CN116925554A - 一种金属有机框架杂化纳米片及实时检测代谢物中葡萄糖和尿酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电化学检测分析技术领域，涉及一种金属有机框架杂化纳米片及实时无创检测代谢物中葡萄糖和尿酸含量的方法。所述金属有机框架杂化纳米片为Cu‑TCPP(Fe)/Mxene复合材料。本发明用纸基电极替代了传统的电解池，进一步缩小了实验成本，提高了实验的便携性和可操作性；通过首次将Cu‑TCPP(Fe)/Mxene复合材料应用于纸基电极上，提高了电子转移的速度和反应的比表面积。因此，本发明的方法具有快速、便携、灵敏度高、检测范围宽、特异性好等优点，对葡萄糖和尿酸的超灵敏无创检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏检测技术具有很好的指导意义。
Description
技术领域
本发明属于电化学检测分析技术领域，更具体地，涉及一种金属有机框架复合材料修饰三电极双通道纸基电极的工作电极，以及利用该纸基电极检测葡萄糖和尿酸的检测方法。
背景技术
随着社会不断发展和生活水平的不断提高，越来越多的人同时患有糖尿病和痛风，这是需要长期治疗的慢性病。对于同时患有糖尿病和痛风的患者，一般需要长期服用药物治疗，并定期测定血糖和尿酸。准确、长期监测血糖/尿酸浓度对评估糖尿病和痛风患者的治疗效果具有重要意义。目前常用的检测葡萄糖和尿酸的方法是用血糖仪和尿酸仪对血液进行检测。这种方法对于同时患有糖尿病和尿酸的病人来说，需采两次血并分别进行检验和监测，这在慢性病自我管理过程中增加了一倍的疼痛。
因此，人们对开发高度灵敏和可靠的生物传感器产生了强烈的兴趣和愿望，以便从人体体液中检测多种分析物。电化学多组分分析已成为一种同时检测多种分析物质的主流方法，广泛应用于生化、免疫传感器和分子诊断等领域。经研究表明电化学反应通道具有平面结构的复合式电化学传感器在生物医学中的应用，为大数据健康市场的快速发展提供了一种有前途的解决方案。虽然有报道称生物传感器能够检测多个靶向生物分子，但同时无创伤性检测血糖和尿酸用于糖尿病和痛风患者POC检测尚未见报道。考虑到这类患者的数量很多，而且日常血糖和尿酸监测需要两次穿孔带来不必要的痛苦，有必要开发一种无创、高灵敏度，快速，简便，低成本的检测方法，对葡萄糖和尿酸进行实时监测。
发明内容
本发明的目的是提供一种金属有机框架杂化纳米片、一种基于金属有机框架复合材料修饰的三电极双通道纸基电极的工作电极，一种基于Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料和氧化酶的纸基电化学生物传感器，以及利用该纸基电极或传感器检测葡萄糖和尿酸的检测方法。该方法能够高灵敏的检测代谢物中的葡萄糖和尿酸含量。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种金属有机框架杂化纳米片，所述金属有机框架杂化纳米片为Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料。
根据本发明一种优选实施方式，所述Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料的制备方法包括以下步骤：
(1)将三水硝酸铜、聚乙烯吡咯烷酮、三氟乙酸混合，得到第一混合液，在搅拌下，向第一混合液中逐滴加入溶解在N,N-二甲基甲酰胺/乙醇溶液中的四(4-羧基苯基)氯化卟吩铁(Ⅲ)，得到第二混合液，所述第二混合液经超声处理后进行加热反应；
(2)反应后，将体系冷却并进行离心、洗涤、干燥，得到Cu-TCPP(Fe)粉末；
(3)将Mxene水溶液与步骤(2)得到的Cu-TCPP(Fe)粉末混合，搅拌处理后离心分离掉未复合的材料，将所得固体真空干燥，得到所述Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料。
具体地，步骤(1)中，相比1mg三水硝酸铜，聚乙烯吡咯烷酮的加入量为4-5mg，三氟乙酸的加入量为16-17μL，四(4-羧基苯基)氯化卟吩铁(Ⅲ)的加入量为1.5-2mg，N,N-二甲基甲酰胺/乙醇溶液的加入量为4-6mL；N,N-二甲基甲酰胺/乙醇溶液中N,N-二甲基甲酰胺与乙醇的体积比为2.5-3.5：1；所述加热反应的温度为75-85℃，时间为3-5h。更具体地，步骤(1)中，相比1mg三水硝酸铜，聚乙烯吡咯烷酮的加入量为4.17mg，三氟乙酸的加入量为16.67μL，四(4-羧基苯基)氯化卟吩铁(Ⅲ)的加入量为1.83mg，N,N-二甲基甲酰胺/乙醇溶液的加入量为5mL；N,N-二甲基甲酰胺/乙醇溶液中N,N-二甲基甲酰胺与乙醇的体积比为3：1；所述加热反应的温度为80℃，时间为4h。
