CN116926148A

CN116926148A - 一种利用dna聚合酶和dna连接酶便捷制备含非天然碱基核酸链的方法及其应用

Info

Publication number: CN116926148A
Application number: CN202210346898.2A
Authority: CN
Inventors: 陈庭坚; 白静思; 邹金容; 曹懿君; 吴静; 郑鑫倩
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2022-04-02
Filing date: 2022-04-02
Publication date: 2023-10-24

Abstract

本发明公开一种利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核酸链的方法及其应用。该方法为将模板链、上游结合链和下游结合链与聚合酶反应缓冲液充分混合得到混合液Ⅰ、变性后，退火；加入非天然核苷三磷酸和DNA聚合酶，得到混合液Ⅱ，孵育，孵育结束后热处理变性聚合酶；将反应液纯化，得到中间混合产物A；将中间混合产物A与ATP、DNA连接酶混合在反应体系中，得到混合液Ⅲ，孵育后纯化，得到中间混合产物B；将中间混合产物B和亲和纯化磁珠混合在缓冲液中；将混合液用缓冲液多次洗涤，并用碱处理分离模板链，得到混合液Ⅳ；洗涤混合液Ⅳ后，加甲酰胺热孵育磁珠，得到混合液Ⅴ；纯化，得到含有非天然碱基的ssDNA。

Description

一种利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核酸链的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核酸链的方法及其应用。

背景技术

非天然碱基(对)的开发在生物化学及生物技术的研究中具有重要作用，是合成生物学的最前沿研究领域。基于非天然碱基来设计合成具有新颖功能的生物大分子元件，既可发挥类似于天然碱基的功能，同时又正交于ATCG体系。新碱基的引入可以丰富有限的DNA、RNA组成元件，极大地拓展遗传密码的数量，并以此为基础合成自然界没有且难以人工合成的催化剂、药物、疫苗及其他产品。在体外，非天然碱基还扩展到了核酸检测诊断技术开发、六碱基核酸适配体筛选、新型生物材料构建等应用领域。另外，在DNA数据存储和计算领域，非天然碱基的引入可将原有ATCG的四进制提升为更高进制，极大地提高DNA数据存储系统的存储能力和DNA计算机运算能力。

经过多年的发展，一系列具有优良性质的非天然碱基(对)被开发出来，其中最具有代表性的包括：Benner研究组开发的基于氢键作用的dS-dB、dP-dZ碱基对；Hirao研究组开发的基于疏水相互作用的Ds-Px碱基对；Romesberg研究组开发的基于疏水相互作用的dTPT3-dNaM碱基对等等。但目前成功应用于活细胞的复制、转录和翻译全部过程的非天然碱基只有dTPT3-dNaM系列碱基对。

合成生物学前沿领域的研究对含非天然碱基的引物获取、基因合成、定点突变、SELEX核酸文库构建不可或缺。含非天然碱基的预定义核酸链可以通过化学固相合成或酶法合成进行制备。化学合成以含非天然碱基的亚磷酰胺为原料，而亚磷酰胺非常不稳定，启用后会很快失效。每次启用固相合成需要一次制备大量的(几十上百条)链，不易随时实现少量规模含非天然碱基寡聚核苷酸的制备需求，固相合成需要额外制备昂贵的非天然碱基亚磷酰胺，对于一些碱基带修饰的官能团兼容性差，需要额外的保护、脱保护、后续修饰步骤。相比之下，酶促法仅使用扩增所需的非天然碱基的三磷酸形式即可，三磷酸形式的固体和水溶液均可在低温长时间保存，随时满足对预定义非天然DNA链的获取需求且不受合成数目的限制。且对于一些特殊用途的碱基，酶法兼容性更强。

