CN117007704A - 一种定量检测二肽中异构体含量的液相分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种定量检测二肽中异构体含量的液相分析方法,所述液相分析方法采用大环抗生素作为手性选择剂,由水、醇和甲酸组成的流动相进行洗脱,所述二肽为同时含有一个手性氨基酸和一个非手性氨基酸。此方法的专属性、线性、重复性、准确度、定量限和检测限均满足药物分析检测的要求,并具有快速准确、选择性高、应用范围广、成本低、灵敏度高的特点。本发明的分析方法能够使二肽与二肽异构体的分离度较佳,达到2.0以上,峰型和杂质分离效果均较好。本发明方法能够准确地定量检测出工艺过程中工序产品或原料药中的异构体含量,保障了药品的安全性以及生产过程中的质量控制,具有良好的应用前景与重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种定量检测二肽异构体含量的液相检测分析方法。
背景技术
司美格鲁肽(Semaglutide)是由Nove Nordisk公司研发的长效GLP-1类似物,通过基因重组技术,利用酵母生产获得,该药物只需要进行每周一次的皮下注射给药。司美格鲁肽作为GLP-1类似物的代表药物之一,在多个临床试验研究已经证明联合不同的口服降糖药可以有效控制血糖,并能够使患者减轻体重、减少收缩压及改善胰岛β细胞功能。
Boc-His(Trt)-Aib-OH(二肽)是司美格鲁肽原料药制备过程中的关键起始物料,但是Boc-His(Trt)-Aib-OH(二肽)在合成过程中含有同分异构体(对映异构体)杂质Boc-D-His(Trt)-Aib-OH(控制≤0.5%)。目前现有技术中没有关于Boc-His(Trt)-Aib-OH(二肽)中的异构体含量检测的分析方法的报道。
因此开发一种简单快速、准确度高、应用范围广、成本低、灵敏度高的检测同时含有一个手性氨基酸和一个非手性氨基酸组成的二肽,尤其是Boc-His(Trt)-Aib-OH中的异构体含量的分析方法具有良好的前景与重要意义,以便准确地定量检测出工艺过程中工序产品或原料药中的异构体含量,以保障药品的安全性以及生产过程中的质量控制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量检同时含有一个手性氨基酸和一个非手性氨基酸组成的二肽中异构体含量的液相分析方法,此方法的专属性、线性、重复性、准确度、定量限和检测限均满足药物分析检测的要求,并具有快速准确、选择性高、应用范围广、成本低、灵敏度高的特点。
为了实现上述目的,本发明提供如下的技术方案,
一种定量检测二肽中异构体含量的液相分析方法,所述液相分析方法采用大环抗生素作为手性选择剂,由水、醇和甲酸组成的流动相进行洗脱,所述二肽由一个含手性α-碳原子的氨基酸和一个含非手性α-碳原子的氨基酸组成。
作为本发明的一种实施方式,所述含手性α-碳原子的氨基酸选自组氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或颉氨酸的天然氨基酸或上述天然氨基酸的衍生物。所述含非手性α-碳原子的氨基酸选自甘氨酸(天然氨基酸)、2-氨基异丁酸(Aib,非天然氨基酸或合成氨基酸)、2,2-二乙基甘氨酸、氮杂丙氨酸和氮杂甘氨酸之类的没有手性碳原子的氨基酸。
作为本发明的一种实施方式,手性α-碳原子的氨基酸和/或非手性α-碳原子的氨基酸的侧链、N端氨基或C端羟基可以不含保护基团,或者可以进一步连接保护基团从而形成各种直链和支链变体。所述氨基酸的侧链或N端氨基的保护基团可以为9-芴甲氧羰基Fmoc、叔丁氧羰基Boc,苄氧羰基Cbz、三苯甲游基Trt、叔丁基tBu等;所述氨基酸的C端羟基可以被烷基(如甲基、乙基等)等取代。
