CN116930284A - 生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明的一个方式提供一种能够进行重现性高的测定的生物传感器。本公开中,作为一个方式,涉及一种生物传感器,其具有基材、在上述基材的表面形成的包含2个以上的电极的导电部、以及载置在上述导电部的至少一部分上的试剂层,其中,上述试剂层的平均厚度为5μm~10μm,上述试剂层的周边部的平均厚度相对于中央部的平均厚度之差为‑6μm~+5μm。[平均厚度之差]=[周边部的平均厚度]‑[中央部的平均厚度]。
Description
技术领域
本公开涉及生物传感器以及使用了该生物传感器的测定方法。
背景技术
生物传感器是使用了配置有酶等生物物质的检测部的分子识别元件和电极之类的换能器(信号转换器件)的分子测量装置,其被用于以葡萄糖为代表的各种生物体内的分析对象物的测定。
生物传感器通常具有电极和载置在该电极上的试剂层。作为形成试剂层的方法,有将包含氧化还原酶和电子传递物质等的试剂液涂布在电极上并使其干燥的方法。作为试剂液的涂布方法,例如有浸渍法、点胶(dispenser)法、丝网印刷法、胶版印刷法以及喷墨印刷法等(日本特开2011-99693号公报、日本特开平6-3317号公报和日本特开2017-520773号公报)。
发明内容
在使用生物传感器进行的以葡萄糖为代表的各种生物物质的测定中,要求以更高的精度(重现性)进行测定。因此,本公开提供可进行重现性高的测定的生物传感器、以及使用了该生物传感器的测定方法。
本公开中,作为一个方式,涉及一种生物传感器,其是具有基材、在上述基材的表面形成的包含2个以上的电极的导电部、以及载置在上述导电部的至少一部分上的试剂层的生物传感器,其中,上述试剂层的平均厚度为5μm~10μm,上述试剂层的周边部的平均厚度相对于中央部的平均厚度之差为-6μm~+5μm。
[平均厚度之差]=[周边部的平均厚度]-[中央部的平均厚度]
本公开中,作为其他方式,涉及使用本公开的生物传感器对试样中的测定对象物进行电化学测定的方法,其包括:使试样与上述生物传感器的试剂层接触;在上述生物传感器的电极之间施加电压;以及测定通过上述电压的施加而产生的电信号。
根据本公开,能够提供可进行重现性高的测定的生物传感器、以及使用了该生物传感器的测定方法。
附图说明
图1是示出本公开的一个实施方式中的生物传感器、以及使用该生物传感器的测定装置的外观的立体图。
图2是示出本公开的一个实施方式中的生物传感器的概略构成的示意图。
图3是用于说明实施例中的试剂层的形成方法的示意图。
图4是用于说明实施例中的试剂层的厚度的测定的示意图。
图5是实施例中得到的结果的一例,示出所得到的试剂层中的平均厚度和周边部与中央部的平均厚度之差的关系。
图6是实施例中得到的结果的一例,示出葡萄糖电流值的变异系数(%)(葡萄糖响应电流值重现性)和试剂层的周边部与中央部的平均厚度之差的关系。
具体实施方式
本发明人在为了提供重现性提高的生物传感器而反复进行研究的过程中发现,若是具备下述试剂层的生物传感器则能够实现高重现性,该试剂层的平均厚度为5μm~10μm、由下式计算出的试剂层的周边部的平均厚度相对于中央部的平均厚度之差为-6μm~+5μm。
[试剂层的周边部的平均厚度相对于中央部的平均厚度之差]=[周边部的平均厚度]-[中央部的平均厚度]
若试剂层的平均厚度以及周边部与中央部的平均厚度之差为上述范围,则试样被供给至试剂层时发生的试剂的溶解大致均匀,能够抑制试剂的溶解不均。其结果,可推测在生物传感器间可能产生的测定误差(对已知浓度的成分进行测定时在不同的生物传感器间产生的测定结果的偏差)降低,重现性提高。但是,本公开并不限定于该机理。
另外,本发明人得到了下述见解:试剂层中的试剂的浓度或量的不均成为试剂产生溶解不均的原因,进而招致重现性的降低。即,试剂层通常通过涂布包含氧化还原酶和电子传递物质等成分的试剂液并使其干燥而形成。当涂布试剂液时,由于干燥过程中产生的浓度梯度,试剂从周边部析出,从周边部开始生长结晶。该试剂层形成时(特别是试剂的干燥时)所产生的成分析出时机的差异成为试剂层中的氧化还原酶等成分的浓度或量产生不均的原因。另外,还已知通过仅滴加1次试剂液而形成试剂层的方法,但这种情况下,周边部的试剂量多、中心部的试剂量减少,因此成为试剂层中的氧化还原酶等成分的浓度或量产生不均的原因。
日本特开2011-99693号公报中公开了为了避免因液滴彼此的合体所致的酶量不均的产生,按照使液滴分离的方式进行喷吹而形成试剂层的方法。但是,该文献的方法中存在下述问题:在需要在有限的范围内载置足够量的试剂的生物传感器中,无法载置足够量的试剂。
本发明人为了降低该不均的产生,尝试了通过将包含氧化还原酶和电子传递物质等试剂成分的试剂液(点状试剂)以规定的间隔(隔开规定的距离)排出,按照液滴彼此实质上不合体的方式将试剂以点状配置,将其层积一体化而进行试剂层的形成。通过像这样将点状试剂以规定的间隔配置并且进行层积一体化,能够降低试剂层形成时的干燥不均、以及试剂层内的试剂成分的浓度或量的不均。另外,通过将试剂以点状配置并进行层积,能够将足够量的试剂载置于生物传感器中。
