CN116948915A - 一株大豆发酵芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株大豆发酵芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及工业微生物技术领域，具体公开了一株大豆发酵芽孢杆菌及其应用。本发明提供一株大豆发酵芽孢杆菌(Bacillus glycinifermentans)veb01，该菌株具有良好的抗逆性，能够耐盐、耐高温、耐乙醇，在8％盐分、55℃、5％乙醇条件下生长良好，同时还能高产木聚糖酶、蛋白酶，可用于大豆制品的发酵，能提升产品氨氮、谷氨酸和还原糖水平，降低粗纤维的含量，提高原料利用率。同时该菌株可用于制备粗酶制剂，对大豆膳食纤维进行处理后，可有效提升大豆膳食纤维的总膳食纤维和可溶性膳食纤维的含量，提高产品质量。

Description

一株大豆发酵芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于工业微生物领域，尤其是涉及一株大豆发酵芽孢杆菌及其应用。
背景技术
大豆是人类非常重要的营养来源，各类大豆来源的食品、调味品渗透在国人的日常饮食中，如大豆油、豆腐、豆浆、豆奶、豆类制品、豆豉、酱油、豆酱等等，同时大豆也是重要的动物饲料，是养殖业不可或缺的蛋白来源，在食品加工过程中通过技术手段提升大豆营养成分的利用效率具有重要意义。
对于提升大豆营养成分的利用效率的研究，主要分为饲料和食品加工两个方向。在饲料方面，通过单体氨基酸补充降低豆粕使用已有一定成效，单体氨基酸大多通过生物发酵制备，在菌种技术不断加持下这种方案有一定成本优势，取得较好效益，但这一方案往往应用基因工程改造菌种来提升氨基酸得率，并不适用于食品工业。在食品加工方面，主要包括加工方式改进、高效微生物选育、外源酶制剂协同等方案。例如在豆制品发酵过程中，通过改变蒸煮条件，使抗营养因子变性，能够提升利用率，但是充分的变性需要更高温度和压力，对设备要求较高，往往伴随高昂的设备投入，并增加能耗，并不符合当前清洁生产的要求。而传统法发酵菌种如米曲霉、毛霉等，能够产生丰富的酶系，通过提升产酶水平也能提高大豆营养成分的利用效率，但是育种周期长，成本高，而且存在退化的风险。同时新菌种的引入往往需要考虑加工过程适配性，大豆发酵制品往往存在高盐、过程高温、半开放发酵产生酒精等情况，对微生物生长有一定抑制作用，存在新筛选菌种抗逆性难以满足生产条件的问题。此外，增加外源酶系也是一种常用的提升大豆营养成分的利用效率的方式，而这种方法往往受限于商业化酶制剂产品的丰富程度和使用成本。因此，从传统大豆发酵制品中，筛选抗逆性好、产酶水平高的菌种，通过协同发酵或者制备酶制剂的方式提高大豆制品的营养成分的利用效率具有重要意义。
发明内容
基于以上技术问题，本发明的主要目的在于克服上述背景技术的不足之处，从传统发酵豆制品中分离出一株大豆发酵芽孢杆菌(Bacillus glycinifermentans)veb01，该菌株具有良好的抗逆性，能够耐盐、耐高温、耐乙醇，在8％盐分、55℃、5％乙醇条件下生长良好，同时还能高产木聚糖酶、蛋白酶，可用于大豆制品的发酵，能提升产品氨氮、谷氨酸和还原糖水平，降低粗纤维的含量，提高原料利用率。
为实现上述目的，发明人进行了深入研究，并经重复多次研究论证而完成获得本发明方案，具体如下：
第一方面，本申请实施例提供了一株大豆发酵芽孢杆菌(Bacillus glycinifermentans)veb01，其特征在于，所述大豆发酵芽孢杆菌veb01已于2023年06月01日保藏于广东微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63512。
第二方面，本发明提供了一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包含上述大豆发酵芽孢杆菌veb01。
第三方面，本发明提供了上述大豆发酵芽孢杆菌veb01或发酵菌剂在大豆制品发酵中的应用。
进一步地，所述应用为用于酱油的发酵