作为本发明的一种实施方式,所述二肽为His-Aib-OH、Boc-His-Aib-OH、His(Trt)-Aib-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH、His-Gly-OH、Boc-His-Gly-OH、His(Trt)-Gly-OH或Boc-His(Trt)-Gly-OH等。
作为本发明的一种实施方式,所述大环抗生素CSPs可选为万古霉素(ChirobioticV)、替考拉宁(Chirobiotic T)、替考拉宁的苷元(Chirobiotic TAG)和/或瑞斯托霉素A(Chirobiotic R)等。这些大环抗生素手性选择剂(属于糖肽)拥有共同的七肽苷元核心,核心上的芳基互相交联形成了篮状的结构,结构上带有浅室用于形成包络物和表面固定的糖基。如万古霉素包括1个糖部分和3个包络内腔;替考拉宁包括3个糖基和4个包络内腔;瑞斯托霉素A包括6个糖基和4个包络内腔。正因为大环抗生素手性选择剂结构上的特异性以及由多个手性中心产生的对映选择性,为发生对映选择性的结合提供了多种潜在的可能性,而这个性质也是许多化学分子对映选择性的来源。其中替考拉宁(Chirobiotic T)对于氨基醇、未衍生化的天然氨基酸、合成氨基酸(如N-衍生化)和(双)多肽具有更佳的对映分离能力。
作为本发明的一种实施方式,所述流动相中的醇可选为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或多种,优选异丙醇或乙醇,进一步优选异丙醇。因为异丙醇相对乙醇或甲醇,二肽和二肽异构体的分离度更佳。
作为本发明的一种实施方式,所述甲酸在水和醇的混合溶剂中的质量占比可选为0.001%~0.5%,优选为0.001%~0.1%,进一步优选为0.0016%~0.02%,在该范围内,能保证二肽和二肽异构体的分离度更佳,且本发明的分离条件下甲酸相对乙酸能使峰形更加尖锐。
作为本发明的一种实施方式,所述水和醇的质量比为1:10~10:1,优选1:4~3:2。
作为本发明的一种实施方式,水、醇和甲酸的质量比是控制对映选择性的一个关键变量。当甲酸在水和醇的混合溶剂中的质量占比为0.02%时,优选水和醇类溶剂的质量比为60:40~50:50,在该质量比范围内,二肽和二肽异构体的分离度能保持在2.0以上;然而在60:40~50:50的质量比范围外,尤其是随着醇类溶剂的增加,二肽和二肽异构体的分离度逐渐减小至2.0以下。通过降低甲酸在水和醇的混合溶剂中的质量占比,如0.0016%或0.002%,即使水和醇类溶剂的质量比减小,如达到20:80或者16:84,二肽和二肽异构体的分离度仍然保持在2.0以上。
作为本发明的一种优选实施方式,所述水、醇类溶剂和甲酸的质量比为50:50:0.02,进一步优选水、异丙醇和甲酸的质量比为50:50:0.02(分离度为2.4)或水、乙醇和甲酸的质量比为50:50:0.02(分离度为2.2)或水、乙醇和甲酸的质量比为60:40:0.02(分离度为2.3)或水、乙醇和甲酸的质量比为200:800:0.02(分离度为2.3)或水、乙醇和甲酸的质量比为160:840:0.016(分离度为2.2)。在上述流动相条件下,二肽与二肽异构体峰分离均较好,且峰型良好。尤其是水、异丙醇和甲酸的质量比为50:50:0.02条件下,二肽与二肽异构体的分离度达到2.4,杂质分离效果较好,且色谱系统运行时间短,不超过20min。
作为本发明的一种实施方式,所述流动相的流速为0.5~1.0ml/min,优选0.7ml/min。
作为本发明的一种实施方式,所述流动相的洗脱方式为等度洗脱或梯度洗脱,优选操作更方便的等度洗脱。
作为本发明的一种实施方式,所述色谱柱的柱温为20~45℃。随着柱温的升高,二肽峰前的基线上抬越严重,因此优选柱温为25℃。
作为本发明的一种实施方式,进样溶液浓度为0.5~1.0mg/ml,进样量5~20μl。当溶液浓度为0.5mg/ml且进样量为20μl时,样品略有过载,二肽峰前基线部分上抬,高于二肽异构体峰后基线,会导致杂质结果偏大;当溶液浓度为0.5mg/ml且进样量为10μl时,灵敏度较低,低浓度响应无法达到预期;当溶液浓度为0.75mg/ml且进样量为10μl时,灵敏度和响应均表现较佳。
