CN117063841A - 一种黄瓜单倍体诱导培养过程中提高出胚率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物单倍体培养技术领域，涉及一种黄瓜单倍体诱导培养过程中提高出胚率的方法，具体为组蛋白去乙酰化酶抑制剂在提高黄瓜单倍体出胚率中的应用。本发明通过将组蛋白去乙酰化酶抑制剂HDACi作为外源诱导调节剂加入黄瓜单倍体诱导培养的培养基中，并调节培养温度、光照等条件，有效提高了黄瓜单倍体诱导培养过程的出胚率，据实施例的数据记载，与采用常规培养基诱导培养的黄瓜单倍体的出胚率相比，加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)这一外源诱导调节剂的诱导培养基诱导培养的黄瓜单倍体的出胚率提高了32.3％左右。
Description
技术领域
本发明属于植物单倍体培养技术领域，涉及一种黄瓜单倍体诱导培养过程中提高出胚率的方法，具体为组蛋白去乙酰化酶抑制剂在提高黄瓜单倍体出胚率中的应用。
背景技术
单倍体育种是利用花药培养、未授粉子房培养以及辐射花粉授粉诱导等方法诱导产生单倍体，并使其单一的染色体各自加倍成对，成为有活力、能正常结实的纯合体。单倍体育种弥补了传统作物育种方法周期长、效率低以及受种质资源限制，可利用资源性状差异减小的缺陷。而且，单倍体育种在遗传上是稳定的，不再分离，相当于同质结合的纯系，可大幅度提高育种效率。
黄瓜单倍体诱导培养过程中，胚状体的发生和发育受到多种因素的影响，如基础培养基的组分、应急诱导方法、外源激素的种类、外植体发育状态等，为促进胚状体的发生和发育，人们往往会在培养基中加入外源诱导调节剂，目前，常见的植物外源诱导调节剂有IAA、NAA、2,4-D、α-萘乙酸、胺鲜酯(DA-6)等，但这些常见的植物外源诱导调节剂对胚状体的发生和发育作用有限，导致黄瓜单倍体诱导培养的出胚率较低。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)是能够抑制动物或植物中的组蛋白脱乙酰基酶活性从而降低其从组蛋白中除去乙酰基的能力的化合物，并通过促进从浓缩形式的染色质转变为扩展形式来调节基因转录。在动物研究中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂对肿瘤细胞迁移、侵袭和转移有抑制作用以及可以抗肿瘤血管生成，而组蛋白去乙酰化酶抑制剂在植物中的作用却鲜有报道，尤其是组蛋白去乙酰化酶抑制剂在黄瓜单倍体诱导培养过程中的作用是现有技术没有报道过的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种黄瓜单倍体诱导培养过程中提高出胚率的方法，将组蛋白去乙酰化酶抑制剂作为外源诱导调节剂加入黄瓜单倍体诱导培养的培养基中，可以有效提高黄瓜单倍体诱导培养的出胚率，与采用常规诱导培养基诱导的结果相比，出胚率可提高32.3％左右。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在提高黄瓜单倍体诱导培养出胚率中的应用。
优选的，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括异羟肟酸类衍生物。
优选的，所述异羟肟酸类衍生物包括伏立诺他。
本发明还提供了一种诱导培养基，所述诱导培养基以MS培养基为基础培养基，还包括0.01～0.2mg/L NAA、0.01～2mg/L 6-BA、0.2～20mg/L伏立诺他、30g/L蔗糖和8g/L琼脂。
本发明还提供了一种提高黄瓜单倍体诱导培养出胚率的方法，包括：将黄瓜未授粉子房切片接种至上述方案所述的诱导培养基中进行培养，得到胚状体。
优选的，所述培养为光培养和暗培养交替进行，所述光培养的条件包括：时间12～18h，光照强度800lux～4000lux，温度24℃～28℃；所述暗培养的条件包括：时间6～12h，温度20℃～25℃。
优选的，所述黄瓜未授粉子房切片通过横切所述黄瓜未授粉子房获得；所述切片的厚度为1～2mm。
优选的，所述接种包括划破所述诱导培养基，将所述黄瓜未授粉子房切片埋入培养基，埋入深度为50％以上的子房切片嵌入所述诱导培养基表面。
本发明还提供了上述方案所述诱导培养基或上述方案所述方法在黄瓜栽培中的应用。
本发明还提供了一种黄瓜幼苗的培养方法，包括将上述方案所述方法得到的胚状体依次进行分化培养和成苗培养，得到黄瓜幼苗。
有益效果：
本发明提供了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在提高黄瓜单倍体诱导培养出胚率中的应用，将组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)作为外源诱导调节剂加入黄瓜单倍体诱导培养的培养基中，并调节培养温度、光照等条件，有效提高了黄瓜单倍体诱导培养过程的出胚率，据实施例的数据记载，与采用常规培养基诱导培养的黄瓜单倍体的出胚率相比，加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂这一外源诱导调节剂的诱导培养基诱导培养的黄瓜单倍体的出胚率提高了32.3％左右。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例2黄瓜单倍体诱导培养得到的胚状体结果；
