CN117030401A - 尿液样本保存剂及其在保存尿液中的应用 - Google Patents

尿液样本保存剂及其在保存尿液中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了尿液样本保存剂及其在保存尿液中的应用，所述尿液样本保存剂包括下列至少之一：焦炭酸二乙酯、异硫氰酸胍、β‑巯基乙醇、咪唑烷基脲、重氮烷基脲、柠檬酸、柠檬酸钠、L‑赖氨酸、乙二胺和叠氮化钠。利用本发明的尿液样本保存剂可以有效保存尿液样本中脱落细胞、游离DNA、外泌体、蛋白质、小分子代谢物、好氧微生物等成分长达7天，便于尿液的保存和运输。

Description

尿液样本保存剂及其在保存尿液中的应用
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及尿液样本保存剂及其在保存尿液中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是世界公共卫生中还未攻克的主要难题，有效的治疗手段还非常有限。临床上对于肿瘤的诊断，通常依靠组织活检，需要非常专业的临床医生取材处理，操作难度大。液体活检作为一种全新的手段，在样本取材上明显不同，不仅可针对血液，也可以选取唾液、胸腔积液、尿液等体液。液体活检避免了手术开刀和穿刺对患者造成的伤害，在安全性上具有较大优越性，操作难度也明显较低，简便易行。该技术对肿瘤诊断、治疗、预后等具有全程监控的作用，实时性和时效性较强。
目前液体活检领域的手段主要包括ctDNA、CTC、外泌体以及细胞外游离核酸(RNA和DNA)。尿液作为人体排出的液体废物，浓缩富集了大量人体所需要排出的物质，同时会接纳由于泌尿系统病变所释放排出的物质成分，可以较全面地反映供体的生理病理情况。同时，尿液量大，收集简单，可重复收集，与血液、血清、恶性积液、脑脊液相比具有无创性等多种优点。
但是，尿液具有带菌、高盐、组成复杂且不固定、受供体身体状态影响较大等特点，使其所含的生物标志物在常见保存状态下难以保存，容易降解灭失，尤其是外泌体、游离DNA、蛋白质、小分子代谢物等组分，同时微生物相关的生物标志物由于微生物大量滋生，也会出现不稳定的特点，如细菌DNA可能增多。在尿液中具有筛查、诊断价值但降解较快。另外，同时存在提取及后续分析不便等问题。现阶段已有的技术方案，往往只能保存尿液中某种或少量生物标志物，难以满足尿液成分全面检测的目的。
因此，目前保存尿液的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了尿液样本保存剂和尿液保存试剂盒及其应用及保存尿液的方法，利用本发明的尿液样本保存剂可以有效保存尿液样本中脱落细胞、游离DNA、外泌体、蛋白质、小分子代谢物、好氧微生物等成分长达7天，便于尿液的保存和运输。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种尿液样本保存剂。根据本发明的实施例，所述尿液样本保存剂包括下列至少之一：焦炭酸二乙酯、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇、咪唑烷基脲、重氮烷基脲、柠檬酸、柠檬酸钠、L-赖氨酸、乙二胺和叠氮化钠。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种尿液保存试剂盒。根据本发明的实施例，所述尿液保存试剂盒包括：前面所述尿液样本保存剂。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述尿液样本保存剂或尿液保存试剂盒在保存尿液中的应用。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种保存尿液的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将尿液与前面所述尿液样本保存剂接触。