作为本发明的一种实施方式,考虑到二肽和二肽异构体为末端吸收,根据紫外全波长扫描结果,检测波长可选为UV 214nm。
作为本发明的一种实施方式,运行时间可选为15~40min,优选20min。
本发明分析检测方法的优点在于:提供了一种定量检测同时含有一个手性氨基酸和一个非手性氨基酸组成的二肽中异构体含量的液相分析方法,所述液相分析方法采用大环抗生素作为手性选择剂,由水、醇和甲酸组成的流动相进行洗脱,此方法的专属性、线性、重复性、准确度、定量限和检测限均满足药物分析检测的要求,并具有快速准确、选择性高、应用范围广、成本低、灵敏度高的特点。本发明的分析方法能够使二肽与二肽异构体的分离度较佳,达到2.0以上,峰型和杂质分离效果均较好。本发明方法能够准确地定量检测出工艺过程中工序产品或原料药中的异构体含量,保障了药品的安全性以及生产过程中的质量控制,具有良好的应用前景与重要意义。
附图说明
图1~12是根据实施例1中#1~12流动相得到的色谱图。
图13是根据实施例2得到的色谱图。
图14是根据实施例4得到的二肽线性结果图。
图15是根据实施例4得到的二肽异构体线性结果图。
图16~18是根据对比例1得到的三组不同流动相的色谱图。
图19是根据对比例2得到的色谱图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果能有更加清楚的理解,现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明,但本发明的保护内容不局限以下实施例。
样品来源:实施方式中所用的Boc-His(Trt)-Aib-OH二肽供试品(纯度99.6%,含Boc-D-His(Trt)-Aib-OH异构体0.06%)采购自厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司、Boc-His(Trt)-Aib-OH二肽对照品(纯度99.5%)和Boc-D-His(Trt)-Aib-OH对照品(纯度99.2%)二肽异构体样品均采购自吉尔生化(上海)有限公司。
实施方式中所用的设备或其它试剂/材料均可通过商业化途径购买得到。
实施例1
实验条件:
设备:高效液相色谱仪(HPLC)。
色谱柱:CHIROBIOTIC T,4.6mm*250mm,5μm。
流动相的配制:以一定体积比的流动相,进行等度洗脱,设置了12组流动相进行筛选,具体见表1和图1~12所示(先洗脱的是二肽,后洗脱的是二肽异构体)。流动相的流速为0.7mL/min,柱温为25℃,进样量为10μL,检测波长为UV 214nm,运行时间20min。
空白溶液:乙腈。
系统适用性溶液的配制:取二肽和二肽异构体适量,用乙腈稀释至每1ml含二肽0.75mg、二肽异构体3.75μg的溶液。
供试品溶液的配制:取供试品适量,加乙腈稀释至每1ml中含二肽0.75mg的溶液。
测定法:精密量取系统适用性溶液与供试品溶液分别注入液相色谱仪,记录色谱图。
表1流动相筛选过程
# | 流动相(体积比) | 分离度 | 图谱 |
1 | 水:甲醇:三乙胺和乙酸=50:50:1 | N/A | 图1 |
2 | 水:甲醇:甲酸=60:40:0.02 | N/A | 图2 |
3 | 水:甲醇:甲酸=50:50:0.02 | 1.8 | 图3 |
4 | 水:甲醇:甲酸=40:60:0.02 | 1.3 | 图4 |
5 | 水:甲醇:甲酸=20:80:0.02 | N/A | 图5 |
6 | 水:乙醇:甲酸=200:800:0.02 | 2.3 | 图6 |
7 | 水:乙醇:甲酸=160:840:0.016 | 2.2 | 图7 |
8 | 水:乙醇:甲酸=60:40:0.02 | 2.3 | 图8 |