图2为对比例2黄瓜单倍体诱导培养得到的胚状体结果。
具体实施方式
本发明提供了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在提高黄瓜单倍体诱导培养出胚率中的应用。本发明所述所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂优选为异羟肟酸类衍生物，进一步优选为伏立诺他(SAHA)。
本发明还提供了一种诱导培养基，所述诱导培养基以MS培养基为基础培养基，还包括0.01～0.2mg/L NAA、0.01～2mg/L 6-BA，0.2～20mg/L伏立诺他、30g/L蔗糖和8g/L琼脂；优选以MS培养基为基础培养基，还仅含有0.01～0.2mg/LNAA、0.01～2mg/L 6-BA，0.2～20mg/L伏立诺他、30g/L蔗糖和8g/L琼脂。本发明所述诱导培养基中的NAA的浓度为0.01～0.2mg/L，优选为0.02～0.1mg/L，进一步优选为0.05mg/L；所述6-BA的浓度为0.01～2mg/L，优选为0.1～1mg/L，进一步优选为0.2mg/L；所述伏立诺他的浓度为0.2～20mg/L，优选为0.2～10mg/L，进一步优选为1～5mg/L，更优选为2.5mg/L，本发明所述伏立诺他的作用为调节黄瓜单倍体诱导培养过程中的基因转录，促进利于胚状体形成的激素产生；所述蔗糖的浓度为30～90g/L，优选为30～60g/L，进一步优选为30g/L；所述琼脂的浓度为6～10g/L，优选为7～9g/L，进一步优选为8g/L。
本发明提供的诱导培养基，在常规的MS培养基和常规的植物激素NAA、IAA以及6-BA的基础上，添加了新型的植物外源诱导调节剂伏立诺他(SAHA)，可有效提高黄瓜单倍体诱导培养的出胚率。
本发明还提供了一种提高黄瓜单倍体诱导培养出胚率的方法，包括将黄瓜未授粉子房切片接种至上述技术方案所述的诱导培养基中进行培养，得到胚状体。
本发明优选先对黄瓜未授粉雌花进行消毒处理，具体步骤优选包括：先用体积百分比为75％的乙醇溶液浸泡处理，再用体积百分比为2.5％的次氯酸钠溶液消毒，然后无菌水浸洗。本发明所述乙醇浸泡的时间优选为30～50s，进一步优选为45s；本发明所述消毒优选为将所述黄瓜未授粉雌花于所述次氯酸钠溶液中浸泡消毒，所述消毒的时间优选为8～15min，进一步优选为10min；所述浸洗的次数优选为3次，每次浸洗的时间优选为1～2min，进一步优选为1.5min。本发明所述消毒处理优选在超净工作台上进行。
完成所述消毒处理后，本发明优选将消毒后的黄瓜未授粉雌花的子房进行切片处理，得到黄瓜未授粉子房切片。本发明所述切片处理的方法优选为横切所述黄瓜未授粉子房。本发明所述黄瓜未授粉子房切片的厚度优选为1～2mm，进一步优选为2mm。
得到所述黄瓜未授粉子房切片后，本发明将所述黄瓜未授粉子房切片接种至上述方案所述的诱导培养基中进行培养，得到胚状体。本发明所述接种优选为划破所述诱导培养基，将所述黄瓜未授粉子房切片埋入培养基。本发明所述埋入深度优选为50％以上的子房切片嵌入所述诱导培养基表面，所述埋入深度优选以子房切片的厚度计。本发明所述培养的方法优选为光培养和暗培养交替进行；所述光培养的条件优选为：光照时间12～18h，进一步优选为16h；光照强度800lux～4000lux，进一步优选为1000lux～3000lux，更优选为2000lux，温度24℃～28℃，进一步优选为25℃；所述暗培养的条件优选为：时间6～12h，温度20℃～25℃，所述暗培养的时间优选为6～12h，进一步优选为8h，所述暗培养的温度优选为20℃～25℃，进一步优选为23℃。
本发明还提供了上述方案所述诱导培养基或上述方案所述提高黄瓜单倍体诱导培养出胚率的方法在黄瓜栽培中的应用。本发明所述黄瓜栽培优选包括黄瓜幼苗的培养。
本发明还提供了一种黄瓜幼苗的培养方法，包括将上述方案所述方法得到的胚状体依次进行分化培养和成苗培养，得到黄瓜幼苗。本发明所述分化培养的培养基以MS为基础培养基，还优选包括0.05mg/LNAA。本发明所述分化培养的培养基的pH值优选为5.7～6.0，进一步优选为5.8。本发明所述分化培养的方法同上述诱导培养的方法，不再赘述。本发明所述成苗培养的培养基以1/2MS为基础培养基，还优选包括0.05mg/LNAA，所述成苗培养的培养基的pH值优选为5.7～6.0，进一步优选为5.8。本发明所述成苗培养的方法同上述诱导培养的方法，不再赘述。
若没有特殊限定，本发明上述技术方案中涉及到的试剂、植物激素、设备均为本领域常规市售产品即可。
本发明所述黄瓜幼苗的培养方法，以上述技术方案所述的诱导培养基和提高黄瓜单倍体诱导培养出胚率的方法为基础，在大幅提高黄瓜单倍体诱导培养出胚率的基础上，再通过后期的染色体加倍和植株再生技术，可为黄瓜新品种选育提供更加丰富的育种材料。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种诱导培养基，具体组成为：MS培养基+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+0.2mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+2.5mg/L伏立诺他(SAHA)，pH＝5.7～6.0。
