CN116925990A - 一种蛋白酶表达水平提高的底盘细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白酶表达水平提高的底盘细胞，属于基因工程以及发酵工程技术领域。本发明使用Cre/lox基因编辑技术敲除枯草芽孢杆菌细胞自溶相关基因并表达角蛋白酶、纳豆激酶和枯草蛋白酶E，得到重组菌株BSΔXLPC‑ker、BSΔXLPC‑NAT和BSΔXLPC‑SES7，相较出发菌株，重组菌株表达角蛋白酶活力提高了42％，表达纳豆激酶活力提高了50％，表达枯草蛋白酶E活力提高了43％，这对枯草芽孢杆菌生产枯草杆菌蛋白酶具有极大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白酶表达水平提高的底盘细胞，属于基因工程以及发酵工程技术领域。
背景技术
角蛋白酶是一种能够降解角蛋白类底物(例如羽毛，羊毛，头发等)的特异性蛋白酶，其主要是由真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生。与传统蛋白酶相比，角蛋白酶具有更强的水解能力和广泛的底物特异性，在皮革工业、洗涤工业和医药行业等都有着良好的应用前景，具有巨大的研究与应用价值。
关于角蛋白酶的研究大多是关于产角蛋白酶菌的分离、筛选以及角蛋白酶的分离纯化和理化性质的研究。近年来随着分子生物学的不断发展，国内外一些学者已经克隆出多个不同来源的角蛋白酶基因，并且进行角蛋白酶的基因工程方面研究，实现了这些基因的异源表达。
当前报道的主要异源表达宿主为大肠杆菌、芽孢杆菌和毕赤酵母。大肠杆菌虽然其在基因操作中的背景清晰、表达元件丰富且生长周期短，但是作为宿主过表达该蛋白质时，会引起其在细胞中的错误折叠并容易形成包涵体，使角蛋白酶产量低下。毕赤酵母作为一种常见的工业酶生产菌株，也可以实现角蛋白酶的异源表达。但是毕赤酵母发酵周期较长，并且往往密码子偏好性和酶分子糖基化等原因也会造成角蛋白酶表达量不高。芽孢杆菌是产生角蛋白酶的主要菌株，它作为角蛋白酶的异源宿主具有得天独厚的近源优势。但是使用芽孢杆菌作为角蛋白酶异源表达的宿主，其中有活性的角蛋白酶胞外表达产量仍较低，难以满足工业化的需求。
然而，随着绿色产业的推动，迫切需要角蛋白酶产业化的实现。因此，通过基因工程菌的手段，构建出可以提高角蛋白酶表达量的基因工程菌株具有重要的实际意义。枯草芽孢杆菌作为异源蛋白表达的常用宿主，在酶工业生产中具有巨大的应用潜力，但是细胞自溶是枯草芽孢杆菌发酵过程中普遍存在的现象，限制了角蛋白酶的生产。
角蛋白酶与纳豆激酶和枯草蛋白酶E同属于枯草杆菌蛋白酶类。异源蛋白在宿主中表达量不高是普遍存在的问题，大多数研究通过分子改造对表达元件进行修饰达到提高异源蛋白表达量的目的，使用枯草芽孢杆菌作为异源表达的宿主时，细胞自溶发生在整个发酵过程，后期加剧，自溶会加速细胞的裂解，表达蛋白酶的产量也会受到细胞自溶的影响。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种蛋白酶表达水平提高的底盘细胞。在课题组前期研究的基础上，本发明通过对表达宿主枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600进行底盘细胞改造，经过一系列自溶相关基因敲除，得到一株蛋白酶表达水平提高的重组枯草芽孢杆菌工程菌株。
其中所述重组枯草芽孢杆菌具有七个缺失的自溶高度相关基因，依次为lytC、cwlC、sigD、skfA、spbC、xpf、pcfA。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方法：
1)以枯草芽孢杆菌WB600的基因组为模板，分别扩增得到要敲除的目的基因上、下游同源臂的序列；
2)通过融合PCR将上游同源臂、抗性标记基因、下游同源臂依次进行连接，将得到的线性片段转化到枯草芽孢杆菌WB600中进行同源重组，获得大量重组菌；
3)挑取单菌落进行PCR验证，如果验证片段大小正确，进一步进行测序验证，测序结果无误，则成功获得单一目的基因敲除菌株；