具体地，步骤(2)中，离心的转速为8000-12000转/min，离心的时间为10-20min；离心后得到红色固体；所述洗涤的方法包括：加入乙醇后，振荡使固体溶解，再超声处理、离心分离。更具体地，步骤(2)中，离心的转速为10000转/min，离心的时间为15min；离心后得到红色固体；所述洗涤的方法包括：加入水后，振荡使固体溶解，再超声处理、离心分离。
具体地，步骤(3)中，将Mxene水溶液与Cu-TCPP(Fe)粉末于室温下搅拌混合，Mxene水溶液的浓度为8-12mg/L，相比1mg Mxene，Cu-TCPP(Fe)粉末的加入量为800-12000mg；离心的条件包括：转速8000-12000转/min，时间为10-20min。更具体地，步骤(3)中，将Mxene水溶液与Cu-TCPP(Fe)粉末于室温下搅拌混合，Mxene水溶液的浓度为10mg/L，相比1mgMxene，Cu-TCPP(Fe)粉末的加入量为1000mg；离心的条件包括：转速10000转/min，时间为15min。
根据本发明，所述金属有机框架复合材料包括2D-MOF与Mxene，其中Mxene具有良好的电催化性能，金属卟啉基MOF纳米片与Mxene的结合可模拟酶级联反应。
本发明的原理为：首先，将Cu-TCPP(Fe)/Mxene金属有机框架复合材料通过滴涂的方式修饰在工作电极上。然后，将葡萄糖氧化酶和尿酸氧化酶通过滴涂的方式修饰在工作电极上。当目标物存在时，氧化酶氧化目标物为葡萄糖酸、尿囊酸和H2O2，然后Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料催化H2O2，产生O2和H2O，同时产生电子，从而引起电流变化。通过连接便携式电化学工作站即可以检测产生电流的大小。其中电流值的大小与目标物的浓度成正相关关系，可以对其进行定量检测，制作标准曲线。对待测样品进行同样方法测定，将测得的电流值代入标准曲线，得到其中葡萄糖和尿酸的浓度。
基于本发明的上述原理，可设计具有三电极双通道体系的纸基电极。所述电极的油墨可以单独提供，也可以通过丝网印刷技术将其打印在NC膜上。
本发明的金属有机框架复合材料具有优异的H2O2电化学催化氧化性能，从而引起电流变化。
本发明中，所述氧化酶需具有氧化葡萄糖和尿酸产生H2O2的能力，根据酶对其底物具有高度特异性和高度催化效能的特点，所述氧化酶优选为葡萄糖氧化酶和尿酸氧化酶。
基于电化学反应原理和本发明的上述原理，本领域技术人员可设计合适的电极体系，包括三电极体系和两电极体系。根据本发明一种优选实施方式，所述电极采用三电极体系。包括工作电极，参比电极和对电极。
具体地，本发明的第二方面提供一种金属有机框架复合材料和氧化酶修饰三电极双通道体系纸基电极，所述电极包括以下组分：
(1)工作电极：修饰的碳加石墨烯电极；
(2)参比电极：Ag/AgCl；
(3)对电极：碳加石墨烯电极；
其中，所述修饰的碳加石墨烯电极为依次经上述的Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料和氧化酶修饰的电极，所述修饰的碳加石墨烯电极能够对葡萄糖和尿酸进行氧化还原反应；
所述氧化酶包括葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶。
根据本发明一种优选实施方式，所述修饰的方法包括：
(a)将葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶用PBS溶液溶解；
(b)通过丝网打印技术制备三电极双通道体系的纸基电极；
(c)将Cu-TCPP(Fe)/Mxene溶液滴涂到步骤(b)所得的纸基电极的工作电极上，放置于4℃冰箱中干燥；
(d)通过滴涂的方法向步骤(c)干燥后的工作电极上修饰步骤(a)的氧化酶溶液，得到所述修饰的碳加石墨烯电极，所得修饰的碳加石墨烯电极可放置于4℃冰箱中干燥保存。
本发明的第三方面提供一种基于Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料和氧化酶的纸基电化学生物传感器，包括：
i)上述的Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料；
