗脱处理，得到洗脱液，洗脱液中含有硫酸软骨素寡糖；
(4c)脱盐：将步骤(4b)中得到的洗脱液进行纳滤脱盐，得到纳滤截留液，使用的纳滤膜孔径为160～500Da，优选360Da；
(4d)除菌：将步骤(4c)中得到的纳滤截留液进行过滤除菌，除菌滤液，使用的纳膜孔径为0.1～0.45μm，优选0.1μm；将除菌滤液打入醇沉罐中；
(4e)沉淀：将步骤(4d)中得到的除菌滤液进行乙醇沉淀，沉淀即为硫酸软骨素A寡糖，使用乙醇与除菌滤液体积比为0.5：1～1.5：1，优选0.8：1；
(4f)脱水：将步骤(4e)中得到的硫酸软骨素A寡糖，用无水乙醇浸泡脱水，浸泡10h；硫酸软骨素A寡糖与无水乙醇的质量比为1：3～1：8，优选1：5；
(4g)干燥与粉碎：将步骤(4f)中得到的脱水硫酸软骨素A寡糖进行真空干燥，再对干燥后的硫酸软骨素A寡糖进行粉碎；
有益效果:
1.本发明通过引入硫酸软骨素裂解酶，从动物软骨中一步法制备了硫酸软骨素寡糖A铁，减少了生产工序和能耗，降低了生产周期与生产成本；
2.本发明用生物降解法替代了物理降解法和化学降解法制备硫酸软骨素寡糖A铁的工艺，有效的保证了硫酸软骨素的天然结构、生物活性及物理化学性质。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明所用到的酶
硫酸软骨素裂解酶A、B、C能够分别催化硫酸软骨素A(4-硫酸软骨素)、硫酸软骨素B(硫酸皮肤素)、硫酸软骨素C(6-硫酸软骨素)形成的糖胺聚糖的裂解；硫酸软骨素裂解酶AC催化硫酸软骨素A或硫酸软骨素C形成的糖胺聚糖的裂解；硫酸软骨素裂解酶ABC催化硫酸软骨素A、硫酸软骨素B或硫酸软骨素C形成的糖胺聚糖的裂解。
硫酸软骨素裂解酶A、硫酸软骨素裂解酶B、硫酸软骨素裂解酶C、硫酸软骨素裂解酶AC、硫酸软骨素裂解酶ABC均购买自上海源叶生物科技有限公司。
实施例1：高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁的制备方法中裂解酶的种类及其配比优化
本实施例说明不同裂解酶的配比对硫酸软骨素裂解效果的影响，往软骨粉粹液中以总酶活：软骨质量＝2×104～4×105U：1kg的比例分别加入硫酸软骨素裂解酶A、硫酸软骨素裂解酶B、硫酸软骨素裂解酶C、硫酸软骨素裂解酶AC、硫酸软骨素裂解酶ABC，初始pH值为6.5～8.0，酶解6h，分别取不同条件下反应的酶解液，利用高效液相色谱法测得硫酸软骨素A的得率并进行对比。当裂解酶为硫酸软骨素裂解酶A、硫酸软骨素裂解酶ABC时，测得的硫酸软骨素A的得率较高为32.64％、33.21％，因此，选用硫酸软骨素裂解酶A与硫酸软骨素裂解酶ABC的复合酶继续进行配比优化。重复上述步骤，分别加入配比为裂解酶A：裂解酶ABC＝1：2、裂解酶A：裂解酶ABC＝2：1、裂解酶A：裂解酶ABC＝2：3、裂解酶A：裂解酶ABC＝3：2的复合酶，初始pH值为6.5～8.0，酶解6h，分别取不同条件下反应的酶解液，利用高效液相色谱法测得硫酸软骨素A的得率并进行对比。当复合酶的配比为裂解酶A：裂解酶ABC＝2：3时硫酸软骨素A的得率最高为38.74％，因此，选用配比为裂解酶A：裂解酶ABC＝2：3的复合酶为最佳裂解酶。
表1不同配比的硫酸软骨素裂解酶的裂解效果
实施例2：高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁的制备方法中裂解酶的酶解时间优化
本实施例说明不同酶解时间对硫酸软骨素裂解效果的影响，按总酶活：软骨质量＝2×104～4×105U：1kg的比例加入配比为裂解酶A：裂解酶ABC＝2：3的复合酶，初始pH值为6.5～8.0，酶解4、6、8、10、12h，所得酶解液中硫酸软骨素A得率如表2所示，当酶解时间为8h时，硫酸软骨素A的得率达到最高为40.57％，。因此选用8h为最佳酶解时间。
表2不同酶解时间对硫酸软骨素复合裂解酶的裂解效果
实施例3：高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁的制备方法中所用树脂种类及其配比优化
本实施例说明不同树脂种类及其配比对硫酸软骨素A寡糖吸附效果的影响，分别使用A830、D101、AB-8、DM301、HPD100树脂中的一种或几种的混合物，用量为软骨投料量的1～2.5倍，利用高效液相色谱法测得流出液中残余硫酸软骨素A寡糖含量，计算吸附率并进行对比。
