CN116926150A - 一种由UDP-D-Glc合成糖核苷酸的方法 - Google Patents

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CN116926150A CN202210320095.XA CN202210320095A CN116926150A CN 116926150 A CN116926150 A CN 116926150A CN 202210320095 A CN202210320095 A CN 202210320095A CN 116926150 A CN116926150 A CN 116926150A
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张家彬
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Abstract

本发明涉及一种由UDP‑D‑Glc合成糖核苷酸的方法，其中所述合成的糖核苷酸由下式I表示。所述方法包括：在30‑40℃下，以UDP‑D‑Glc为起始糖核苷酸，采用一锅法在酶和辅因子再生系统存在下，通过酶催化反应制备式I的糖核苷酸。本申请的方法通过在常见糖苷酸的合成中采用辅因子再生系统来产生辅因子，降低了糖核苷酸的生产成本和产物的纯化难度。

Description

一种由UDP-D-Glc合成糖核苷酸的方法
技术领域
本发明属于糖生物学领域，具体涉及一种合成糖核苷酸的方法。
背景技术
聚糖，也称为多糖或寡糖，在自然界中与核酸和蛋白质一起形成三类生物聚合物之一。众所周知，聚糖或糖缀合物可作为细胞间相互作用的配体或毒素、抗体和微生物的靶标。在活细胞中，单糖被核苷通过单磷酸或二磷酸激活，形成糖核苷酸作为糖基转移酶的糖基化供体。糖核苷酸的水解是一种产生能量的反应，为糖苷键的形成提供驱动力。作为糖基转移酶的底物，糖核苷酸已被广泛用于糖基转移酶的鉴定以及聚糖和糖缀合物的生物合成研究。
由于糖核苷酸在糖生物学和糖化学中的重要性，已经开发出化学和酶促方法来制备糖核苷酸。化学方法可分为两种方式，包括糖-1-磷酸与活化的单磷酸核苷的缩合和活化的糖与核苷二磷酸的直接偶联。然而，糖核苷酸在有机溶剂中的低溶解度、极性基团的存在以及糖苷键在剧烈反应条件下的不稳定性使得化学合成非常具有挑战性。较差的区域选择性通常需要多步保护/脱保护操作，从而导致收率低。相比之下，酶促合成仅产生仅表现出天然型端基异构体构型的产品。在活细胞中，糖核苷酸是通过补救途径或从头生物合成途径产生的。包括使用激酶对糖进行磷酸化和通过焦磷酸化酶进行焦磷酸化。然而，该策略仅成功制备了极少数常见的天然糖核苷酸。或者，从现有的常见糖核苷酸从头生物合成糖核苷酸在自然界中产生大部分糖核苷酸。该过程涉及单个或多个反应，包括脱水、异构化、差向异构化、氧化、还原、胺化和乙酰化反应。人们普遍认为，由于反应路线复杂、纯化困难和制备成本高，这种复杂的生物转化在合成应用中是不切实际的。在这些障碍中，产物纯化是最具挑战性的问题，只有高效液相色谱纯化被证明是一种从这种复杂反应系统中以极小规模(微克到毫克级)获得产物的有效方法。因此，大多数天然存在的糖核苷酸还没有成功地大量制备。因此，基因库中发现的大量糖基转移酶无法进行生化表征，许多重要聚糖和糖缀合物的生物合成途径仍不清楚。这严重阻碍了糖科学的进步。
发明内容
基于上述现有技术中的存在的问题，本发明的技术目的是提供一种无需繁琐纯化操作的制备常见糖核苷酸的通用方法，其能够使用UDP-D-Glc(尿苷二磷酸-D-葡萄糖)来大规模、高收率制备常见糖核苷酸。
本发明提供一种制备糖核苷酸的方法，所述方法包括：在30-40℃下，优选在37℃下，以UDP-D-Glc为起始糖核苷酸，采用一锅法在酶或酶体系和辅因子再生系统(Cofactorregeneration system,CRS)存在下通过反应制备由下式I表示的糖核苷酸：
其中，在式I中，
R1选自H和羟基；
R2选自羟基、氨基以及乙酰氨基；并且
R3选自甲基、羧基以及H。
在具体实施方式中，所述酶或酶体系选自以下各组：
酶系统名 酶
OPME1 VUGD,BfeR
OPME2 VUGD,L136
OPME3 VUGD,L136,PglD