ii)氧化酶，所述氧化酶包括葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶；
iii)三电极双通道体系的纸基电极，优选通过丝网打印技术制备；
iv)便携式电化学工作站。
本发明的第四方面提供一种实时检测生命流动体中葡萄糖和尿酸含量的方法，该方法基于上述的电极、或上述的电化学生物传感器进行，包括以下步骤：
(1)获取金属有机框架纳米片Cu-TCPP(Fe)；
(2)将Cu-TCPP(Fe)与Mxene溶液反应，形成Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料溶液；
(3)将葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶用PBS溶液溶解；
(4)通过丝网打印技术制备三电极双通道体系的纸基电极；
(5)将步骤(2)所得Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料溶液滴涂到步骤(4)所得的纸基电极的工作电极上，放置于4℃冰箱中干燥；
(6)向步骤(5)干燥后的工作电极上通过滴涂的方法修饰步骤(3)制备的氧化酶溶液，得到修饰好的电极，可放置于4℃冰箱中干燥保存；
(7)分别量取葡萄糖、尿酸标准溶液加入步骤(6)修饰好的电极的工作区域，该区域为亲水区域；
(8)测量步骤(7)所得反应产物溶液的电流信号，建立葡萄糖、尿酸标准溶液浓度与电流信号的标准曲线；
(9)将含有葡萄糖、尿酸的待测液进行上述测试，将得到的电流信号值代入步骤(8)的标准曲线，计算待测液中葡萄糖、尿酸的浓度。
本发明中，所述葡萄糖氧化酶和尿酸氧化酶分装可采用本领域常规的方法进行，例如，用1×PBS缓冲溶液将葡萄糖氧化酶和尿酸氧化酶稀释成1U/μL，然后在无菌条件下，每10μL一个离心管进行分装，然后离心，置于-20℃保存，这样可以避免反复冻融导致氧化酶失活。
根据本发明，采用一系列浓度梯度的葡萄糖和尿酸标准品溶液进行标准曲线的建立，其浓度范围可以为0.001nM-5mM、0.025nM-5mM。
测量步骤(8)所得反应产物溶液的电流信号的条件与所测溶液的浓度有关，可采用循环伏安法。测量条件优选包括：最大电流10A，最小电流值1pA，测量时间为100s。
本发明的所述方法中，修饰工作电极的Cu-TCPP(Fe)/Mxene的体积的量的确定包括如下步骤：
(1)将Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液、葡萄糖标准溶液和尿酸标准溶液置于室温；
(2)取6个纸基电极，编号为①，②，③，④，⑤，⑥，在工作电极上分别修饰20μL，30μL，40μL，50μL，60μL，70μL的Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液和5μL葡萄糖氧化酶、10μL尿酸氧化酶，置于4℃冰箱保存；
(3)将修饰了Cu-TCPP(Fe)/Mxene杂化纳米片、与所述氧化酶的纸基电极与所述纸基电极连接的电化学工作站打开，设置好参数后，预热20min；
(4)分别量取100μL 1mM葡萄糖和尿酸标准溶液滴加到纸基电极的工作区域，使其浸润工作电极，参比电极和对电极，然后绿色接工作电极，白色接参比电极，红色接对电极，黄色接另一个工作电极，连接好以后，直接点击开始，比较不同体积的Cu-TCPP(Fe)/Mxene的电流值大小，确定最佳反应体积为葡萄糖50μL，尿酸40μL。
本发明的所述方法中，修饰工作电极的氧化酶的体积的量的确定包括如下步骤：
(1)将Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液、葡萄糖标准溶液和尿酸标准溶液置于室温；
(2)取6个纸基电极，编号为①，②，③，④，⑤，⑥，在工作电极上分别修饰50μL和40μL Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液和3μL，4μL，5μL，6μL，7μL和8μL的葡萄糖氧化酶以及7μL，8μL，9μL，10μL，11μL，12μL放置于4℃冰箱保存；
(3)将修饰了Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料、与所述氧化酶的纸基电极与所述纸基电极连接的电化学工作站打开，设置好参数后，预热20min；
