CN117045649A - 一种用于治疗索拉非尼耐药肝细胞癌的组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物领域，涉及一种用于治疗索拉非尼耐药肝细胞癌的组合物。本发明所述的用于治疗索拉非尼耐药肝细胞癌的组合物包括：有效治疗剂量的甘草查尔酮A和索拉非尼。本发明还提供了含有甘草查尔酮A和索拉非尼的组合物在制备治疗索拉非尼耐药肝细胞癌的药物中的用途，将含有甘草查尔酮A和索拉非尼的组合物作为有效成分用于制备口服剂型。本发明所述的组合物可以通过阻滞自噬体‑溶酶体融合而抑制耐药细胞自噬水平，导致耐药细胞内ROS显著增加，诱导耐药细胞凋亡，从而提高耐药细胞对索拉非尼敏感性。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，涉及一种用于治疗索拉非尼耐药肝细胞癌的组合物，尤其是涉及一种提高索拉非尼耐药肝癌细胞药物敏感性的组合物，以及该组合物的应用。
背景技术
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种高死亡率的原发性肝癌。它是全球范围内最致命的恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织的2020年全球癌症相关数据，在死亡人数最多的10种癌症中，肝癌是第三位。在中国，HBV携带者众多，其导致的肝硬化等继发病是HCC的主要致病因素之一，因此国内肝癌死亡人数居高不下。在肝癌的综合治疗中，常用的治疗方法包括手术治疗，化疗，放射治疗等，但由于其副作用大，转移复发可能性高，往往导致晚期HCC。
索拉非尼（Sorafenib，SORA）是一种多激酶抑制剂，临床用于治疗无法手术治疗的晚期肾细胞癌及转移的原发肝细胞癌，是晚期HCC的一线用药。然而，索拉非尼本身的耐药性影响了其临床疗效的发挥。著名的索拉非尼肝细胞癌评估随机方案（SHARP）试验表明，索拉非尼可额外改善患者2.8个月的总生存期。然而，在6个月内就出现耐药性，临床疗效十分有限。因此，现在迫切希望寻求解决逆转肝癌索拉非尼耐药、提高索拉非尼的临床疗效的方法。
甘草查尔酮A（Licochalcone A，LCA）是一种从甘草根提取的一种天然查尔酮类化合物，其具有广泛的生物活性与药理作用，包括抗炎、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫与抗肿瘤等。在抗肿瘤领域，多种肿瘤细胞系被用于LCA的抗肿瘤研究，包括胆管癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、肝癌等。然而在耐药方面，探索LCA对肝癌耐药方面的影响还未见报道。因此，
发明内容：
本发明的目的在于提供一种用于治疗索拉非尼耐药肝细胞癌的组合物，该组合物能提高索拉非尼对耐药肝癌患者的临床疗效。
本发明所述的用于治疗索拉非尼耐药肝细胞癌的组合物包括：有效治疗剂量的甘草查尔酮A和索拉非尼。
根据本发明所述的组合物的进一步特征，所述甘草查尔酮A与索拉菲尼的有效治疗剂量比例为1:1至1:2。
优选地，所述甘草查尔酮A与索拉菲尼的有效治疗剂量比例为1:1.5。
本发明还提供了含有甘草查尔酮A和索拉非尼的组合物在制备治疗索拉非尼耐药肝细胞癌的药物中的用途。
根据本发明所述的用途的进一步特征，将含有甘草查尔酮A和索拉非尼的组合物作为有效成分用于制备口服剂型。
优选地，所述的口服剂型为固体片剂或溶液剂。
发明人找到了一种联合索拉非尼针对索拉非尼耐药肝细胞癌治疗的辅助药物甘草查尔酮A（LCA），验证了LCA与索拉非尼对肝癌耐药细胞的联合作用，并确定了相关的分子机制。该药物组合物可以通过阻滞自噬体-溶酶体融合而抑制耐药细胞自噬水平，导致耐药细胞内ROS显著增加，诱导耐药细胞凋亡，从而提高耐药细胞对索拉非尼敏感性。
本发明通过实验表明，CA与索拉非尼联合处理肝癌耐药细胞24 h后，相比于未给药组与单给LCA或索拉非尼组，细胞活力显著下降，自噬水平降低，ROS显著升高，两者联合用药大幅提高了肝癌耐药细胞对索拉非尼的敏感性。
附图说明
图1显示CCK-8检测HepG2与HepG2-SR的IC50。
图2A显示CCK-8检测LCA（10μM）与索拉非尼（10 μM，15 μM，20 μM）联合应用对HepG2-SR细胞活力的影响。
