CN117024604A - 一种重组生物防御融合蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本披露提供一种重组蛋白，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:2所示序列具有≥99％的序列同一性，并且在特定位置含有特定的氨基酸突变。所述重组蛋白具有较高的抗菌和抗病毒活性，具有良好的应用前景。本披露还提供了含编码所述蛋白的核酸序列的载体、宿主细胞，以及含所述重组蛋白或载体的医疗器械或药物。所述医疗器械包括：创伤敷料、抑菌敷料、抗人乳头瘤病毒(HPV)敷料、阴道敷料、宫颈敷料、阴茎润滑组合物、消毒液、洗液、口腔护理膏、阴道栓。
Description
技术领域
本披露涉及生物化工技术领域，具体涉及一种重组蛋白及其应用。
背景技术
乳铁蛋白(lactoferrin)是一种存在于乳制品和人体分泌物中的蛋白质。乳铁蛋白作为天然生物防御因子或生物防御素，具有多种生物学活性，包括抗菌和抗病毒作用。
乳铁蛋白通过多种机制发挥其抗菌和抗病毒的作用。包括络合铁离子、与细菌细胞膜上的脂蛋白相互作用、以及与细菌和病毒的DNA结合等；从而阻止细菌和病毒的繁殖和生存。
但是，乳铁蛋白的天然产量很低，同时仍期望乳铁蛋白的抗菌和抗病毒活性能有所提高。目前对于通过改造乳铁蛋白并人工生物合成，获得更高活性和更高产量存在迫切的需求。
发明内容
已知乳铁蛋白(lactoferrin)是一种广泛存在于乳制品和人体分泌物中的蛋白质。乳铁蛋白具有多种生物学活性，包括抗菌和抗病毒作用，其通过多种机制发挥其活性。
发明人对牛乳铁蛋白(SEQ ID NO:1)的截短体(N-端叶第1-332aa)做肽段突变分析，筛选了多个突变位点，其中包括三个结构稳定性潜在较优的突变体，分别是Q199R、L161P、P147R，其中Q199和P147位点处于DNA结合功能区；Q199R和P147R突变导致分子柔性下降，L161P突变导致分子柔性提高。
实验测试发现，P147R和L161P突变体的抗菌、抗病毒活性优于Q199R突变体。不受理论束缚地，发明人推测P147位残基突变成精氨酸后，有可能增强了与细菌或病毒的蛋白和核酸的结合，进而增强了对细菌和病毒的抑制作用。
发明人随后同时引入P147R和L161P突变，然后与促穿膜域、促愈合域、促折叠域融合，得到重组乳铁蛋白(SEQ ID NO:2)。融合促穿膜域的目的在于提高蛋白在细胞膜上的锚定与穿透功能，可能有潜力促进乳铁蛋白生物防御功能肽段破坏细菌或者病毒的包膜，一方面物理穿孔，破坏细菌病毒膜结构，一方面乳铁蛋白肽段与膜内的细菌或病毒核酸或蛋白通过电荷吸附物理结合，诱导核酸或蛋白的空间变构，阻断其正常生物学功能，从而抑制细菌或病毒的增殖。另外尝试通过促折叠域提高蛋白正确折叠与可溶性，增强蛋白产量和溶解度。而实验测试表明，双点突变体重组蛋白(SEQ ID NO:10)具有较强的抗菌和抗病毒活性，重组乳铁蛋白的抗菌、抗病毒活性相比牛乳铁蛋白截短体的单点突变体和双点突变体都进一步增强，且强于牛乳铁素。
因此，在本披露的第一方面，提供一种重组蛋白，其特征在于，
a.所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示序列具有≥99％的序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:10所示序列的第157位为残基R，在对应于SEQ ID NO:10所示序列的第171位为残基P；
或者
b.所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示序列具有≥99％的序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:2所示序列的第327位为残基R，在对应于SEQ ID NO:2所示序列的第341位为残基P。
在一些实施方案中，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
在一些实施方案中，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
