CN113461675B - 一种针对skp2的小分子抑制剂tak-491及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子靶向治疗领域，具体涉及SKP2蛋白(S‑phase kinase‑associated protein 2)的小分子抑制剂TAK‑491及其在抑制和杀伤胃癌细胞中的应用。一种针对SKP2的小分子抑制剂TAK‑491，该小分子抑制剂TAK‑491的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。所述小分子抑制剂可抑制SKP2蛋白进抑制胃癌细胞增殖。所述小分子抑制剂在制备治疗胃癌药物中的应用。本发明提供的SKP2的小分子抑制剂与已知抑制剂相比，亲和力强，可作为一种新的抗肿瘤药物来彻底清除肿瘤和干细胞，具有广泛的应用前景。

Description

一种针对SKP2的小分子抑制剂TAK-491及其应用
技术领域
本发明属于分子治疗领域，具体涉及SKP2蛋白(S-phase kinase-associatedprotein 2 )的小分子抑制剂TAK-491及其在抑制和杀伤胃癌等中的应用。
背景技术
癌症是21世纪严重威胁人类健康的疾病之一。恶性肿瘤是死亡率最高的疾病。据统计，世界上每四个人中就有一人具有患癌症的风险。目前，世界上癌症患者的数量逐年增加，并有年轻化趋势。全球癌症发病及死亡率继续增长的趋势预示,癌症将成为人类的第一杀手，已构成对公共卫生的巨大挑战。改善癌症患者的预后情况是提高病人生存率的关键因素。肿瘤的产生是一个多种机制共同参与的过程，多种蛋白发生了异常的表达。所以针对癌症的靶点进行药物研究与开发是急需解决的问题。
泛素-蛋白酶体系是蛋白降解的途径之一，选择性降解特意靶蛋白。泛素-蛋白酶体不仅降解蛋白，还能参与细胞增殖和细胞周期等生物过程的调控。此外，泛素途径还调控多种细胞过程，如细胞自噬、凋亡、信号转导、受体内吞控制、抗原处理、降解抗病毒蛋白以及病毒的增殖过程。细胞内泛素-蛋白酶体通路是由泛素激活酶E1、泛素结合酶E1和泛素连接酶E3和26S蛋白酶复合物组成，蛋白泛素化降解分两步完成，先是由E1-E2-E3构成的级联反应泛素化修饰底物蛋白，后由proteasome降解。目前发现泛素化调节蛋白质降解在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。
其中，SKP2(S-phase kinase-associated protein 2)是F-box蛋白家族中的一员，在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌以及淋巴瘤均有异常高的表达，有癌基因的特征。SKP2作为泛素-蛋白酶体通路中E3连接酶-SCF复合物的底物识别亚基来行使功能的。由于SKP2介导了细胞增值的许多负性调控因子（如p27、p21、p53和p57等）的泛素化降解，上调的SKP2与癌细胞的快速生长和永生化有关。
TAK-491（又名阿齐沙坦酯，Azilsartan Medoxomil）是一个有效的血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂，它能阻止血管收缩和血管紧张素Ⅱ。阿齐沙坦酯现成为应用比例上升最快的药物，是因为该药物的有效性和良好的安全性，耐受性好，不良反应少。现阶段针对SKP2没有已上市的小分子抑制剂药物。薯蓣皂苷（Dioscin）是一种天然甾体皂苷类化合物，其在薯蓣科植物的根茎中含量高，薯蓣具有祛痰、消食利水、舒筋活血、截疟等功效，具有改善心血管功能、护肝、调节机体免疫能力、抗血小板聚集、降血脂等多种药理作用。有研究证实Dioscin能结合SKP2蛋白上，抑制了SKP2的表达水平，促进SKP2的泛素化。然而，使用Dioscin作为SKP2的抑制剂存在一些缺点：Dioscin对SKP2的亲和力较低，在微摩尔水平；Dioscin对SKP2特异性不强。针对这些方面，需要发展其他抑制剂以提高对SKP2的亲和力。
因此，针对SKP2靶点进行小分子抑制剂进行开发研究成为目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对SKP2的小分子抑制剂 TAK-491及其应用，该分子抑制剂对SKP2有较好的抑制作用，对用于治疗胃癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌等癌症有一定的作用。本发明通过高通量药物筛选，筛选出针对SKP2的新型小分子抑制剂TAK-491。通过CCK8实验检测SKP2新型抑制剂对胃癌细胞的IC50值，通过平板克隆形成实验检测SKP2新型抑制剂对胃癌细胞的抑制作用，细胞形态学验证TAK-491促进胃癌细胞焦亡，通过Westernblot确定该有效的化合物是针对SKP2靶点促进胃癌细胞焦亡，进而有继续研究针对SKP2的小分子抑制剂的价值与意义。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种针对SKP2的小分子抑制剂TAK-491，该小分子抑制剂TAK-491的化学结构式如下：
。
进一步地，所述小分子抑制剂可抑制SKP2蛋白进抑制肿瘤细胞增殖用。
进一步地，所述肿瘤细胞为胃癌细胞。
进一步地，所述小分子抑制剂在制备治疗胃癌药物中的应用。
进一步地，该药物为任何药物治疗学上可接受的剂型。
进一步地，该药物为任何药物治疗学上可接受的的剂量。
本发明有益效果如下。