OPME4 HasB
OPME5 HasB,UXS
在具体实施方式中，所述辅因子再生系统选自如下的辅因子再生系统：
特别地，在采用CRS1辅因子再生系统时，相对于3克的UDP-D-Glc，CRS1辅因子再生系统由0.1至0.2当量NADP+、3当量D-葡萄糖和1毫克至2毫克BsGH组成；
在采用CRS2辅因子再生系统时，相对于3克的UDP-D-Glc，CRS2辅因子再生系统由5当量L-谷氨酸和0.1当量PLP组成；
在采用CRS3辅因子再生系统时，相对于3克的UDP-D-Glc，CRS3辅因子再生系统由0.05当量的CoA、2当量ATP、3当量乙酸钠和5毫克ACS组成；
在采用CRS4辅因子再生系统时，相对于3克的UDP-D-Glc，CRS4辅因子再生系统由0.1至0.2当量NAD+、3当量丙酮酸和5毫克LdhA组成。
所述辅因子再生系统CRS1、CRS2、CRS3和CRS4的再生过程分别如以下反应式所示：
对于UDP-D-Glc的来源没有特别限制。在具体实施方式中，UDP-D-Glc可以通过如下路线1合成：
其中，UDP-D-Glc由Sucrose(蔗糖)在SuSy(Acidithiobacillus caldus)与二磷酸尿苷(UDP)的作用下生成(该过程采用一锅法合成)。在本申请中使用的起始糖核苷酸UDP-D-Glc也可通过商购获得。
在具体实施方式中，所述式I的核苷酸选自以下各项之一：
在具体实施方式中，采用还原导向的NADPH再生系统合成UDP-L-Rha，具体地，UDP-L-Rha的合成通过以下路线2进行：
在具体实施方式中，采用胺化导向的PMP再生系统合成UDP-D-VioNH2，具体地，UDP-D-VioNH2的合成通过以下路线3进行：
在具体实施方式中，采用乙酰化导向的AcCoA再生系统合成UDP-D-VioNAc，具体地，UDP-D-VioNAc的合成通过以下路线4进行：
在具体实施方式中，采用氧化导向的NAD+再生系统合成UDP-D-GlcA，具体地，UDP-D-GlcA的合成通过以下路线5进行：
在具体实施方式中，采用氧化导向的NAD+再生系统合成UDP-D-Xyl，具体地，UDP-D-Xyl的合成通过以下路线6进行：
在上述路线2、3、4、5、6中，采用如下所示的复合酶系统与CRS1，CRS2，CRS3或CRS4结合来制备各糖核苷酸：
具体地，在UDP-L-Rha的合成中，选择使用复合酶系统OPME1，UDP-D-Glc首先在VUGD的存在下发生酶催化反应，反应完成后，加入CRS1及BfeR，进一步通过酶催化反应制得产物UDP-L-Rha，优选地，前述酶催化反应在37℃下进行。
具体地，在UDP-D-VioNH2的合成中，选择使用复合酶系统OPME2，UDP-D-Glc首先在VUGD的存在下发生酶催化反应，反应完成后，加入CRS2及L136，进一步通过酶催化反应制得产物UDP-D-VioNH2，优选地，前述酶催化反应在37℃下进行。
具体地，在UDP-D-VioNAc的合成中，选择使用复合酶系统OPME3，UDP-D-Glc首先在VUGD的存在下发生酶催化反应，反应完成后，加入CRS2，CRS3及L136，PglD，进一步通过酶催化反应制得产物UDP-D-VioNAc，优选地，前述酶催化反应在37℃下进行。
具体地，在UDP-D-GlcA的合成中，选择使用酶复合系统OPME4，UDP-D-Glc在HasB和CRS4的存在下发生酶催化反应，得到产物UDP-D-GlcA，优选地，前述酶催化反应在37℃下进行。
具体地，在UDP-D-Xyl的合成中，选择使用酶复合系统OPME5，UDP-D-Glc首先在HasB及CRS4的存在下发生酶催化反应，反应完成后，加入UXS，进一步通过酶催化反应制得产物UDP-D-Xyl，优选地，前述酶催化反应在37℃下进行。
在实施方式中，所述反应在pH＝7.3-7.9，优选7.5的缓冲体系下进行，优选地，所述缓冲体系为Tris缓冲体系。
虽然上文采用具体实施方式就本申请的辅因子再生系统进行了详细描述，然而本申请的辅因子再生系统并不局限于上述常见糖核苷酸的合成，本领域的技术人员基于本领域的公知常识及常规技术手段，可以将本申请的辅因子再生系统应用于任何需要还原、氧化、脱水、异构化、胺化及乙酰化导向的合成反应中，这些也均包括在本发明的范围内
有益效果