在本披露的第二方面，提供一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如第一方面所述的蛋白。
在一些实施方案中，所述编码序列经过了密码子优化。
在一些实施方案中，所述密码子优化用于在真核或原核细胞中表达。
在一些实施方案中，所述原核细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
在一些实施方案中，所述真核细胞为毕赤酵母、酿酒酵母或动物细胞。
在本披露的第三方面，提供一种载体，其特征在于，所述载体包含编码如第一方面所述的蛋白的核苷酸序列，以及与所述核苷酸序列可操作地连接的调控序列。
在一些实施方案中，所述调控序列为启动子和/或增强子序列，所述调控序列用于调控所述编码序列的表达。
在一些实施方案中，所述载体为质粒。
在本披露的第四方面，提供一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如第三方面所述的载体。
所述宿主细胞是指已引入所述载体的细胞，包括此类细胞的后代。
在一些实施方案中，所述载体为质粒。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
在一些实施方案中，所述原核细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
在一些实施方案中，所述真核细胞为毕赤酵母、酿酒酵母或动物细胞。
在本披露的第五方面，提供一种制备如第一方面所述蛋白的方法，其包含下述步骤：将如第四方面中任一项所述的宿主细胞的载体进行表达，然后进行分离纯化得到。
在一些实施方案中，所述表达为组成表达和/或诱导表达。
在本披露的第六方面，提供一种医疗器械，其特征在于，所述医疗器械包含如第一方面所述的蛋白、如第二方面所述的核酸分子、如第三方面所述的载体或如第四方面所述的宿主细胞。
在一些实施方案中，所述医疗器械任选自：创伤敷料、抑菌敷料、抗人乳头瘤病毒敷料、阴道敷料、宫颈敷料、阴茎润滑组合物、消毒液、洗液、口腔护理膏、阴道栓。
在一些实施方案中，所述医疗器械任选自：抑菌敷料、抗病毒敷料。
在一些实施方案中，所述医疗器械任选自：抑菌敷料、抗人乳头瘤病毒敷料。
在一些实施方案中，所述医疗器械任选自：创伤敷料、阴道敷料、宫颈敷料、阴茎润滑组合物、消毒液、洗液、口腔护理膏、阴道栓。
在本披露的第七方面，提供一种药物，其特征在于，所述药物包含如第一方面所述的蛋白、如第二方面所述的核酸分子、如第三方面所述的载体或如第四方面所述的宿主细胞。
在一些实施方案中，所述药物为抗细菌药或抗病毒药。
在一些实施方案中，所述药物包含药学上可接受的辅料。
在本披露的第八方面，提供如第一方面所述的蛋白、如第二方面所述的核酸分子、如第三方面所述的载体或如第四方面所述的宿主细胞在制备药物或医疗器械中的应用。
在一些实施方案中，所述药物为用于治疗细菌和/或病毒感染的药物。进一步地，在一些实施方案中，所述药物为用于治疗HPV病毒感染的药物。在一些实施方案中，所述药物为用于治疗细菌感染的药物。
在一些实施方案中，所述医疗器械用于细菌和/或病毒感染。在一些实施方案中，所述医疗器械用于HPV病毒感染。在一些实施方案中，所述医疗器械用于细菌感染。
本披露的牛乳铁蛋白的N-端叶332aa的P147R+L161P突变体的重组蛋白(SEQ IDNO:10)以及在此基础上进一步设计的重组乳铁蛋白(SEQ ID NO:2)都同时兼具较强的抗菌和抗病毒活性，取得了预料不到的技术效果，具有很好的应用前景。
另外，上述2个蛋白具有广谱的抗菌和抗病毒活性，对多种细菌和病毒表现出良好的抑制效果。
具体实施方式
下面通过具体实施例的方式进一步说明本披露，但并不因此将本披露限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例
实施例1.牛乳铁蛋白截短突变体的设计及重组乳铁蛋白的设计
发明人对牛乳铁蛋白(SEQ ID NO:1)截取N-端lobe的332aa，得到截短体。对截短体做肽段突变分析，筛选了多个突变位点，其中包括三个结构稳定性潜在较优的突变体，分别是Q199R、L161P、P147R，其中Q199和P147位点处于DNA结合功能区；Q199R和P147R突变导致分子柔性下降，L161P突变导致分子柔性提高。