(4)分别量取100μL 1mM葡萄糖和尿酸标准溶液滴加到纸基电极的工作区域，使其浸润工作电极，参比电极和对电极，然后绿色接工作电极，白色接参比电极，红色接对电极，黄色接另一个工作电极，连接好以后，直接点击开始，比较不同体积氧化酶的电流值大小，确定葡萄糖氧化酶最佳体积为5μL，尿酸氧化酶最佳体积为10μL。
本发明的所述方法中，缓冲液pH值的确定包括如下步骤：
(1)将Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液置于室温；
(2)取6个纸基电极，编号为①，②，③，④，⑤，⑥，在工作电极上分别修饰修饰50μL和40μL Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液和葡萄糖氧化酶5μL，尿酸氧化酶10μL，放置于4℃冰箱保存；
(3)将电化学工作站打开，设置好参数后，预热20min；
(4)分别量取100μL pH＝4.40，pH＝5.40；pH＝6.40；pH＝7.40；pH＝8.40；pH＝9.40的1×PBS缓冲溶液滴加到纸基电极的工作区域，使其浸润工作电极，参比电极和对电极，然后绿色接工作电极，白色接参比电极，红色接对电极，黄色接另一个工作电极，连接好以后，直接点击开始，比较不同pH的1×PBS缓冲溶液的电流值大小，确定pH＝7.40为葡萄糖最佳测试条件，pH＝5.40为尿酸最佳测试条件。
本发明用纸基电极替代了传统的电解池，进一步缩小了实验成本，提高了实验的便携性和可操作性；通过添加葡萄糖和尿酸氧化酶和Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料，提高了电子转移的速度和反应的比表面积。因此，本发明的方法具有灵敏度高、检测范围宽、特异性好等优点，对葡萄糖和尿酸的超灵敏检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏检测技术具有很好的指导意义。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为Cu-TCPP(Fe)二维金属有机框架的扫描电镜图。
图2为Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料的扫描电镜图。
图3为Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料的透射电镜图。
图4a和图4b分别为以葡萄糖和尿酸标准品的浓度的对数为横坐标，各浓度对应的电流值为纵坐标绘制的标准曲线。
图5为基于Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料和葡萄糖、尿酸氧化酶纸基电化学检测方法的稳定性试验结果，测量浓度为1mM，其中a图为葡萄糖检测的稳定性，b图为尿酸检测的稳定性。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
下述各实施例中，硝酸铜、三水合物购自上海麦克林生化科技有限公司，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)化学试剂购自Sigma公司，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购自罗恩试剂，meso-四(4-羧基苯基)卟吩氯化铁购自上海麦克林生化科技有限公司，实验中所用到的葡萄糖和尿酸标准品购自阿法埃莎(中国)化学有限公司，葡萄糖、尿酸氧化酶和人工汗液、尿液、唾液购自上海源叶生物科技有限公司。电化学工作站购自上海华辰。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下实施例中，修饰工作电极的Cu-TCPP(Fe)/Mxene的葡萄糖的体积为50μL，尿酸的体积为40μL。修饰工作电极的葡萄糖氧化酶的体积为5μL，尿酸氧化酶的体积为10μL。配制葡萄糖溶液的1×PBS缓冲溶液的pH＝7.40，配制尿酸溶液的1×PBS缓冲溶液的pH＝5.40。
实施例一
本实施例提供一种基于Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料及葡萄糖和尿酸氧化酶纸基电化学生物传感器的生命流动体中葡萄糖和尿酸含量的实时检测方法的建立，包括以下步骤：
(1)Cu-TCPP(Fe)2D MOF合成方法：
①称取7.2mg三水硝酸铜，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)30mg，量取三氟乙酸(0.1M)120μL，放于250mL圆底烧瓶中。