酶反应的最大优点是立体选择性和区域选择性高。因此，多步酶反应可以一次性进行，被称作“一锅多酶法(One-pot multienzyme reaction,OPME)”。尽管常见糖核苷酸的生物转化途径十分复杂，但是最后一步通常为还原、氧化、胺化、乙酰化反应。以上所述反应均为不可逆过程，同时需要辅因子，NADH/NADPH、NAD+/NADP+、5‘-磷酸吡哆胺(PMP)或乙酰辅酶A(AcCoA)。
鉴于此，本申请设计避免逐步合成的一锅法来合成常见糖核苷酸。本申请通过如上文所述的辅因子再生系统(Cofactor regeneration system,CRS)来产生辅因子，可以降低生产成本和产物的纯化难度。经验证，将一锅多酶法与上述辅因子再生系统偶联，反应仍可以顺利进行，从而避免了纯化不稳定、难分离的中间体，进而使酶法大量合成糖核苷酸变成现实。
具体实施方式
下文中，通过具体实施方式来详细本发明的技术方案，然而这些技术方案仅用于使本领域的技术人员更好地了解本申请，而不用于限制本申请的范围。
在下文中使用的所有相关的酶，全部通过大肠杆菌表达系统制备，并使用Ni-NTA纯化。具体地，BfeR(epimerase and reductase)来自Botryotinia fuckeliana(灰葡萄孢霉)，PglD(acetyltransferase)来自Campylobacter jejuni(空肠弯曲杆菌)，L136(aminotransferase)来自Giant DNA virus mimivirus(巨型DNA病毒拟态病毒的转氨酶)，BsGH(D-glucose dehydrogenase)来自Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)，LdhA(lactatedehydrogenase)来自Leuconostoc mesenteroides(肠系膜明串珠菌)，HasB(UDP-D-Glcdehydrogenase)来自Streptococcus pyogenes(酿脓链球菌)，VUGD(UDP-D-Glc 4,6-dehydratase)来自Acanthocystis turfacea chlorella virus(刺胞虫小球藻病毒)，UXS(UDP-Xyl synthetase)来自Sinorhizobium meliloti(梅利洛蒂辛诺氏菌)。本申请中使用的所有基因都是人工合成的。基因合成服务由金斯瑞(中国南京)或生工生物(中国上海)提供。
所有基因都被克隆到pET-28a载体中，并且在N端或C端具有六个组氨酸(His)标签的重组蛋白。将测序确认的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中以进行蛋白质表达。将含有重组载体pET-28a的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在两升含有50ug/ml卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中在37℃、200rpm的旋转振荡器中培养。当OD值达到0.8时加入0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，16℃下过夜诱导蛋白表达。通过在7000rpm下离心10min收集细胞。将细胞沉淀重新悬浮在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液、300mM NaCl、10mM咪唑；pH7.5)中。用微流化器破碎细胞并将裂解液12,000g离心10min以去除细胞碎片。使用Ni-NTA琼脂糖柱纯化带His标签的蛋白。在纯化之前，柱子用裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、300mMNaCl、10mM咪唑；pH 7.5)平衡。用2倍柱体积的裂解缓冲液洗涤柱子，并用洗脱缓冲液(50mMTris-HCl、300mM NaCl、300mM咪唑；pH 7.5)洗脱目标蛋白。蛋白质浓度用BCA蛋白质检测试剂盒测定。以上虽然描述了本申请中各酶的来源，然而其来源途径并不限于此，只要其可以实现在本申请中所意图实现的功能即可。
