CN117054666A - 一种单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序文库的制备方法 - Google Patents
一种单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序文库的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微流控芯片技术领域，尤其涉及一种单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序文库的制备方法。本发明包含多个局部开孔的疏水层，并对开孔进行了不同的功能修饰的微流控芯片制备测序文库，实现了单细胞筛选、培养、细胞与分泌蛋白分别捕获并做相应的反应处理的全过程，集成度高、易实现自动化，使用疏水层局部开孔的设计能够简单、高效地筛选出单个目标细胞，且不会对目标细胞有损伤、也不会造成其他细胞的流失。
Description
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，尤其涉及一种单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序文库的制备方法。
背景技术
细胞是生命活动的基本单位，大量不同形态、不同功能的细胞有序地组合在一起构成一个生物体，细胞的异质性普遍存在于这些细胞之中，研究表明，即便是看上去很相似的两个细胞，也可能存在显著的异质性。而传统的细胞分析方法大多是基于细胞群体的层面上进行的，平均化的分析结果会使少数关键的异常的信息被掩盖、忽视，无法获得更深入准确的分析结果。因此，在单个细胞层面上进行分析检测显得尤为重要，单细胞分析是研究细胞异质性的有效手段。目前已有的单细胞组学分析包括基因组、转录组、表观遗传组、蛋白组、代谢组等，在单细胞多组学研究中，单细胞转录组与蛋白质的联合分析具有重要意义。转录组作为基因的表达产物，在特定时间和空间的限定下传递着基因信息；蛋白质作为表型的直接输出者，直观反映了细胞当下的生理状态与细胞功能。对二者进行同时分析，有助于理解基因表达与功能表现之间的相关关系。单细胞转录组和蛋白质联合分析主要包括原位荧光杂交法、邻位连接分析技术和测序技术。其中，测序技术因能提供高靶标分析通量及多组学联合分析能力，成为了单细胞转录组和蛋白质联合分析的重要技术手段。随着微流控技术的发展和进步，将测序技术与微流控技术结合，使用DNA标记抗体孵育细胞后与编码微球共包裹于液滴中，细胞裂解所释放的mRNA和DNA标记抗体被编码微球捕获，随后对液滴中的所有产物进行放大与测序，便能实现单细胞转录组与蛋白质的联合分析。
单细胞分离是单细胞分析的首要难题，传统的单细胞分析方式是先在显微镜下挑选单个细胞再转入离心管内进行后续反应处理，这个方法操作繁琐、且试剂消耗量大。相较之下，上述利用微流控技术来进行单细胞分析的方法虽然具有简化操作、试剂用量小、反应速度快、不易引入污染等优势，但普通的泵注式微流控需要联合控制多个泵和阀门来对不同液路、气路进行通断，较难实现多步连续反应的集成。而且，这类基于微流控的联合分析技术在细胞与编码微球的包裹过程中受泊松分布限制，细胞利用率较低；其次，样本中游离核酸以及游离抗体的存在导致其背景污染大，定量分析不准确。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服现有技术难点，提供一种基于数字微流控技术的单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序文库的制备方法，利用数字微流控芯片为平台，通过介电润湿的原理对芯片上的电极施加电压精准驱动液滴移动，在同一芯片上就能同时对单细胞转录组和分泌蛋白分别进行处理和反应，能够实现简单、高效、精准、易集成的单细胞多组学分析。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种使用微流控芯片制备单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序文库的方法，所述微流控芯片包括上极板、下极板；所述上极板包括基底和疏水层；所述下极板包括依次相接触的基底、电极层、介质层和局部开孔的疏水层；