当树脂为AB-8时，吸附率最高，为65.28％；当树脂为HPD100时，吸附率为63.97％，其余三种树脂的吸附率均低于60％。因此，选用AB-8和HPD100继续进行配比优化。重复上述步骤，选用混合树脂中AB-8：HPD100＝1：1、AB-8：HPD100＝1：2、AB-8：HPD100＝2：1、AB-8：HPD100＝2：3、AB-8：HPD100＝3：2，用量为软骨投料量的1～2.5倍，利用高效液相色谱法测得流出液中残余硫酸软骨素A寡糖含量，计算吸附率并进行对比。当混合树脂配比为AB-8：HPD100＝2：1时，对硫酸软骨素A寡糖的吸附率最高，达到70.32％。因此，选用配比为AB-8：HPD100＝2：1的混合树脂为最佳树脂。
表3不同树脂种类及配比的吸附效果
实施例4：高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁的制备方法中铁盐种类及其配比优化
本实施例说明不同铁盐种类及其配比对硫酸软骨素A寡糖洗脱效果的影响，按120g/L分别使用氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、硫酸亚铁和氯化亚铁中的一种或几种的混合物以3BV/h的流速对吸附了硫酸软骨素寡糖的AB-8树脂柱进行洗脱处理，得到含有硫酸软骨素A寡糖的洗脱液，利用高效液相色谱法测得洗脱液中硫酸软骨素A寡糖含量，计算洗脱率并进行对比。当铁盐为氯化铁时，洗脱率最高，为96.71％；当铁盐为硫酸铁时，洗脱率为93.87％，其余三种铁盐水溶液的洗脱率均低于90％。因此，选用氯化铁和硫酸铁继续进行配比优化。当混合物中氯化铁：硫酸铁＝1：1时，其洗脱率为95.45％；当氯化铁：硫酸铁＝1：2时，洗脱率为92.99％，均低于单一使用氯化铁水溶液洗脱时的洗脱率。因此，选用氯化铁水溶液作为最佳铁盐洗脱水溶液。
表4不同铁盐种类及配比的洗脱效果
实施例5：高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁的制备方法中无水乙醇与除菌滤液体积比优化
本实施例说明无水乙醇与除菌滤液不同体积比对硫酸软骨素A寡糖铁沉淀效果的影响，分别以体积比为无水乙醇：除菌滤液＝0.5：1、无水乙醇：除菌滤液＝0.8：1、无水乙醇：除菌滤液＝1：1、无水乙醇：除菌滤液＝1.5：1，沉淀时间为30min，取不同无水乙醇与除菌滤液体积比得到的上清液，利用高效液相色谱法测定计算硫酸软骨素A寡糖的残留率并进行对比。当无水乙醇与除菌滤液体积比为0.5：1时，硫酸软骨素A寡糖的残留率为3.87％，当无水乙醇与除菌滤液体积比为0.8：1时，硫酸软骨素A寡糖的残留率为2.13％，当无水乙醇与除菌滤液体积比为1：1时，硫酸软骨素A寡糖的残留率为2.41％,当无水乙醇与除菌滤液体积比为1.5：1时，硫酸软骨素A寡糖的残留率为2.89％。因此，当无水乙醇与除菌滤液体积比为0.8：1时，选用其作为最佳无水乙醇沉淀体积比。
表5不同无水乙醇与除菌滤液体积比的沉淀效果
实施例6：以2000kg牛鼻骨为原料生产硫酸软骨素A寡糖铁
本实施例说明2000kg牛鼻骨可生产制得的硫酸软骨素A寡糖铁收率，将2000kg牛鼻骨浸泡在水中使其软化，软化后的牛鼻骨用超声粉碎机进行粉碎，加入6000kg蒸馏水，升温至35℃，用氨水或盐酸调整pH至7.5，然后加入5×108U配比为硫酸软骨素裂解酶A：硫酸软骨素裂解酶ABC＝2：3的复合酶，酶解8h；升温至65℃，保温0.5h灭酶。灭酶结束后利用碟片离心机将酶解液进行固液分离，收集重液(硫酸软骨素寡糖液)；用盐酸调节重液pH为6.0后，加入到硫酸软骨素专用吸附树脂柱内进行硫酸软骨素吸附，期间利用高效液相色谱法检测硫酸软骨素是否吸附完全；吸附完成后用蒸馏水冲洗吸附了硫酸软骨素的树脂柱；然后用120g/L的FeCl3水溶液以3BV/h的流速对树脂柱进行洗脱，得到的洗脱液中含有硫酸软骨素寡糖；将洗脱液用160Da的纳滤仪进行脱盐，脱盐后的硫酸软骨素寡糖液体利用0.1μm孔径的过滤装置进行除菌，再用三效浓缩仪进行浓缩，接着加入配比为无水乙醇：除菌滤液＝0.8：1的溶液对除菌滤液进行有机溶剂沉淀，将沉淀用无水乙醇进行脱水处理，脱水后的沉淀利用真空干燥剂进行干燥即得硫酸软骨素A寡糖铁356kg，收率为17.8％。
表6硫酸软骨素A寡糖铁检测参数
Claims (10)
1.一种高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)软骨预处理：将动物软骨在蒸馏水中浸泡3～4h，水与软骨的配比为2：1～5：1，软化后再将动物软骨进行微波粉碎处理，软骨颗粒达到微米级；