术语
OPME:One-pot multienzyme reaction,一锅多酶；本文中也用OPME指代酶体系；
CRS:Cofactor regeneration system,辅因子再生系统；本文中也用CRS指代具体的五种辅因子再生系统；
NAD+:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
NADH:还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
NADP+:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；
NADPH:还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；
PLP:5'-磷酸吡哆醛；
PMP：5'-磷酸吡哆胺；
CoA:coenzyme A,辅酶A；
ATP:腺嘌呤核苷三磷酸；
BsGH:D-glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis，枯草芽孢杆菌来源的D-葡萄糖脱氢酶；
LdhA:lactate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides,肠膜明串珠菌来源乳糖脱氢酶；
ACS:AcCoA synthetase,来源于大肠杆菌的乙酰辅酶A合成酶；
VUGD：UDP-D-Glc 4,6-dehydratase from Acanthocystis turfacea chlorellavirus，来自刺胞虫小球藻病毒的UDP-D-Glc C-4、C-6脱水酶
BfeR：3,5-epimerase/4-reductase from Botryotinia fuckeliana，来自灰葡萄孢霉的C-3、C-5异构酶和C-4还原酶
HasB：UDP-D-Glc dehydrogenase from Streptococcus pyogenes，来自酿脓链球菌的UDP-D-Glc脱氢酶；
L136：aminotransferase from Giant DNA virus mimivirus来自巨型DNA病毒拟态病毒的转氨酶；
PglD：acetyltransferase from Campylobacter jejuni，来自空肠弯曲杆菌的乙酰转移酶；
UXS：UDP-Xyl synthetase from Sinorhizobium meliloti，来自苜蓿中华根瘤菌的UDP-Xyl合成酶；
SuSy：sucrose synthase from Acidithiobacillus caldus，来自钙酸硫杆菌的蔗糖合酶。
在下文中例示了5种常见糖核苷酸(结构如下)的合成。所采用的一锅多酶系统与辅因子再生系统的偶联及收率总结在下表1中。
表1一锅多酶法偶联辅因子再生系统(CRS)合成糖核苷酸
在上表中，
a起始糖核苷酸UDP-D-Glc由Sucrose制备。
b反应起始原料为3克的UDP-D-Glc。
c收率的计算是相对于UDP-D-Glc，基于摩尔比率。
本申请选取自然界中常见的糖核苷酸UDP-D-Glc用来合成与其相关的其他常见糖核苷酸。UDP-D-Glc合成反应包括22.4克的UDP，171克蔗糖，10mM的氯化镁，以及SuSy。从蔗糖开始按照一锅法合成；分离收率为70％(参见以下路线1)。下文合成的5种糖核苷酸涵盖了大多数的已报道的源自UDP-D-Glc的常见糖核苷酸。
一、用于制备UDP-L-Rha的还原导向(线路2)。
首先，尝试用一个包括VUGD、BfER和NADPH再生体系在内的一锅反应来合成UDP-L-Rha。然而，在最终的反应平衡中仍存在大量的UDP-D-Glc，这表明UDP-L-Rha强烈抑制了VUGD的活性。用尺寸排阻柱、离子交换柱或硅胶柱从UDP-D-Glc中纯化UDP-L-Rha的尝试没有成功。因此，重新设计了合成UDP-L-Rha的两步策略，因为观察到在没有UDP-L-Rha的情况下，第一步反应可以干净地进行。