对于从头设计的非天然碱基而言，其匹配规则正交于ATCG天然配对模式。并且复制和转录对聚合酶有特别的活性要求。在酶识别底物方面，得益于前人在非天然碱基开发和六碱基DNA/RNA研究领域中的贡献，发现Klenow Fragment(KF)聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent、Deep Vent、KOD、Phusion等DNA聚合酶及其突变株对非天然碱基核苷酸表现出不同程度的识别和合成活性。前人的研究是基于含有非天然碱基核苷酸残基作为模板的条件下，遵循“形状互补”和“堆积”匹配模式将非天然碱基核苷酸通过5’端高保真的引入对位。

我们开发了一种在无非天然模板存在条件下，从头获取含非天然碱基核酸链的酶促方法。利用聚合酶对非天然底物的识别活性，探寻不同聚合酶对非天然碱基与天然碱基的错配活性和错配规律，在寡聚核苷酸链中部任意预定位置插入非天然碱基。核酸链中部插入非天然碱基后，优化连接酶的活性来修复非天然碱基与天然碱基之间的磷酸骨架。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种使用DNA聚合酶、DNA连接酶高效合成在核酸链特定位点嵌入含非天然核苷酸的预定义寡核酸链的方法。

本发明利用DNA聚合酶将含非天然碱基的核苷酸嵌入DNA双链内部缺口处，再利用DNA连接酶的部分活性完成缺口修复，并进一步获取在特定位点含有非天然碱基(Unnatural base,UB)的预定义寡聚核酸链。经纯化后的寡聚核酸链可应用于核酸分子的特定标记与偶联、含非天然碱基的人工半合成生命的构建等领域。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

(1)将模板链、上游结合链、下游结合链与聚合酶反应缓冲液充分混合得到混合液Ⅰ；

(2)混合液Ⅰ在95℃条件下变性后，退火；

(3)加入非天然核苷三磷酸和聚合酶到退火后的体系中，得到混合液Ⅱ；

(4)将混合液Ⅱ孵育，孵育结束后热处理变性聚合酶；

(5)将(4)中反应液纯化，得到中间混合产物A：带缺口的双链DNA；

(6)将中间混合产物A与ATP、连接酶混合在反应体系中反应，得到混合液Ⅲ；

(7)混合液Ⅲ孵育后纯化，得到中间混合产物B；

(8)将(7)的中间混合产物B和亲和纯化磁珠混合在1×BWBS缓冲液中；

(9)将(8)中混合液用1×BWBS缓冲液多次洗涤，并用碱处理分离单链产物，得到混合液Ⅳ；

(10)用1×BWBS缓冲液多次洗涤混合液Ⅳ后，加甲酰胺热孵育磁珠，得到混合液Ⅴ；

(11)纯化混合液Ⅴ，即可得到终产物C：含有非天然碱基的ssDNA。

进一步的，步骤(1)中所述单链终浓度为0.1-10μM；聚合酶反应缓冲液醋酸镁5-15mM，氯化钾10-100mM，Tris·HCl10-50mM；反应缓冲液的pH为7.5-7.9。