9 | 水:乙醇:甲酸=50:50:0.02 | 2.2 | 图9 |
10 | 水:乙醇:甲酸=40:60:0.02 | 1.6 | 图10 |
11 | 水:乙醇:甲酸=20:80:0.02 | 1.4 | 图11 |
12 | 水:异丙醇:甲酸=50:50:0.02 | 2.4 | 图12 |
结果表明:如图1所示,当流动相体系中添加三乙胺和乙酸时,峰形不好,且左边的二肽峰与死体积的峰有交叉。如图2所示,当流动相中水:甲醇:甲酸的体积=60:40:0.02时,峰形出现不对称现象,且洗脱时间超过20min,直至30min还未洗脱完全。如图4、图5和图11所示,当流动相中水:甲醇的体积或水:乙醇的体积=40:60:0.02或20:80:0.02时,二肽和二肽异构体的分离度小于2.0。
如图6所示,水、乙醇和甲酸的质量比为200:800:0.02时,二肽和二肽异构体的分离度为2.3;如图7所示,水、乙醇和甲酸的质量比为160:840:0.016,二肽和二肽异构体的分离度为2.2;如图8所示,水、乙醇和甲酸的质量比为60:40:0.02,二肽和二肽异构体的分离度为2.3;如图9所示,水、乙醇和甲酸的质量比为50:50:0.02,二肽和二肽异构体的分离度为2.2;如图10所示,水、异丙醇和甲酸的质量比为50:50:0.02,二肽和二肽异构体的分离度为2.4,分离度实现了更优。在上述流动相条件下,二肽与二肽异构体峰分离均较好,且峰型良好。尤其是水、异丙醇和甲酸的质量比为50:50:0.02条件下,二肽与二肽异构体的分离度达到2.4,且杂质分离效果较好。
当甲酸在水和醇的混合溶剂中的质量占比为0.02%时,优选水和醇类溶剂的质量比为60:40~50:50,在该质量比范围内,二肽和二肽异构体的分离度能保持在2.0以上;然而在60:40~50:50的质量比范围外,尤其是随着醇类溶剂的增加,二肽和二肽异构体的分离度逐渐减小至2.0以下。通过降低甲酸在水和醇的混合溶剂中的质量占比,如0.0016%或0.002%,即使水和醇类溶剂的质量比减小,如达到20:80或者16:84,二肽和二肽异构体的分离度仍然保持在2.0以上。
实施例2
在实施例1的基础上,对柱温进行了筛选,分别选择柱温为25℃、30℃、35℃和40℃,其余条件均同实施例1。记录色谱图,具体对比如图13所示。结果表明,柱温越高,二肽峰前基线上抬越严重,因此本发明的分析方法适合在25℃柱温下操作。
实施例3
在实施例1的基础上,用CHIROBIOTIC V(万古霉素)替代CHIROBIOTIC T手性选择剂,其余条件均同实施例1,二肽和二肽异构体的分离度为1.8且峰形、响应均较佳。结果表明该色谱柱同样适用于二肽和二肽异构体的分离。
实施例4
参照实施例1中使用的#12流动相(水:异丙醇:甲酸=50:50:0.02),对提供的方法进行了系统适用性、精密度、专属性、线性、定量限、检测限、准确度和范围的性能参数的方法学验证,本次验证以Boc-His(Trt)-Aib-OH(二肽)作为样品。
实验条件:
设备:高效液相色谱仪(HPLC)。
色谱柱:CHIROBIOTIC T,4.6mm*250mm,5μm。
流动相的配制:以水、异丙醇和甲酸的混合溶剂为流动相,水、异丙醇和甲酸的质量比为50:50:0.02,进行等度洗脱。流动相的流速为0.7mL/min,柱温为25℃,进样量为10μL,检测波长为UV 214nm,运行时间20min。
空白溶液:乙腈。
系统适用性溶液的配制:取二肽和二肽异构体适量,用乙腈稀释至每1ml含二肽0.75mg、二肽异构体3.75μg的溶液。
供试品溶液的配制:取供试品适量,加乙腈稀释至每1ml中含二肽0.75mg的溶液。
测定法:精密量取系统适用性溶液与供试品溶液分别注入液相色谱仪,记录色谱图。
(1)系统适用性(SST)
通过分析6针系统适用性溶液得到,具体结果如下表2所示。
表2系统适用性结果
名称 | 二肽峰面积 | 二肽与二肽异构体峰的分离度 |