所述局部开孔的疏水层包括局部亲水化区域和捕获抗体修饰区域；
所述电极层设有储液区、废液池、样本回收区、储液区和液滴生成通道；
所述储液区包括细胞悬液储液区、细胞培养液储液区、清洗液储液区、带有DNA序列标记的检测抗体试剂储液区、裂解液储液区、逆转录试剂储液区、扩增试剂储液区；
所述上极板和下极板的疏水层表面相对，中间以200-300微米的间隔层隔开，间隙内注满填充油。
本发明微流控芯片包括上极板、下极板两个部分。两极板平行相对，中间以间隔层隔开形成相对封闭的反应空间。其中，上极板为导电玻璃基底涂覆一层疏水层，用于接地。下极板自下而上由基底、电极层、介质层和局部开孔的疏水层组成。电极层包括多个储液区、样本回收区、废液池以及每个储液区的液滴生成通道和移动通道，储液区分别用于贮存细胞悬液、细胞培养液、裂解液、逆转录试剂、扩增试剂、清洗液、含有DNA标记序列的检测抗体等试剂；样本回收区用于分别回收反应后的转录组样本和分泌蛋白样本。局部开孔的疏水层有两处开孔，一是直径较小的局部亲水圆柱形凹槽，用于捕获单细胞；二是直径较大的经捕获抗体修饰的圆柱形凹槽，用于捕获单细胞分泌蛋白；这两个位置即为两种样本的处理和反应区。
一些实施方案中，所述局部亲水化区域的圆孔直径为100-400微米；
所述捕获抗体修饰区域的圆孔直径为400-800微米。
一些实施方案中，所述局部亲水化区域和捕获抗体修饰区域下方分别设有局部温度控制模块。
一些实施方案中，所述上极板的基底为氧化铟锡导电玻璃基底，疏水层为特氟龙疏水层；
所述下极板的基底为玻璃基底，电极层为铬电极层，介质层为氧化硅介质层，疏水层为特氟龙疏水层。
本发明具体实施例中，所述芯片的间隔层采用200-300微米厚的双面胶，贴于芯片四周，作为间隔的同时还起到密封整个芯片的作用，除了双面胶还可以采用其他材料，保证上下极板具有200-300微米的间隔即可。
一些具体实施例中，本发明使用微流控芯片制备单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序文库的方法包括：
(1)加样：先将所述微流控芯片内加满填充油，然后依次对每个储液区施加电压，分别加入预先配制好的反应试剂；
(2)单细胞捕获：对细胞悬液储液区的液滴生成通道进行通断电控制，从储液区中生成一个细胞悬液小液滴移动到局部亲水化的电极，反复操纵液滴在四周来回移动，直至单个目标细胞位于局部亲水区域范围，断电等待细胞沉降到亲水区域内，通电控制剩余细胞悬液移动到废液池；
(3)细胞培养：通断电控制细胞培养液储液区生成一个小液滴并移动到局部亲水化区域，将芯片放入培养箱中进行培养；
(4)细胞与分泌蛋白分离：从培养箱中取出芯片，采用和步骤(2)相同的方式将目标细胞沉降到亲水区域内，通电控制剩余液滴移动到捕获抗体修饰的电极上，使捕获抗体与目标蛋白质进行结合；
(5)细胞裂解：通断电从裂解液储液区中生成一个裂解液小液滴，移到捕获的单细胞处，通过局部温控模块加热使细胞裂解；
(6)逆转录：细胞裂解之后，通电控制逆转录试剂生成一个小液滴并移动到局部亲水化电极与裂解后的样本进行充分混匀，控制局部温控模块加热进行逆转录反应；
(7)蛋白质清洗：等待逆转录反应的期间，用清洗液洗去捕获抗体修饰电极上剩余的未与抗体结合的其他蛋白质；