(2)酶解：用6mol/L的氨水或6mol/L的盐酸调节步骤(1)得到的软骨粉粹液的pH为6.5～8.0；向其中加入硫酸软骨素裂解酶，使硫酸软骨素裂解酶的总酶活与软骨质量的比例为2×104～4×105U：1kg，酶解4～12h，，最后灭酶，得到酶解液；
(3)固液分离：将步骤(2)中得到的酶解液利用碟片离心机进行固液分离，其中轻液是骨油，重液是硫酸软骨素寡糖液，固体是骨渣、骨蛋白和失活的硫酸软骨素裂解酶，碟片离心机转速为2000～8000rpm；
(4)硫酸软骨素A寡糖制备
(4a)树脂吸附：将步骤(3)得到的硫酸软骨素寡糖液加入硫酸软骨素专用吸附树脂柱内，经吸附处理后，得到吸附了硫酸软骨素寡糖的树脂柱；
(4b)硫酸软骨素寡糖洗脱：
用50～100g/L的铁盐水溶液以2～5BV/h的流速对吸附了硫酸软骨素寡糖的树脂柱进行洗脱处理，得到洗脱液，洗脱液中含有硫酸软骨素寡糖；
(4c)脱盐：将步骤(4b)中得到的洗脱液进行纳滤脱盐，得到纳滤截留液，使用的纳滤膜孔径为160～500Da；
(4d)除菌：将步骤(4c)中得到的纳滤截留液进行过滤除菌，除菌滤液，使用的纳膜孔径为0.1～0.45μm，将除菌滤液打入醇沉罐中；
(4e)沉淀：将步骤(4d)中得到的除菌滤液进行有机溶剂沉淀，沉淀即为硫酸软骨素A寡糖；
(4f)脱水：将步骤(4e)中得到的硫酸软骨素A寡糖，用无水乙醇浸泡脱水，浸泡10h；硫酸软骨素A寡糖与无水乙醇的质量比为1：3～1：8；
(4g)干燥与粉碎：将步骤(4f)中得到的脱水硫酸软骨素A寡糖进行真空干燥，再对干燥后的硫酸软骨素A寡糖进行粉碎。
2.根据权利要求1所述的高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁，其特征在于，步骤(2)中，所述的硫酸软骨素裂解酶为硫酸软骨素裂解酶A、硫酸软骨素裂解酶B、硫酸软骨素裂解酶C、硫酸软骨素裂解酶AC、硫酸软骨素裂解酶ABC中的一种或几种的混合物。
3.根据权利要求1所述的高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁，其特征在于，上述硫酸软骨素裂解酶添加的总酶活与软骨质量的比例为2×104～4×105U：1kg。
4.根据权利要求1所述的高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁的制备方法，其特征在于，步骤(4a)中，所述的树脂为A830、D101、AB-8、DM301、HPD100中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求4所述的高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁的制备方法，其特征在于，所述树脂投料质量为软骨投料质量的1～2.5倍。
6.根据权利要求1所述的高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁，其特征在于，步骤(4b)中，所述的铁盐水溶液为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、硫酸亚铁或氯化亚铁的水溶液。
7.根据权利要求1所述的高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁，其特征在于，步骤(4b)中，所述铁盐水溶液的浓度为50～100g/L，使用量为2～4倍柱体积。
8.根据权利要求1所述的高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁，其特征在于，步骤(4c)中，所述的纳滤膜孔径为100Da、360Da、500Da、1000Da中的一种。
9.根据权利要求1所述的高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁，其特征在于，步骤(4e)中，所述的有机溶剂为乙醇和丙酮的一种或两种的混合物。
10.根据权利要求1所述的高酶解液相含量硫酸软骨素A寡糖铁，其特征在于，步骤(4e)中，所述有机溶剂与除菌滤液体积比为0.5：1～1.5：1。
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