SST-1 | 34209.426 | 3.1 |
SST-2 | 34188.424 | 3.1 |
SST-3 | 34166.308 | 3.1 |
SST-4 | 34161.695 | 3.1 |
SST-5 | 34215.081 | 3.1 |
SST-6 | 34246.043 | 3.1 |
相对标准偏差RSD | 0.1% | N/A |
可接受标准 | RSD不得过2% | 不小于1.5 |
合格/失败 | 合格 | 合格 |
结果表明:6针系统适用性溶液中二肽峰面积的RSD满足可接受标准不得过2%;二肽与二肽异构体峰之间的分离度满足可接受标准不小于1.5的规定。因此,本发明的分析方法的系统适用性结果符合规定。
(2)精密度
分析方法的精密度系指均匀供试品多次取样,用该分析方法测定各结果的一致程度。分析方法的精密度通过测定重复性来证明。
该方法的重复性是通过对6份平行配制的供试品溶液进行检测来评估,具体结果见表3。6份供试品溶液中二肽异构体含量的RSD应不大于15%。
表3重复性结果
名称 | 二肽异构体含量 |
重复1 | 0.057% |
重复2 | 0.064% |
重复3 | 0.062% |
重复4 | 0.059% |
重复5 | 0.060% |
重复6 | 0.063% |
相对标准偏差RSD | 4% |
可接受标准 | 不大于15% |
合格/失败 | 合格 |
结果表明:6份独立测定的供试品溶液中二肽异构体含量的RSD满足不大于15%的可接受标准。因此,本发明的分析方法具有较高的精密度。
(3)专属性
专属性是指在可能存在的物质如杂质、降解产物以及辅料存在的情况下分析方法能准确确定被测物质存在的能力。专属性可以用峰纯度和分离度来表示。
分析方法的专属性通过分析标入二肽异构体的供试品(代号:Spiked 0.5%-1、Spiked 0.5%-2和Spiked 0.5%-3)、100%浓度的二肽和二肽异构体(代号:100%-L-STD与100%-D-STD)、50%浓度的二肽和二肽异构体来证明(代号:50%-L-STD与50%-D-STD),具体结果如表4所示。
表4专属性结果
结果表明:二肽和二肽异构体峰的分离度均不小于1.5,二肽和二肽异构体峰均是纯的。标入异构体的供试品中,二肽和二肽异构体峰的分离度均不小于1.5;100%浓度的二肽和二肽异构体、50%浓度的二肽和二肽异构体中,二肽和二肽异构体峰是纯的,均满足规定。因此,本发明的分析方法具有较好的专属性。
(4)线性
分析方法的线性系指在一定范围内供试品中被分析物测定结果与其浓度直接或经适当数学转化呈正比关系。
分析方法的线性可以通过平行数份的线性溶液来证明。以各线性溶液中二肽和二肽异构体的浓度(μg/ml)为横坐标,峰面积为纵坐标(数份检测的平均值),进行线性拟合,可得标准线性方程,数据产生的回归线产生一个不小于0.990的相关系数(R)。二肽线性结果如表5和图14所示,二肽异构体线性结果如表6和图15所示。
表5二肽线性结果汇总
表6二肽异构体线性结果汇总
结果表明:二肽浓度在0.3835μg/ml至11.5060μg/ml(相当于0.05%-1.5%的杂质水平,)的线性符合相关系数(R)不小于0.990的可接受标准,二肽异构体浓度在0.3754μg/ml至11.2606μg/ml(0.05%-1.5%的杂质水平)的线性符合相关系数(R)不小于0.990的可接受标准。因此,本发明的分析方法具有较好的线性。且通过二肽异构体与二肽线性方程斜率的比值(42803.930/39853.362≈1.07)得到校正因子,其落在0.9-1.1的范围内,无需校正。
(5)线性
分析方法的范围系指用该方法测定得到具有一定精密度、准确度和线性关系结果的被分析物高浓度和低浓度区间。
分析方法的范围通过分析0.05%、0.5%和1.5%级别的溶液来证明,二肽具体结果如表7所示,二肽异构体具体结果如表8所示。