[生物传感器]
本公开中,作为一个方式,涉及一种生物传感器,其具有基材、在上述基材的表面形成的包含2个以上的电极的导电部、以及载置在上述导电部的至少一部分上的试剂层。本公开的生物传感器中,试剂层的平均厚度为5μm~10μm,试剂层的周边部的平均厚度相对于中央部的平均厚度之差为-6μm~+5μm。
[平均厚度之差]=[周边部的平均厚度]-[中央部的平均厚度]
根据本公开的生物传感器,在一个或多个实施方式中能够实现重现性高的测定。根据本公开的生物传感器,在一个或多个实施方式中,可降低批次间差异、批次内差异,能够输出正确的响应测定值,提供准确的值。
试剂层的平均厚度为5μm~10μm。从得到更高的重现性的方面出发,试剂层的平均厚度优选大于5μm、为6μm以上、6.5μm以上或7μm以上。从同样的方面出发,试剂层的平均厚度优选为9.5μm以下、9μm以下或8.5μm以下。试剂层的平均厚度可以通过实施例中记载的方法进行测定、计算。试剂层的厚度的测定例如可以如实施例中所记载,通过沿着试剂层的短边方向的中心线(图4的箭头的位置)测定厚度来进行。图4是用于说明试剂层的平均厚度的测定方法的示意图,仅抽出试剂层来进行记载。需要说明的是,本公开中的试剂层是指载置于实质上参与分析对象物的测定的区域的试剂的层。作为实质上参与分析对象物的测定的区域,在一个或多个实施方式中,可以举出样本流动的流路内。
试剂层的周边部的平均厚度相对于中央部的平均厚度之差(也称为“周边部与中央部的平均厚度之差”)为-6μm~+5μm。从得到更高的重现性的方面出发,周边部与中央部的平均厚度之差优选为-5μm~+5μm、-4μm~+4μm、-3μm~+3μm、-2μm~+2μm或-1μm~+1μm。另外,从同样的方面出发,更优选为-3.5μm~+2.5μm、-3μm~+2μm或-3μm~+1.5μm。试剂层的周边部的平均厚度相对于中央部的平均厚度之差可以通过实施例中记载的方法进行计算。
试剂层的中央部的平均厚度和周边部的平均厚度可以如实施例中所记载的方法那样,使用通过与试剂层的平均厚度相同的方法测定的厚度来进行计算。
[试剂层的形状:棱柱(长方体)]
试剂层的形状为棱柱(长方体)或与之类似的形状的情况下,试剂层的中央部的平均厚度也可以是从试剂层的短边方向中心线与长边方向中心线的交点起在短边方向上各0.1mm宽(合计宽度0.2mm、例如图4的CE)处的平均厚度。在基材上形成有样本流动的流路的生物传感器中,在试剂层被载置于该流路内,试剂层的短边方向为样本在流路中流动的流路方向,试剂层的长边方向为与该流路方向正交的生物传感器的宽度方向的情况下(例如图2的方式),试剂层的中央部的平均厚度可以换言为从试剂层的短边方向中心线与长边方向中心线的交点起向上游侧和下游侧各0.1mm宽(合计宽度0.2mm)处的平均厚度。
在试剂层的形状为棱柱(长方体)的情况下,试剂层的周边部的平均厚度是指从试剂层的短边方向的两端部起各0.1mm宽(例如图4的EN1和EN2)处的平均厚度。
[试剂层的形状:圆柱]
在试剂层的形状为圆柱或与之类似的形状的情况下,试剂层的中央部的平均厚度是指在生物传感器的长边方向上从试剂层的中心起半径0.1mm宽处的平均厚度。周边部的平均厚度是从圆周部起0.1mm宽处的平均厚度,是指在与生物传感器的长边方向平行的试剂层的中心线上从试剂层的两端部(圆周部)起各0.1mm宽(宽度0.1mm×2)处的平均厚度。
试剂层的中央部的平均厚度和周边部的平均厚度可以通过实施例中记载的方法进行测定、计算。
在一个或多个实施方式中,从上面观察的试剂层的形状可以举出圆形、椭圆形以及多边形等。作为多边形,在一个或多个实施方式中可以举出三角形、四边形、矩形、五边形、六边形、七边形和八边形等。在一个或多个实施方式中,试剂层也可称为柱状结构体。在一个或多个实施方式中,试剂层可以为棱柱、圆柱或椭圆柱。在一个或多个实施方式中,试剂层为四棱柱,优选为大致长方体。在为大致长方体的情况下,在一个或多个实施方式中,试剂层按照其长边方向与生物传感器的长边方向正交的方式配置在基材上。
在一个或多个实施方式中,试剂层可以通过利用点式印刷将包含氧化还原酶和电子传递物质的试剂液层积在形成有导电部的基材上而形成。从得到更高的重现性的方面出发,在一个或多个实施方式中,第2层以后的点式印刷优选在通过点式印刷先行配置的试剂液干燥后进行。
