CN117007813A - Foxo3基因及其靶向抑制剂在鸡原始生殖细胞增殖及迁移定植中的应用 - Google Patents

Foxo3基因及其靶向抑制剂在鸡原始生殖细胞增殖及迁移定植中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了FOXO3基因及其靶向抑制剂在鸡原始生殖细胞增殖及迁移定植中的应用，属于生物技术领域。本发明深入研究了靶向下调FOXO3基因表达对鸡原始生殖细胞增殖和体内迁移效率的影响。结果表明，在现有的培养鸡原始生殖细胞培养液基础上添加1μM的FOXO3的抑制剂Carbenoxolone(CBX)可显著促进鸡原始生殖细胞的体外增殖。经验证，干扰FOXO3基因表达也会显著促进鸡原始生殖细胞增殖。另外，经1μM抑制剂CBX处理后的原始生殖细胞，注射入鸡胚体内，迁移定植性腺能力出现了显著升高。本发明能有效地促进体外鸡原始生殖细胞的增殖能力,基础培养液中添加适宜浓度CBX对鸡原始生殖细胞可显著提高迁移定植到性腺的能力，且能很好的维持其生物学特性。

Description

FOXO3基因及其靶向抑制剂在鸡原始生殖细胞增殖及迁移定 植中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及FOXO3基因及其靶向抑制剂在鸡原始生殖细胞增殖及迁移定植中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)是发育过程中建立的第一个生殖细胞群(Germ cell specification in mice:signaling,transcription regulation,andepigenetic consequences.REPRODUCTION)，是卵母细胞和精原细胞的共同起源，是能够将遗传信息从亲代传递给子代的干细胞，保证了种系间遗传物质的稳定传递。在禽类中，由于原始生殖细胞的生殖特性及其独特的迁移、分化途径等使其成为了家禽育种、保种及转基因禽类等研究的重要应用材料。在鸡中，原始生殖细胞最早在透明区的中心区域被发现，随后通过血液循环系统迁移到达并定植于生殖嵴(The early development of germ cellsin chicken.Int J Dev Biol)。然而，目前从早期胚胎中分离出的原始生殖细胞数量很少，远远不能满足研究需要。因此，建立一个能使鸡原始生殖细胞有效增殖和传代且不改变生殖干细胞潜能的体外培养系统，则是这些应用必不可少的前提条件。
FOXO3即叉头框转录因子3，属于FOXO转录因子家族成员，是目前研究得较为广泛的一个重要转录因子(Stress-dependent regulation of FOXO transcription factorsby the SIRT1 deacetylase.Science)。FOXO3在动物体内广泛分布，并行使不同的生理功能，包括参与细胞周期阻滞性、诱导细胞凋亡、细胞增殖与分化、发育调节、糖代谢等(Structure/function relationships underlying regulation of FOXO transcriptionfactors.Oncogene)。目前研究证明，调控细胞周期是FOXO3转录因子发挥的最重要的作用，当细胞周期蛋白(CDK1)过表达时，FOXO3蛋白的活性显著下降，促进细胞周期的进行(Anovel mechanism of gene regulation and tumor suppression by thetranscription factor FKHR.Cancer Cell)，相反，当细胞核中的FOXO3蛋白过表达时，细胞周期蛋白(CDK4)的活性显著下降，抑制细胞周期的进行(Cell cycle inhibition byFoxO forkhead transcription factors involves downregulation of cyclin D.MolCell Biol)。