(8)检测抗体结合：将带有DNA序列标记的检测抗体试剂移动到捕获抗体修饰电极上，静置，使检测抗体与目标蛋白质进行结合；
(9)蛋白质清洗：重复步骤(7)洗去残余的检测抗体；
(10)扩增：通电控制向步骤(6)和(9)获得的两个样本中加入扩增试剂进行充分混匀，通过控制两个局部温控模块循环升降温来进行扩增反应；
(11)样本回收文库构建：扩增反应结束后，通电将步骤(10)得到的两个样本移动到相应的取样口，用移液枪分别将样本吸出保存在离心管内，对样本进行文库构建，即得到单细胞转录组和分泌蛋白的测序文库。
本发明步骤(1)中，所述填充油为硅油和/或矿物油。
本发明步骤(6)中，逆转录的条件为：42℃90min；70℃15min。
本发明步骤(10)中，所述扩增反应的条件为：
95℃3min；
(95℃30sec，60℃30sec)30个循环；
72℃1min；72℃5min；4℃保温直至样本回收。
本发明还提供了所述微流控芯片的制备方法，包括：
将上极板基底清洗后涂覆疏水层；
将下极板基底清洗后依次涂覆电极层、沉积介质层和涂覆局部开孔的疏水层；
将所述上极板和下极板的疏水层表面相对，中间以200-300微米的间隔层隔开，将两个极板的间隙内注满填充油，形成相对密闭的生化反应空间，获得所述微流控芯片。
一些实施方案中，所述局部开孔的疏水层的制备方法包括：
在介质层上利用光刻胶覆盖亲水化区域和捕获抗体修饰区域，旋涂氟龙溶液，烘干成膜，对所述覆盖区域进行去胶，对所述捕获抗体修饰区域依次进行清洗、封闭、清洗。
与传统的技术方法相比，本发明有如下几个优势：
(1)在同一个数字微流控芯片上设计并制备多个局部开孔的疏水层，并对这些开孔进行了不同的功能修饰，能够同时实现单细胞筛选、培养、细胞与分泌蛋白分别捕获并做相应的反应处理的全过程，集成度高、易实现自动化；
(2)使用电极局部亲水的设计能够简单、高效地筛选出单个目标细胞(一般在五分钟以内完成)，且不会对细胞有损伤、也不会造成其他稀有细胞的流失；
(3)在数字微流控芯片上进行反应，所需反应体积小，能降低试剂消耗量，节约试剂成本；此外，芯片内填充满了油相隔离，能有效防止样本蒸发及污染。
附图说明
图1示一种用于实现单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序文库制备的数字微流控芯片；
图2所示为单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序的流程；
图3示显微镜下观察的实际捕获过程。
具体实施方式
本发明提供了一种单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序文库的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明基于数字微流控技术的单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序文库的制备方法包括如下步骤：
(1)加样：先将数字微流控芯片内加满填充油，然后依次对每个储液区施加电压，分别加入预先配制好的反应所需的试剂；
(2)单细胞捕获：对细胞悬液储液区的液滴生成通道进行通断电控制，从储液区中生成一个细胞悬液小液滴移动到局部亲水化区域，反复操纵液滴在四周来回移动，直至单个目标细胞位于局部亲水化区域范围，断电等待细胞沉降到局部亲水化区域内，通电控制剩余细胞悬液移动到废液池；
(3)细胞培养：生成一个培养液小液滴移动到局部亲水化的电极，将芯片放入培养箱中进行培养，在此期间细胞会分泌蛋白质；
(4)细胞与分泌蛋白分离：从培养箱中取出芯片，使用和步骤(2)相同的方式将目标细胞沉降到亲水区域内，通电控制剩余液滴移动到捕获抗体修饰的电极上，静置等待捕获抗体与目标蛋白质进行结合；