试剂层的大小可以根据基材、流路和导电部的形状等适当地确定。在基材为宽度7mm、长度30mm的矩形形状、流路为宽度1.8mm、长度4mm的矩形形状、并且露出于流路的导电部中的工作电极的形状为宽度1.8mm、长度0.8mm的矩形形状的情况下,在一个或多个实施方式中,试剂层的宽度(生物传感器的短边方向的长度)为1.5mm以上、2mm以上、2.5mm以上或3mm以上。在一个或多个实施方式中,试剂层的宽度(生物传感器的短边方向的长度)为5mm以下、4.5mm以下或4mm以下。在一个或多个实施方式中,试剂层的长度(生物传感器的长边方向的长度)为0.5mm以上、0.6mm以上、0.8mm以上或0.9mm以上。在一个或多个实施方式中,试剂层的长度(生物传感器的长边方向的长度)为2mm以下、1.6mm以下或1.4mm以下。
在一个或多个实施方式中,试剂层的底面的大小(纵×横)为0.5mm×1.5mm~2mm×5mm。本公开中,试剂层的纵向在一个或多个实施方式中可以为生物传感器的长边方向。试剂层的横向在一个或多个实施方式中可以为生物传感器的短边方向。
在一个或多个实施方式中,本公开的生物传感器中的试剂层包含氧化还原酶和电子传递物质。
[氧化还原酶]
作为氧化还原酶,在一个或多个实施方式中,可以举出葡萄糖脱氢酶(GDH)、葡萄糖氧化酶(GOD)、胆固醇氧化酶、醌血红素乙醇脱氢酶(QHEDH(PQQ Ethanol dh))、山梨糖醇脱氢酶、D-果糖脱氢酶、D-葡糖苷-3-脱氢酶、纤维二糖脱氢酶、乳酸氧化酶(LOD)、乳酸脱氢酶(LDH)和尿酸脱氢酶等。
在一个或多个实施方式中,氧化还原酶可以具有黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、吡咯并喹啉醌(PQQ)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)作为辅酶(也称为催化亚基或催化结构域)。作为具有辅酶的氧化还原酶,在一个或多个实施方式中,可以举出FAD-GDH、PQQ-GDH、NAD-GDH和NADP-GDH等。
在一个或多个实施方式中,作为氧化还原酶,可以举出米曲霉(Aspergillusoryzae)型FAD-GDH(黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶)等。作为米曲霉型FAD-GDH,在一个或多个实施方式中,可以使用日本特开2013-083634号中公开的物质。援引该文献的内容作为构成本公开的一部分的内容。
在一个或多个实施方式中,试剂层中的氧化还原酶的混配量为1000KU/cm3以下、优选为500KU/cm3以下、更优选为300KU/cm3以下。试剂层中的氧化还原酶的混配量的上限没有特别限定,在一个或多个实施方式中为1KU/cm3以上。在一个或多个实施方式中,试剂层中的氧化还原酶的混配量为200KU/cm3~300KU/cm3、优选为200KU/cm3~280KU/cm3、更优选为210KU/cm3~260KU/cm3。本公开中,“U”是酶活性的单位,是指在最佳条件下在1分钟内作用于1μmol底物的酶量。本公开中,“KU”是指千单位(kilo-unit)。
[电子传递物质]
在一个或多个实施方式中,电子传递物质可以举出钌化合物、1-甲氧基-PES(1-甲氧基-5-乙基吩嗪硫酸乙酯盐、1-mPES)、1-甲氧基-PMS(1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯盐、1-mPMS)、苯二胺化合物、醌化合物、铁氰化物、辅酶Q0(2,3-二甲氧基-5-甲基对苯醌)、天青A氯化物(3-氨基-7-(二甲基氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物)、酚藏花红(3,7-二氨基-5-苯基吩嗪鎓氯化物)、6-氨基喹喔啉以及四硫富瓦烯等。
作为钌化合物,在一个或多个实施方式中,可以使用作为氧化型的钌络合物存在于反应体系中、作为电子传递物质发挥功能的钌化合物。钌络合物的配体的种类没有特别限定。作为钌化合物,在一个或多个实施方式中可以举出下述化学式所表示的氧化型钌络合物。
[Ru(NH3)5X]n+
作为X,可以举出NH3、卤素离子、CN、吡啶、烟酰胺或H2O,其中优选NH3或卤素离子。作为卤素离子,在一个或多个实施方式中,可以举出Cl-、F-、Br-以及I-。式中的n+表示根据X的种类确定的氧化型钌(III)络合物的价数。作为钌络合物,在一个或多个实施方式中,可以使用日本特开2018-013400号公报中公开的物质。援引该文献的内容作为构成本公开的一部分的内容。作为钌化合物,在一个或多个实施方式中,可以举出[Ru(NH3)6]2+或[Ru(NH3)6]3+等钌六胺等。作为钌化合物,在一个或多个实施方式中,可以举出[Ru(NH3)6]Cl3等。
作为苯二胺化合物,在一个或多个实施方式中,可以举出N,N-二甲基-1,4-苯二胺以及N,N,N’,N’-四甲基-1,4-苯二胺二盐酸盐等。
作为醌化合物,在一个或多个实施方式中,可以举出1,4-萘醌、2-甲基-1,4-萘醌(VK3)、9,10-菲醌、1,2-萘醌、对二甲基醌、甲基苯醌、2,6-二甲基苯醌、1,2-萘醌-4-磺酸钠、1,4-蒽醌、四甲基苯醌以及百里醌等。