UDP-D-Glc首先与VUGD一起孵育，当薄层色谱法未观察到UDP-D-Glc时，将BfeR和CRS1(0.1当量NADP+，3当量D-葡萄糖和BsGH)加入反应体系中，将UDP-4-keto-6-deoxy-Glc转化为UDP-L-Rha。过夜反应后，由于转化不完全转化，只观察到微量的中间体UDP-4-keto-6-deoxy-Glc。然而，大多数杂质可以通过尺寸排除和离子交换色谱法去除。最后，UDP-L-Rha的产率为73％。
以NADH和NADPH为还原剂的还原酶催化的还原反应是糖核苷酸生物转化中最普遍的反应。从UDP-D-Glc到UDP-L-Rha的生物合成途径已经研究清楚。这一过程需要四步，包括：C-4,6脱水、C-5差向异构化、C-3差向异构化和C-4还原，涉及两个酶催化(路线2)。
本申请采用刺胞虫小球藻病毒(Acanthocystis turfacea chlorella virus)的脱水酶(VUGD)与来自灰葡萄孢霉(Botryotinia fuckeliana)的具有C-3、C-5异构酶和C-4还原酶的多功能酶(BfeR)。但是，大量合成使用NADH和NADPH成本太高。由于NAD+和NADP+比NADH和NADPH价格便宜很多，为了提供强大的还原力，本申请使用来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的D-葡萄糖脱氢酶(BsGH)，由NAD+或NADP+制备NADH或NADPH，从而大大降低了生产成本。
如下所示，在CRS1系统中，BsGH使用NADP+作为辅因子将D-葡萄糖氧化为葡萄糖酸内酯，而形成NADPH以便在本申请中用于还原反应。
二、用于制备UDP-D-VioNH2的胺化导向(线路3)。
UDP-D-VioNH2的生物合成从UDP-D-Glc开始，首先由UDP-D-Glc-C4,6脱水酶(VUGD)催化脱水反应，然后通过转氨酶L136将UDP-4-keto-6-deoxy-Glc的C-4位胺化生成UDP-D-VioNH2(路线3)。转氨酶的供体是5'-磷酸吡哆胺(pyridoxamine-5'-phosphate,PMP)，它由5'-磷酸吡哆醛(PLP)和L-谷氨酸再生(如下CRS2所示)，无需外源酶。为了驱动反应形成UDP-D-VioNH2，在反应体系中加入了高达5当量的L-Glu。但大量的L-谷氨酸很难去除，为了便于产物的纯化，在此使用了植物乳杆菌中的L-谷氨酸脱羧酶(GadB)对剩余的L-谷氨酸进行脱羧处理。通过离子交换柱的纯化，可以很容易地去除产物氨基丁酸盐。由于纯化损失，经P-2柱和离子交换柱纯化后，UDP-D-VioNH2的收率为65％。
三、制备UDP-D-VioNAc的乙酰化导向反应(路线4)。
糖核苷酸的N-乙酰化由乙酰转移酶催化，使用乙酰辅酶A(AcCoA)作为乙酰供体。然而，AcCoA太昂贵而无法用来进行大规模合成。由于CoA比AcCoA便宜很多，因此采用再生系统CRS3(如下所示)产生AcCoA，其中AcCoA是通过AcCoA合成酶(ACS)由乙酸钠、CoA和ATP合成的。
UDP-D-VioNAc由UDP-D-VioNH2的N-乙酰化产生的，从空肠弯曲杆菌(PglD)中发现的乙酰转移酶可以将UDP-D-VioNH2乙酰化为UDP-D-VioNAc。采用AcCoA再生系统，低至0.001当量的CoA足以使PglD完全转化。为了避免UDP-D-VioNH2的水解，本申请中，直接采用了一锅法反应，从UDP-D-Glc中合成了UDP-D-VioNAc，其中采用了双辅因子再生系统。一旦UDP-D-Glc被上述UVGD完全转化，就在反应体系中加入5当量L-Glu、0.05当量PLP、0.002当量CoA、2当量ATP、3当量醋酸钠、ACS、L136和PglD，形成UDP-D-VioNAc(路线4)。经分子排阻色谱柱和离子交换柱纯化后，UDP-D-VioNAc的产率为80％。
四、用于制备UDP-D-GlcA氧化导向反应(路线5)。
以NAD+或NADP+为辅因子，由脱氢酶催化的生物氧化是自然界中合成羧酸糖及其衍生物的主要途径。
在本申请中新设计的一锅法反应中(路线5)，UDP-D-Glc的生物氧化与NAD+的再生体系(CRS4)结合使用。
如下所示，在CRS4中，来自肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的乳酸脱氢酶(LdhA)将丙酮酸还原为D-乳酸，同时将NADH氧化为NAD+。