实验测试发现，P147R和L161P突变体的抗菌和抗病毒活性优于Q199R突变体。不受理论束缚地，发明人推测P147位残基突变成精氨酸后，增强了与细菌或病毒的蛋白和核酸的结合，进而增强了对细菌和病毒的抑制作用。
发明人随后同时引入P147R和L161P突变，然后与促穿膜域、促愈合域、促折叠域融合表达，得到重组生物防御融合蛋白，即重组乳铁蛋白(SEQ ID NO:2)。融合促穿膜域的目的在于提高蛋白在细胞膜上的穿透与锚定功能，可能有潜力促进生物防御肽段破坏细菌或者病毒的包膜，一方面物理穿孔，破坏细菌病毒膜结构，一方面防御功能肽段与膜内的细菌或病毒核酸或蛋白通过电荷吸附物理结合，诱导核酸或蛋白的空间变构，阻断其正常生物学功能，从而抑制细菌或病毒的增殖。另外尝试通过促折叠域提高蛋白正确折叠与可溶性，增强蛋白产量和溶解度。
实施例2.重组乳铁蛋白的制备
合成得到含重组乳铁蛋白的编码序列(通过ExpOptimizer在默认参数下进行了在线的密码子优化)的DNA片段，然后与pET28a(+)载体分别使用BlpI和NcoI酶切，酶切产物通过T4DNA连接酶连接。反应液转化stbl3感受态，过夜培养，挑选阳性克隆测序鉴定。测序正确的阳性克隆培养后，提取得到重组乳铁蛋白的表达载体质粒(SEQ ID NO:3)。
载体质粒转化表达菌株E.coliBL21(DE3)。在含卡那霉素的LB培养液中37℃过夜培养。加IPTG至0.4mM，16℃诱导20h。离心收集菌体，加裂解液后超声破碎，离心获得含融合蛋白的上清液。0.45um滤膜过滤后使用镍柱层析纯化、然后使用离子色谱层析和RP-HPLC纯化，洗脱液冷冻干燥，得到纯度95.6％的重组乳铁蛋白(SEQ ID NO:2)。其在SDS-PAGE中，在30kDa～70kDa范围内呈现一条带。
实施例3.抗菌活性检测
菌液的制备
将肺炎克雷伯菌(ATCCBAA-2814)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(ATCC8739)、铜绿假单胞菌(ATCC9027)分别接种于营养琼脂平板上培养使其活化，实验前挑取单个菌落接种于MH琼脂培养基中，37℃培养16h，配制得到约107CFU/mL的菌悬液。
最小抑菌浓度的测定
采用琼脂平板稀释法测定MIC：
按实施例1的方法制备、纯化得到牛乳铁蛋白的N-端叶332aa的重组蛋白(SEQ IDNO:4)、牛乳铁蛋白的N-端叶332aa的P147R突变体的重组蛋白(SEQ ID NO:5)、牛乳铁蛋白的N-端叶332aa的Q199R突变体的重组蛋白(与SEQ ID NO:5的区别仅在于突变位点不同)、牛乳铁蛋白的N-端叶332aa的L161P突变体的重组蛋白(与SEQ ID NO:5的区别仅在于突变位点的差异)、人乳铁蛋白的重组蛋白(SEQ ID NO:7)、人乳铁蛋白N-端叶333aa的重组蛋白(SEQ ID NO:8)、牛乳铁蛋白的重组蛋白(SEQ ID NO:9)、牛乳铁蛋白的N-端叶332aa的P147R+L161P突变体的重组蛋白(SEQ ID NO:10)。纯度为95.3％-96.6％。
使用Fmoc固相合成法合成、切割得到牛乳铁素多肽粗品，RP-HPLC纯化得到牛乳铁素多肽(SEQ ID NO:6)，纯度为96.0％。
将实施例2及本实施例制备的蛋白/多肽分别加无菌水，溶解或混合均匀后得到所需各种浓度的供试液；另设无菌水为阴性对照组。取已灭菌的MH琼脂培养基加热后冷却到50℃左右，取9mL加入到培养皿中，迅速加入1mL的蛋白供试液，混合均匀，使得其中的蛋白浓度分别为8192μg/mL、4096μg/mL、2048μg/mL、1024μg/mL、512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL或0.25μg/mL。室温冷却至凝固，加1μL菌悬液于培养基上涂布均匀，37℃培养20h，以肉眼可见抑制细菌生长的最低浓度为MIC(μg/mL)。
各蛋白对于大肠杆菌的MIC测试结果如表1所示。N-端叶332aa的P147R突变体的重组蛋白和L161P突变体的重组蛋白相比N-端叶332aa的重组蛋白而言，抗菌活性有明显提高，而Q199R突变未带来抗菌活性的改善。因此后续对N-端叶332aa的P147R+L161P突变体的重组蛋白进行测试和改造，抗菌活性如表2所示。P147R+L161P突变体在与促穿膜域、促愈合域、促折叠域融合后，得到的重组乳铁蛋白的抗菌活性进一步提高。
