CN117069865A

CN117069865A - 一种基于T细胞抗原表位猫过敏原蛋白嵌合肽cFel d 1的原核表达及其卵黄抗体的制备

Info

Publication number: CN117069865A
Application number: CN202311319699.3A
Authority: CN
Inventors: 王秀敏; 李春晓; 王金全; 安尉; 王佳雪; 王振龙; 陶慧; 韩冰; 刘杰
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhongke Vitality Tai (Guangdong) Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2023-10-12
Filing date: 2023-10-12
Publication date: 2023-11-17
Anticipated expiration: 2043-10-12
Also published as: CN117069865B

Abstract

本发明公开了一种基于T细胞抗原表位猫过敏原蛋白嵌合肽cFel d 1的原核表达及其卵黄抗体的制备。本发明提供了一种嵌合肽cFel d 1，其包括猫过敏原Fel d 1抗原氨基酸残基的第25‑41位氨基酸残基所示区段、第46‑59位氨基酸残基所示区段、第85‑98位氨基酸残基所示区段、第132‑140位氨基酸残基所示区段和第145‑153位氨基酸残基所示区段。本发明的实验证明了，该嵌合肽cFel d 1免疫动物后所获得的抗体效价较高，可与猫过敏原完整Fel d 1蛋白特异性结合，并优于以完整Fel d 1蛋白制备的多克隆抗体（效价高8倍）。

Description

一种基于T细胞抗原表位猫过敏原蛋白嵌合肽cFel d 1的原核表达及其卵黄抗体的制备

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基于T细胞抗原表位猫过敏原蛋白嵌合肽cFel d 1的原核表达及其卵黄抗体的制备。

背景技术

过敏在日常生活中是很常见的问题之一，严格来说，过敏是机体产生的一种过激的免疫反应，机体将外来的一些物质视为异物从而引发机体免疫反应过度，继而导致人体发生一系列过敏反应。宠物毛发过敏原诱发的过敏症状严重程度差异很大，从与鼻炎和结膜炎相关的不适到严重的哮喘；哮喘可能发展成危及生命的疾病，猫犬毛发过敏原被认为是诱发人类哮喘和过敏性鼻炎的主要危险因素。猫毛发过敏原是室内环境中主要的过敏原来源，引起鼻塞、眼痒、咳嗽等不适症状，严重时可能导致哮喘和过敏性休克。在自然条件下接触猫的过敏原会导致更多的外周气道阻塞，它可以发展成危及生命的状况。有研究中表明，在世界范围内，人类对猫毛发过敏的患病率通常在5-20%左右。截至目前，Fel d 1- Feld 8八种猫的过敏原在WHO/IUIS中注册，其中Fel d 1是猫过敏原中最主要的致敏原，占人类对猫毛发过敏率约96%，空气中低至100 ng/m³的Fel d 1便足以引起过敏症状。

Fel d 1主要储存在猫的唾液和毛发中，当猫咪梳理自己毛发时，Fel d 1会转移到猫毛发上。另外，含有Fel d 1过敏原的猫皮屑作为小的空气传播颗粒传播到环境中。Feld 1是由两个异源二聚体形成分子大小为35 kDa四聚糖蛋白，二聚体之间以非共价键的方式链接，每个异源二聚体由一个70残基肽和一个85、90或92残基肽组成。这些链在每个异源二聚体中通过二硫键共价连接。Fel d 1的结构与兔子宫珠蛋白的结构具有相似性，其链Ⅰ与子宫珠蛋白共享氨基酸同源性，而链Ⅱ是具有N-端连接寡糖的糖蛋白。在Fel d 1内部有一个不对称空腔，可以结合内源性配体；在体内，Fel d 1的过敏原性由粘膜抗原呈递细胞（如树突状细胞）上的甘露糖受体识别决定。Fel d 1作为猫过敏原中最主要的致敏原，目前已成为开发新的过敏原特异性免疫疗法的理想蛋白分子。有研究表明，过敏原蛋白的线性表位或模拟表位的短肽可以靶向过敏原特异性T细胞，由此制备的表位疫苗或抗体比传统疫苗或抗体更安全、保护率更高。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于T细胞抗原表位猫过敏原蛋白嵌合肽cFel d 1的原核表达及其卵黄抗体的制备。