作为铁氰化物,在一个或多个实施方式中,可以举出铁氰化钙等。
在一个或多个实施方式中,试剂层中的电子传递物质的混配量为0.1mmol/cm3以上、优选为0.5mmol/cm3以上、更优选为1mmol/cm3以上。试剂层中的电子传递物质的混配量的上限没有特别限定,在一个或多个实施方式中,为50mmol/cm3以下或10mmol/cm3以下。
试剂层可以包含除氧化还原酶和电子传递物质以外的其他成分。作为其他成分,在一个或多个实施方式中,可以举出缓冲剂、氨基酸、表面活性剂、消泡剂和粘结剂等。
作为缓冲剂,在一个或多个实施方式中,可以举出磷酸缓冲剂、胺系缓冲剂以及具有羧基的缓冲剂等。作为胺系缓冲剂,在一个或多个实施方式中,可以举出三(三(羟基甲基)氨基甲烷)、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸)、CHES(N-环己基-2-氨基乙烷磺酸)、CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙烷磺酸)、TAPS(N-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸)、CAPS(N-环己基-3-氨基丙烷磺酸)、Bis-Tris(双(2-羟基乙基)亚氨基三(羟基甲基)甲烷)、TAPSO(2-羟基-N-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸)、TES(N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)、Tricine(N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸)和ADA(N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸)等。作为具有羧基的缓冲剂,在一个或多个实施方式中,可以举出柠檬酸缓冲剂、磷酸柠檬酸缓冲剂、乙酸-乙酸Na缓冲剂、苹果酸-乙酸Na缓冲剂、丙二酸-乙酸Na缓冲剂以及琥珀酸-乙酸Na缓冲剂等。缓冲剂可以为一种,也可以合用两种以上。在一个或多个实施方式中,缓冲剂的pH为6.8~7.5、优选为6.9~7.0。
在一个或多个实施方式中,作为氨基酸,可以举出甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸以及组氨酸等。
在一个或多个实施方式中,作为表面活性剂,可以举出TritonX-100((对叔辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇)、Tween20(聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯)、十二烷基硫酸钠、全氟辛烷磺酸、硬脂酸钠、烷基氨基羧酸(或其盐)、羧基甜菜碱、磺基甜菜碱以及磷酸酯甜菜碱等。表面活性剂可以为一种、也可以合用两种以上。
在一个或多个实施方式中,作为粘结剂,可以举出树脂粘结剂和层状无机化合物等。在一个或多个实施方式中,作为树脂粘结剂,可以举出丁缩醛树脂粘结剂以及聚酯树脂粘结剂等。作为层状无机化合物,可以使用WO2005/043146中记载的层状无机化合物。在一个或多个实施方式中,作为层状无机化合物,可以举出具有离子交换能力的溶胀性粘土矿物等。在一个或多个实施方式中,作为层状无机化合物,可以举出膨润土、蒙脱石、蛭石以及合成氟云母等。粘结剂可以为一种、也可以合用两种以上。
[基材]
在一个或多个实施方式中,作为基材,可以举出片状绝缘性基材。在一个或多个实施方式中,作为基材的材质,可以举出热塑性树脂、热固化性树脂、玻璃、陶瓷和纸等。在一个或多个实施方式中,作为热塑性树脂,可以举出聚醚酰亚胺(PEI)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)以及聚乙烯(PE)等。在一个或多个实施方式中,作为热固化性树脂,可以举出聚酰亚胺树脂和环氧树脂等。
[导电部]
导电部包含2个以上的电极,形成于基材的表面。在一个或多个实施方式中,电极可以为包含工作电极和对电极的电极对,也可以为包含工作电极、对电极和参比电极的三电极体系。在一个或多个实施方式中,导电部可以进一步具有检测电极。在导电部具有至少包含工作电极和对电极的电极对的情况下,在一个或多个实施方式中,试剂层优选至少载置于工作电极上。
在一个或多个实施方式中,作为电极的材质,可以使用具有导电性的材质。在一个或多个实施方式中,作为具有导电性的材质,可以举出金属材料和碳材料等。在一个或多个实施方式中,作为金属材料,可以举出金(Au)、铂(Pt)、银(Ag)、钌(Ru)、钯(Pd)和镍(Ni)合金等。在一个或多个实施方式中,作为镍合金,可以举出镍-钒合金、镍-钨合金以及镍-钌合金等。在一个或多个实施方式中,作为碳材料,可以举出石墨、碳纳米管、石墨烯以及中孔碳等。