近年来，越来越多的研究证明，FOXO3基因在动物的繁殖相关性状方面发挥重要的调控作用。动物的卵巢功能与卵泡的闭锁程度和原始卵泡池的大小有直接关系，而卵泡生长与发育又是和卵巢颗粒细胞的生长和分化直接相关(The significance of fragile Xmental retardation gene 1CGG repeat sizes in the normal and intermediaterange in women with primary ovarian insufficiency.Hum Reprod)。在猪上，FOXO3基因与猪原始卵母细胞静息和激活的状态有关，敲低FOXO3基因对猪原始卵母细胞的发育起到激活作用(Knockdown of FOXO3 induces primordial oocyte activation inpigs.Reproduction)。另外，FOXO3基因的表达还与猪的卵巢颗粒细胞的凋亡有关，该基因可能参与卵泡闭锁等相关疾病(Expression and function of apoptosis initiatorFOXO3 in granulosa cells during follicular atresia in pig ovaries.J ReprodDev)。在鸡上也得到证明，在体外培养的鸡卵泡颗粒细胞培养基中外源添加FOXO3蛋白，发现一些促凋亡相关基因比如FASLG、Bnip3和CDKN1BmRNA的表达水平显著升高，说明FOXO3基因过表达促进鸡卵巢颗粒细胞的凋亡(FOXO3Is Expressed in Ovarian Tissues andActs as an Apoptosis Initiator in Granulosa Cells of Chickens.Biomed ResInt)。这些报道都有力地证明了FOXO3基因在动物卵母细胞和颗粒细胞的发育中扮演者重要角色。然而，迄今为止，尚无有关FOXO3基因在鸡原始生殖细胞方面的研究。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供FOXO3基因(记载在NCBI中，GeneID:421769)及其靶向抑制剂在鸡原始生殖细胞增殖及迁移定植中的应用。本发明研究发现FOXO3基因与鸡原始生殖细胞增殖及迁移定植有关，通过靶向抑制FOXO3基因能够促进鸡原始生殖细胞增殖和迁移定植。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一方面，提供FOXO3基因作为靶标在调控鸡原始生殖细胞增殖和迁移定植中的应用。
本发明的第二方面，提供靶向FOXO3基因的抑制剂在如下(1)或(2)中的应用：
(1)制备促进鸡原始生殖细胞增殖和/或迁移定植的产品；
(2)构建鸡原始生殖细胞增殖且不改变生殖干细胞潜能的体外培养系统。
上述应用中，所述靶向FOXO3基因的抑制剂选自能够下调FOXO3基因表达或抑制FOXO3基因发挥功能的物质；优选为甘珀酸钠(Carbenoxolone，CBX)或干扰RNA。
进一步优选的，所述干扰RNA的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；具体如下：
正义链：GCACCGAGCUGGAUGAUGUTT；(SEQ ID NO.1)
反义链：ACAUCAUCCAGCUCGGUGCTT。(SEQ ID NO.2)
注：根据WIPO ST.26标准的规定，RNA序列中的尿嘧啶“U”在序列表中用“T”表示。
本发明的第三方面，提供一种促进鸡原始生殖细胞增殖和/或迁移定植的方法，包括以下步骤：
将鸡原始生殖细胞用含有甘珀酸钠的基础培养液进行培养；
或者，通过siRNA干扰鸡原始生殖细胞FOXO3基因的表达。
优选的，所述基础培养液中甘珀酸钠的浓度为0.5μM-2μM；进一步优选的，所述基础培养液中甘珀酸钠的浓度为1μM。