4)上述1)-3)的方法成功敲除第一个基因后，在此基础上同样沿步骤1)-3)的方法，依次敲除另外六个与细胞自溶相关的基因，最终获得一系列枯草芽孢杆菌细胞自溶相关基因缺失菌株。
5)将携带角蛋白酶基因的质粒载体pP43NMK-ker通过化学转化方法转化所获得的枯草芽孢杆菌细胞自溶基因缺失菌株。
本发明提供一种枯草芽孢杆菌重组菌，缺失或沉默自溶相关基因lytC、cwlC、xpf和pcfA，并表达角蛋白酶。
在一种实施方式中，敲除自溶相关基因lytC、cwlC、xpf和pcfA。
在一种实施方式中，所述自溶相关基因lytC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述cwlC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述xpf的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述pcfA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述纳豆激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述枯草蛋白酶E的氨基酸序列如SEQID NO.12所示。
在一种实施方式中，用于表达所述蛋白酶的载体包括但不限于pP43NMK。
在一种实施方式中，所述重组菌的宿主包括但不限于枯草芽孢杆菌WB600。
本发明还提供一种生产角蛋白酶、纳豆激酶或枯草蛋白酶E的方法，将所述重组菌进行发酵，在35～40℃，发酵至少24h。
在一种实施方式中，发酵过程还进行补料。
在一种实施方式中，在10h-20h内以20～25g·h-1恒速流加葡萄糖，第20h停止流加直到发酵结束。
在一种实施方式中，pH为7.0～7.5，溶氧量在20～30％。
本发明还提供一种提高枯草芽孢杆菌中蛋白酶表达量的方法，敲除自溶相关基因lytC、cwlC、xpf和pcfA，并过表达角蛋白酶、纳豆激酶或枯草蛋白酶E。
本发明还提供所述重组菌在生产含角蛋白酶、纳豆激酶或枯草蛋白酶E的产品中的应用。
有益效果：
本发明所利用BSΔXLPC-ker重组菌进行发酵，相较于出发菌株WB600-ker，其角蛋白酶活由出发菌株339KU/mL提高至482KU/mL，提高了42％；利用BSΔXLPC-NAT重组菌发酵生产纳豆激酶，纳豆激酶酶活(1297U/mL)与出发菌株WB600-NAT生产酶活(861U/mL)相比，提高了50％；利用BSΔXLPC-SES7重组菌发酵生产枯草蛋白酶E，枯草蛋白酶E酶活(2391U/mL)与出发菌株WB600-SES7生产酶活(1679U/mL)相比，提高了43％。
附图说明
图1为使用摇瓶体系发酵，菌株WB600-ker和菌株BSΔXLPC-ker的发酵上清液的酶活趋势。
图2为使用摇瓶体系发酵，菌株WB600-ker和菌株BSΔXLPC-ker的生长曲线。
图3为使用5L发酵罐体系发酵，菌株WB600-ker和菌株BSΔXLPC-ker的发酵上清液的酶活趋势和生长曲线。
图4为使用摇瓶体系发酵，菌株WB600-ker和127株重组菌株表达角蛋白酶的初步筛选结果(L：lytC，C：cwlC，X：xpf，P：pcfA，S：sigD，A：skfA，C1：spbC)。
图5为使用摇瓶体系发酵，菌株WB600-ker和重组菌株表达角蛋白酶的二次筛选结果。
图6为使用摇瓶体系发酵，菌株WB600-ker和重组菌株表达角蛋白酶的三次筛选结果。
图7为使用摇瓶体系发酵，菌株WB600-ker和三次筛选结果角蛋白酶活最好的三株重组菌株的酶活趋势(b)及生长曲线(a)。
图8为使用摇瓶体系发酵，以菌株Bacillus subtilis WB600和重组菌株BSΔXLPC为宿主细胞，表达纳豆激酶(a)和枯草蛋白酶E(b)的蛋白酶活趋势和生长曲线(纳豆激酶：NAT，枯草蛋白酶E：SES7)。
具体实施方式
涉及的培养基为：
LB培养基(g·L-1)：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10，固体培养基加15g·L-1琼脂粉，121℃灭菌15min。依据实际需要添加相应抗生素。