在一个或多个实施方式中,电极可以举出通过将金属材料等上述材质在基材上成膜而形成的薄膜电极等。在一个或多个实施方式中,作为成膜方法,可以举出丝网印刷、物理蒸镀(PVD、例如溅射)或化学蒸镀(CVD)等。
在一个或多个实施方式中,作为本公开的生物传感器中的试样,可以举出生物试样等。在一个或多个实施方式中,作为生物试样,可以举出血液和尿以及来自它们的试样、细胞提取试样、以及细胞培养液等。
在一个或多个实施方式中,作为本公开的生物传感器中的测定对象物,可以举出葡萄糖、胆固醇、乙醇、山梨糖醇、果糖、纤维二糖、乳酸和尿素等。
[生物传感器的制造方法]
在一个或多个实施方式中,本公开的生物传感器可以如下制造:准备形成有包含2个以上的电极的导电部的基材,将试剂液通过点式印刷在导电部上进行试剂的层积而形成试剂层。在一个或多个实施方式中,试剂层优选按照载置于2个以上的电极中的至少一个电极(工作电极)上的一部分的方式来形成。
在其他方式中,本公开涉及制造本公开的生物传感器的方法。本公开的生物传感器的制造方法包括:通过将试剂液点式印刷在形成于基材表面的导电部上,对试剂进行层积而形成试剂层;该试剂层的形成包括:按照所形成的试剂层的平均厚度、以及试剂层的周边部的平均厚度相对于中央部的平均厚度之差为上述范围的方式将试剂液点式印刷而对试剂进行层积。
本公开的制造方法中的电极、基材、试剂以及平均厚度与上述本公开的生物传感器相同。
[测定方法]
本公开中,作为其他方式,涉及使用本公开的生物传感器对试样中的测定对象物进行电化学测定的方法,其包括:使试样与上述生物传感器的试剂层接触;在上述生物传感器的电极之间施加电压;以及测定通过上述电压的施加而产生的电信号。
本公开中的“电化学测定”是指应用电化学测定方法进行测定,在一个或多个实施方式中,可以举出电流测定法、电位差测定法、电量分析法等。作为电流测定法,在一个或多个实施方式中,可以举出对通过施加电压使被还原的电子传递物质氧化时所产生的电流值进行测定的方法。
作为所施加的电压没有特别限制,在一个或多个实施方式中,为10mV以上或50mV以上、优选为100mV以上。另外,在一个或多个实施方式中,施加电压为1000mV以下或700mV以下、优选为600mV以下、500mV以下、400mV以下或300mV以下。
<实施方式>
参照附图对本公开的生物传感器的制造方法的一例进行说明。以下说明的实施方式的构成是一例,本公开并不限定于实施方式的构成。本实施方式中,以通过使用喷墨打印机的点式印刷来形成试剂层的情况为例进行说明。
首先,如图2所示,通过溅射在基材上形成由第1电极对10、第2电极对20和血液检测电极30构成的电极体系(导电部)。第1电极对10具有第1工作电极11和第1对电极12,第2电极对20具有第2工作电极21和第2对电极22,该电极体系由5个电极形成。
接着,在第1电极对10(第1工作电极11和第1对电极12)上形成试剂层40。
试剂层40可以通过使用喷墨打印机在基材上的试剂载置面上以规定的间隔进行试剂液的点式印刷(滴加和干燥)来形成。以规定的间隔进行的点式印刷例如可以如下进行:在俯视基材的试剂载置面时,在载置面上虚拟地设置格子(例如斜方格、菱形格、中心矩形格或等腰三角形格),该格子中,在以均等的间隔排列的多个列上使点以均等的间隔排列、并且各列的点各自相互错开配置间隔的一半,交替地反复进行对奇数列上的各点的点式印刷以及对偶数列上的各点的点式印刷。
对试剂层40形成的一个实施方式进行说明。首先,对于第1层,例如在上述奇数列上的各点上滴加试剂液并使其干燥,由此以格子状配置试剂。接着,对于第2层,例如在偶数列上的各点上滴加试剂液并使其干燥,由此在与第1层不同的位置以格子状配置试剂。之后,对于第3层,例如在奇数列上的各点上滴加试剂液并使其干燥,由此在与第1层大致相同的位置以格子状配置试剂。反复进行该试剂液的滴加和干燥。其结果,例如在形成第2层时滴加的试剂液将第1层的试剂的一部分溶解、干燥,由此配置第2层的试剂。第3层和第4层以及此后的层中也反复地进行该试剂的部分溶解和干燥,由此能够形成试剂层的周边部的平均厚度与试剂层的中心部的平均厚度之差为规定范围的试剂层,能够进一步提高重现性。
在形成有试剂层40的基材上配置具有矩形切除部的间隔件(未图示)作为被覆区域2b,在其上配置形成有空气孔2e的合成树脂制造的盖(未图示),由此能够制造生物传感器。
在一个或多个实施方式中,本公开的生物传感器可以用于血糖值计之类的测定装置中。图1中示出测定装置的一例。图1的测定装置1可以用作便携式血糖测定器、血糖自测仪等血糖值计。
如图1所示,测定装置1具备主体1a。主体1a设有用于插入长条状的生物传感器2的插入口1b、显示测定数据的显示画面1c、以及用于与外部设备进行数据通信的连接器1d。
如图1所示,生物传感器2形成有试样供给口2d和空气孔2e。试样供给口2d与后述的流路(图2的2a)连通,空气孔2e是为了将由于从试样供给口2d向流路(图2的2a)内供给试样而带来的流路(图2的2a)内的空气排出而设置的。