进一步的，所述基础培养液为含有25ng/μL Acitivin A、50ng/μL bFGF、0.1mMβ-mercaptoethanol、1.2mM Sodium Pyruvate、1X Antibiotic-antimycotic、1X B27supplement、1X GS nucleosides、1X GlutaMax、1X NEAA、2.5％(体积分数)鸡血清和7.5％(体积分数)胎牛血清的KO-DMEM培养基。
优选的，所述siRNA的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明的有益效果：
(1)鸡原始生殖细胞作为精子和卵子的前体细胞，具有发育的潜能，试验中所用鸡原始生殖细胞是从发育10天的北京油鸡鸡胚性腺中分离出来的。发明人深入研究了一种靶向FOXO3基因的抑制剂在鸡原始生殖细胞增殖及迁移定植中的应用。结果表明，在现有的培养鸡原始生殖细胞培养液基础上添加FOXO3的抑制剂Carbenoxolone(CBX)，可显著促进鸡原始生殖细胞的增殖。根据加入CBX浓度的不同，其对鸡原始生殖细胞增殖的影响程度不同，当CBX浓度为1μM时其作用效果最显著，能有效地促进鸡原始生殖细胞在体外的增殖及迁移定植能力，且在含该浓度CBX的培养液中鸡原始生殖细胞能很好地维持其生物学特性。
(2)本发明提供FOXO3基因在促进鸡原始生殖细胞增殖中的应用，将FOXO3基因进行小RNA干扰，能有效的促进鸡原始生殖细胞的增殖，且能很好的维持其生物学特性。
(3)原始生殖细胞是一种极有应用前景的遗传资源，然而鸡原始生殖细胞在使用传统方法进行体外培养时增殖缓慢，也会逐渐丧失种系能力。因此，本发明在传统的培养体系中添加FOXO3的抑制剂CBX，优化和开发了鸡原始生殖细胞的培养系统，提高了鸡原始生殖细胞的增殖能力。
附图说明
图1：FOXO3的抑制剂Carbenoxolone(CBX)对体外原始生殖细胞增殖的影响；图1中的A图，CBX的终浓度为0、0.5、1和2μM，处理原始生殖细胞后培养24、48和72h时测定450nm处检测上清液的OD值，得到柱状图；图1中的B图，添加1μM CBX处理原始生殖细胞后EdU染色和DDX4免疫荧光染色的代表图像，箭头表示EdU-DDX4双阳性细胞，比例尺＝50μm；图1中的C图，EdU阳性增殖细胞占比统计分析图。
图2：干扰FOXO3基因对体外原始生殖细胞增殖的影响；图2中的A图，FOXO3基因的siRNA干扰效率，通过RT-qPCR测定FOXO3基因在转染位点的相对表达量；图2中的B图，CCK-8试验检测干扰FOXO3基因后促进体外培养的原始生殖细胞的增殖。
图3：FOXO3的抑制剂Carbenoxolone(CBX)对原始生殖细胞迁移定植的影响。设置1μM CBX处理的原始生殖细胞为实验组和未处理正常培养的原始生殖细胞为对照组，经过PKH26细胞膜红色荧光标记,并等量注射进孵化至2.5天的鸡胚血管中，继续孵化3.5天后，统计胚胎性腺中PKH26标记的原始生殖细胞的数目。图3中的A图，体式荧光显微镜下，胚胎性腺中PKH26标记的原始生殖细胞图，比例尺＝100μm；图3中的B图，胚胎性腺中PKH26标记的原始生殖细胞数目统计直方图。
图4：体外培养的原始生殖细胞SSEA1-DDX4共免疫荧光染色鉴定图。添加FOXO3的抑制剂Carbenoxolone(CBX)处理或干扰FOXO3基因后的鸡原始生殖细胞具有生殖干性。未处理正常培养的鸡原始生殖细胞作为可以表达多能干细胞标记物以及生殖细胞标记物的阳性对照，即Control，鸡胚胎成纤维细胞作为几乎不表达表达多能干细胞标记物以及生殖细胞标记物的阴性对照，即Fibroblast，比例尺＝50μm。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如前所述，目前从早期鸡胚胎中分离出的原始生殖细胞数量很少，远远不能满足研究需要。因此，建立一个能使鸡原始生殖细胞有效增殖和传代且不改变生殖干细胞潜能的体外培养系统则是这些应用必不可少的前提条件。
有鉴于此，本发明对鸡原始生殖细胞增殖和迁移定植进行了深入研究。本发明首次发现FOXO3基因与鸡原始生殖细胞增殖及迁移定植有关，通过靶向抑制FOXO3基因能够促进鸡原始生殖细胞增殖和迁移定植，且能很好的维持其生物学特性，由此提出了本发明。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。其中：