第一方面，本发明提供了一种嵌合肽cFel d 1，其包括猫过敏原Fel d 1抗原氨基酸残基的第25-41位氨基酸残基所示区段、第46-59位氨基酸残基所示区段、第85-98位氨基酸残基所示区段、第132-140位氨基酸残基所示区段和第145-153位氨基酸残基所示区段。

上文所述嵌合肽cFel d 1中，所述各个区段之间通过柔性氨基酸Linker连接。

上文所述嵌合肽cFel d 1为如下A1）-A4）中任一种：

A1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2）将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白质；

A3）序列中包含A1）或A2）所限定氨基酸序列的蛋白质；

A4）在A1）-A3）任一种所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

上述嵌合肽cFel d 1大小为9 kDa，该重组嵌合肽cFel d 1具有完整Fel d 1蛋白的抗原性，可以用于免疫抗体的制备。

第二方面，本发明提供了第一方面所述嵌合肽cFel d 1的编码核酸。

上文所述编码核酸为如下B1）-B4）中任一所述的DNA分子：

B1）编码区包括序列表中序列2所示的核苷酸序列的DNA分子；

B2）核苷酸序列为序列表中序列2的核苷酸序列的DNA分子；

B3）在严格条件下与B1）或B2）中所述的核苷酸序列杂交，且编码第一方面所述嵌合肽cFel d 1的DNA分子；

B4）与B1）或B2）的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码第一方面所述嵌合肽cFel d 1的DNA分子。

第三方面，本发明提供了含有第二方面所述编码核酸的重组载体或转基因细胞系或重组菌。

第四方面，本发明提供了第一方面所述嵌合肽cFel d 1在如下C1、C3或C4或C5中的应用：

或，本发明提供了第二方面所述编码核酸或第三方面所述的重组载体或转基因细胞系或重组菌在如下C2、C3或C4或C5中的应用：

C1）作为免疫原或制备免疫调节剂；

C2）制备免疫原或制备免疫调节剂；

C3）制备Fel d 1的抗体；该抗体具有中和过敏原Fel d 1的功能。

C4）制备抗过敏疫苗；嵌合肽cFel d 1通过免疫机体产生抗体中和过敏原Fel d1，实现抗过敏；

C5）制备中和或降低Fel d 1含量的产品；嵌合肽cFel d 1通过免疫机体产生抗体中和过敏原Fel d 1，实现降低Fel d 1含量。

上述机体为动物，具体为禽类或哺乳动物，进一步具体为蛋鸡或小鼠。

上述抗过敏疫苗为抗猫毛发或猫唾液过敏疫苗。

第五方面，本发明提供了一种抗过敏疫苗，包括第一方面所述嵌合肽cFel d 1。

第六方面，本发明提供了由第一方面所述嵌合肽cFel d 1作为抗原制备的抗体。

第七方面，本发明提供了第六方面所述抗体在如下任一种的应用：

D1）制备治疗过敏产品；该抗体作为治疗过敏药物的活性成分。

D2）制备降低Fel d 1含量的产品；该抗体作为降低Fel d 1含量的产品的活性成分。

或，本发明提供了一种治疗过敏的产品，包括上述的抗体。

上文中，所述抗体为多克隆抗体，其作用是中和过敏原Fel d 1。

进一步地，所述抗体为动物血清抗体或动物卵黄抗体。

更进一步地，所述抗体为小鼠血清抗体或蛋鸡卵黄抗体。

所述小鼠血清抗体按照如下方法制备：将所述嵌合肽cFel d 1用1×PBS（氯化钠8.0 g，磷酸氢二钠 1.44 g，磷酸二氢钾0.24 g，氯化钾 0.2 g，pH 7.4）稀释后与等体积佐剂混合乳化，以25 μg/只的剂量皮下注射的方式对小鼠进行免疫，共免疫三次，第一次和第二次免疫间隔期为21天，第二次和第三次免疫间隔期为10天，最后一次免疫后一周，收集小鼠血清，得到小鼠血清抗体；