图2中示出本公开的生物传感器的一个实施方式的示意图。图2中,上侧为上游侧,下侧为下游侧。
生物传感器2具备基材、使用金属或碳材料在基材上形成的导电部、以及形成于导电部上的试剂层40。在导电部和试剂层40上层积具有矩形切除部的间隔件(未图示)作为被覆区域2b,进而在其上层积形成有空气孔2e的合成树脂制造的盖(未图示)。通过基材、间隔件和盖的层积,形成具有由间隔件的切除部形成的试样供给口2d的空间,该空间构成流路2a。空气孔2e形成于流路2a的下游端附近。
本实施方式中,基材的宽度为7mm、长度为30mm、厚度为250μm。流路2a的宽度为2mm、长度为4mm。试剂层40的宽度(生物传感器的短边方向)为2.7mm、长度(生物传感器的长边方向)为1mm。
导电部按照如下方式形成:作为第1电极对10的第1工作电极11和第1对电极12、作为第2电极对20的第2工作电极21和第2对电极22、以及血液检测电极30这5个电极在流路2a内各个电极在生物传感器2的宽度方向(短边方向)上平行地以矩形状露出。在流路2a中露出的第1电极对10、第2电极对20和血液检测电极30与导入的血液(试样)接触,作为测定区域发挥功能。相邻的各电极间绝缘。在导电部由通过物理蒸镀形成的金属材料形成的情况下,通过利用激光描绘规定的电极图案(修剪),使各电极间绝缘。在导电部使用碳材料形成的情况下,隔开规定的间隔形成各电极。本实施方式的导电部(电极)使用镍钒合金来形成。
各电极沿着生物传感器2的长边方向延伸设置,在上游端侧向生物传感器2的宽度方向弯曲。该弯曲部分从上游侧起按照第2工作电极21、第2对电极22、第1工作电极11、第1对电极12和血液检测电极30的顺序在生物传感器2的宽度方向上并行地配置。各电极在从生物传感器2的上游端到下游端附近的被覆区域2b被上述盖(未图示)所覆盖,但下游端部分未被覆盖而露出,该部分构成插入到主体1a的插入口1b中的连接区域2c。在该连接区域2c,第1工作电极11的引出部11a、第1对电极12的引出部12a、第2工作电极21的引出部21a、第2对电极22的引出部22a以及血液检测电极30的引出部30a分别成为露出的接点。
在生物传感器2的上游部分的宽度方向中央部分,在各电极与盖(未图示)之间形成有间隙。该间隙如上所述是导入包含测定对象物的血液并使其流动的毛细管状的流路2a。另外,作为从上游侧数起的第2个电极的第2对电极22与作为第3个电极的第1工作电极11之间的间隙为非导电区域45,该非导电区域45比其他电极间的间隙更宽。该非导电区域45是通过利用激光在电极层上描绘矩形形状的图案而与其他电极绝缘地形成的区域。
试剂层40载置于第1工作电极11上。载置有该试剂层40的区域的下游侧到达第1对电极12的中间,上游侧到达非导电区域45的中间,但未达到第2对电极22。换言之,第1工作电极11与第2对电极22之间被非导电区域45隔开,因此阻碍了载置于第1工作电极11上的试剂层40与第2对电极22的接触。当血液(试样)被点样至生物传感器2的试样供给口2d时,由于毛细管力而在流路2a中按照第2工作电极21、第2对电极22、第1工作电极11、第1对电极12和血液检测电极30的顺序向下游侧流动。此时,当血液(试样)到达第1工作电极11时,载置于第1工作电极11上的试剂层40的试剂成分被血液(试样)溶解。
作为使用生物传感器2对试样中的测定对象物进行电化学测定的方法的一例,以试样为全血、测定对象物为葡萄糖的情况为例来进行说明。
首先,使全血试样与生物传感器2的试样供给口2d接触。当全血试样被点样至生物传感器2的试样供给口2d时,由于毛细管力而在流路2a中按照第2工作电极21、第2对电极22、第1工作电极11、第1对电极12和血液检测电极30的顺序向下游侧流动。此时,当全血试样到达第1工作电极11时,载置于第1工作电极11上的试剂层40中包含的试剂成分(氧化还原酶和电子传递物质等)被全血试样溶解。
之后,向电极对施加规定的电位时,在试剂层40内存在的电子传递物质与位于试剂层40下的第1工作电极11之间进行电子的转移,从而流通氧化电流。可以基于此进行葡萄糖浓度的测定。作为所施加的电压,在一个或多个实施方式中为10mV~1000mV、优选为100mV~600mV。
上述实施方式以试样为血液(例如全血)的情况下的生物传感器的形态及测定方法为例进行了说明,但本公开并不限定于此,即使为血液以外的尿等各种生物试样也可同样地进行测定。
本公开可非限定性地涉及下述一个或多个实施方式。
[1]一种生物传感器,其具有:
基材;
在上述基材的表面形成的包含2个以上的电极的导电部;以及
载置在上述导电部的至少一部分上的试剂层,
其中,
上述试剂层的平均厚度为5μm~10μm,
上述试剂层的周边部的平均厚度相对于中央部的平均厚度之差为-6μm~+5μm。
[平均厚度之差]=[周边部的平均厚度]-[中央部的平均厚度]