人激活素A(Acitivin A)购自派普泰克生物科技有限公司；人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、β-mercaptoethanol、Sodium Pyruvate购自北京索莱宝科技有限公司；B27supplement、GS nucleosides(核苷酸补充剂)，购自默克密理博中国有限公司；KO-DMEM培养基、Antibiotic-antimycotic(抗生素-抗真菌剂)、GlutaMax(谷氨酰胺添加剂)、NEAA购自赛默飞世尔科技有限公司。
甘珀酸钠(Carbenoxolone，CBX)的CAS号为7421-40-1。
实施例1：鸡原始生殖细胞培养液的配制
以含有25ng/μL Acitivin A、50ng/μL bFGF、0.1mMβ-mercaptoethanol、1.2mMSodium Pyruvate、1X Antibiotic-antimycotic、1X B27 supplement、1X GSnucleosides、1X GlutaMax、1X NEAA、2.5％(体积分数)鸡血清和7.5％(体积分数)胎牛血清的KO-DMEM培养基为基础培养液；在基础培养液中添加FOXO3抑制剂CBX，使CBX的浓度为0.5μM-2μM，配制得到鸡原始生殖细胞CBX培养液。
以上浓度参数均为配制的鸡原始生殖细胞培养液中的终浓度。
实施例2：鸡胚成纤维细胞饲养层的培养
(1)北京油鸡受精种蛋(购自河南商丘，实施本发明不限于该品种)孵化至5～7天，用75％酒精清洗种蛋，用含有新洁尔灭的脱脂棉球擦拭种蛋的钝端，小心敲开蛋壳，用弯镊子取出胚体于培养皿，PBS漂洗两次；
(2)将胚体放入新的培养皿中，去除鸡胚的四肢、头尾以及内脏，余下组织用PBS漂洗两次；
(3)使用眼科手术剪刀将余下组织剪碎，直到剪成肉糜状，然后转移至1.5mL的离心管中；
(4)0.25％胰蛋白酶提前37℃水浴预热20min，取0.5mL预热的0.25％胰蛋白酶加入离心管中，室温消化10～20min，期间不断用移液枪轻柔吹打直至无明显沉淀出现；
(5)加入等体积的含有10％ FBS的RPMI 1640培养液终止消化，用移液枪小心吹散混匀细胞悬液；
(6)将细胞悬液经过40μm滤膜过滤，收集过滤后的细胞悬液1,000r/min，离心5min后收集细胞沉淀；
(7)用含有10％FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，接种于24孔板中，置于39℃，5％ CO2培养箱条件下培养。
实施例3：鸡原始生殖细胞的分离培养
(1)北京油鸡受精种蛋(购自河南商丘，实施本发明不限于该品种)孵化至10天，用75％酒精清洗种蛋，用含有新洁尔灭的脱脂棉球擦拭种蛋的钝端，小心敲开蛋壳，用弯镊子取出胚体于培养皿，PBS漂洗两次；
(2)将胚体放入新的培养皿中，小心剖开腹部去其内脏，在后肠前1/3的背脊处用由丝镊子摘取雌性左侧卵巢，用PBS漂洗3次；
(3)使用眼科手术剪刀将卵巢剪碎，直到剪成肉糜状，然后转移至1.5mL的离心管中；
(4)0.25％胰蛋白酶提前37℃水浴预热20min，取0.5mL预热的0.25％胰蛋白酶加入离心管中，室温消化10min，期间不断用移液枪轻柔吹打直至无明显沉淀出现；
(5)加入等体积的KO-DMEM培养基终止消化，用移液枪小心吹散混匀细胞悬液；
(6)将细胞悬液经过40μm滤膜过滤，收集过滤后的细胞悬液1,000r/min，离心5min后收集细胞沉淀；
(7)基础培养基重悬细胞沉淀，并接种于提前铺有鸡胚成纤维细胞饲养层的24孔板中(实施例2制备)，置于39℃，5％ CO2培养箱条件下培养。
实施例4：FOXO3抑制剂Carbenoxolone(CBX)处理对原始生殖细胞增殖的影响