(5)细胞裂解：通断电从裂解液储液区中生成一个裂解液小液滴移到捕获的单细胞处，通过局部温控模块加热使细胞裂解；
(6)逆转录：细胞裂解之后，生成一个逆转录试剂小液滴并通电移动到局部亲水化电极与裂解后的样本进行充分混匀，加热开始进行逆转录反应；
(7)蛋白质清洗：等待逆转录反应的同时，用清洗液洗去捕获抗体修饰电极上剩余的未与抗体结合的其他蛋白质；
(8)检测抗体结合：将带有DNA序列标记的检测抗体试剂移动到捕获抗体修饰电极上，静置等待检测抗体与目标蛋白结合；
(9)蛋白质清洗：检测抗体与目标蛋白质结合之后，重复步骤(7)洗去残余的检测抗体；
(10)扩增：通电控制往步骤(6)和(9)获得的两个样本中加入扩增试剂进行充分混匀，通过控制两个温控模块循环升降温来进行扩增反应；
(11)样本回收文库构建：扩增反应结束后，通电将步骤(10)得到的两个样本移动到相应的取样口，用移液枪分别将样本吸出保存在离心管内，再对样本进行文库构建，即得到单细胞转录组和分泌蛋白的测序文库。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明数字微流控芯片的设计及制备
图1所示为一种用于实现单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序文库制备的数字微流控芯片设计方案。数字微流控芯片包括上极板、下极板两个部分。其中，上极板选用氧化铟锡(Indium tin oxide,ITO)导电玻璃作为基底，表面涂覆1％特氟龙溶液形成疏水层。下极板由玻璃基底、电极层、介质层和局部开孔的疏水层组成。在图1所示的设计方案中，电极层主要包括七个储液区1(分别为：细胞悬液储液区1A、细胞培养液储液区1B、清洗液储液区1C、带有DNA序列标记的检测抗体试剂储液区1D、裂解液储液区1E、逆转录试剂储液区1F、扩增试剂储液区1G)、一个废液池2、两个样本回收区3以及各储液区液滴生成通道4等。局部开孔的疏水层由局部亲水化区域5和捕获抗体修饰区域6组成。
图1所示的数字微流控芯片制备方法如下：
上极板制作：
(1)基底清洗：将ITO导电玻璃浸泡于10％玻璃清洗液中，放入超声仪中使用65℃超声清洗40分钟，然后将导电玻璃取出浸泡于超纯水中超声清洗15分钟，接着更换超纯水再重复清洗一次，最后使用氮气枪吹干，放入135℃恒温干燥箱中烘干30分钟以上。
(2)疏水层涂覆：使用浓度为1％的特氟龙溶液作为疏水层，将特氟龙溶液旋涂在清洗过的导电玻璃上，旋涂完毕置于加热台上，220℃烘30分钟。
下极板制作：
(1)基底清洗：下极板使用普通玻璃作为基底，清洗步骤与上极板基底清洗步骤完全一致。
(2)电极层制备：在洗净的玻璃基底上使用磁控溅射或蒸镀的方式制得约300纳米厚的铬金属层，再通过光刻显影、湿法刻蚀的方式得到设计方案中的电极分布图案。
(3)介质层制备：使用化学气相沉积的方法，在电极层上方沉积厚度约为500纳米的氧化硅介质层。
(4)局部开孔的疏水层制备：先通过光刻显影的方式用光刻胶覆盖局部亲水化区域5和捕获抗体修饰区域6，再将特氟龙溶液旋涂在介质层上方，将特氟龙溶液烘干成膜后，再对光刻胶覆盖的局部亲水化区域5和捕获抗体修饰区域6进行去胶，留下两个没有被疏水层覆盖的局部亲水的小圆柱形凹槽。其中，局部亲水化区域5的圆孔直径约为100-400微米，捕获抗体修饰区域6的圆孔直径约为400-800微米。
(5)捕获抗体修饰：将捕获抗体修饰于捕获抗体修饰区域6，在4℃环境下存放12小时，取出芯片用磷酸盐缓冲液对捕获抗体修饰区域6进行清洗，然后加入封闭缓冲液于室温下存放2小时，再次用磷酸盐缓冲液进行清洗，即可得到捕获抗体修饰区域6。
上、下极板分别制备完成后，将两个极板的疏水表面相对，中间以200-300微米的间隔层隔开，再往两极板间隙内注满填充油(一般为硅油或矿物油，本实施例中选择的是硅油)，即形成相对密闭的生化反应空间。