第四方面，本发明提供了一种酱油的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括在发酵至20-30天的酱油酱醪中添加上述大豆发酵芽孢杆菌veb01或发酵菌剂的步骤。
第五方面，本发明提供了上述大豆发酵芽孢杆菌veb01或发酵菌剂在制备木聚糖酶中的应用。
第六方面，本发明提供了一种粗酶液，其特征在于，所述粗酶液由上述大豆发酵芽孢杆菌veb01的发酵液过滤、浓缩得到。
第七方面，本发明提供了上述粗酶液在制备大豆膳食纤维中的应用。
第八方面，本发明提供了一种提升大豆膳食纤维质量的方法，其特征在于，包含将大豆膳食纤维用上述粗酶液进行处理的步骤。
进一步地，所述粗酶液处理的条件为35-45℃处理4-6h。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1、大豆发酵制品广泛应用在食品、饲料等领域，发酵过程中存在高温、高盐、含酒精等环境因素可能对菌种的生长造成一定影响，本发明提供的大豆发酵芽孢杆菌veb01，具有良好的抗逆性，能够耐盐、耐高温、耐乙醇，在8％盐分、55℃、5％乙醇条件下生长良好，可用于大豆制品的发酵。
2、本发明提供的大豆发酵芽孢杆菌veb01，能高产木聚糖酶、蛋白酶，用于大豆制品的发酵，无需添加外源酶，就可以提升产品氨氮、谷氨酸和还原糖水平，降低粗纤维的含量，提高原料利用率。
3、本发明提供的大豆发酵芽孢杆菌veb01可用于制备粗酶制剂，对大豆膳食纤维进行处理后，可有效提升大豆膳食纤维的总膳食纤维和可溶性膳食纤维的含量，提高产品质量。
附图说明
图1为大豆发酵芽孢杆菌veb01菌落形态图；
图2为不同温度下大豆发酵芽孢杆菌veb01生长曲线图；
图3为不同盐分下大豆发酵芽孢杆菌veb01生长曲线图；
图4为不同乙醇浓度下大豆发酵芽孢杆菌veb01生长曲线图；
本发明提供的大豆发酵芽孢杆菌(Bacillus glycinifermentans)veb01，已于2023年06月01日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:63512；该菌株于2023年06月01日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2023年06月01日检测为存活菌株。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规食品级试剂、方法和设备。
本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1菌种的筛选
1.菌株分离：
取1g采集的大豆发酵制品，置于15mL无菌离心管中，加入10mL生理盐水，适量5mm玻璃珠，在振荡器上充分震荡混匀，获得混匀液。将装有混匀液的离心管置于在90℃水浴锅中保温30分钟，杀死大部分细胞，保留芽孢。处理后的离心管用自来水冷却，然后进行10倍稀释后涂布PCA平板。37℃培养过夜，选择菌落分离效果较好的平板挑取单菌落，选择表面略湿润、略透明的菌落，重新稀释涂布，再次分离，以确定获得纯菌落。将菌落形态一致的平板，挑取大小合适的菌落，进行耐热性测试和16S rDNA序列分析。
2.耐热性测试及菌种鉴定：
将挑选的菌落在LB液体培养基中37℃培养过夜，然后取3uL菌液滴在PCA平板，分别在37℃、45℃和55℃下静置培养48小时后，观察生长情况。同时将挑选的菌落使用通用引物扩增16S rDNA序列，进行测序分析，获得序列后在NCBI进行BLAST分析，确定菌落种属。结果记录于表1中。
表1：筛选菌种情况
上述表格中“+++”表示55℃、45℃和37℃下培养48小时均可见明显菌落；“++”表示45℃和37℃下培养48小时均可见明显菌落；“+”表示仅在37℃下培养48小时可见明显菌落。
由表中结果可知，594号菌株耐热性最佳，具有应用潜力，该菌株在PCA平板培养基上的菌落形态如图1所示。经16S rDNA测序鉴定为大豆发酵芽孢杆菌(Bacillusglycinifermentans)，将此菌种命名为veb01，于2023年06月01日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63512。