(1)CCK-8增殖检测：将实施例3中处于对数生长期的鸡原始生殖细胞接种到96孔板中，在孔中分别加入不同浓度CBX(0.5μM、1μM、2μM)处理的鸡原始生殖细胞CBX培养液，每个浓度做3个重复，同时在对照组中加入等量的不含CBX的基础培养液。
将所述的鸡原始生殖细胞在39℃、含5％CO2的培养箱中分别培养24，48和72h，然后分别加入10μL的CCK-8(购自北京索莱宝科技有限公司)39℃孵育2小时。在450nm处检测上清液的光密度值。
试验结果见图1A。本发明发现使用1μM的CBX可以显著提高鸡原始生殖细胞增殖率，因而本实施例确定了1μM的CBX作为培养体系的最佳处理浓度。
(2)EdU增殖检测：体外培养的北京油鸡原始生殖细胞通过显微镜观察细胞状态，待细胞状态良好时，添加1μM的CBX处理，未处理正常培养的细胞为阴性对照组。CBX处理细胞48h后，将处理组和对照组的24孔板中鸡原始生殖细胞在培养液中加入EdU(购自赛默飞世尔科技有限公司)，其终浓度为10uM，在39℃、含5％CO2的培养箱中孵育6h。用4％多聚甲醛溶液室温固定后，以磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，用0.5％的Triton X-100透化10min，以PBS漂洗3次后用10％山羊封闭血清封闭1.5h，加入DDX4(购自艾博抗上海有限公司，ab13840，使用时体积比为1:200)抗体放置4℃冰箱过夜孵育，以PBS漂洗3次后加入二抗(Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit IgG，购自武汉赛维尔生物科技有限公司，使用时体积比为1:200)室温避光孵育1.5h，以PBS漂洗3次后加入EdU染料室温孵育30min，以PBS漂洗3次后加入DAPI对细胞核进行染色10min，PBS浸洗5min，滴加PBS覆盖细胞培养皿底后即可进行荧光观察。通过EdU和DDX4的共免疫荧光染色来指示增殖的鸡原始生殖细胞。
结果发现，在对照组和处理组中均观察到EdU的加入，且大部分都是EdU-DDX4双阳性细胞，表明原始生殖细胞正在积极增殖并形成细胞集落(见图1B)，进一步通过统计EdU阳性细胞占原始生殖细胞细胞总数的比例发现，1μM的CBX处理后原始生殖细胞的增殖速度显著快于对照组(见图1C)。
实施例5：干扰FOXO3基因对体外原始生殖细胞增殖的影响
将鸡原始生殖细胞接种于24孔板上培养，每孔加1mL实施例1的基础培养液，设置了敲低实验组(siRNA-FOXO3)和阴性对照组(siRNA-NC)，以基础培养液处理的细胞作为空白对照，未进行任何siRNA干扰；敲低实验组所转染的siRNA的序列如下：
正义链：GCACCGAGCUGGAUGAUGUTT；(SEQ ID NO.1)
反义链：ACAUCAUCCAGCUCGGUGCTT。(SEQ ID NO.2)
siRNA-NC为试验过程中保证试验完整的阴性对照，其具体序列为：
正义链：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，(SEQ ID NO.3)
反义链：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'，(SEQ ID NO.4)
注：根据WIPO ST.26标准的规定，上述siRNA序列中的尿嘧啶“U”在序列表中用“T”表示。
每组有三个重复，通过显微镜观察细胞状态，待细胞密度达到50％～60％时进行细胞转染。
本试验使用Polyplus的jetPRIME试剂盒进行转染，具体操作如下：
(1)稀释siRNA：siRNA以冻干粉的形式运输，使用前需按说明进行溶解。因为OligoRNA呈很轻的干膜状贴附在离心管壁上，打开时很容易丢失，所以打开离心管之前需先使用10,000rpm/min的转速离心3min,然后缓慢打开离心管。用125μL DEPC水去重悬1OD双链siRNA，充分混合，稀释时应尽量避光操作，最后溶解为20μM的储存液，分装保存于-80℃，避免反复冻融；
(2)细胞转染前一天，按照jetPRIME试剂盒的说明，每孔均添加500μL不含青链霉素的鸡原始生殖细胞基础培养基(在基础培养液中去掉Antibiotic-antimycotic)；