UDP-D-GlcA可以通过典型的两步法从D-GlcA开始进行合成，得到理想的收率。另外，UDP-D-GlcA也可以通过辅助因子依赖的脱氢酶从UDP-D-Glc中制备。由于蔗糖比D-GlcA便宜得多，因此用UDP-D-Glc制备UDP-D-GlcA也很有吸引力。许多研究小组发现，NAD+再生体系与UDP-D-GlcA脱氢酶的偶联可以提高反应产率。然而，由于酶活性较差，关于扩大合成规模的问题仍然存在。通过对来源为冰岛热棒菌的PIUGDH、人的UGDH、长双歧杆菌的BLUGDH、蜡状芽孢杆菌的BcUGDH、棘孢小单孢菌的Cals8和酿脓链球菌的HasB的许多UDP-D-GlcA脱氢酶的检测，发明人最终发现HasB活性高，蛋白表达水平好，适合用于大规模合成。在分析测试中，发现在葡萄糖依赖的NAD+CRS4存在下，UDP-D-Glc可以在不到2小时内完全地转化为UDP-D-GlcA，而在没有CRS4的组中，转化率相当低(路线5)。产物经P-2柱和离子交换柱纯化后，产率为87％。
五、用于制备UDP-Xyl氧化导向反应(路线6)。
虽然UDP-D-Xyl是最常见的糖核苷酸之一，但由于缺乏一种激酶将D-Xyl磷酸化为D-Xyl-1-P，因此其合成仍然非常困难。一些研究小组开发了一种化学酶法制备UDP-D-Xyl，其中以化学方法合成D-Xyl-1-P，然而，化学合成操作很复杂，收率相当低。也有一些研究小组开发了一种两步策略，从UDP-D-Glc制备UDP-D-Xyl，其中使用了来自人类的UDP-D-Glc脱氢酶和UDP-Xyl合酶。由于HasB在UDP-D-GlcA的大规模合成中非常活跃，本申请中利用另一种苜蓿中华根瘤菌(UXS)的UDP-D-Xyl合成酶将UDP-D-Glc转化为UDP-Xyl。分析测试表明，UDP-D-GlcA可以通过UXS完全转化为UDP-D-Xyl，这表明了大量合成的可能性。因此，在此进行了一个大规模的反应，其中UDP-D-GlcA是由上述的UDP-D-Glc制备的。然后，在反应体系中加入UXS，形成UDP-D-Xyl。最后，通过分子排阻柱和离子交换柱纯化，收率为75％。
实施例
在以下实施例中使用的所有相关的酶，全部通过大肠杆菌表达系统制备，并使用Ni-NTA纯化。具体地，BsGH是枯草芽孢杆菌来源的D-葡萄糖脱氢酶；
LdhA是肠膜明串珠菌来源乳糖脱氢酶；ACS是来源于大肠杆菌的乙酰辅酶A合成酶；VUGD是来自刺胞虫小球藻病毒的UDP-D-Glc C-4、C-6脱水酶；BfeR是来自灰葡萄孢霉的C-3、C-5异构酶和C-4还原酶；HasB是来自酿脓链球菌的UDP-D-Glc脱氢酶；L136是来自巨型DNA病毒拟态病毒的转氨酶；PglD是来自空肠弯曲杆菌的乙酰转移酶；UXS是来自苜蓿中华根瘤菌的UDP-Xyl合成酶；SuSy是来自钙酸硫杆菌的蔗糖合酶。本申请中使用的其他基因都是人工合成的。基因合成服务由金斯瑞(中国南京)或生工生物(中国上海)提供。
所有基因都被克隆到pET-28a载体中，以产生在N端或C端具有六个组氨酸(His)标签的重组蛋白。将经鉴定正确的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中以进行蛋白质表达。将含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在两升含有50ug/ml卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中在37℃、200rpm的旋转振荡器中培养。当OD值达到0.8时加入0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，16℃下过夜诱导蛋白表达。通过在7000rpm下离心10min收集细胞。将细胞沉淀重新悬浮在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液、300mM NaCl、10mM咪唑；pH 7.5)中。用微流化器破碎细胞并将裂解液12,000g离心30min以去除细胞碎片。使用Ni-NTA琼脂糖柱纯化带His标签的蛋白。在纯化之前，柱子用裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、300mM NaCl、10mM咪唑；pH 7.5)平衡。用2倍柱体积的裂解缓冲液洗涤柱子并用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl、300mM NaCl、300mM咪唑；pH 7.5)洗脱目标蛋白。蛋白质浓度用BCA蛋白质检测试剂盒测定。以上虽然描述了本申请中各酶的来源，然而其来源途径并不限于此，只要其可以在本申请中所意图实现的功能即可。