实施例2大豆发酵芽孢杆菌veb01性能测定
1.温度性能测定：
挑取大豆发酵芽孢杆菌veb01单菌落接种至LB培养基中37℃培养过夜，进行活化；将活化后的菌液按2％接种量接种至LB培养基，分别在25℃、37℃、42℃、50℃和60℃下震荡培养，每个温度3个平行，固定时间取样测定OD600。取每个检测点平均值，绘制不同温度下veb01的生长曲线，结果记录于图2中。
图2结果表明大豆发酵芽孢杆菌veb01具有一定耐热性，在50℃条件下生长良好，且平台期生物量相比25℃、37℃、42℃更高，但是当温度升高到60℃时，菌体不再生长；结合实施例1的初筛测试结果说明，大豆发酵芽孢杆菌veb01可耐受55℃高温，在50℃下液态培养生长良好。
2.耐盐性能测定：
挑取大豆发酵芽孢杆菌veb01单菌落接种至LB培养基中37℃培养过夜，进行活化；将活化后的菌液按2％接种量接种至含5％、8％、12％氯化钠的LB培养基，在37℃下震荡培养，固定时间取样测定OD600，绘制不同盐分下veb01的生长曲线，结果记录于图3中。
图3结果表明，大豆发酵芽孢杆菌veb01能够耐受8％盐分，12％盐分下生长受到明显抑制，但并不致死，后期还是会有缓慢生长。
3.耐乙醇性能测定：
挑取大豆发酵芽孢杆菌veb01单菌落接种至LB培养基中37℃培养过夜，进行活化；将活化后的菌液按2％接种量接种至含1％、3％、5％乙醇的LB培养基，在37℃下震荡培养，固定时间取样测定OD600，绘制不同乙醇浓度下veb01的生长曲线，结果记录于图4中。
图4结果表明，大豆发酵芽孢杆菌veb01能够耐受一定浓度乙醇，在5％乙醇浓度下仍能很好生长，可满足一般性的大豆制品发酵条件要求。
4.产酶特性测定
挑取大豆发酵芽孢杆菌veb01单菌落接种至LB培养基中37℃培养过夜，进行活化；将活化后的菌液按5％接种量接种至LB液体培养基，在37℃下震荡培养48小时，取培养液按国标方法测定纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶酶活情况，同时以初筛获得的另一株大豆发酵芽孢杆菌606作为对照，结果记录于表2中。
表2：酶活测定结果
项目 veb01 606 测定方法
纤维素酶(U/mL) 34±5 51±3 GB/T 23881-2009
木聚糖酶(U/mL) 1319±21 421±19 GB/T 23874—2009
蛋白酶(U/mL) 853±14 509±20 GB1886.174
淀粉酶(U/mL) 59±6 130±14 GB1886.174
由表2结果可知，大豆发酵芽孢杆菌veb01培养液中木聚糖酶和蛋白酶的酶活明显高于对照组，大豆发酵芽孢杆菌veb01具有高产木聚糖酶和蛋白酶的特性，将对大豆糖类和蛋白质类大分子的分解具有促进作用。
实施例3大豆发酵芽孢杆菌veb01传代稳定性测试
挑取大豆发酵芽孢杆菌veb01单菌落接种至LB培养基中37℃培养过夜，进行活化；将活化的菌液接种至LB固体培养基，37℃恒温培养24小时，之后继续转接于LB固体培养基，37℃恒温培养24小时，以此类推获得不同代数的菌株来测定菌种传代稳定性。将第1代、第5代和第10代的菌种活化后按5％接种量接种至LB液体培养基中，37℃下震荡培养48小时后取培养液按实施例2方法测定木聚糖酶和蛋白酶活力水平，结果记录于表3中。
表3：veb01传代稳定性测试结果
传代数 木聚糖酶酶活(u/mL) 蛋白酶酶活(u/mL)
第1代 1250±13 921±15
第5代 1269±45 884±31
第10代 1293±36 891±38
由表3结果可知，大豆发酵芽孢杆菌veb01经过传代后，木聚糖酶和蛋白酶活力水平没有明显差异，菌种产酶能力没有明显差异，传代性能稳定。
实施例3大豆发酵芽孢杆菌veb01用于酱油发酵
酱油发酵：大豆经清洗、浸泡、蒸煮后，冷却至室温，按7:3干料质量比拌入小麦粉，加入干料1‰的沪酿3.042曲精，在32℃培养12h后进行翻曲，然后转入28℃继续培养至黄豆表面布满黄绿色孢子。取成曲250g，置于900mL酱瓶中，加入500g 18％(M/V)盐水，充分混匀，在30℃恒温室进行发酵。