发酵培养基(g·L-1)：胰蛋白胨20、酵母粉10、蔗糖20、Na2HPO46、KH2PO4 3、MgSO4·7H2O 0.3，121℃灭菌15min。枯草芽孢杆菌发酵使用。
涉及的培养条件：
(1)菌体活化：使用接种环沾取保存于-80℃冰箱中的甘油管内的少量菌液，使用LB固体培养基平板，将沾取的菌液在平板上进行划线，随后将平板倒置在37℃恒温培养箱中，恒温培养12至16小时。
(2)种子培养：在LB液体培养基(装液量2mL，10mL摇菌管)中加入硫酸卡那霉素，在平板上挑取单菌落，将单菌落接种于其中，在37℃、转速220r·min-1恒温摇床中的培养12至16小时。
(3)摇瓶发酵：在发酵培养基(装液量25mL，250mL摇瓶)中加入硫酸卡那霉素，以5％的接种量将培养好的种子液接种于其中，在37℃，转速220r·min-1的恒温摇床中培养24小时。
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化：
在平板上挑取枯草芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中(1mL，50mL离心管)在37℃，转速220r·min-1的恒温摇床中培养8-12h，向其中加入终浓度3％的木糖，诱导2h，加入1mL(初始浓度10％)的甘油，分装100μL/管，存于-80℃冰箱待使用。
向100μL/管的感受态细胞中加入500～1000ng的目的DNA，在37℃，转速220r·min-1的恒温摇床中后培养1.5～3h，涂布相应抗性平板。
角蛋白酶酶活的测定：取50μL适当稀释的发酵上清液，加入150μL 50mM的Gly/NaOH溶液作为缓冲液和100μL浓度为2.5％的水溶性角蛋白(购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，产品编码：K0043)作为底物，混匀后于40℃下反应20min；加入200μL 4％(w/v)的三氯乙酸(TCA)终止反应，室温8000r·min-1离心3min。取上清200μL，加入1mL 4％(w/v)的Na2CO3和200μL的福林酚试剂，混匀后50℃下显色10min，使用0.5cm石英比色皿于660nm下测定清液吸光值；实验组3个平行，空白对照是在加入底物之前先加入反应终止剂TCA，其余操作同上。
酶活的定义：在该条件下OD660每升高0.001所需酶量为一个酶活力单位(1U)。
纳豆激酶和枯草蛋白酶E蛋白酶活的测定：取适当稀释的酶溶液200μL加入至预热好的1％酪蛋白溶液中，40℃反应10min后加入400μL 0.4mol·L-1三氯乙酸(TCA)终止反应。反应结束后在200μL反应液中先加入1mL 0.4mol·L-1Na2CO3溶液，混匀后加入200μL福林酚试剂，40℃显色反应20min后测定OD680。实验组3个平行，空白对照是在加入底物之前加入三氯乙酸终止反应，其它操作与上述相同。
酶活力单位定义：在40℃，pH 10条件下，10min分解酪蛋白生成1μg酪氨酸所需酶量定义为一个酶活力单位(U)。
实施例1细胞自溶相关基因缺失菌株的构建
(1)分别设计特异性引物lytC-F1/R1、lytC-F2/R2、cwlC-F1/R1、cwlC-F2/R2、sigD-F1/R1、sigD-F2/R2、skfA-F1/R1、skfA-F2/R2、spbC-F1/R1、spbC-F2/R2、xpf-F1/R1、xpf-F2/R2、pcfA-F1/R1、pcfA-F2/R2(见表1)从枯草芽孢杆菌基因组上扩增得到要敲除的目的基因上、下游同源臂的序列。PCR扩增条件为：98℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸15s，72℃完全延伸5min，12℃保温5min，35个循环。