(3)混合液的制备：按照jetPRIME试剂盒的说明，以24孔板每孔加入500μL的培养基计算，配制混合液的体系如下：50μL buffer+2.5μL siRNA(20μM)，移液器吹打混匀，稍离心后+2μL reagent，移液器吹打混匀，稍离心后室温避光孵育15min；
(4)加入转染试剂前，细胞需更换一次新的培养基，每孔均添加500μL不含青链霉素的基础培养液；
(5)将混合溶液悬空一滴一滴的滴加到细胞中，均匀滴加，避免局部高浓度，之后手动轻轻晃板使其混匀，转染后的24孔板继续放置5％CO2，39℃的细胞培养箱培养；
(6)转染6h后，更换新的不含青链霉素的培养基，续放置5％CO2，39℃的细胞培养箱培养。
(7)转染48h后，收集细胞沉淀，提取RNA，进行RT-qPCR验证，根据FOXO3的mRNA的相对表达水平，验证其敲低效率(见图2A)。
(8)CCK-8增殖检测：体外培养的北京油鸡原始生殖细胞通过显微镜观察细胞状态，待细胞密度达到50％～60％时，采用siRNA进行细胞转染。
siRNA细胞转染48h后将原始生殖细胞转移到96孔板，在体外继续培养24、48、72h后，采用CCK-8法检测分析原始生殖细胞的增殖情况。结果显示，与对照组相比，干扰FOXO3基因后原始生殖细胞的增殖速度显著提高(见图2B)。
实施例6：鸡原始生殖细胞性腺迁移能力的鉴定
(1)试验组鸡原始生殖细胞使用含1μM CBX的鸡原始生殖细胞CBX培养液处理48h，而对照组鸡原始生殖细胞使用不含CBX的培养基(基础培养液)处理48h。在显微注射前用荧光染料PKH26对以上鸡原始生殖细胞进行红色荧光标记。
(2)鸡胚注射按照如下步骤进行：取1×106原始生殖细胞重悬于50μL的培养液中，用显微注射玻璃针吸取2μL细胞悬液并注射到孵化2.5天的鸡胚血管中，继续孵化3.5天后，统计胚胎性腺中荧光细胞的数目(见图3A)。在体式荧光显微镜下，计数胚胎性腺中PKH26标记细胞的数量，可以看出经过培养并进行红色荧光标记的原始生殖细胞具有成功迁移到性腺中的能力，而且使用1μM的CBX处理后的原始生殖细胞相比对照组原始生殖细胞来说细胞迁移数目更多(见图3B)，因此1μM的CBX处理后的原始生殖细胞具有更强的迁移定植能力。
实施例7：细胞免疫荧光染色鉴定
为保证FOXO3抑制剂Carbenoxolone(CBX)处理后以及siRNA干扰FOXO3基因后的鸡原始生殖细胞可以很好的维持其生物学特性，本发明通过生殖细胞特异性蛋白(DDX4)和干细胞标记物胚胎阶段特异性表面抗原(SSEA-1)对细胞进行双免疫荧光染色鉴定，具体步骤如下:
(1)以分别用1μM的FOXO3抑制剂Carbenoxolone(CBX)处理48h以及siRNA(SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示)干扰FOXO3基因48h后的鸡原始生殖细胞为试验对象。
将上述处理后的鸡原始生殖细胞用4％多聚甲醛溶液室温固定后，以磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，用0.5％的Triton X-100透化10min，以PBS漂洗3次后用10％山羊封闭血清封闭1.5h，加入DDX4(购自艾博抗上海有限公司,ab13840,使用时体积比为1:200)抗体放置4℃冰箱过夜孵育，以PBS漂洗3次后加入二抗(Alexa Fluor 488-conjugated donkeyanti-rabbit IgG，购自武汉赛维尔生物科技有限公司,使用时体积比为1:200)室温避光孵育1.5h，以PBS漂洗3次后加入DAPI对细胞核进行染色10min，PBS浸洗5min，滴加PBS覆盖细胞培养皿底后即可进行荧光观察。试验结果见图4。可见FOXO3抑制剂Carbenoxolone(CBX)处理后以及siRNA干扰FOXO3基因后的鸡原始生殖细胞的细胞膜中表达DDX4生殖细胞特异性标记，呈现绿色荧光，细胞核为DAPI染色。