以下所有使用的分子排阻柱为填料是Bio-Gel-P-2树脂(Bio-Rad，CA)或SephadexG-15树脂(GE Healthcare)的柱子。离子交换色谱采用填充阴离子交换树脂(701氯离子形式，国药集团)，乙醇购买自国药集团。PLP、L-谷氨酸购自carbosynth责任有限公司(苏州，中国)。ATP、UTP、NAD+、NADP+购自BioChemSyn(上海BioChemSyn公司)，除另有说明外，所有其他化学品均从Sigma购买。
实施例1：UDP-L-Rha的大规模合成与纯化：
体系包含20mM Tris-HCl(PH 7.5)、3克UDP-D-Glc、30毫克VUGD、反应在37℃下进行。UDP-D-Glc转化完全后，加入0.1当量NADP+、3当量D-葡萄糖、30毫克BfeR和5毫克BsGH。反应完全后，加入等体积的冷乙醇终止反应，离心除去不溶性沉淀后，上清液经分子排阻柱和离子交换柱分离纯化，产物收率为73％。
实施例2：UDP-VioNH2的大规模合成与纯化：
反应体系包含20mM Tris-HCl(PH 7.5)、3克UDP-D-Glc、20毫克VUGD、反应在37℃下进行。UDP-D-Glc转化完全后，加入0.1当量PLP、5当量L-谷氨酸、10毫克L136，反应在37℃下进行。反应完全后，加入等体积的冷乙醇终止反应，离心除去不溶性沉淀后，浓缩上清液后经分子排阻柱和离子交换柱分离纯化，产物收率为65％。
实施例3：UDP-D-VioNAc的大规模合成与纯化：
反应体系包含20mM Tris-HCl(PH 7.5)、3克UDP-D-Glc、10毫克VUGD、反应在37℃下进行。UDP-D-Glc转化完全后，加入0.1当量PLP、5当量L-谷氨酸、和30毫克L136，反应在37℃下进行。反应完全后，加入2当量的ATP，3当量的醋酸钠，0.05当量的CoA，5毫克的PglD和5毫克的ACS，反应在37℃下进行。反应完全后，加入等体积的冷乙醇终止反应，离心除去不溶性沉淀后，上清液经浓缩后，通过分子排阻柱和离子交换柱进行分离纯化，产物收率为80％。
实施例4：UDP-D-GlcA的大规模合成与纯化：
反应体系包含20mM Tris-HCl(PH 7.5)，3克UDP-D-Glc，0.1当量NAD+，3当量丙酮酸，30毫克HasB和5毫克LdhA，反应在37℃下进行。一旦发现反应停滞前进，就加入等体积的冷乙醇终止反应，离心除去不溶性沉淀后，上清液经浓缩后，通过分子排阻柱和离子交换柱进行分离纯化，产物收率为87％。
实施例5：UDP-D-Xyl的大规模合成与纯化：
反应体系包含20mM Tris-HCl(PH 7.5)、3克UDP-D-Glc、0.1当量NAD+、3当量丙酮酸、30毫克HasB和5毫克LdhA，反应在37℃下进行。UDP-D-Glc反应完全后，加入50毫克UXS，反应37℃下进行。待UDP-D-GlcA反应完全后，加入等体积的冷乙醇终止反应，离心除去不溶性沉淀后，上清液经浓缩后，通过分子排阻柱和离子交换柱进行分离纯化，产物收率为75％。
以上实施例中制备的糖核苷酸的1H NMR和13C NMR数据如下表2中所示。
表2
综上，本申请成功地开发了高效制备糖核苷酸的通用方法。通过使用不同克隆来源的糖核苷酸合成酶，复杂的天然合成路线被重新组合进行合成反应。通过添加辅因子再生体系提供过量的辅因子，推动最后的不可逆反应，生成目标糖核苷酸。通过这种方法，由UDP-D-Glc起始大规模、高效地制备了5个糖核苷酸，整个过程无需繁琐的纯化操作。更为重要的是，昂贵辅因子的催化量使用降低了大规模合成的成本。由于大多数报道的糖核苷酸的最后一个生物转化步骤涉及还原、氧化、胺化或者乙酰化反应，因此本发明的这种方法可以很容易的扩展到其他生物合成途径明了的糖核苷酸。