实施例2单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序文库制备方法
图2所示为单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序的流程。下面结合该流程介绍在图1所示的芯片上的具体实施方法：
(1)使用硅油填充整个数字微流控芯片，接着依次对七个储液区进行预通电，将反应所需的试剂分别加入到相应的储液区位置；
(2)通断电控制细胞悬液储液区生成一个小液滴，并移动到局部亲水化区域5所在电极，操控液滴在局部亲水化区域5附近来回移动，并在显微镜下观察，当有单个目标细胞停留在局部亲水化区域5上方时，断电静置1-2分钟，使细胞在重力作用下沉降到局部亲水化区域5底部，通电将其他细胞悬液移动到废液池(若是稀有细胞样本，也可将剩余细胞悬液移回储液区，用移液枪吸出回收继续使用)，图3为显微镜下观察的实际捕获过程记录；
(3)通断电控制细胞培养液储液区生成一个小液滴并移动到局部亲水化区域5所在电极，将芯片放入培养箱中，37℃培养12小时；
(4)从培养箱中取出芯片恢复至室温，在显微镜下观察细胞是否仍在局部亲水化区域5内，若是，通电控制含有细胞分泌蛋白的培养液移动到捕获抗体修饰区域6所在电极，若不是，重复步骤(2)的方式将目标细胞沉降到亲水区域内，再通电控制剩余液滴移动到捕获抗体修饰区域6所在电极，静置1小时，使捕获抗体与目标蛋白质进行结合；
(5)通断电从裂解液储液区中生成一个裂解液小液滴，移动到局部亲水化区域5所在电极，控制局部亲水化区域5下方的局部温控模块对区域5进行72℃加热3分钟，使细胞裂解，本实施例使用的裂解液配方如表1所示；
表1细胞裂解液配方
(6)细胞裂解之后，通电控制逆转录试剂生成一个小液滴移动到局部亲水化区域5电极，与裂解后的样本进行充分混匀，控制局部温控模块按照表2的温度设置对局部亲水化区域5进行加热，开始逆转录反应，逆转录试剂配方如表3所示；
表2逆转录反应温度
表3逆转录试剂配方
(7)在等待逆转录的过程中，捕获抗体修饰区域完成与目标蛋白的结合，先通电将捕获抗体修饰区域上的液滴移至废液池，再从清洗液储液区生成一个清洗液小液滴移至捕获抗体修饰区域6所在电极，洗去残余的未被捕获的蛋白质移动到废液池，这里的清洗液选用磷酸盐缓冲液；
(8)从检测抗体储液区生成一个检测抗体小液滴移至捕获抗体修饰区域6所在电极，静置1小时，使检测抗体与目标蛋白质进行结合；
(9)检测抗体与目标蛋白质结合之后，重复步骤(7)洗去残余的检测抗体；
(10)通电控制扩增试剂生成两个小液滴并分别移至局部亲水化区域5所在电极和捕获抗体修饰区域6所在电极，分别与步骤(6)和(9)获得的两个样本进行充分混匀，控制两个局部温控模块按照表4的温度设置对局部亲水化区域5和捕获抗体修饰区域6分别进行循环升降温，开始扩增反应，扩增试剂的配方如表5所示；
表4扩增反应温度
表5扩增试剂配方
(11)扩增反应结束后，通电将步骤(10)得到的两个样本移动到相应的取样口，用移液枪分别将样本吸出保存在离心管内，然后对两个样本分别进行文库构建，即得到单细胞转录组和分泌蛋白的测序文库。
由图3结果可知，采用本发明微流控芯片分离得到的单细胞的细胞结构完好无损，在分离目标细胞之后，其他细胞全部都在剩余细胞悬液之中且形态完好。适用于单细胞分离、分析以及后续单细胞转录组和分泌蛋白的测序文库的构建。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种使用微流控芯片制备单细胞转录组和分泌蛋白的多组学联合测序文库的方法，其特征在于，所述微流控芯片包括上极板、下极板；所述上极板包括基底和疏水层；所述下极板包括依次相接触的基底、电极层、介质层和局部开孔的疏水层；
所述局部开孔的疏水层包括局部亲水化区域和捕获抗体修饰区域；