对比例1
一种诱导培养基，具体组成为：MS培养基+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+0.2mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA，pH＝5.7～6.0。
实施例2
一种黄瓜单倍体诱导培养的方法，具体步骤如下：
1)取材：取3种不同品种(“中农26号”、“北京102”、“翠丰1号”)的健康黄瓜植株开花前一天的未授粉雌花，各50个；
2)消毒：在超净工作台中，首先用75％的乙醇浸泡步骤1)中的未授粉雌花45s，再用2.5％次氯酸钠消毒10min，然后无菌水浸洗3次，每次1.5min；
3)切片：将步骤2)消毒后的未授粉雌花中的子房置于滤纸上，用手术刀将其横切成2mm厚度的子房切片；
4)诱导培养：划破实施例1的诱导培养基，将步骤3)得到的子房切片埋入培养基中，埋入深度为子房切片厚度的50％以上即可，将培养基放置在智能人工气候箱中进行光暗交替培养，设置光培养条件为：光照时间16h，光照强度2000lux，温度25℃，设置暗培养为：时间8h，温度23℃；培养1-2周后，得到胚状体。
对比例2
一种黄瓜单倍体诱导培养的方法，与实施例2的方法相同，区别在于步骤4)用到的诱导培养基为对比例1的诱导培养基。
实施例2和对比例2分别做三次平行试验，观察并记录实施例2和对比例2的出胚结果，取平均值，结果见图1、图2和表1。
表1实施例2和对比例2不同品种黄瓜单倍体诱导培养出胚数和出胚率
由表1结果可知，采用常规培养基培养方法的黄瓜单倍体诱导培养的出胚率11.4％～18.6％之间，采用添加伏立诺他的培养基进行黄瓜单倍体诱导培养的出胚率达到15.4％～24％，平均出胚率提高了32.3％。
应用例1
一种黄瓜幼苗的培养方法，具体步骤如下：
1)将实施例2得到的胚状体转移至分化培养基中进行分化培养，分化培养基的组成为：以MS培养基为基础培养基，添加0.05mg/LNAA；pH＝5.8，培养方法同实施例2步骤4)，不再赘述；
2)将完成分化培养的胚状体转移至成苗培养基中进行成苗培养，成苗培养基的组成为以1/2MS培养基为基础培养基，加入0.05mg/LNAA，pH＝5.8，培养方法同实施例2步骤4)，不再赘述，培养3-4周，得到黄瓜幼苗。
由以上实施例可知，本发明提供了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在提高黄瓜单倍体诱导培养出胚率中的应用，将组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)作为外源诱导调节剂加入黄瓜单倍体诱导培养的培养基中，并调节培养温度、光照等条件，有效提高了黄瓜单倍体诱导培养过程的出胚率，与采用常规培养基诱导培养的黄瓜单倍体的出胚率相比，加入HDACi这一外源诱导调节剂的诱导培养基诱导培养的黄瓜单倍体的出胚率提高了32.3％左右，并且，本发明在大幅提高了黄瓜单倍体诱导培养出胚率的基础上，通过后期的染色体加倍和植株再生技术，可为黄瓜新品种选育提供更加丰富的育种材料。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在提高黄瓜单倍体诱导培养出胚率中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括异羟肟酸类衍生物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述异羟肟酸类衍生物包括伏立诺他。
4.一种诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基以MS培养基为基础培养基，还包括0.01～0.2mg/LNAA、0.01～2mg/L 6-BA、0.2～20mg/L伏立诺他、30g/L蔗糖和8g/L琼脂。
5.一种提高黄瓜单倍体诱导培养出胚率的方法，其特征在于，包括：将黄瓜未授粉子房切片接种至权利要求4所述的诱导培养基中进行培养，得到胚状体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养为光培养和暗培养交替进行；所述光培养的条件包括：时间12～18h，光照强度800lux～4000lux，温度24℃～28℃；所述暗培养的条件包括：时间6～12h，温度20℃～25℃。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述黄瓜未授粉子房切片通过横切所述黄瓜未授粉子房获得；所述切片的厚度为1～2mm。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述接种包括划破所述诱导培养基，将所述黄瓜未授粉子房切片埋入培养基，埋入深度为50％以上的子房切片嵌入所述诱导培养基表面。
9.权利要求4所述诱导培养基或权利要求5～8任一项所述的方法在黄瓜栽培中的应用。
10.一种黄瓜幼苗的培养方法，其特征在于，包括将权利要求5～8任一项所述方法得到的胚状体依次进行分化培养和成苗培养，得到黄瓜幼苗。
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