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种使尿液在保存3～7天后IL-8含量降幅不超过10％、和/或基因组DNA含量降幅不超过20％、和/或游离DNA含量降幅不超过20％、和/或外泌体表面蛋白CD63含量降幅不超过10％、和/或尿液蛋白质含量降幅不超过15％、和/或β-羟丁酸含量降幅不超过10％的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将尿液与前面所述尿液样本保存剂接触。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明提出了尿液样本保存剂、尿液保存试剂盒、尿液样本保存剂或尿液保存试剂盒在保存尿液中的应用、保存尿液的方法和使尿液在保存3～7天后IL-8含量降幅不超过10％、和/或基因组DNA含量降幅不超过20％、和/或游离DNA含量降幅不超过20％、和/或外泌体表面蛋白CD63含量降幅不超过10％、和/或尿液蛋白质含量降幅不超过15％、和/或β-羟丁酸含量降幅不超过10％的方法，下面将分别对其进行详细描述。
尿液样本保存剂
在本发明的一个方面，本发明提出了一种尿液样本保存剂。根据本发明的实施例，尿液样本保存剂包括下列至少之一：焦炭酸二乙酯、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇、咪唑烷基脲、重氮烷基脲、柠檬酸、柠檬酸钠、L-赖氨酸、乙二胺和叠氮化钠。
本发明的发明人基于尿液组成特性，对其与众多试剂的作用进行研究，发现采用焦炭酸二乙酯、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇、咪唑烷基脲、重氮烷基脲、柠檬酸、柠檬酸钠、L-赖氨酸、乙二胺和叠氮化钠可以有效地保存尿液样本中脱落细胞、游离DNA、外泌体、蛋白质、小分子代谢物、好氧微生物等成分长达7天。
根据本发明实施例的尿液样本保存剂中，叠氮化钠主要发挥维持尿液中代谢物稳定的作用。具体地，由于叠氮化钠有还原性，发明人通过将其与β-巯基乙醇配合使用，以共同保持体系的还原态，防止体系常温运输保存时接触空气中的氧气导致尿液样本中β-羟基丁酸、脲、蛋白质、细胞结构等氧化损耗。同时，β-巯基乙醇也可以发挥抑制RNA酶活性的作用。由于尿液排出后处于与空气接触的环境，其中多种活细胞与菌进行有氧呼吸，发生氧化磷酸化，将改变尿液中琥珀酸等相关物质的组成与含量。发明人利用叠氮化钠具有抑制细胞呼吸相关酶的特性，阻止氧化磷酸化相关化学反应，排除干扰。另外，叠氮化钠可以抑制细菌增殖，防止细菌增殖对尿液检测成分的影响。
焦炭酸二乙酯用于去除体系中含有的RNA；异硫氰酸胍用于变性并稳定蛋白质组分；咪唑烷基脲和重氮烷基脲用于细胞固定；柠檬酸钠用于螯合尿液中的金属离子以防止尿液结晶；柠檬酸调节pH值；L-赖氨酸作为氨基酸表面活性剂用于缓冲；乙二胺用于抑制尿液DNA酶活性同时进一步阻止结晶；叠氮化钠用于维持尿液代谢组化合物稳定。
在一些实施例中，尿液样本保存剂包括：焦炭酸二乙酯、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇、咪唑烷基脲、重氮烷基脲、柠檬酸、柠檬酸钠、L-赖氨酸、乙二胺和叠氮化钠。
根据本发明的实施例，基于尿液样本保存剂的总重量，异硫氰酸胍的浓度为1～5质量％，咪唑烷基脲的浓度为0.1～5质量％，重氮烷基脲的浓度为0.1～5质量％，β-巯基乙醇的浓度为1～10质量％，柠檬酸钠的浓度为0.1～5质量％，L-赖氨酸的浓度为1～10质量‰，乙二胺的浓度为5～15质量％，叠氮化钠的浓度为0.1～5质量‰。
在一些实施例中，异硫氰酸胍的浓度为1质量％、1.5质量％、2质量％、2.5质量％、3质量％、3.5质量％、4质量％、4.5质量％、5质量％；咪唑烷基脲的浓度为0.5质量％、1质量％、1.5质量％、2质量％、2.5质量％、3质量％、3.5质量％、4质量％、4.5质量％；重氮烷基脲的浓度为0.3质量％、0.4质量％、0.5质量％、0.6质量％、0.7质量％；β-巯基乙醇的浓度为3.5质量％、4质量％、4.5质量％、5质量％、5.5质量％、6质量％、6.5质量％；柠檬酸钠的浓度为0.3质量％、0.4质量％、0.5质量％、0.6质量％、0.7质量％；L-赖氨酸的浓度为3.5质量‰、4质量‰、4.5质量‰、5质量‰、5.5质量‰、6质量‰、6.5质量‰；乙二胺的浓度为8.5质量％、9质量％、9.5质量％、10质量％、10.5质量％、11质量％、11.5质量％；叠氮化钠的浓度为0.85质量‰、0.9质量‰、0.95质量‰、1质量‰、1.05质量‰、1.1质量‰、1.15质量‰。