[2]如[1]所述的生物传感器,其中,上述试剂层包含氧化还原酶和电子传递物质。
[3]如[1]或[2]所述的生物传感器,其中,上述试剂层通过将包含氧化还原酶和电子传递物质的试剂液利用点式印刷进行层积而形成。
[4]如[1]至[3]中任一项所述的生物传感器,其中,上述试剂层为大致长方体。
[5]如[4]所述的生物传感器,其中,上述试剂层的底面大小为0.5mm×1.5mm~2mm×5mm。
[6]如[1]至[5]中任一项所述的生物传感器,其中,
导电部具有至少包含工作电极和对电极的电极对,
上述试剂层至少载置在上述工作电极上。
[7]如[1]至[6]中任一项所述的生物传感器,其中,试剂层中的上述氧化还原酶的含量在每单位体积(cm3)的试剂层中为200KU~300KU。
[8]如[2]或[3]所述的生物传感器,其中,上述试剂层中的上述电子传递物质的含量在每单位体积(cm3)的试剂层中为0.1mmol~50mmol。
[9]如[1]至[8]中任一项所述的生物传感器,其中,上述试剂层进一步包含表面活性剂。
[10]使用[1]至[9]中任一项所述的生物传感器对试样中的测定对象物进行电化学测定的方法,其包括:
使试样与上述生物传感器的试剂层接触;
在上述生物传感器的电极之间施加电压;以及
测定通过上述电压的施加而产生的电信号。
以下通过实施例进一步对本公开进行详细说明,但这些实施例为例示,本公开并不限定于这些实施例。
实施例
(实施例1)
在形成有电极的基材(PET、厚度250μm、长度30mm×宽度7mm)上,通过下述过程利用喷墨装置进行试剂的点式印刷,由此形成试剂层。试剂层的形成在室温、湿度50%以下的条件下进行。
<过程>
1.将试剂液填充至喷墨装置的储藏部,在下述条件下将试剂液(粘度:2~3mPa·s)的液滴排出到形成有电极的基材(PET制)上,形成试剂的液滴点(由试剂液构成的点状的液滴、斑点样)(第1层)。使液滴的排出量为12ng(10pL)。使排出液滴的间隔(点的中心间距)为70μm,以格子状进行排出。第1层的液滴点全部形成后,使液滴点干燥(30秒)。干燥后的液滴点的直径为50~70μm。
2.接着,在干燥后的第1层的液滴点上形成试剂的液滴点,使其干燥(第2层)。第2层的液滴点的形成中,使液滴的排出量为23ng(18pL),按照液滴点的中心位于以第1层的相邻的液滴点的中心(图3的c1A、c1B、c1C和c1D)为顶点的正方形的大致中心(图3的c2)的方式来形成。干燥后的液滴点的直径为90~100μm。排出液滴的间隔(点的中心间距)与第1层同样地为70μm。
3.接着,在干燥后的第2层的液滴点上形成试剂的液滴点,使其干燥(第3层)。第3层的液滴点的形成中,使液滴的排出量为23ng,使液滴点的中心位于与第1层的液滴点的中心大致相同的位置。
4.接着,在干燥后的第3层的液滴点上与第2层同样地形成试剂的液滴点并使其干燥(第4层)。
5.最后,在干燥后的第4层的液滴点上与第3层同样地形成试剂的液滴点并使其干燥(第5层)。由此得到三维层积的试剂层(大致长方体(四棱柱))。所得到的试剂层中的FAD-依赖性葡萄糖脱氢酶的混配量为232KU/cm3,电子传递物质的混配量为3.56mmol/cm3。
<液滴点形成条件>
相邻的点中心间距(例如,图3的c1A与c1B的距离(X)):70μm
排出次数:对于试剂层形成区域(长1000μm、宽2700μm、长方体),长14次×宽39次。
本实施例中,首先,在俯视基材的试剂的载置面时,虚拟地设置二维格子。即,各格子点在以均等的间隔排列的多个列上以均等的间隔排列,并且相邻各列的格子点各自相互错开配置间隔的一半来配置。对于第1层,在奇数列上的格子点上滴加液滴并使其干燥,由此形成以格子状排列的第1层的液滴点。然后,对于第2层,在偶数列上的格子点上滴加液滴并使其干燥,由此形成第2层的液滴点。对于第3层,在奇数列上的格子点上滴加液滴并使其干燥,由此形成第3层的液滴点。反复进行该操作。由此,在形成第2层的液滴点时滴加的液滴将第1层的液滴点部分溶解后干燥,形成第2层的液滴点,在第3层形成时、第4层形成时以及第5层形成时也同样地反复进行部分溶解和干燥,因此形成了试剂层的周边部的平均厚度与试剂层的中央部的平均厚度之差为规定范围的试剂层。
试剂液的组成如下。
<试剂液的组成>
FAD-依赖性葡萄糖脱氢酶(商品名:葡萄糖脱氢酶“Amano 8”、MW:18万、天野酶制剂株式会社制造):48KU/mL
Ru络合物(Ru(NH3)6Cl3、LT Metal Co.Ltd公司制造):626mM
1-甲氧基PES(1-甲氧基-5-乙基吩嗪硫酸乙酯盐、株式会社同仁化学研究所公司制造):2.27mM
磷酸缓冲液(pH:7.0):300mM
甘氨酸:2质量%
CHAPS:2质量%
消泡剂:0.04质量%
[试剂层的厚度的测定]
所得到的试剂层的厚度使用台式触针式轮廓测量系统(商品名:DektakXT、BRUKER制)进行测定。测定沿着试剂层的短边方向的中心线(生物传感器的长边方向的中心线、在距左端大约1350μm的位置通过的中心线)进行(图4的箭头方向)。试剂层从上面观察的形状为长方形。