表7二肽范围结果
表8:二肽异构体范围结果
结果表明:各级别的平均回收率满足可接受标准在80-120%之间。各级别下的回收率的RSD满足可接受标准不得大于15%,相关系数(R)满足可接受标准不小于0.990。因此证明了本发明的分析方法中二肽的范围是0.3835μg/ml至11.5060μg/ml,二肽异构体的范围是0.3754μg/ml至11.2606μg/ml。
(6)定量限
定量限系指在规定的实验条件下供试品中被分析物能被测量的最低量,且具有可接受的精密度和准确度。
分析方法的定量限由分析平行配制的6份定量限(LOQ)溶液(二肽浓度0.3835μg/ml,二肽异构体浓度0.3754μg/ml,相当于0.05%水平)来证明,具体结果如表9所示。
表9定量限溶液检测结果
结果表明:6份平行配制的定量限溶液中二肽的信噪比、二肽异构体的信噪比均符合不小于10的可接受标准;二肽的平均回收率、二肽异构体的平均回收率均符合在80-120%之间的可接受标准;二肽的平均回收率的RSD、二肽异构体的平均回收率均符合不大于15%的可接受标准。
(7)检测限
检测限系指在规定试验条件下供试品中被分析物能被检出的最低量,不一定要求定量。
分析方法的检测限由分析平行配制的6份检测限溶液(二肽和二肽异构体的浓度0.19μg/ml,相当于0.025%水平)来证明,具体结果如表10所示。
表10检测限溶液的结果
重复 | 二肽S/N | 二肽异构体S/N |
LOD-1 | 16 | 8 |
LOD-2 | 14 | 8 |
LOD-3 | 14 | 7 |
LOD-4 | 13 | 7 |
LOD-5 | 14 | 8 |
LOD-6 | 13 | 7 |
可接受标准 | 不小于3 | 不小于3 |
合格/失败 | 合格 | 合格 |
结果表明:6份平行配制的检测限溶液中二肽和二肽异构体均能被检出,符合规定(S/N≥3)。
(8)准确度
分析方法的准确度系指用该方法所得测试结果与真值的接近程度。分析方法的准确度应在一定范围内测定。
分析方法准确度通过分析标记供试品(供试品分别标记0.05%、0.5%和1.5%三个级别的二肽异构体)的回收率和RSD证明,具体结果如表11所示。
表11二肽异构体回收率和RSD
结果表明:各级别平均回收率满足可接受标准在80-120%之间。各浓度下的回收率的RSD满足可接受标准不得大于15%。因此,本发明的分析方法是准确的。
对比例1
实验条件:
设备:高效液相色谱仪(HPLC)。
色谱柱:CHIRALPAK QD-AX(手性离子交换剂,以金鸡纳氨基甲酸酯作为选择剂,分离原理是利用离子化的选择剂使分析物与电荷相反的选择剂之间产生离子的相互作用),4.6mm*250mm,5μm。流动相的配制:以甲醇、冰醋酸和三乙胺为流动相,甲醇、冰醋酸和三乙胺的质量比为100:2:0.2,进行等度洗脱。流动相的流速为0.5mL/min,柱温为25℃,进样量分别为10μL、30μL和100μL,检测波长为UV 214nm,运行时间20min。
空白溶液:甲醇。
系统适用性溶液的配制:取二肽和二肽异构体适量,用甲醇稀释至每1ml含二肽和二肽异构体各0.5mg的溶液。
测定法:精密量取系统适用性溶液与供试品溶液分别注入液相色谱仪,记录色谱图,具体如图16所示。
结果表明:该色谱条件下,当进样量为10μL或30μL,二肽和二肽异构体峰均响应较低,低于1.0以下;即使增加进样量至100μL,虽主峰响应有变高,但响应有进一步提高的空间,且提高进样量后,二肽和二肽异构体峰的分离度为1.5,分离度变差。
进一步筛选流动相,发现在CHIRALPAK QD-AX(手性离子交换剂)色谱柱条件下,峰响应总体偏低,低于1.0。当选择甲醇、冰醋酸和二乙胺=500:5:1的流动相,色谱峰非常容易出现分叉现象,具体如图17所示。当选择甲醇:冰醋酸:三乙胺=500:5:4的流动相,会出现未知峰,具体如图18所示,分析可能原因为流动相的pH接近6.0,与二肽的pKa接近,二肽呈现部分离子化的状态,同一化合物的两种状态在该色谱条件下有分离趋势,故呈现三个峰的状态。当选择其它流动相体系,色谱法完全未分离或者分离度≤1.5。因此该方法不适用。