在一些优选实施例中，基于尿液样本保存剂的总重量，异硫氰酸胍的浓度为1.2～1.8质量％，咪唑烷基脲的浓度为0.5～1质量％，重氮烷基脲的浓度为0.2～0.8质量％，β-巯基乙醇的浓度为3～7质量％，柠檬酸钠的浓度为0.2～0.8质量％，L-赖氨酸的浓度为3～7质量‰，乙二胺的浓度为8～12质量％，叠氮化钠的浓度为0.8～1.2质量‰。在另一些优选实施例中，基于尿液样本保存剂的总重量，异硫氰酸胍的浓度为1.5质量％，咪唑烷基脲的浓度为0.75质量％，重氮烷基脲的浓度为0.5质量％，β-巯基乙醇的浓度为5质量％，柠檬酸钠的浓度为0.516质量％，L-赖氨酸的浓度为5质量‰，乙二胺的浓度为10质量％，叠氮化钠的浓度为1质量‰。
发明人经过大量实验得到上述尿液样本保存剂中各组分的较优浓度，由此，可以进一步有效地避免尿液中成分损失，延长保存期。
根据本发明的实施例，尿液样本保存剂中进一步含有水。
根据本发明的实施例，尿液样本保存剂的pH值为6～6.5，在一些实施例中，pH值为6.1、6.2、6.3、6.4，优选6.2。由此，可以进一步有效地避免尿液中成分损失，延长保存期。具体地，可以通过改变尿液样本保存剂中柠檬酸的添加量，以调整体系pH值。
尿液保存试剂盒
在本发明的另一方面，本发明提出了一种尿液保存试剂盒。根据本发明的实施例，尿液保存试剂盒包括：前面所述尿液样本保存剂。由此，利用该尿液保存试剂盒可以有效地保存尿液样本中脱落细胞、游离DNA、外泌体、蛋白质、小分子代谢物、好氧微生物等成分长达7天，便于尿液的保存和运输。
根据本发明的实施例，尿液保存试剂盒中进一步包括：尿液保存容器，尿液保存容器中装有前面所述尿液样本保存剂。
在本发明中，术语“尿液保存容器”是指可以盛放尿液样本保存剂的容器，对于其材质和形状不做严格限定，只要不干扰尿液成分即可。例如，尿液保存容器的材质可以为聚苯乙烯、聚氯乙烯等，形状可以为管状、盒状等，可以根据实际情况灵活选择。
需要说明的是，前面针对尿液样本保存剂所描述的特征和优点，同样适用于该尿液保存试剂盒，在此不再赘述。
应用
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述尿液样本保存剂或尿液保存试剂盒在保存尿液中的应用。如前所述，利用根据本发明实施例的尿液样本保存剂或尿液保存试剂盒可以有效地保存尿液样本中脱落细胞、游离DNA、外泌体、蛋白质、小分子代谢物、好氧微生物等成分长达7天。
需要说明的是，前面针对尿液样本保存剂和尿液保存试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该尿液保存试剂盒，在此不再赘述。
方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种保存尿液的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将尿液与前面所述尿液样本保存剂接触。由此，通过将尿液与尿液样本保存剂接触，可以有效地保存尿液样本中脱落细胞、游离DNA、外泌体、蛋白质、小分子代谢物、好氧微生物等成分长达7天。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种使尿液在保存3～7天后IL-8含量降幅不超过10％、和/或基因组DNA含量降幅不超过20％、和/或游离DNA含量降幅不超过20％、和/或外泌体表面蛋白CD63含量降幅不超过10％、和/或尿液蛋白质含量降幅不超过15％、和/或β-羟丁酸含量降幅不超过10％的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将尿液与前面所述尿液样本保存剂接触。