进一步的，步骤(1)中所述模板链为预定义链的互补链；非天然核苷酸嵌入位点的对位可以是ATCG中的一种。

进一步的，步骤(3)中所述聚合酶为KF(exo^-)DNA聚合酶、T4(exo^-)DNA聚合酶，终浓度为0.02-7U/μL。

进一步的，步骤(3)中所述非天然核苷酸终浓度为0.5-200μM。

进一步的，步骤(4)中孵育温度为16～72℃；热变性温度大于90℃；热变性时间大于5min。

进一步的，步骤(6)中ATP终浓度为0.1-5mM；DNA连接酶终浓度为0.1-20U/μL。

进一步的，步骤(7)中，孵育温度在16～42℃，孵育产物通过商业化试剂盒、变性或非变性丙烯酰胺胶分离纯化。

进一步的，步骤(7)1×BWBS缓冲液含TrisHCl0-20mM，EDTA1-10mM，氯化钠1-5M；pH为7-8。

本发明提供了一种简便、高效的DNA定点嵌入特定非天然核苷酸，制备含有非天然碱基DNA的方法。该方法以预定义序列的互补单链DNA序列为模板，以嵌入位点前后端两段DNA寡核苷酸链为引物，通过DNA聚合酶、DNA连接酶合成定点嵌入特定核苷酸的目标DNA或非天然/修饰DNA。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供的方法，利用DNA聚合酶、DNA连接酶合成定点嵌入特定核苷酸的目标DNA，实现对DNA产物的荧光或生物素标记等，并且在实现标记的同时仍然保留功能性核酸分子(例如适配体)的活性与功能。本方法仅需要稳定性较好的三磷酸形式的非天然核苷酸，随时合成小数量的任意核苷酸链。由于酶法的温和性，获取含有特殊修饰的核苷酸链可直接满足生化实验需求，而不需要繁琐的保护、脱保护、修饰过程。

附图说明

图1是非天然碱基核苷酸定点嵌入DNA与非天然核酸单链的获取技术流程示意图。

图2是混合中间产物A：DNA聚合酶插入非天然碱基核苷酸后带缺口的双链DNA的Biotin-shift PAGE胶图。

图3是混合中间产物B：DNA连接酶连接缺口处的产物的变性PAGE胶图。

图4是终产物C：酶促法获取的非天然核苷酸单链扩增后的产物保真度验证。

图5是利用非天然碱基进行内部标记的核酸适配体辅助酶联寡核苷酸吸附试验(ELONA，Enzyme-linked oligonucleotide assay)的实验原理与结果图。

图6是验证T4(exo^-)DNA聚合酶插入非天然碱基核苷酸以及DNA连接酶连接的效果图。

图7是验证利用T4(exo^-)DNA聚合酶和T4 DNA连接酶体系，酶促法获取单链含非天然碱基的效果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明的过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1

制备含dTPT3^Biotin高保真度的非天然碱基序列

实施例1中采用的模板和引物序列如表1所示。

表1实施1例所用DNA序列

参照图1所示，图1中，DNA模板与引物退火结合，加入KF(exo^-)DNA聚合酶将dTPT3^BiotinTP延伸到缺口3’端引物上，T4DNA连接酶连接两条引物的缺口。带Biotin的酶连产物与链霉亲和素蛋白修饰的磁珠孵育，加入氢氧化钠除去模板链，再用甲酰胺溶液在加热条件下洗脱下含dTPT3^Biotin的单链DNA。图中N为dA/dT/dC/dG任意一种，Y为dTPT3。制备定点嵌入含非天然碱基核苷酸(dTPT3^Biotin)的DNA模板的方法，包括：

1)将2μM模板、2μM引物1与1μM引物2加入1×聚合酶反应缓冲溶液中混匀，98℃加热10min后，自然冷却至室温，得到反应体系。

2)向20μL反应体系加入5μM dTPT3^BiotinTP和4U KF(3'→5'exo^-)聚合酶，混合均匀于37℃孵育1min。

3)上述所得粗产物2μL与1μL链霉亲和素蛋白混合孵育，室温下静置30min。向孵育产物中混合终浓度为1×上样缓冲液，6％PAGE胶分析。跑胶参数为电压150V,时间25min(图2，图2中，55bp处条带为未插入非天然碱基双链DNA；300bp-400bp处条带为插入dTPT3^BiotinTP后DNA链与链霉亲和素蛋白结合物；ATCG为插入非天然碱基位点模板链上的天然碱基；“+”为阳性对照；“-”为阴性对照。泳道1是以A为对位，用KF(exo^-)插入dTPT3^BiotinTP产物与链霉亲和素蛋白孵育；泳道2在泳道1产物的基础上，利用T4连接酶酶促连接后的产物与链霉亲和素蛋白孵育；泳道3是以T为对位，用KF(exo^-)插入dTPT3^BiotinTP产物与链霉亲和素蛋白孵育；泳道4在泳道3产物的基础上，利用T4连接酶酶促连接后的产物与链霉亲和素蛋白孵育；泳道5是以C为对位，用KF(exo^-)插入dTPT3^BiotinTP产物与链霉亲和素蛋白孵育；泳道6在泳道5产物的基础上，利用T4连接酶酶促连接后的产物与链霉亲和素蛋白孵育；泳道7是以G为对位，用KF(exo^-)插入dTPT3^BiotinTP产物与链霉亲和素蛋白孵育；泳道8在泳道7产物的基础上，利用T4连接酶酶促连接后的产物与链霉亲和素蛋白孵育。)。