②在搅拌下，逐滴加入溶解在36mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)：乙醇(3：1)溶液中的四(4-羧基苯基)氯化卟吩铁(III)13.2mg。
③将该混合溶液超声10min。
④将圆底烧瓶放入水浴锅中，加热至80℃，然后保持反应4h。
⑤拿出放置室温，离心15min，转速为10000转/min，得红色固体。
⑥将得到的固体用20mL乙醇洗涤3次，加入水后，振荡使其溶解，再超声5-10min，使其完全溶解，离心15min，转速为10000转/min。
⑦将最后离心得到的固体，放入真空干燥箱中干燥，得到Cu-TCPP(Fe)2D MOF，4℃密封保存，所得材料的扫描电镜图如图1所示。
(2)Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料的合成方法：
①量取10mL Mxene水溶液(10mg/L)水溶液加入试管中，随后加入100mg Cu-TCPP(Fe)粉末，室温下搅拌6h。
②将上述混合溶液放入离心机，离心15min，转速10000转/min，去掉未复合的材料。
③将上述混合溶液放入离心机，离心15min，转速10000转/min，去掉上清液，得到固体。
④将得到的固体放入真空干燥箱中，烘干，得到Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料，4℃密封保存，Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料的扫描电镜图和透射电镜图分别如图2、3所示。
(3)纸基电极的制备：
①用打印机将蜡打印到普通的纸张上，并在90℃下处理5分钟，以使蜡均匀地渗透到纸张上，创建一个专为这个范围设计的疏水图案。
②然后，使用丝网打印机打印三个电极。工作电极和对电极使用碳和石墨烯按一定比例混合的墨水打印，参比电极使用Ag/AgCl墨水打印。由此产生的工作电极宽度为2mm。
(4)修饰纸基电极的制备：
①将Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液从4℃冰箱中拿出，放置室温。
②量取40μL和50μL的混悬液通过滴注的方式对工作电极进行修饰，每次量取25μL，分三次进行修饰，每修饰完一次把电极放置于4℃冰箱中干燥2h。
③将葡萄糖和尿酸氧化酶从-20℃冰箱中拿出，融解后，量取5μL葡萄糖氧化酶和10μL尿酸氧化酶对工作电极采用滴注的方式进行修饰，修饰好以后，将电极放置于4℃冰箱中干燥保存。
(5)将葡萄糖和尿酸标准溶液从4℃冰箱中拿出，用1×PBS缓冲液分别配制成0.000013μM，0.00004μM，0.00012μM，0.0004μM，0.001μM，0.003μM，0.01μM的溶液。
(6)打开电化学工作站，设置参数最大电流为10A，最小电流为1pA，时间设置为100s，预热20min。
(7)取步骤(5)配制好的不同浓度葡萄糖和尿酸溶液100μL，依次滴加到纸基电极的工作区域，使溶液浸润工作电极，参比电极和对电极。
(8)绿色接工作电极，白色接参比电极，红色接对电极，黄色接另一个工作电极，连接好以后，直接点击开始。
(9)检测不同浓度的葡萄糖(0.001nM，0.005nM，3.125nM，78.125nM，29295nM，732375nM，5000000nM)、不同浓度尿酸(0.025nM，0.125nM，15.625nM，78.125nM，146475nM，1000000nM，5000000nM)并得到各个浓度的电流值大小。
利用软件计算得到其标准曲线为F＝0.6005lgC+5.6720(R2＝0.9987)，F＝3.2817lgC+8.2856(R2＝0.9994)，检测线性范围分别为0.001nM-5mM，0.025nM-5mM，检出限是1.88aM/L和5.80pM/L(S/N＝3)。以电流值为纵坐标，葡萄糖和尿酸标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，如图4a和图4b所示。
实施例二
基于Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料及葡萄糖和尿酸氧化酶纸基电化学生物传感器检测代谢物中葡萄糖和尿酸的方法加标回收实验，包括以下步骤：
(1)以四种不同浓度向人工汗液中添加葡萄糖和尿酸：0，5μmol/L，50μmol/L和500μmol/L。将人工汗液和葡萄糖和尿酸在试管中混合，得到四种不同浓度的待测样品，放置于4℃冰箱中保存待用。