所述卵黄抗体按照如下方法制备：将所述嵌合肽cFel d 1用1×PBS（同上）稀释后与等体积佐剂混合乳化，以300 mg/只的剂量肌肉注射的方式免疫蛋鸡，共免疫四次，每次免疫间隔期为两周，收集第3-16周的鸡蛋，聚乙二醇沉淀法提取，获得卵黄抗体。

本发明以25 μg/只嵌合肽cFel d 1免疫小鼠后获得的抗体效价为1:34500-1:301500；以嵌合肽cFel d 1免疫蛋鸡（300 mg/只），三周后获得的抗体效价为1:2²⁰，九周后获得的抗体效价最高，为1:2²²，十六周后获得的抗体效价为1:2¹⁷。嵌合肽cFel d 1特异性卵黄抗体以1.5%、2%的添加量饲喂猫四周后，其唾液中的Fel d 1含量分别下降73.1%和66.7%，优于市场类似产品（42.0%）。

本发明的实验证明，该嵌合肽cFel d 1免疫动物后所获得的抗体效价较高，可与猫过敏原完整Fel d 1蛋白特异性结合，并优于以完整Fel d 1蛋白制备的多克隆抗体（效价高8倍）。

附图说明

图1为猫过敏原蛋白Fel d 1的预测分析。A. 柔韧性预测；B. β-转角预测；C. 表面可接触性预测；D. 抗原性预测；E. 亲水性预测。

图2为猫过敏原蛋白嵌合肽cFel d 1的原核表达与纯化。A. 转化子的菌落PCR鉴定. M：DNA marker；1：阴性对照；2：阳性转化子菌落PCR；B. IPTG诱导BL21表达嵌合肽cFeld 1的SDS-PAGE电泳图. M：蛋白marker；1：IPTG诱导前的蛋白表达；2：IPTG诱导后的蛋白表达；C. 菌体超声前后的SDS-PAGE电泳图. M: 蛋白marker；1：超声后的菌体沉淀；2：超声后的上清液；D. 嵌合肽cFel d 1的纯化. M：蛋白marker；1：流穿液；2、3：50 mM咪唑洗脱液；4：100 mM咪唑洗脱液；5、6：500 mM咪唑洗脱液。

图3为重组嵌合肽cFel d 1免疫小鼠后的血清IgG效价测定。

图4为重组嵌合肽cFel d 1免疫蛋鸡后的卵黄抗体IgY效价测定。

图5为特异性卵黄抗体IgY饲喂猫四周后的唾液中过敏原含量的测定。

图6为特异性卵黄抗体IgY饲喂猫四周后的唾液中过敏原含量的变化。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中1×PBS配方如下：氯化钠8.0 g，磷酸氢二钠 1.44 g，磷酸二氢钾0.24 g，氯化钾 0.2 g，余量为水，pH 7.4。

实施例1、基于T细胞抗原表位重组的猫过敏原蛋白嵌合肽cFel d 1的获得

通过网络在线工具预测猫过敏原蛋白Fel d 1的T细胞抗原表位，根据表面可接触性、抗原性、亲水性、β-转角柔韧性等筛选合适的表位进行重组蛋白序列的确定，进一步构建重组质粒、诱导表达及优化表达条件后超声处理，并经过Ni²⁺柱纯化、透析冻干，完成基于T细胞抗原表位的猫过敏原蛋白嵌合肽cFel d 1的制备。

本发明实施例所使用的质粒载体、所使用的菌株均为市售商品，所使用的试剂均为市售商品；所用引物以及DNA序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