发明人发现，将尿液与前面所述尿液样本保存剂接触后，所得溶液在保存3～7天后，其中的众多成分均鲜少损失，由此表明尿液样本保存剂有助于更好地保护尿液成分。
根据本发明的实施例，所述接触包括将尿液与尿液样本保存剂混合，由此，以便使尿液均匀分散于尿液样本保存剂中，更好地保护其中的成分。
需要说明的是，前面针对尿液样本保存剂所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中，按照下列方法制备尿液样本保存剂：
1、组成
表1尿液样本保存剂组成
成分 质量分数
异硫氰酸胍 1.5％
咪唑烷基脲 0.75％
重氮烷基脲 0.5％
β-巯基乙醇 5％
柠檬酸钠 0.516％
L-赖氨酸 5‰
乙二胺 10％
叠氮化钠 1‰
2、步骤
将表1中的各成分溶解于焦炭酸二乙酯(DEPC)处理水中，用柠檬酸调节pH值至6.2，得到尿液样本保存剂。
实施例2
采取10例健康人尿液样本。采集后立即混匀，每例平均分为A、B、C三份。其中A样本10例置于实施例1配置的尿液样本保存剂中保存3天，B样本10例置于实施例1配置的尿液样本保存剂中保存7天，C样本10例于取样当日直接进行后续处理。将保存/未保存的溶液于1600g离心10min，取尿沉渣，加入100μL PBS缓冲液(Thermo Fisher，20012027)匀浆后，将匀浆液和尿液上清进行如下检测：
1、取匀浆液50μL使用人IL-8Elisa试剂盒(Thermo Fisher，KHC0081)进行检测，通过人白细胞介素对尿沉渣中尿路上皮细胞进行表征。
2、取匀浆液50μL使用基因组DNA提取试剂盒进行提取，采用qubit 4.0(thermoFisher)测定基因组DNA得率。
3、取尿液上清2mL，使用游离DNA提取试剂盒(Qiagen 55114)进行游离DNA提取，采用qubit 4.0(thermo Fisher)测定游离DNA得率。
4、采用离心后的尿沉渣提取后的基因组DNA，采用Agilent 4200genomic DNAassay测定基因组DNA完整性，以DIN值表征。
5、采用离心后的尿液上清提取后的游离DNA，采用Agilent 4200D1000 assay测定游离DNA片段。
6、取尿液上清5mL，加入聚乙二醇沉淀剂，孵育后16000g离心20min，将沉淀重悬于PBS缓冲液(Thermo Fisher，20012027)后使用人CD63 Elisa试剂盒(Thermo Fisher，EH95RB)进行检测，通过外泌体表面蛋白CD63表征外泌体。
7、取尿液上清500μL，使用双缩脲比色法测定尿液蛋白质含量。
8、取尿液上清500μL，采用β-羟基丁酸检测试剂盒(Abcam Ab83390)测定β-羟基丁酸含量。
9、取未离心尿液样本600μL，匀浆后采用微生物DNA提取试剂盒(Qiagen 51804)提取后使用表皮葡萄球菌探针法荧光定量PCR试剂盒(上海信裕生物，XY932120P15)检测表皮葡萄球菌保存量。
结果如表2所示，可以看出，相同样本按照本发明的尿液样本保存剂保存3天、7天各项提取效果均无显著差异，且均符合相应样本质控要求以及正常人样本标准范围。具体地，IL-8与CD63均未明显下降，且cfDNA未出现大片段污染，即脱落细胞与外泌体结构均得到较好保持；基因组DNA质控标准DIN值未显著下降，即基因组DNA在尿液样本中未出现明显降解。表皮葡萄球菌为栖息于人体表皮的常见需氧菌，其ct值在3天与7天变化不大，即其在所保存尿液样本中能被较好的保存且未大量繁殖。
表2未保存、保存3天和7天后检测结果
注：降幅/％＝(保存后的参数值-未保存的相应参数值)×100％/未保存的相应参数值
DIN值为查表所得，无计算意义；Ct值为对数，没有直接对比降幅的意义。
实施例3
在该实施例中，按照实施例1的方法制备尿液样本保存剂A、B、C、D、E、F、G、H、I，区别在于，A将尿液样本保存剂中的异硫氰酸胍替换为盐酸胍；B的异硫氰酸胍质量分数为2％；C的异硫氰酸胍质量分数为1％；D的β-巯基乙醇替换为二硫苏糖醇；E的柠檬酸钠-柠檬酸pH调节体系换成磷酸钠-磷酸；F的pH值为6.6，G的pH值为5.8，H的L-赖氨酸替换为甘氨酸，I的乙二胺替换为硫脲。