图2B显示CCK-8检测LCA（10μM，15μM）与索拉非尼联合应用对HepG2-SR细胞活力的影响。
图3A至3B显示LCA（10μM）与索拉非尼（15μM）联合应用对HepG2-SR细胞中Beclin-1与P62表达的影响。
图4A显示共聚焦观察LCA（10μM）与索拉非尼（15μM）联合应用对HepG2-SR细胞中自噬体与溶酶体的影响。
图4B显示LCA（10μM）与索拉非尼（15μM）联合应用对HepG2-SR细胞中SANP29表达的影响。
图5显示LCA（10μM）与索拉非尼（15μM）联合应用对HepG2-SR细胞中ROS含量的影响。
图6A至6B显示LCA（10μM）与索拉非尼（15μM）联合应用对HepG2-SR细胞中BCL-2与BAX表达的影响。
图6C显示流式检测LCA（10μM）与索拉非尼（15μM）联合应用对HepG2-SR细胞凋亡的影响。
具体实施方式
实施例一：索拉非尼耐药肝癌细胞的建立
细胞来源：HepG2敏感细胞，购买自上海中国科学院细胞库。
HepG2敏感细胞在补充有12%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%丙酮酸钠和1%谷胱甘肽二肽的最低必需培养基（MEM）中培养（均购买自中国武汉普诺赛生物科技有限公司）。所有细胞均在37°C、湿度为5%（v/v）的CO2培养箱中培养。
药品来源：索拉非尼，购买自上海麦克林生化科技有限公司
HepG2细胞在索拉非尼浓度逐步增加的情况下培养，直到达到最大耐受剂量。HepG2敏感细胞与耐药肝癌细胞以每孔3×104个细胞铺96孔板，在37℃培养箱过夜，待细胞贴壁后，给予梯度浓度的索拉非尼刺激24 h，CCK-8检测细胞活力。
结果如图1所示，表明HepG2敏感细胞的IC50为7.025（6.65-7.41）μM，而HepG2耐药肝癌细胞（HepG2-SR）的IC50为39.29（36.28 - 42.29）μM，耐药指数达到了5.6，表明肝癌索拉非尼耐药细胞（HepG2-SR）成功建立。
实施例二：甘草查尔酮A（LCA）与索拉非尼联合用药提高肝癌耐药细胞对索拉非尼的敏感性实验
药品来源：甘草查尔酮A（LCA），购买自四川维克齐生物科技有限公司。
采用实施例一建立的HepG2-SR，以每孔3×104个细胞铺96孔板，在37℃培养箱过夜，待细胞贴壁后，给予10 μM LCA与10 μM，15 μM，20 μM索拉非尼刺激24 h，即LCA与索拉非尼的用量比为1:1，1:1.5，1:2，CCK-8检测细胞活力。
结果如图2A所示，分别单独以10 μM LCA、10 μM 索拉非尼、15 μM 索拉非尼给药后，HepG2-SR细胞活力在80%以上，基本没有什么杀伤力；以20 μM 索拉非尼给药后，HepG2-SR细胞活力略降为60%左右。而10 μM LCA分别与10 μM、15 μM、20 μM索拉非尼联用后，均对HepG2-SR细胞产生强大杀伤力，显著提高肝癌耐药细胞对索拉非尼的敏感性。因此，初步确定甘草查尔酮A与索拉菲尼的有效治疗剂量比例为1:1至1:2。
其中，当10 μM LCA与15 μM 索拉非尼联用时，这个用量比既保证了单药对耐药细胞基本没有杀伤力，又保证了联用后拥有足够的杀伤效果。因此，在后续实验中，选取10 μMLCA 与15 μM 索拉非尼联合用药，即优选LCA与索拉非尼的用量比例为1:1.5。
采用实施例一建立的HepG2-SR，以每孔3×104个细胞铺96孔板，在37℃培养箱过夜，待细胞贴壁后，给予固定浓度的LCA（10μM与15μM）与梯度浓度的索拉非尼刺激24 h，CCK-8检测细胞活力。
结果如图2B所示，HepG2-SR细胞的IC50为48.38（46.31-50.45）μM，与10μM的LCA联合时，IC50降至6.242（5.85-6.63）μM，与15μM的LCA联合时IC50降至2.305（2.16 - 2.45）μM，这表明LCA与索拉非尼联用可以显著提高肝癌耐药细胞的敏感性。
实施例三：LCA与索拉非尼联合用药抑制肝癌耐药细胞自噬