对比例2
实验条件:
设备:高效液相色谱仪(HPLC)。色谱柱:CHIRALPAK IC(多糖衍生物耐溶剂型手性柱,硅胶表面共价键合有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯),手性识别可能来源于分子中多个编写葡萄糖单元的手性中心、聚合物骨架的螺旋扭曲以及手性内腔的相邻聚合物链的联结),4.6mm*250mm,5μm。
设置了4组流动相进行筛选(#1组为乙腈:异丙醇=90:10、#2组为乙腈:异丙醇=60:40、#3组为0.1%三氟乙酸乙腈溶液:异丙醇=95:5、#4组为正己烷:异丙醇=6:40);流动相的流速为0.5mL/min,柱温为25℃,进样量为10μL,检测波长为UV 214nm,运行时间20min。
空白溶液:异丙醇。
系统适用性溶液的配制:取二肽和二肽异构体适量,用异丙醇稀释至每1ml含二肽和二肽异构体各0.5mg的溶液。
测定法:精密量取系统适用性溶液与供试品溶液分别注入液相色谱仪,记录色谱图,其中#1组的典型图谱如图19所示。
结果表明,该色谱柱条件下,以上4组流动相洗脱出完全未分离的二肽和二肽异构体峰,因此该方法不适用。
Claims (10)
1.一种定量检测二肽中异构体含量的液相分析方法,其特征在于:所述液相分析方法采用大环抗生素作为手性选择剂,由水、醇和甲酸组成的流动相进行洗脱,所述二肽由一个含手性α-碳原子的氨基酸和一个含非手性α-碳原子的氨基酸组成。
2.根据权利要求1所述的液相分析方法,其特征在于:所述含手性α-碳原子的氨基酸选自组氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或颉氨酸的天然氨基酸或上述天然氨基酸的衍生物;所述含非手性α-碳原子的氨基酸选自甘氨酸(天然氨基酸)、2-氨基异丁酸(Aib,非天然氨基酸或合成氨基酸)、2,2-二乙基甘氨酸、氮杂丙氨酸或氮杂甘氨酸。
3.根据权利要求1所述的液相分析方法,其特征在于:所述二肽选自His-Aib-O、Boc-His-Aib-OH、His(Trt)-Aib-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH、His-Gly-OH、Boc-His-Gly-OH、His(Trt)-Gly-OH或Boc-His(Trt)-Gly-OH。
4.根据权利要求1所述的液相分析方法,其特征在于:所述大环抗生素CSPs选自万古霉素、替考拉宁、替考拉宁的苷元和/或瑞斯托霉素A。
5.根据权利要求4所述的液相分析方法,其特征在于:所述大环抗生素CSPs为替考拉宁。
6.根据权利要求1~5任一项所述的液相分析方法,其特征在于:所述流动相中的醇可选为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或多种,优选异丙醇。
7.根据权利要求1所述的液相分析方法,其特征在于:所述甲酸在水和醇的混合溶剂中的质量占比可选为0.001%~0.5%,优选为0.0016%~0.02%。
8.根据权利要求7所述的液相分析方法,其特征在于:所述水、醇类溶剂和甲酸的质量比为50:50:0.02。
9.根据权利要求1所述的液相分析方法,其特征在于:所述水和醇的质量比为1:10~10:1,优选1:4~3:2。
10.根据权利要求1~5或7~9任一项所述的液相分析方法,其特征在于:所述流动相的流速为0.5~1.0ml/min,色谱柱的柱温为20~45℃,进样溶液浓度为0.5~1.0mg/ml,进样量5~20μl,运行时间为15~40min。
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