表1.大肠杆菌的MIC测试结果
表2.大肠杆菌的MIC测试结果
各蛋白对于其他细菌的MIC测试结果如表3所示。牛乳铁蛋白的N-端叶332aa的P147R+L161P突变体的重组蛋白的抗菌活性与牛乳铁素多肽相近，而重组乳铁蛋白的抗菌活性显著优于牛乳铁素多肽。
表3.细菌的MIC测试结果
实施例4.抗病毒活性检测
使用文献IntJMolSci.2019Nov1；20(21):5455的方法进行抗病毒活性测定。
制备得到逆转录病毒(含有HPV-18URR驱动HPV-18E6、HPV-18E7的表达框)转导的HaCaT细胞的培养物，培养细胞并在第6至12天暴露于不同浓度(2μg/mL、20μg/mL)的重组乳铁蛋白、牛乳铁素(SEQ ID NO:11，固相合成得到，纯度为95.9％)、牛乳铁蛋白的重组蛋白、牛乳铁蛋白N-端叶突变体的重组蛋白的水溶液；对照组用DMSO处理。在第13天时使用RT-qPCR方法检测培养物中每个细胞的HPV-18DNA拷贝数相比DMSO组的百分比。重复多次实验。
结果如表4所示(平均值±标准差)，牛乳铁蛋白的N-端叶332aa的P147R+L161P突变体的重组蛋白抑制HPV病毒DNA的活性优于牛乳铁素多肽，重组乳铁蛋白的抗病毒活性显著优于牛乳铁素多肽(P<0.05)。
表4.细菌的MIC测试结果
尽管上面已经示出和描述了本披露的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不构成为对本披露的限制，本领域的普通技术人员在本披露的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种重组蛋白，其特征在于，
a.所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示序列具有≥99％的序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:10所示序列的第157位为残基R，在对应于SEQ ID NO:10所示序列的第171位为残基P；
或者
b.所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示序列具有≥99％的序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:2所示序列的第327位为残基R，在对应于SEQ ID NO:2所示序列的第341位为残基P。
2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:2。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的蛋白。
4.一种载体，其特征在于，所述载体包含编码权利要求1所述的蛋白的核苷酸序列，以及与所述核苷酸序列可操作地连接的调控序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求4所述的载体。
6.一种医疗器械，其特征在于，所述医疗器械包含权利要求1所述的蛋白、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞。
7.如权利要求6所述的医疗器械，其特征在于，所述医疗器械任选自：创伤敷料、抑菌敷料、抗人乳头瘤病毒敷料、阴道敷料、宫颈敷料、阴茎润滑组合物、消毒液、洗液、口腔护理膏、阴道栓。
8.一种药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1所述的蛋白、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞。
9.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物为抗细菌药或抗病毒药。
10.权利要求1所述的蛋白、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备药物或医疗器械中的应用。
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