<平均厚度>
在试剂层的短边方向的中心线(距左端大约1350μm的位置)上,以670nm的刻度测定从一个端部到另一端部(从生物传感器的上游侧到下游侧)的高度(试剂层的厚度)。计算出其算术平均值,由此求出试剂层的平均厚度。
<试剂层的周边部的平均厚度相对于中央部的平均厚度之差>
使用如上测定的试剂层的厚度,计算出两端部的平均厚度(THEN)与中央部的平均厚度(THCE)。两端部的平均厚度(THEN)通过将两端部(生物传感器的上游侧和下游侧)(图4的EN1和EN2、各0.1mm宽)的厚度进行算术平均而算出。另外,中央部的平均厚度(THCE)通过将以试剂层的短边方向中心线与长边方向中心线的交点为中心的宽0.2mm处的厚度进行算术平均而算出。即,中央部的平均厚度是在试剂层的短边方向的中心线(上游侧和下游侧)上距该交点各0.1mm宽处(图4的CE、合计宽度0.2mm)的平均厚度。使用所得到的两端部的平均厚度(周边部的平均厚度、THEN)和中央部的平均厚度(THCE),通过下式求出试剂层的周边部与中央部的平均厚度之差。
[周边部与中央部的平均厚度之差]=(THEN)-(THCE)
[葡萄糖电流值重现性试验]
使用通过上述方法形成了试剂层的生物传感器,进行葡萄糖电流值重现性试验。葡萄糖重现性定义为各样本浓度下的葡萄糖电流值(循环伏安法(Cyclic Voltammetry)、C.V.)的平均值。
使用恒电位仪(Arkray株式会社制造),以0.2V施加电压,测定电流值。由所得到的电流值得到变异系数(Coefficient of Variation、CV)(%)。将其结果示于图6。
CV(%)的值低意味着葡萄糖电流值的重现性高,CV(%)小于1.4表示在生物传感器性能上具有理想的重现性。
<评价条件>
使用样本:全血样本
Glu/Hct浓度:Glu45mg/dl/Hct42%、Glu130mg/dl/Hct42%、Glu330mg/dl/Hct42%评价数:n=10(在各Glu/Hct浓度下实施,因此合计实施了30次评价)
图5中示出所得到的试剂层的平均厚度和周边部与中央部的平均厚度之差(高低差)的关系,图6示出葡萄糖响应电流的CV(%)(葡萄糖响应电流值重现性(Glu值重现性))和周边部与中央部的平均厚度之差(高低差)的关系。图5和图6的图中所示的数值为各试剂层的周边部与中央部的平均厚度之差(高低差)。图5中,●绘制点表示试剂层的平均厚度为5μm~10μm的范围内的数据,×绘制点表示5μm~10μm的范围外的数据。图6中,在中央部与周边部的平均厚度之差包含在-6μm~+5μm的范围内的数据中,将Glu值重现性(%)小于1.4%的数据以●绘制点来表示,将1.4%以上的数据以×绘制点来表示。
如图5和图6所示,试剂层的平均厚度(试剂的高度)为5μm~10μm、周边部与中央部的平均厚度之差(高低差)为-6μm~+5μm时,CV(%)小于1.4%,批次间差异、批次内差异降低,得到了高重现性。
Claims (10)
1.一种生物传感器,其具有:
基材;
在所述基材的表面形成的包含2个以上的电极的导电部;以及
载置在所述导电部的至少一部分上的试剂层,
其特征在于,
所述试剂层的平均厚度为5μm~10μm,
所述试剂层的周边部的平均厚度相对于中央部的平均厚度之差为-6μm~+5μm,[平均厚度之差]=[周边部的平均厚度]-[中央部的平均厚度]。
2.如权利要求1所述的生物传感器,其中,所述试剂层包含氧化还原酶和电子传递物质。
3.如权利要求1或2所述的生物传感器,其中,所述试剂层通过将包含氧化还原酶和电子传递物质的试剂液利用点式印刷进行层积而形成。
4.如权利要求1或2所述的生物传感器,其中,所述试剂层为大致长方体。
5.如权利要求4所述的生物传感器,其中,所述试剂层的底面大小为0.5mm×1.5mm~2mm×5mm。
6.如权利要求1或2所述的生物传感器,其中,
所述导电部具有至少包含工作电极和对电极的电极对,
所述试剂层至少载置在所述工作电极上。
7.如权利要求2所述的生物传感器,其中,所述试剂层中的所述氧化还原酶的含量在每单位体积即每cm3的试剂层中为200KU~300KU。
8.如权利要求2所述的生物传感器,其中,所述试剂层中的所述电子传递物质的含量在每单位体积即每cm3的试剂层中为0.1mmol~50mmol。
9.如权利要求1或2所述的生物传感器,其中,所述试剂层进一步包含表面活性剂。
10.一种方法,其是使用权利要求1~9中任一项所述的生物传感器对试样中的测定对象物进行电化学测定的方法,其特征在于,包括:
使试样与所述生物传感器的试剂层接触;
在所述生物传感器的电极之间施加电压;以及
测定通过所述电压的施加产生的电信号。
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