采用实施例一建立的HepG2-SR，铺6孔板，待细胞密度达到80%左右时，给予10μMLCA与15μM索拉非尼处理24 h后，用裂解液收集细胞进行全蛋白提取，而后按照BCA蛋白定量试剂盒（购自KeyGEN，江苏）说明书的操作方法对蛋白进行定量。蛋白在12％PAGE胶分离后转膜至PVDF膜上，应用P62抗体与Beclin-1抗体（购自Cell Signaling Technology）和β-actin抗体（购自Fude Biotechnology）孵育后，应用羊抗兔二抗（购自FudeBiotechnology）再次孵育，最终应用ECL技术发光成像。蛋白条带的结果是以Image J软件对胶片照片中各条带灰度值的计算与分析。
蛋白质印迹（western blot）结果如图3A所示，表明两药联合处理组P62表达显著增加，Beclin-1表达减少，肝癌耐药细胞自噬水平受到显著抑制。
采用实施例一建立的HepG2-SR铺6孔板，待细胞密度达到80%左右时，给予10μMLCA与15μM索拉非尼处理0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h后，用裂解液收集细胞进行全蛋白提取，而后按照BCA蛋白定量试剂盒（购自KeyGEN，江苏）说明书的操作方法对蛋白进行定量。蛋白在12％PAGE胶分离后转膜至PVDF膜上，应用P62抗体与Beclin-1抗体（购自CellSignaling Technology）和β-actin抗体（购自Fude Biotechnology）孵育后，应用羊抗兔二抗（购自Fude Biotechnology）再次孵育，最终应用ECL技术发光成像。蛋白条带的结果是以Image J软件对胶片照片中各条带灰度值的计算与分析。
蛋白质印迹（western blot）结果如图3B所示，表明两药联合处理后随给药时间的增加，P62表达随之增加，而Beclin-1随之表达减少，肝癌耐药细胞自噬水平受到显著抑制。
实施例四： LCA与索拉非尼联合用药抑制肝癌耐药细胞自噬体-溶酶体融合
采用实施例一建立的HepG2-SR，以每孔1×105个细胞铺共聚焦皿，在37℃培养箱过夜，待细胞贴壁后，每皿加入1×106pfu mCherry-eGFP标记的LC3B构建的重组腺病毒18h，然后换上正常培养基培养24 h，最后给予10μM LCA与15μM索拉非尼处理24 h，共聚焦下观察溶酶体与自噬小体的融合情况。
结果如图4A所示，发现LCA与索拉非尼联合处理可以阻滞溶酶体与自噬小体的融合，阻断自噬。
采用实施例一建立的HepG2-SR铺6孔板，待细胞密度达到80%左右时，给予10μMLCA与15μM索拉非尼处理24 h后，用裂解液收集细胞进行全蛋白提取，而后按照BCA蛋白定量试剂盒（购自KeyGEN，江苏）说明书的操作方法对蛋白进行定量。蛋白在12％PAGE胶分离后转膜至PVDF膜上，应用SANP29（一种调节自噬小体与溶酶体融合的功能蛋白）抗体（购自Huaan Biotechnology）和β-actin抗体（购自Fude Biotechnology）孵育后，应用羊抗兔二抗（购自Fude Biotechnology）再次孵育，最终应用ECL技术发光成像。蛋白条带的结果是以Image J软件对胶片照片中各条带灰度值的计算与分析。
蛋白质印迹（western blot）结果如图4B所示，表明两药联合处理组SANP29表达减少，表明耐药细胞溶酶体与自噬小体的融合受到阻滞。
实施例五：LCA与索拉非尼联合用药使肝癌耐药细胞ROS显著增加
采用实施例一建立的HepG2-SR以每孔1×105个细胞铺12孔板，在37℃培养箱过夜，待细胞贴壁后，给予10μM LCA与15μM索拉非尼处理24 h，使用ROS含量检测试剂盒（购自Beyotime Biotechnology，上海）进行检测，在尼康倒置显微镜下观察各组荧光的强度。荧光图片以Image J软件对照片中荧光强度进行计算与分析。
结果如图5所示，LCA与索拉非尼联合处理组相比于未给药组与单给LCA或索拉非尼组，ROS显著升高。
实施例六：LCA与索拉非尼联合用药诱导肝癌耐药细胞凋亡