具体如下：

1、嵌合肽cFel d 1蛋白基因的获得

首先将编码猫过敏原蛋白Fel d 1的链Ⅰ和链Ⅱ的基因链接起来，获得全长的基因序列。然后利用ProPred程序进行Fel d1蛋白Th表位预测，使用CTLpred 软件对Fel d1蛋白的 CTL 抗原表位预测，猫过敏原蛋白Fel d 1的抗原表位、表面可接触性、抗原性、亲水性、β-转角柔韧性等预测如图1所示；使用南京德泰生物信息工具提供的抗原决定簇预测软件（http://www.detaibio.com/peptide-antigen-prediction）进行多种预测算法，对Fel d1蛋白序列进行抗原性、亲水性、β-转角、表面可接触性、柔韧性进行预测；综合分析预测结果后，选取天然猫过敏原Fel d 1抗原（Ⅰ链＋Ⅱ链）的第25-41位、46-59位、85-98位、132-140位和145-153位氨基酸序列，并在序列之间使用柔性Linker（GGGGS）连接，得到嵌合肽cFeld 1蛋白，大小约为9 kDa。

嵌合肽cFel d 1蛋白的氨基酸序列为如序列1所示，VAQYKALPVVLENARILGGGGSDAKMTEEDKENALSGGGGSFAVANGNELLLDLSGGGGSLVMTTISSSGGGGSGEAVQNTVE，下划线为柔性氨基酸Linker。

为了提高表达量，对嵌合肽cFel d 1蛋白的编码基因进行了大肠杆菌的密码子优化，并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因合成，嵌合肽cFel d 1蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列2所示，嵌合肽cFel d 1基因大小为243 bp：GTGGCACAATACAAAGCACTACCTGTAGTATTGGAAAATGCCAGAATACTGGGAGGAGGAGGATCGGATGCAAAAATGACAGAAGAGGATAAGGAGAATGCTCTCAGCGGAGGAGGAGGATCGGCGGTGGCCAATGGAAATGAATTACTGTTGGACTTGTCCGGAGGAGGA GGATCGCTAGTCATGACAACCATCAGCTCCAGCGGAGGAGGAGGATCGGAAGCAGTTCAGAACACCGTAGAA，下划线为柔性氨基酸Linker的编码基因。

2、嵌合肽cFel d 1蛋白的表达和纯化

1）重组载体的制备

将序列2所示的嵌合肽cFel d 1蛋白的编码基因替换pET-28a载体的XhoI和NcoI酶切位点之间的序列，得到的重组载体pET-28a-cFel d 1。

2）蛋白表达

将上述重组载体pET-28a-cFel d 1转化到大肠杆菌表达株系BL21（DE3），并在LB板（50 μg/mL卡那霉素）上培养16-18 h（37°C）。通过菌落PCR筛选阳性转化子；得到重组菌BL21（DE3）/pET-28a-cFel d 1。

菌落PCR引物序列如下：

F： 5’- GGAATTCCATATGATGGTGGCACAATAC-3’ （序列3）

R： 5’- CCGCTCGAGTTCAACGGTGTTCT-3’ （序列4）

阳性转化子的筛选结果如图2A所示，阳性转化子中含有约为300 bp的目的基因序列，表明嵌合肽cFel d 1基因序列已经被成功转化至BL21菌株。

将BL21（DE3）/ pET-28a-cFel d 1单个生长的菌落接种在LB液体培养基中，并在37°C（220 rpm）下培养16-18 h，得到菌液。然后将菌液转接至具有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，并在37°C（220 rpm）下培养，直到600 nm处的光密度值（OD）为0.6，加入0.2 mMIPTG，于37°C、220 rpm诱导2 h后，10000 rpm离心20 min（4°C），收集菌体沉淀。

通过12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析IPTG诱导前后菌体沉淀嵌合肽cFel d1的表达情况。

结果如图2B所示，IPTG诱导后获得大小约为 9 kDa的嵌合肽cFel d 1。

为了分离所表达的目的蛋白质，将菌体沉淀加入适量裂解液（100 mL菌液约加入20 mL裂解液（25 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.5）），于超声仪上充分溶解（15%功率，超声15-20 min），并进行离心（4°C，10000 rpm，15 min），收集上清液和沉淀。