本发明的小分子抑制剂可用于抑制SKP2，具有较高的选择特异性，针对性强，与已知的SKP2抑制剂Dioscin相比IC50较小，证明亲和力更强。
附图说明
图1为小分子抑制剂TAK-491与人源SKP2蛋白的结合模型示意图以及结合能评分。
图2为小分子抑制剂TAK-491对胃癌细胞HGC-27的杀伤作用及IC50值。
图3为小分子抑制剂TAK-491对胃癌细胞HGC-27的抑制增殖作用。
图4为小分子抑制剂TAK-491对SKP2蛋白的作用。
图5为小分子抑制剂TAK-491抑制SKP2蛋白使胃癌细胞HGC-27发生焦亡。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例详细说明了本发明，但不用于限制本发明的范围。本实施例采用常规实验技术，这些均是本技术领域人员所熟悉的，可以按照本实施例使用材料厂商所提供的说明书即可进行。
实施例
1.实验材料。
1.1细胞系。
人胃癌细胞系HGC-27。
1.2 实验试剂。
RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清，0.5%结晶紫，CCK8试剂。
2.实验方法。
2.1 MOE软件进行药物筛选。
首先在PDB库中获得SKP2蛋白的具体结构（2ass）,结构优化后进行分子对接，最后筛选出评分较好的TAK-491(selleck公司，批次号：S305702)。
2.2 细胞增殖CCK8实验。
Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8 （2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐））。WST-8可被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。本实验中，取对数生长期的胃癌细胞HGC-27细胞接以4×103个细胞/孔的密度接种到96孔板上。然后，用不同浓度的TAK-491处理细胞24小时，随后换新鲜培养液100 µl后，每孔分别加入10 µl CCK8（DojindoMolecular Technologies Inc.，Japan）处理1小时。 使用多模式读取酶标仪（LD942，北京，中国）测量450nm处的吸光度。每组设6个复孔，control组加入等量的培养基，同时设置不含细胞和待测物质的空白孔。细胞存活率=（实验孔OD值-空白孔OD值）/（control组OD值-空白孔OD值）× 100%。
2.3细胞平板克隆形成实验。
用1× PBS缓冲液小心清洗对数生长期的HGC-27细胞株三次，用适量胰酶消化细胞，用计数板计数，用培养基将细胞稀释到500个/每组。将500个细胞加入到含有2mL培养基，充分混匀后，加入到六孔板中，且加入终浓度为0.4μM的TAK-491，保持平衡将细胞放置到细胞培养箱中培养。持续培养7天后观察细胞集落形成情况并换液，即用1× PBS缓冲液小心清洗三次后，重新加入相应的新鲜培养基继续培养，14天后取出培养皿。移除培养基，1× PBS缓冲液小心清洗2次，用4%的多聚甲醛固定20min。再用1× PBS缓冲液小心清洗两次，加入苏木素覆盖细胞，染色30min。最后用1× PBS缓冲液小心清洗两次后可以观察细胞集落形成情况并成像用于后期统计观察。
2.4 细胞转染以及Western Blot。
根据细胞生长速度选择合适的密度进行铺大皿。转染前细胞汇合达到70-80%，转染2天后汇合度90%左右。培养基中不含有抗生素。SKP2质粒3000g离心，杂菌被离心到下层，用时取上清（或用75%的乙醇沉淀细菌）。配制转染以1mL体系为例：500μL无血清培养基+lipo2μL，轻轻混匀，室温放置5min。500μL无血清培养基+质粒2000ng，轻轻混匀，室温放置5min。将两个管合并，混匀，放置20min，转染试剂配制完成。吸走原培养基，用1× PBS洗两遍，加入配好的转染试剂，来回轻柔摇晃细胞培养板。将培养好的细胞加入400nM的TAK-491，培养24h后，提取蛋白，蛋白定量后，进行蛋白变性，配胶，上样后，进行电泳，转膜，封闭和一抗二抗孵育，最后进行化学发光。
2.5 细胞形态学观察。
将终浓度为0.4μM的TAK-491加入胃癌细胞HGC-27中，培养24h后利用显微镜进行形态学拍照。
图1 表明本发明的小分子抑制剂TAK-491与SKP2蛋白的结合情况、位点以及结合能为-6.3026kcal/mol。图2表明TAK-491对胃癌细胞HGC-27的抑制作用，随着TAK-491浓度的升高，细胞抑制率增加，且TAK-491的IC50为399.1nM。图3表明终浓度0.4μM的TAK-491对胃癌细胞HGC-27的抑制情况。图4表明添加终浓度为0.4μM的TAK-491后促进胃癌细胞HGC-27的焦亡。图5初步表明TAK-491通过抑制SKP2蛋白使胃癌细胞HGC-27发生焦亡。

Claims (3)

1.一种小分子抑制剂TAK-491在制备抑制SKP2的表达水平进而治疗胃癌的药物中的应用，其特征在于，所述应用的作用方式为小分子抑制剂TAK-491通过抑制SKP2的表达水平进而抑制胃癌细胞增殖；所述小分子抑制剂TAK-491的化学结构式如下：
。
2.如权利1所述的应用，其特征在于，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂型。
3.如权利1所述的应用，其特征在于，所述药物为任何药物治疗学上可接受的的剂量。
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