采用实施例一建立的HepG2-SR铺6孔板，待细胞密度达到80%左右时，给予10μMLCA与15μM索拉非尼处理24 h后，用裂解液收集细胞进行全蛋白提取，而后按照BCA蛋白定量试剂盒（购自KeyGEN，江苏）说明书的操作方法对蛋白进行定量。蛋白在12％PAGE胶分离后转膜至PVDF膜上，应用BCL-2抗体（购自Huaan Biotechnology）、 BAX抗体（购自Proteintech）和β-actin抗体（购自Fude Biotechnology）孵育后，应用羊抗兔二抗（购自Fude Biotechnology）再次孵育，最终应用ECL技术发光成像。蛋白条带的结果是以Image J软件对胶片照片中各条带灰度值的计算与分析。
结果如图6A所示，LCA与索拉非尼联合处理的BAX/BCL-2值显著升高，表明两药联合用药诱导耐药细胞凋亡，提高耐药细胞对索拉非尼的敏感性。
采用实施例一建立的HepG2-SR铺6孔板，待细胞密度达到80%左右时，给予10μMLCA与15μM索拉非尼处理0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h后，用裂解液收集细胞进行全蛋白提取，而后按照BCA蛋白定量试剂盒（购自KeyGEN，江苏）说明书的操作方法对蛋白进行定量。蛋白在12％PAGE胶分离后转膜至PVDF膜上，应用BCL-2抗体（购自Huaan Biotechnology）、BAX抗体（购自Proteintech）和β-actin抗体（购自Fude Biotechnology）孵育后，应用羊抗兔二抗（购自Fude Biotechnology）再次孵育，最终应用ECL技术发光成像。蛋白条带的结果是以Image J软件对胶片照片中各条带灰度值的计算与分析。
结果如图6B所示，LCA与索拉非尼联合处理的BAX/BCL-2值随给药时间的增加而升高，表明两药联合用药诱导耐药细胞凋亡具有时间依赖性。
采用实施例一建立的HepG2-SR铺6孔板，待细胞密度达到80%左右时，给予10μMLCA与15μM索拉非尼处理24 h后，用无EDTA的胰酶消化并收获细胞，然后重悬在结合缓冲液中，并在室温下与Annexin V-FITC和PI在黑暗中孵育20分钟。对于每个样品，通过流式细胞仪器（购自DxFLEX，Beckman-Colter，苏州，中国江苏）检测到至少1×104个细胞。如图6C，LCA与索拉非尼联合处理的凋亡率最高，并且主要集中在早期凋亡，表明两药联合用药诱导耐药细胞凋亡，提高耐药细胞对索拉非尼的敏感性。
实施例七：本发明所述组合物的药物剂型的制备
可根据现有制药工艺，采用药学上可接受的辅料、辅助剂或载体，分别制备口服剂型的索拉非尼和甘草查尔酮A，然后联合用药。
根据本发明的实验数据，甘草查尔酮A与索拉菲尼的有效治疗剂量比例为1:1至1:2，优选为1:1.5。
索拉非尼是已批准上市的口服药物，目前药物剂型为口服剂型，包括固体片剂和溶液剂。
甘草查尔酮A作为原料药，通常以粉末形式销售，可以制备为口服剂型，包括固体片剂和溶液剂。
一个典型工艺是：将甘草查尔酮A粉末与颗粒内赋形剂混合，流化床造粒，研磨，并与颗粒外赋形剂共混，得到甘草查尔酮A的最终粉末混合物；片剂压缩以产生片芯；进行薄膜包衣以产生薄膜包衣的片剂；包装。
另一个典型工艺是：将甘草查尔酮A粉末与颗粒内赋形剂混合，干法造粒，研磨，并与颗粒外赋形剂共混，得到甘草查尔酮A的最终粉末混合物；片剂压缩以产生片芯；进行薄膜包衣以产生薄膜包衣的片剂；包装。
Claims (6)
1.一种用于治疗索拉非尼耐药肝细胞癌的组合物，其特征在于，包括：有效治疗剂量的甘草查尔酮A和索拉非尼。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述甘草查尔酮A与索拉菲尼的有效治疗剂量比例为1:1至1:2。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述甘草查尔酮A与索拉菲尼的有效治疗剂量比例为1:1.5。
4.含有甘草查尔酮A和索拉非尼的组合物在制备治疗索拉非尼耐药肝细胞癌的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：将含有甘草查尔酮A和索拉非尼的组合物作为有效成分用于制备口服剂型。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的口服剂型为固体片剂或溶液剂。
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