将上述超声后的上清液和沉淀分别通过12% SDS-PAGE进行电泳，利用图像软件分析重组嵌合肽。

结果如图2C所示，菌体经超声破碎以后，在上清液中出现大小约9 kDa的目的条带，与嵌合肽cFel d 1理论分子大小相一致。

3）蛋白纯化

使用Ni²⁺亲和层析柱分离纯化所表达的嵌合肽cFel d 1。具体如下：

将上述2）分离的上清液用滤膜（孔径0.22 μm）过滤后，使用纯化仪纯化分离目的蛋白。利用不同浓度的咪唑溶液（50-500 mM）洗脱，收集不同浓度咪唑洗脱后的洗脱液。

SDS-PAGE电泳检测，结果如图2D所示，粗蛋白液经过100 mM咪唑洗脱后，获得分子量约为9 kDa的嵌合肽cFel d 1，其它浓度的咪唑洗脱液并未获得该目的条带。

收集100 mM咪唑的洗脱液经透析后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到嵌合肽cFel d 1（重组的嵌合肽cFel d 1）；再将嵌合肽cFel d 1溶于1×PBS中，得到嵌合肽cFeld 1溶液。

通过CBB法检测嵌合肽cFel d 1溶液的蛋白浓度。

实施例2、基于T细胞抗原表位的猫过敏原蛋白嵌合肽cFel d 1多克隆抗体的制备

1、抗体制备

1）小鼠多克隆抗体IgG

采用实施例1获得的嵌合肽cFel d 1溶液，使用1×PBS稀释至浓度为500 μg/mL，每只小鼠取50 μL与等体积的弗氏佐剂乳化，经皮下注射对小鼠进行免疫，共进行三次免疫，接种抗原量（cFel d 1）均为25 μg/只，接种周期具体为：

第一次免疫：第0天采用重组的嵌合肽cFel d 1溶液与弗氏完全佐剂按照1:1混合，充分乳化后进行免疫。同时，佐剂对照组使用1×PBS与弗氏不完全佐剂按照1:1混合进行免疫，空白对照组不做处理。免疫当天记为第0天。

第二次免疫：第21天采用重组的嵌合肽cFel d 1溶液与弗氏不完全佐剂按照1:1混合，充分乳化后进行免疫。同时佐剂对照组使用1×PBS与弗氏不完全佐剂按照1:1混合进行免疫，空白对照组不做处理。

第三次免疫：第31天采用重组的嵌合肽cFel d 1溶液与弗氏不完全佐剂按照1:1混合，充分乳化后进行免疫。同时，佐剂对照组使用1×PBS与弗氏不完全佐剂按照1:1混合进行免疫，空白对照组不做处理。

三次免疫结束一周后，采集小鼠眼球血，在室温静置1 h后，离心10 min（3000rpm），取上清即为多克隆抗体（小鼠抗血清）。

2）卵黄抗体IgY

（1）免疫

采用实施例1获得的嵌合肽cFel d 1溶液，使用1×PBS稀释至浓度为600 μg/mL，取500 μL与等体积的弗氏佐剂乳化后，经肌肉多点注射接种140日龄的海兰褐蛋鸡，共进行四次免疫，接种抗原为剂量为300 mg/只，具体接种步骤如下：

第二次免疫：第14天采用重组的嵌合肽cFel d 1溶液与弗氏不完全佐剂按照1:1混合，充分乳化后进行免疫。同时，佐剂对照组使用1×PBS与弗氏不完全佐剂按照1:1混合进行免疫，空白对照组不做处理。

第三次免疫：第28天采用重组的嵌合肽cFel d 1溶液与弗氏不完全佐剂按照1:1混合，充分乳化后进行免疫。同时，佐剂对照组使用1×PBS与弗氏不完全佐剂按照1:1混合进行免疫，空白对照组不做处理。