Claims (10)

1.一种制备糖核苷酸的方法，所述方法包括：在30-40℃下，以UDP-D-Glc为起始糖核苷酸，采用一锅法在酶或酶体系和辅因子再生系统存在下通过反应制备由下式I表示的糖核苷酸：
其中，在式I中，
R1选自H和羟基；
R2选自羟基、氨基以及乙酰氨基；并且
R3选自甲基、羧基以及H。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶或酶体系选自以下各组：
酶系统名 酶 OPME1 VUGD,BfeR OPME2 VUGD,L136 OPME3 VUGD,L136,PglD OPME4 HasB OPME5 HasB,UXS
。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述辅因子再生系统选自如下的辅因子再生系统：
4.根据权利要求3所述的方法，其中，在采用CRS1辅因子再生系统时，相对于3克的UDP-D-Glc，CRS1辅因子再生系统由0.1至0.2当量NADP+、3当量D-葡萄糖和1毫克至2毫克BsGH组成；
在采用CRS2辅因子再生系统时，相对于3克的UDP-D-Glc，CRS2辅因子再生系统由5当量L-谷氨酸和0.1当量PLP组成；
在采用CRS3辅因子再生系统时，相对于3克的UDP-D-Glc，CRS3辅因子再生系统由0.05当量的CoA、2当量ATP、3当量乙酸钠和5毫克ACS组成；
在采用CRS4辅因子再生系统时，相对于3克的UDP-D-Glc，CRS4辅因子再生系统由0.1至0.2当量NAD+、3当量丙酮酸和5毫克LdhA组成。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述式I的糖核苷酸选自以下各项之一：
6.根据权利要求5所述的方法，其中，
如以下路线2所示，采用还原导向的NADPH再生系统CRS1合成UDP-L-Rha：
在以上路线2中，选择使用复合酶系统OPME1，UDP-D-Glc首先在VUGD的存在下发生酶催化反应，反应完成后，加入CRS1及BfeR，进一步通过酶催化反应制得产物UDP-L-Rha；
如以下路线3所示，采用胺化导向的PMP再生系统CRS2合成UDP-D-VioNH2：
在以上路线3中，选择使用复合酶系统OPME2，UDP-D-Glc首先在VUGD的存在下发生酶催化反应，反应完成后，加入CRS2及L136，进一步通过酶催化反应制得产物UDP-D-VioNH2；
如以下路线4所示，采用乙酰化导向的AcCoA再生系统CRS3合成UDP-D-VioNAc：
在以上路线4中，选择使用复合酶系统OPME3，UDP-D-Glc首先在VUGD的存在下发生酶催化反应，反应完成后，加入CRS2，CRS3及L136，PglD，进一步通过酶催化反应制得产物UDP-D-VioNAc；
如以下路线5所示，采用氧化导向的NAD+再生系统CRS4合成UDP-D-GlcA：
在以上路线5中，选择使用酶复合系统OPME4，UDP-D-Glc在HasB和CRS4的存在下发生酶催化反应，得到产物UDP-D-GlcA；
如以下路线6所示，采用氧化导向的NAD+再生系统CRS4合成UDP-D-Xyl：
在以上路线6中，选择使用酶复合系统OPME5，UDP-D-Glc首先在HasB及CRS4的存在下发生酶催化反应，反应完成后，加入UXS，进一步通过酶催化反应制得产物UDP-D-Xyl。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述反应在37℃下进行。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述反应在pH＝7.3-7.9的缓冲体系下进行。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述反应在pH＝7.5的缓冲体系下进行。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述缓冲体系为Tris缓冲体系。
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