收集三个不同尿液样本，每个尿液样本分为27例，其中9例尿液样本置于尿液样本保存剂A-I中保存1天，9例尿液样本置于尿液样本保存剂A-I中保存3天，9例尿液样本置于尿液样本保存剂A-I中保存7天。将保存的溶液于1600g离心10min，取尿沉渣，加入100μLPBS缓冲液(Thermo Fisher，20012027)匀浆后，将匀浆液和尿液上清进行检测，具体参见实施例2。
结果如表3所示，可以看出，利用保存剂A-I对尿液的保存效果不佳，IL-8和gDNA含量显著降低，cfDNA含量显著升高，gDNA完整性降低，容易出现cfDNA大片段污染。
表3保存1、3和7天后检测结果
实施例4
在该实施例中，按照实施例1的方法制备尿液样本保存剂，区别在于，将叠氮化钠的浓度改为0.5‰。
将制备的尿液样本保存剂与实施例2的尿液样本保存1、3、7天，采用实施例2的方法对保存后的溶液进行检测。
结果如下表4所示，尿液样本保存剂中叠氮化钠浓度过少，尿液保存效果不佳，相比而言，叠氮化钠浓度为1‰，保存效果较优。
表4对比例2检测结果
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例2或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种尿液样本保存剂，其特征在于，包括下列至少之一：焦炭酸二乙酯、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇、咪唑烷基脲、重氮烷基脲、柠檬酸、柠檬酸钠、L-赖氨酸、乙二胺和叠氮化钠。
2.根据权利要求1所述的尿液样本保存剂，其特征在于，基于所述尿液样本保存剂的总重量，异硫氰酸胍的浓度为1～5质量％，咪唑烷基脲的浓度为0.1～5质量％，重氮烷基脲的浓度为0.1～5质量％，β-巯基乙醇的浓度为1～10质量％，柠檬酸钠的浓度为0.1～5质量％，L-赖氨酸的浓度为1～10质量‰，乙二胺的浓度为5～15质量％，叠氮化钠的浓度为0.1～5质量‰。
3.根据权利要求1所述的尿液样本保存剂，其特征在于，基于所述尿液样本保存剂的总重量，异硫氰酸胍的浓度为1.2～1.8质量％，咪唑烷基脲的浓度为0.5～1质量％，重氮烷基脲的浓度为0.2～0.8质量％，β-巯基乙醇的浓度为3～7质量％，柠檬酸钠的浓度为0.2～0.8质量％，L-赖氨酸的浓度为3～7质量‰，乙二胺的浓度为8～12质量％，叠氮化钠的浓度为0.8～1.2质量‰。
4.根据权利要求1所述的尿液样本保存剂，其特征在于，基于所述尿液样本保存剂的总重量，异硫氰酸胍的浓度为1.5质量％，咪唑烷基脲的浓度为0.75质量％，重氮烷基脲的浓度为0.5质量％，β-巯基乙醇的浓度为5质量％，柠檬酸钠的浓度为0.516质量％，L-赖氨酸的浓度为5质量‰，乙二胺的浓度为10质量％，叠氮化钠的浓度为1质量‰。
5.根据权利要求1所述的尿液样本保存剂，其特征在于，所述尿液样本保存剂的pH值为6～6.5，优选6.2。
6.一种尿液保存试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1～5任一项所述尿液样本保存剂。
7.权利要求1～5任一项所述尿液样本保存剂或权利要求6所述尿液保存试剂盒在保存尿液中的应用。
8.一种保存尿液的方法，其特征在于，包括：将尿液与权利要求1～5任一项所述尿液样本保存剂接触。
9.一种使尿液在保存3～7天后IL-8含量降幅不超过10％、和/或基因组DNA含量降幅不超过20％、和/或游离DNA含量降幅不超过20％、和/或外泌体表面蛋白CD63含量降幅不超过10％、和/或尿液蛋白质含量降幅不超过15％、和/或β-羟丁酸含量降幅不超过10％的方法，其特征在于，包括：将尿液与权利要求1～5任一项所述尿液样本保存剂接触。
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