第四次免疫：第42天采用重组的嵌合肽cFel d 1溶液与弗氏不完全佐剂按照1:1混合，充分乳化后进行免疫。同时，佐剂对照组使用1×PBS与弗氏不完全佐剂按照1:1混合进行免疫，空白对照组不做处理。

第一次免疫结束后，每天收集鸡蛋。

（2）卵黄抗体的提取

采用聚乙二醇沉淀法提取卵黄抗体，具体步骤如下：

①收集的鸡蛋洗净经75 %酒精消毒后小心地剥离蛋壳，分离蛋清与蛋黄，尽可能地去除蛋清；

②将蛋黄转移到滤纸上，滚动除去剩余的蛋清，然后用刺血针或移液管尖切割卵黄膜，将蛋黄倒入量筒中；

③加入卵黄４倍体积的1×PBS，随后加入PEG6000干粉使其最终浓度为3.5%（质量体积比，g:mL），充分混合，随后静置，在 4℃下离心 20 min（10000 rpm），取上清，倒入折叠的滤纸中过滤；

④向所收集的上清中加入PEG6000使其终体积为8.5%（体积百分含量），充分混匀10 min，4℃下离心20 min（10000 rpm），弃上清；

⑤使用玻璃棒和涡旋器将沉淀溶解在1×PBS中，并加入与原始体积量相同的PBS，加入PEG6000使其终体积为12%，充分混匀10 min后，4℃下离心20 min（10000 rpm），弃上清；

将沉淀溶解于1×PBS，获得粗提IgY（卵黄抗体），-20℃保存。

2、抗体效价的测定

操作步骤：

1）包被：利用实施例1制备的原核表达纯化的嵌合肽cFel d 1作为抗原，用包被液稀释成1.5 μg/mL，100 μL/孔加入到酶标板中，4℃孵育过夜。

2）洗涤：次日弃去96孔板内液体，用洗涤液洗涤4次。

3）封闭：加入封闭液（200 μL/孔），37℃孵育2 h。

4）洗涤：用洗涤液洗涤4次。

5）加入待测样品（一抗）：将上述1得到的小鼠抗血清（多克隆抗体）或卵黄抗体（粗提IgY）用样品稀释液连续稀释，加入（100 μL/孔）到已包被好的酶标板中，使用样品稀释液作为阴性对照组；37℃孵育1 h。

6）洗涤：用洗涤液洗涤4次。

7）加酶标二抗：用样品稀释液按比例稀释二抗（小鼠抗鸡IgY-HRP，bersee，BIR798），加入到板中（100 μL/孔），37℃孵育1 h。

8）洗涤：洗涤液洗4次。

9）显色：加入TMB显色液（100 μL/孔）至96孔板，37℃避光孵育10-15 min。

10）终止反应、测定效价：加入终止液（100 μL/孔）至96孔板中，5 min后使用酶标仪在450 nm处测定各孔的吸光值；阳性反应的最大稀释度为待测抗体的效价。

具体地，对抗血清中特异性IgG抗体以及蛋鸡卵黄抗体效价检测所用的试剂如下：

①包被缓冲液（pH 9.6碳酸盐缓冲液）

NaHCO₃ 2.93 g

Na₂CO₃ 1.59 g

ddH₂O定容至1 L。

②洗涤缓冲液（PBST，pH 7.4）

NaCl 8.0 g

Na₂HPO₄ 1.2 g

KH₂PO₄0.2 g

KCl 0.2 g

Tween-20 0.5 mL

ddH₂O定容至1 L。

③封闭液：

脱脂奶粉5.0 g，加PBST定容至100 mL。

④封闭液：

脱脂奶粉5 g，加PBST定容至100 mL。

⑤样品稀释液：

脱脂奶粉0.5 g，加PBST定容至100 mL。

⑥终止液（1 M H₂SO₄）：

蒸馏水178.3 mL，加入浓硫酸（98%）21.7 mL，定容至400 mL。

TMB显色液；索莱宝公司购买。

效价检测结果如图3、图4所示，三次免疫后，小鼠血清中的特异性抗体IgG效价为1:34500-1:301500（图3）。蛋鸡免疫第九周时卵黄抗体IgY效价达到最高水平，为1:2²²（图4）。