(2)分别设计特异性引物扩增得到壮观霉素(S，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)、氯霉素(C，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)以及博来霉素(Z，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)作为抗性标签。
(3)分别设计全长引物lytC-F/R、cwlC-F/R、sigD-F/R、skfA-F/R、spbC-F/R、xpf-F/R、pcfA-F/R(见表1)，通过融合PCR的方法，将上游同源臂、抗性标记基因、下游同源臂依次连接融合。融合PCR条件：一轮融合98℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸2min，72℃完全延伸10min，12℃保温5min，15个循环；二轮融合98℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸2min，72℃完全延伸10min，12℃保温5min，30个循环；通过融合PCR得到的片段有lytCUP-S-lytCDN、lytCUP-C-lytCDN、lytCUP-Z-lytCDN、cwlCUP-S-cwlCDN、cwlCUP-C-cwlCDN、cwlCUP-Z-cwlCDN、sigDUP-S-sigDDN、sigDUP-C-sigDDN、sigDUP-Z-sigDDN、skfAUP-S-skfADN、skfAUP-C-skfADN、skfAUP-Z-skfADN、spbCUP-S-spbC-DN、spbCUP-C-spbC-DN、spbCUP-Z-spbC-DN、xpfUP-S-xpfDN、xpfUP-C-xpfDN、xpfUP-Z-xpfDN、pcfAUP-S-pcfADN、pcfAUP-C-pcfADN、pcfAUP-Z-pcfADN。
(4)将得到的线性融合片段以单一或组合的方式化学转化枯草芽孢杆菌WB600，次日得到大量重组菌株，进行测序验证，得到正确的重组菌株；构建的重组菌见表2。
实施例2重组菌株角蛋白酶的表达
(1)将携带角蛋白酶基因的质粒载体pP43NMK-ker化学转化所获得的枯草芽孢杆菌细胞自溶基因缺失菌株；pP43NMK-ker重组载体的构建方法记载于公开号为US20210079371A1的专利中，所述角蛋白酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。将所获得的表达角蛋白酶的重组菌株命名为表2中敲除相应基因的菌株名称-ker。以敲除lytC、cwlC、xpf和pcfA为例，敲除上述4个基因的菌株命名为BSΔXLPC，进一步表达角蛋白酶的重组菌株命名为BSΔXLPC-ker。将质粒载体pP43NMK-ker化学转化至Bacillus subtilisWB600得到的重组菌株命名为WB600-ker。
(2)挑取阳性转化子于含有卡那抗性的LB培养基中过夜培养得到种子液，以5％的接种量接种于含有卡那抗性的发酵培养基中(装液量25mL，250mL摇瓶)，在37℃、220rpm下培养24h。
(3)于4℃、12000rpm离心发酵液得到上清，测定发酵液上清角蛋白酶活力(检测结果见图1)。重组菌株BSΔXLPC-ker的角蛋白酶活力(170KU/mL)是出发菌株WB600-ker(120KU/mL)的142％。
推测角蛋白酶的胞外表达量与细胞生长有关，在菌株发酵时期取样测量其600nm波长下的吸光值(见图2)。相较于出发菌株WB600-ker(OD600＝20.875)，菌株BSΔXLPC-ker(OD600＝32.7425)的生物量提高了57％，BSΔXLPC-ker菌体细胞自溶得到抑制，推测其表达外源蛋白的能力得到提高。
实施例3基因工程菌5L发酵罐生产角蛋白酶
(1)将WB600-ker和BSΔXLPC-ker的甘油菌在带有卡那抗性的LB平板上划线活化，再挑取单菌落接种于种子培养基，于37℃，220rpm培养12h得到一级种子液，再按2％的接种量转接到种子培养基，于37℃，220rpm培养4h得到二级种子液；
(2)在5L发酵罐中加入3L发酵培养基，121℃处理20min后冷却至室温，调节初始pH为7.0，温度37℃，转速500rpm，通气量3.0vvm，按照5％的接种量接入二级种子液；