4)加终浓度为1％DMSO、1mM ATP、20U/μL T4DNA连接酶到上述步骤2)中的反应体系并混合均匀，25℃孵育12h(图2)，回收300bp处产物。

5)取步骤4)中粗产物1μL混入终浓度为1×变性上样缓冲液(1×TBE)，98℃变性10min。如图3，图3中，短链为插入位点分别是ATCG的模板；长链是含嵌入dTPT3^BiotinTP的产物链；模板链之下短链为未连接的短链。泳道1是以A为对位，T4连接酶酶促连接后的粗产物，变性胶分离；泳道2是以T为对位，T4连接酶酶促连接后的粗产物；泳道3是以C为对位，T4连接酶酶促连接后的粗产物；泳道4是以G为对位，T4连接酶酶促连接后的粗产物；泳道5是以G为对位的模板链。样品用变性PAGE跑胶分析，并加入模板对照。跑胶参数为250V，时间50min。

6)500ng-1μg反应产物(双链DNA)与1mg经1×BWBS缓冲液洗涤好的链霉亲和素蛋白标记的磁珠混匀，加入等体积的1×BWBS缓冲液后，于室温温和振荡2h。上述体系置于磁力架上静置2min，弃上清液，用1×BWBS缓冲液洗涤磁珠6次。加入新配置的0.1MNaOH溶液，洗涤磁珠2次，弃上清液，再用1×BWBS缓冲液洗涤磁珠6次。用90％的甲酰胺于90℃处理10min，混合液置于磁力架上静置2min，收集上清液。

7)将收集的上清液用Zymo ssDNA/RNA Clean and Concentrator^TM试剂盒纯化后，用双蒸水洗脱，收集洗脱液即为含dTPT3^Biotin的DNA单链模板。

8)将7)中获取的含dTPT3^Biotin的DNA单链作为模板，在普通PCR的基础上补加1.2mM铜离子和dNaMTP、dTPT3^BiotinTP非天然碱基核苷三磷酸用于扩增，获取特定位点包含非天然碱基对的双链DNA。

9)重复实施例1中步骤3)操作，获取的含非天然碱基对的双链DNA的保真度如图4所示，图4中泳道1为扩增产物；泳道2为扩增产物与链霉亲和素蛋白育结合物。

实施例2

制备定点嵌入生物素(Biotin)标记非天然碱基的功能性DNA

实施例2中采用的模板和引物序列如表2所示。

表2实施例2所用DNA序列

参照图1所示，制备定点嵌入Biotin标记非天然碱基的DNA适配体的方法，包括：

1)2μM模板2、2μM引物3与1μM引物4加入1×聚合酶反应缓冲溶液中混匀，于98℃加热10min后，冷却至室温，得到反应体系。

2)向反应体系加入5μM dTPT3^BiotinTP和0.4UKF(3'→5'exo^-)聚合酶，混合均匀于37℃孵育1min，孵育结束后用试剂盒纯化。

3)加终浓度为1％DMSO、1mM ATP、20U/μL T4 DNA连接酶到上述反应体系，混合均匀于25℃孵育12h。

4)500ng-1μg反应产物(双链DNA)与1mg经1×BWBS缓冲液洗涤好的链霉亲和素蛋白标记的磁珠混匀，加入等体积的1×BWBS缓冲液后，于室温温和振荡2h。上述体系置于磁力架上静置2min，弃上清液，用1×BWBS缓冲液洗涤磁珠6次。加入新配置的0.1MNaOH溶液，洗涤磁珠2次，弃上清液，再用1×BWBS缓冲液洗涤磁珠6次。用90％的甲酰胺于90℃处理10min，混合液置于磁力架上静置2min，收集上清液。