实施例3、特异性卵黄抗体IgY的饲喂效果实验

将实施例2的1的2）中免疫后蛋鸡获得的鸡蛋黄（含有卵黄抗体IgY）冻干粉碎后分别以质量百分含量1.5%（图中记作E-1.5%，9只猫）、2%（图中记作E-2%，9只猫）的饲喂添加量拌入猫的日粮中，并进行饲喂4周，对照组为市场类似产品（LOVIDOVI洛利波利（南京麦西崴克生物技术有限公司），图中记作CK，5只猫），并分别在饲喂前（图中记作0周）、饲喂后1周（图中记作1周）、饲喂后2周（图中记作2周）、3周（图中记作3周）和4周（图中记作4周）收集猫的唾液样本，使用Fel d 1 ELISA 2.0 kit（Indoor Biotech）检测Fel d 1蛋白的含量。

检测结果如图5、6所示，猫咪在进食特异性卵黄抗体IgY一周至四周后，1.5%添加量处理组中猫唾液中的Fel d 1含量平均下降41.1-73.1%（除1只猫的数值异常外），2%添加量处理组中猫唾液中的Fel d 1含量平均下降46.5-79.3%，对照组中猫唾液中的Fel d 1含量平均下降32.3-60.5%，这表明卵黄抗体能够降低猫过敏原Fel d 1含量，可以作为抗过敏药物。

Claims

1.一种嵌合肽cFel d 1，其包括猫过敏原Fel d 1抗原氨基酸残基的第25-41位氨基酸残基所示区段、第46-59位氨基酸残基所示区段、第85-98位氨基酸残基所示区段、第132-140位氨基酸残基所示区段和第145-153位氨基酸残基所示区段。

2.根据权利要求1所述的嵌合肽cFel d 1，其特征在于：所述各个区段之间通过柔性氨基酸Linker连接。

3.根据权利要求1所述的嵌合肽cFel d 1，其特征在于：所述嵌合肽cFel d 1为如下A1）-A4）中任一种：

A1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2）将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由A1）衍生的蛋白质；

A3）序列中包含A1）或A2）所限定氨基酸序列的蛋白质；

4.权利要求1-3任一所述嵌合肽cFel d 1的编码核酸。

5.根据权利要求4所述的编码核酸，其特征在于：

所述编码核酸为如下B1）-B4）中任一所述的DNA分子：

B1）编码区包括序列表中序列2所示的核苷酸序列的DNA分子；

B2）核苷酸序列为序列表中序列2的核苷酸序列的DNA分子；

B3）在严格条件下与B1）或B2）中所述的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1-3任一所述嵌合肽cFel d 1的DNA分子；

B4）与B1）或B2）的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码权利要求1-3任一所述嵌合肽cFel d 1的DNA分子。

6.含有权利要求4或5所述编码核酸的重组载体或转基因细胞系或重组菌。

7.权利要求1-3任一所述嵌合肽cFel d 1在如下C1、C3或C4或C5中的应用：

或，权利要求4或5所述编码核酸或权利要求6所述的重组载体或转基因细胞系或重组菌在如下C2、C3或C4或C5中的应用：

C1）作为免疫原或制备免疫调节剂；

C2）制备免疫原或制备免疫调节剂；

C3）制备Fel d 1的抗体；

C4）制备抗过敏疫苗；

C5）制备中和或降低Fel d 1含量的产品。

8.一种抗过敏疫苗，包括权利要求1-3任一所述嵌合肽cFel d 1。

9.由权利要求1-3任一所述嵌合肽cFel d 1作为抗原制备的抗体。

10.权利要求9所述抗体在如下任一种的应用：

D1）制备治疗过敏产品；

D2）制备降低Fel d 1含量的产品；

或，一种治疗过敏的产品，包括权利要求9所述的抗体。