(3)在10h-20h内以21.6g·h-1恒速流加葡萄糖，第20h停止流加直到发酵结束；
(4)采用氨水对发酵过程进行实时pH调节，控制pH在7.0左右，控制发酵过程温度为37℃，发酵过程通过调节搅拌转速和通气量控制体系溶氧量在30％左右；
(5)对发酵过程取样，于4℃、12000rpm离心发酵液得到上清，测定得到发酵第24h时，BSΔXLPC-ker发酵上清中角蛋白酶活力最高，为482KU/mL，比WB600-ker发酵上清中角蛋白酶活力(339KU/mL)提高了42％(检测结果见图3)。
实施例4重组菌株纳豆激酶的表达
具体实施方式参考实施例2，区别在于，用纳豆激酶基因替换质粒pP43NMK-ker中的角蛋白酶基因，构建重组质粒pP43NMK-NAT。
重组质粒pP43NMK-NAT构建：设计引物pP43NMK-F/R，NAT-F/R，分别以质粒pP43NMK-ker和纳豆激酶(NAT)基因(SEQ ID NO.11)为模板，PCR扩增得到质粒骨架以及纳豆激酶(NAT)基因，通过Gibson连接技术进行连接得到连接产物。(引物见表3)
其中Gibson连接反应体系为：5×Reaction buffer 100μL，T5 exonuclease(10U/μL)0.31μL，Phusion polymerase(2U/μL)6.25μL，Taq ligase(40U/μL)50μL，H2O 218.44μL。
将连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于添加氨苄青霉素(终浓度100mg·L1)的LB固体培养基，于37℃培养8-10h，用添加氨苄青霉素(终浓度100mg·L1)的LB液体培养基将LB固体培养平板上的单菌落清洗下转移到15mL摇菌管中，于37℃、220r/min培养3～4h后提取质粒，并送公司测序验证，验证正确即获得重组质粒pP43NMK-NAT。
将所得重组质粒pP43NMK-NAT分别转化出发菌株Bacillus subtilis WB600和实施例1所获得的重组菌株BSΔXLPC，获得重组菌株WB600-NAT和BSΔXLPC-NAT，进行摇瓶发酵。结果表明，发酵24h，WB600-NAT发酵液上清中纳豆激酶的蛋白酶酶活为861U/mL，而利用重组菌株BSΔXLPC-NAT表达纳豆激酶的蛋白酶酶活力为1297U/mL，蛋白酶活力提高了50％。
实施例5重组菌株枯草蛋白酶E的表达
具体实施方式参考实施例2，区别在于，用枯草蛋白酶E替换质粒pP43NMK-ker中的角蛋白酶基因，构建重组质粒pP43NMK-SES7。
重组质粒pP43NMK-SES7构建：设计引物pP43NMK-F/R，SES7-F/R，分别以质粒pP43NMK-ker和枯草蛋白酶E(SES7)基因(SEQ ID NO.13)为模板，PCR扩增得到质粒骨架以及枯草蛋白酶E(SES7)基因，通过Gibson连接技术进行连接得到连接产物。(引物见表3)
其中Gibson连接反应体系为：5×Reaction buffer 100μL，T5 exonuclease(10U/μL)0.31μL，Phusion polymerase(2U/μL)6.25μL，Taq ligase(40U/μL)50μL，H2O 218.44μL。
将连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于添加氨苄青霉素(终浓度100mg·L1)的LB固体培养基，于37℃培养8-10h，用添加氨苄青霉素(终浓度100mg·L1)的LB液体培养基将LB固体培养平板上的单菌落清洗下转移到15mL摇菌管中，于37℃、220r/min培养3～4h后提取质粒，并送公司测序验证，验证正确即获得重组质粒pP43NMK-SES7。
将所得重组质粒pP43NMK-SES7分别转化出发菌株Bacillus subtilis WB600和实施例1所获得的重组菌株BSΔXLPC，获得重组菌株WB600-SES7和BSΔXLPC-SES7，进行摇瓶发酵。结果表明，发酵24h，WB600-SES7(出发菌株的重组菌)发酵液上清中枯草蛋白酶E的蛋白酶酶活为1679U/mL，而利用重组菌株BSΔXLPC-SES7表达枯草蛋白酶E的蛋白酶酶活力为2391U/mL，蛋白酶活力提高了43％。