(2)以分别用1μM的FOXO3抑制剂Carbenoxolone(CBX)处理48h以及siRNA(SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示)干扰FOXO3基因48h后的鸡原始生殖细胞为试验对象。
将上述处理后的原始生殖细胞用4％多聚甲醛溶液室温固定后，以磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，用0.5％的Triton X-100透化10min，以PBS漂洗3次后用10％山羊封闭血清封闭1.5h，加入SSEA-1(购自圣克鲁斯抗体公司,sc-21702,使用体积比1:200)抗体放置4℃冰箱过夜孵育，以PBS漂洗3次后加入山羊抗鼠的二抗(购自赛默飞世尔科技有限公司,使用时体积比为1:200)室温避光孵育1.5h，以PBS漂洗3次后加入DAPI对细胞核进行染色10min，PBS浸洗5min，滴加PBS覆盖细胞培养皿底后即可进行荧光观察。试验结果见图4。可见FOXO3抑制剂Carbenoxolone(CBX)处理后以及siRNA干扰FOXO3基因后的鸡原始生殖细胞的细胞膜中表达SSEA-1干细胞特异性标记，即呈现红色荧光，细胞核为DAPI染色。
本试验使用鸡胚成纤维细胞(CEF)作为阴性对照进行免疫荧光染色，结果显示并没有相关蛋白表达(图4中的“Fibroblast”)，表明FOXO3抑制剂Carbenoxolone(CBX)处理后以及siRNA干扰FOXO3基因后的鸡原始生殖细胞可以很好的维持其生物学特性。
综上所述，本发明能够提供一种靶向FOXO3基因的抑制剂在鸡原始生殖细胞增殖及迁移定植中的应用，在所述基础培养液中添加FOXO3抑制剂Carbenoxolone(CBX)可显著促进鸡原始生殖细胞的增殖及迁移定植能力，且能很好的维持其生物学特性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.FOXO3基因作为靶标在调控鸡原始生殖细胞增殖和迁移定植中的应用。
2.靶向FOXO3基因的抑制剂在如下(1)或(2)中的应用：
(1)制备促进鸡原始生殖细胞增殖和/或迁移定植的产品；
(2)构建鸡原始生殖细胞增殖且不改变生殖干细胞潜能的体外培养系统。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述靶向FOXO3基因的抑制剂选自甘珀酸钠或干扰RNA。
4.一种促进鸡原始生殖细胞增殖和/或迁移定植的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将鸡原始生殖细胞用含有甘珀酸钠的基础培养液进行培养；
或者，通过siRNA干扰鸡原始生殖细胞FOXO3基因的表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基础培养液中甘珀酸钠的浓度为0.5μM-2μM。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基础培养液中甘珀酸钠的浓度为1μM。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述基础培养液为含有25ng/μLAcitivin A、50ng/μL bFGF、0.1mMβ-mercaptoethanol、1.2mM Sodium Pyruvate、1XAntibiotic-antimycotic、1X B27 supplement、1X GS nucleosides、1X GlutaMax、1XNEAA、2.5％(体积分数)鸡血清和7.5％(体积分数)胎牛血清的KO-DMEM培养基。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述siRNA的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
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