大豆发酵芽孢杆菌veb01培养：veb01经活化一代后转接到含5％氯化钠的LB培养基中，37℃，210rpm/min，恒温空气摇床培养2天。
大豆发酵芽孢杆菌veb01回填：将培养2天的veb01菌液以107CFU/mL的接种量回填到发酵第25天的酱醪中。继续发酵至60天，测定原油还原糖、氨氮、谷氨酸指标，并测定酱渣的粗纤维含量。同时设置606菌株回填组和不回填对照组对比测试，结果记录于表4中。
表4：Veb01用于酱油发酵测试结果
由表3结果可知，大豆发酵芽孢杆菌veb01回填组在还原糖、氨氮指标上均有一定提升，意外的发现谷氨酸指标也有升高(7％)，并且大豆发酵芽孢杆菌veb01回填组酱渣粗纤维含量明显有下降，说明veb01对于大豆营养成分的分解有提升效果。
实施例4大豆发酵芽孢杆菌veb01用于大豆膳食纤维改性
大豆膳食纤维可广泛应用于肉制品、速冻食品、调料食品、烘焙食品、糖果、饮料、米面制品及保健品。其中总膳食纤维和可溶性膳食纤维是重要的品质指标。大豆发酵芽孢杆菌veb01可产生木聚糖酶，使用veb01粗酶制剂改性大豆膳食纤维可提升总膳食纤维和可溶性膳食纤维的含量，提高益生品质。
粗酶的制备：挑取大豆发酵芽孢杆菌veb01单菌落接种至LB培养基中37℃培养过夜，进行活化；将活化的veb01按照5％体积比接种到LB液体培养基中，37℃培养12-16h，获得一级种子液。将一级种子液按6％接种量接种到15L发酵罐中进行发酵(发酵罐培养基1％酵母粉，4％蛋白胨，2％葡萄糖，氨水调初始pH 7.0)，控制发酵温度37℃，转速200-500rpm，通气量0.72m3/h，流动补充葡萄糖作为碳源，控制糖浓度10g/L，连续发酵48h下罐。下罐的发酵液经4000rpm离心10min取上清，加入5％硅藻土搅拌30min混匀。然后进行板框压滤工艺获得清液，使用分子量5kDa的超滤浓缩柱子浓缩，弃去废液，浓缩倍数3-5倍，使用0.22μM滤膜过滤除菌，即为粗酶液。
改性方法：称取100g大豆膳食纤维，加入1900mL水中，搅拌均匀，加入20mL粗酶液、1g山梨酸钾，40℃下处理5小时后，抽滤并冷冻干燥。干燥后粉碎过筛，检测总膳食纤维与可溶性膳食纤维含量，结果记录于表5中。
表5 大豆膳食纤维改性测试结果
检测指标 改性前 改性后 检测方法
总膳食纤维 70.1 73.8 GB5009.88-2014
可溶性膳食纤维 4.68 6.59 GB5009.88-2014
结果见表5所示，经过veb01粗酶液改性后，大豆膳食纤维的总膳食纤维和可溶性膳食纤维含量有得到明显提升，大豆膳食纤维质量指标由三级提升至二级。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一株大豆发酵芽孢杆菌(Bacillus glycinifermentans)veb01，其特征在于，所述大豆发酵芽孢杆菌veb01的保藏编号为GDMCC No:63512。
2.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包含如权利要求1所述的大豆发酵芽孢杆菌veb01。
3.如权利要求1所述的大豆发酵芽孢杆菌veb01或权利要求2所述的发酵菌剂在大豆制品发酵中的应用。
4.如权利要求3所述的应用为用于酱油的发酵。
5.一种酱油的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括在发酵至20-30天的酱油酱醪中添加权利要求1所述的大豆发酵芽孢杆菌veb01或权利要求2所述的发酵菌剂的步骤。
6.如权利要求1所述的大豆发酵芽孢杆菌veb01或权利要求2所述的发酵菌剂在制备木聚糖酶中的应用。
7.一种粗酶液，其特征在于，所述粗酶液由权利要求1所述的大豆发酵芽孢杆菌veb01的发酵液过滤、浓缩得到。
8.如权利要求7所述的粗酶液在制备大豆膳食纤维中的应用。
9.一种提升大豆膳食纤维质量的方法，其特征在于，包含将大豆膳食纤维用权利要求7所述的粗酶液进行处理的步骤。
10.如权利要求9所述的提升大豆膳食纤维质量的方法，其特征在于，所述的粗酶液处理的条件为35-45℃处理4-6h。
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