5)将收集的上清液用Zymo ssDNA/RNA Clean and Concentrator^TM试剂盒纯化后，用双蒸水洗脱，收集洗脱液即为Biotin标记非天然碱基的DNA适配体。

6)Biotin标记非天然碱基的DNA适配体加入1×PBS缓冲液(10mM Na₂HPO₄，2mMKH₂PO₄，68.5mM NaCl，2.7mM KCl，2mM MgCl₂，pH 7.4)后，于95℃处理5min后，迅速置于冰上孵育5min。经热变性后的Biotin标记非天然碱基的DNA适配体在降温过程中折叠为具有活性的高级结构。

7)将上一步折叠好的Biotin标记非天然碱基的DNA适配体与人凝血酶于37℃，孵育15min，DNA适配体靶向结合人凝血酶。

8)用Biotin标记非天然碱基的DNA适配体检测人凝血酶的ELONA实验原理如图5所示，图5中，凝血酶孵育在高吸附性酶标板上，含有带Biotin修饰的非天然碱基的DNA适配体与凝血酶结合，并以无适配体孵育组为对照，加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素蛋白捕获含Biotin标记的DNA适配体，再用辣根过氧化物酶底物显色，读取相应波长的荧光值。具体操作是：将上一步折叠好的Biotin标记非天然碱基的DNA适配体加入经人凝血酶铺板并用牛血清蛋白(BSA)封闭、洗涤好的酶标板中，于37℃孵育15min。

9)用1×PBS缓冲液洗涤微孔3次后，加入1:1000稀释后的辣根过氧化物标记链霉亲和素蛋白，室温静置1h。

10)用1×PBS缓冲液洗涤微孔6次后，加入2,2-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)显色液，室温静置15-20min显色。加入1％SDS终止反应后读数。

11)读取410nm处的吸光值，dTPT3^Biotin定点标记适配体的检测柱状图如图5所示。其中，对照组为不加DNA适配体，实验组为加入含dTPT3^Biotin的DNA适配体，其他实验条件相同，读取波长410nm处的吸光值。图为三组平行实验的平均值。

实施例3

利用无链置换活性聚合酶制备定点嵌入含氨基标记非天然碱基的五碱基ssDNA

实施例3中采用的模板和引物序列如表3所示。

表3实施例3所用DNA序列

参照图1所示，制备定点嵌入含氨基标记非天然碱基的五碱基ssDNA的方法，包括：

1)2μM模板3、2μM引物5与1μM引物6加入1×聚合酶反应缓冲溶液中混匀，于98℃加热10min后，冷却至室温，得到反应体系。

2)向反应体系加入200μM dTPT3^Am和0.2U T4(exo^-)聚合酶，混合均匀于37℃孵育5min，孵育结束后试剂盒纯化。

3)加终浓度为1％DMSO、1mM ATP、20U/μL T4 DNA连接酶到上述反应体系，混合均匀于25℃孵育12h，如图6，图6中，检测和分析T4(exo^-)DNA聚合酶和T4 DNA连接酶对于插入一个碱基和连接错配位点的效率。泳道1为引物参照；泳道2为T4(exo^-)插入一个dTPT3^Am；泳道3为T4连接酶连接。

4)取上述步骤3)中粗产物0.2μL混入终浓度为1×变性上样缓冲液(1×TBE)，98℃变性10min。样品用变性PAGE分离，跑胶参数为250V，时间50min。

5)将上述4)中聚丙烯酰胺凝胶中较短的目的片段切割，回收，并用试剂盒纯化。

6)将5)中获取的含dTPT3^Am的DNA单链与NHS-PEG-Biotin按1：100倍当量比例混合在pH 8.5的1×PBS溶液中，于冰上反应过夜。所得反应液经过试剂盒纯化，取20-50ng纯化产物和链霉亲和素蛋白孵育。半小时后孵育产物通过PAGE胶分析。通过Biotin-shift效果，判断非天然核苷酸的插入效果，如图7，图7中泳道1为Biotin-shift验证实施例3中获取的预定义单链效果。泳道2为获取的预定义链与链霉亲和素蛋白孵育结果。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核酸链的方法及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtttcctgtg tgaaattgtt atcctctcac aattccacac aacatacgaa gcc 53