表1引物
表2重组菌列表
注：L：lytC，C：cwlC，X：xpf，P：pcfA，S：sigD，A：skfA，C1：spbC
表3引物序列
对比例1：
具体实施方式参考实施例2，将携带角蛋白酶基因的质粒载体pP43NMK-ker转化实施例1所获得的127株枯草芽孢杆菌细胞自溶基因缺失菌株，首先进行127株重组菌株的初步发酵筛选(图4)，随后在初筛结果中选择了角蛋白酶活16万以上的菌株进行二次发酵筛选(图5)，再从二次筛选结果中选择角蛋白酶活更好的八株重组菌株做三次发酵筛选(图6)，最后根据三轮筛选的结果选择最好的三株菌BSΔcwlC-ker进行发酵过程的实时监测，各菌株的发酵酶活如下表所示。三轮筛选中菌株BSΔXPC-ker的OD600值为30.1225、菌株BSΔcwlC-ker的OD600值为26.33。
表4菌株发酵生产角蛋白酶的酶活
| 菌株 | 角蛋白酶酶活(KU/mL) |
| BSΔcwlC-ker | 174.19 |
| BSΔpcfA-ker | 159.2 |
| BSΔXP-ker | 158.67 |
| BSΔXPC-ker | 169.89 |
| BSΔC1APC-ker | 170.23 |
| BSΔXC1LAC-ker | 164.62 |
| BSΔXC1LAP-ker | 161.33 |
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，缺失或沉默自溶相关基因lytC、cwlC、xpf和pcfA，并表达蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，敲除自溶相关基因lytC、cwlC、xpf和pcfA。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述蛋白酶包括角蛋白酶、纳豆激酶和枯草蛋白酶E。
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，表达所述蛋白酶的载体包括但不限于pP43NMK。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主包括但不限于枯草芽孢杆菌WB600。
6.一种生产蛋白酶的方法，其特征在于，将权利要求1～5任一所述重组菌在35～40℃发酵至少24h；所述蛋白酶包括角蛋白酶、纳豆激酶和枯草蛋白酶E。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵过程还进行补料。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述补料是在10h-20h内以20～25g·h-1恒速流加葡萄糖，第20h停止流加直到发酵结束。
9.一种提高枯草芽孢杆菌中蛋白酶表达量的方法，其特征在于，敲除自溶相关基因lytC、cwlC、xpf和pcfA，并过表达角蛋白酶、纳豆激酶或枯草蛋白酶E。
10.权利要求1～5任一所述重组菌在生产含角蛋白酶、纳豆激酶和枯草蛋白酶E的产品中的应用。
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| CN202310929472.4A Pending CN116925990A (zh) | 2023-07-26 | 2023-07-26 | 一种蛋白酶表达水平提高的底盘细胞 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN116925990A (zh) |
-
2023
- 2023-07-26 CN CN202310929472.4A patent/CN116925990A/zh active Pending
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