所述电极层设有储液区、废液池、样本回收区、储液区和液滴生成通道；
所述储液区包括细胞悬液储液区、细胞培养液储液区、清洗液储液区、带有DNA序列标记的检测抗体试剂储液区、裂解液储液区、逆转录试剂储液区、扩增试剂储液区；
所述上极板和下极板的疏水层表面相对，中间以200-300微米的间隔层隔开，间隙内注满填充油。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述局部亲水化区域的圆孔直径为100-400微米；
所述捕获抗体修饰区域的圆孔直径为400-800微米。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述局部亲水化区域和捕获抗体修饰区域下方分别设有局部温度控制模块。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上极板的基底为氧化铟锡导电玻璃基底，疏水层为特氟龙疏水层；
所述下极板的基底为玻璃基底，电极层为铬电极层，介质层为氧化硅介质层，疏水层为特氟龙疏水层。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，包括：
(1)加样：先将所述微流控芯片内加满填充油，然后依次对每个储液区施加电压，分别加入预先配制好的反应试剂；
(2)单细胞捕获：对细胞悬液储液区的液滴生成通道进行通断电控制，从储液区中生成一个细胞悬液小液滴移动到局部亲水化的电极，反复操纵液滴在四周来回移动，直至单个目标细胞位于局部亲水区域范围，断电等待细胞沉降到亲水区域内，通电控制剩余细胞悬液移动到废液池；
(3)细胞培养：通断电控制细胞培养液储液区生成一个小液滴并移动到局部亲水化区域，将芯片放入培养箱中进行培养；
(4)细胞与分泌蛋白分离：从培养箱中取出芯片，采用和步骤(2)相同的方式将目标细胞沉降到亲水区域内，通电控制剩余液滴移动到捕获抗体修饰的电极上，使捕获抗体与目标蛋白质进行结合；
(5)细胞裂解：通断电从裂解液储液区中生成一个裂解液小液滴，移到捕获的单细胞处，通过局部温控模块加热使细胞裂解；
(6)逆转录：细胞裂解之后，通电控制逆转录试剂生成一个小液滴并移动到局部亲水化电极与裂解后的样本进行充分混匀，控制局部温控模块加热进行逆转录反应；
(7)蛋白质清洗：等待逆转录反应的期间，用清洗液洗去捕获抗体修饰电极上剩余的未与抗体结合的其他蛋白质；
(8)检测抗体结合：将带有DNA序列标记的检测抗体试剂移动到捕获抗体修饰电极上，静置，使检测抗体与目标蛋白质进行结合；
(9)蛋白质清洗：重复步骤(7)洗去残余的检测抗体；
(10)扩增：通电控制向步骤(6)和(9)获得的两个样本中加入扩增试剂进行充分混匀，通过控制两个局部温控模块循环升降温来进行扩增反应；
(11)样本回收文库构建：扩增反应结束后，通电将步骤(10)得到的两个样本移动到相应的取样口，用移液枪分别将样本吸出保存在离心管内，对样本进行文库构建，即得到单细胞转录组和分泌蛋白的测序文库。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，步骤(1)中所述填充油为硅油和/或矿物油。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中逆转录的条件为：42℃90min；70℃15min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(10)中所述扩增反应的条件为：
95℃3min；(95℃30sec，60℃30sec)30个循环；72℃1min；72℃5min；4℃保温直至样本回收。
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