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggataacaat ttcacacagg aaacag 26

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcttcgtat gttgtgtgga attgtgag 28

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cactggcccc aaccacacca acctaccagt g 31

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggttggggc cagtg 15

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cactggtagg ttggt 15

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

actggcccca accacaccaa cctaccagtg taatttttta ttttat 46

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggttggggc cagtg 15

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cactggtagg ttggt 15

Claims

1.一种利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核苷酸链的方法，其特征包括如下步骤：

(1)将单链与聚合酶反应缓冲液充分混合得到混合液Ⅰ；所述单链包括模板链、上游结合链和下游结合链；

(2)混合液Ⅰ变性后，退火冷却至室温；

(3)加入非天然核苷三磷酸和DNA聚合酶到退火后的体系中，得到混合液Ⅱ；

(4)将混合液Ⅱ孵育，孵育结束后热处理变性DNA聚合酶，得到反应液；

(5)将步骤(4)中得到的反应液进行纯化，得到中间混合产物A，即插入非天然碱基并带缺口的双链DNA；

(6)将中间混合产物A与ATP、DNA连接酶混合在1×Tris反应缓冲液体系中，得到混合液Ⅲ；

(7)混合液Ⅲ孵育后纯化，得到中间混合产物B，即含非天然碱基的DNA链；

(8)将步骤(7)的中间混合产物B和亲和纯化磁珠混合在1×BWBS缓冲液中；

(9)将步骤(8)中混合液用1×BWBS缓冲液多次洗涤，并用碱处理分离DNA模板链，得到混合液Ⅳ；

(11)纯化混合液Ⅴ，即可得到终产物C：含有非天然碱基的单链DNA。

2.根据权利要求1所述利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核苷酸链的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述单链终浓度为0.1-10μM；聚合酶反应缓冲液中包括醋酸镁5-15mM，氯化钾10-100mM和Tris·HCl 10-50mM；反应缓冲液的pH为7.5-7.9；

所述模板链为预定义链的互补链。

3.根据权利要求1所述利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核苷酸链的方法，其特征在于，步骤(2)具体为：混合液Ⅰ在95℃条件下变性后，退火。

4.根据权利要求1所述利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核苷酸链的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述非天然核苷酸嵌入位点的对位是ATCG中的一种；所述非天然核苷酸与单链之比为5-200；聚合酶终浓度为0.02-7U/μL；所述非天然核苷酸的终浓度为2.5-10μM。

5.根据权利要求1所述利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核苷酸链的方法，其特征在于，步骤(4)中，孵育温度为16-72℃，孵育时间为1-60min；热变性温度大于90℃；热变性时间大于5min。

6.根据权利要求1所述利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核苷酸链的方法，其特征在于，步骤(6)中，ATP终浓度为0.1-5mM；DNA连接酶终浓度为0.1-20U/μL。

7.根据权利要求1所述利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核苷酸链的方法，其特征在于，步骤(7)中，孵育温度在16～42℃，孵育产物通过商业化试剂盒、变性或非变性丙烯酰胺胶分离纯化。

8.根据权利要求1所述利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核苷酸链的方法，其特征在于，步骤(8)1×BWBS缓冲液含Tris盐10-20mM，EDTA1-10mM，氯化钠1-5M；pH为7.5-7.9。

9.根据权利要求1所述利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核苷酸链的方法，其特征在于，步骤(10)中，所述甲酰胺的使用总体积为30μL。

10.权利要求1～9任一项所述制备方法制备得到的含非天然碱基核苷酸链，应用于核酸分子的定点标记、含非天然碱基对的人工半合成生命的构建等领域。