(2)将Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液从4℃冰箱中拿出，放置室温。
(3)量取40μL和50μL的混悬液通过滴注的方式对工作电极进行修饰，每次量取25μL，分三次进行修饰，每修饰完一次把电极放置于4℃冰箱中干燥2h。
(4)将葡萄糖和尿酸氧化酶从-20℃冰箱中拿出，融解后，量取5μL葡萄糖氧化酶和10μL尿酸氧化酶对工作电极采用滴注的方式进行修饰，修饰好以后，将电极放置于4℃冰箱中干燥保存。
(5)打开电化学工作站，设置参数最大电流为10A，最小电流为1pA，时间设置为100s，预热20min。
(6)向步骤(4)修饰好的电极工作区域添加步骤(1)配制的不同加标浓度的葡萄糖和尿酸溶液100μL，使溶液浸润工作电极，参比电极和对电极。
(7)绿色接工作电极，白色接参比电极，红色接对电极，黄色接另一个工作电极，连接好以后，直接点击开始。
(8)通过标准曲线计算检测的浓度与实际添加浓度比较，葡萄糖的回收率的范围为95％-103％，尿酸的回收率范围为100％-103％，RSD范围分别为5.42％-6.94％，7.54％-9.30％。结果表明该检测方法可以应用到实际汗液检测，并且前处理简单。
实施例三
基于Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料及葡萄糖和尿酸氧化酶纸基电化学生物传感器检测代谢物中葡萄糖和尿酸的方法加标回收实验，包括以下步骤：
(1)以四种不同浓度向人工尿液中添加葡萄糖和尿酸：0，5μmol/L，50μmol/L和500μmol/L。将人工尿液和葡萄糖和尿酸在试管中混合，得到四种不同浓度的待测样品，放置于4℃冰箱中保存待用。
(2)将Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液从4℃冰箱中拿出，放置室温。
(3)量取40μL和50μL的混悬液通过滴注的方式对工作电极进行修饰，每次量取25μL，分三次进行修饰，每修饰完一次把电极放置于4℃冰箱中干燥2h。
(4)将葡萄糖和尿酸氧化酶从-20℃冰箱中拿出，融解后，量取5μL葡萄糖氧化酶和10μL尿酸氧化酶对工作电极采用滴注的方式进行修饰，修饰好以后，将电极放置于4℃冰箱中干燥保存。
(5)打开电化学工作站，设置参数最大电流为10A，最小电流为1pA，时间设置为100s，预热20min。
(6)向步骤(4)修饰好的电极工作区域添加步骤(1)配制的不同加标浓度的葡萄糖和尿酸溶液100μL，使溶液浸润工作电极，参比电极和对电极。
(7)绿色接工作电极，白色接参比电极，红色接对电极，黄色接另一个工作电极，连接好以后，直接点击开始。
(8)通过标准曲线计算检测的浓度与实际添加浓度比较，葡萄糖的回收率的范围为95％-103％，尿酸的回收率范围为100％-103％，RSD范围分别为5.42％-6.94％，7.54％-9.30％。结果表明该检测方法可以应用到实际尿液检测，并且前处理简单。
实施例四
基于Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料及葡萄糖和尿酸氧化酶纸基电化学生物传感器检测代谢物中葡萄糖和尿酸实时检测方法稳定性实验，包括以下步骤：
(1)将葡萄糖和尿酸标准溶液从4℃冰箱中拿出，用1×PBS缓冲液分别配制成1mM的标准溶液。
(2)将Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液从4℃冰箱中拿出，放置室温。
(3)量取40μL和50μL的混悬液通过滴注的方式对工作电极进行修饰，每次量取25μL，分三次进行修饰，每修饰完一次把电极放置于4℃冰箱中干燥2h。
(4)将葡萄糖和尿酸氧化酶从-20℃冰箱中拿出，融解后，量取5μL葡萄糖氧化酶和10μL尿酸氧化酶对工作电极采用滴注的方式进行修饰，修饰好以后，将电极放置于4℃冰箱中干燥保存。
(5)打开电化学工作站，设置参数最大电流为10A，最小电流为1pA，时间设置为100s，预热20min。
(6)向步骤(4)修饰好的电极工作区域添加步骤(1)配制的葡萄糖和尿酸溶液100μL，使溶液浸润工作电极，参比电极和对电极。
(7)绿色接工作电极，白色接参比电极，红色接对电极，黄色接另一个工作电极，连接好以后，直接点击开始。
(8)通过电化学工作站测得每个溶液的电压大小，然后选取30天、40天、50天、60天、80天和100天的时候，按照上述方法步骤(1)配制的葡萄糖和尿酸溶液的电压值，然后通过软件处理得到其柱状图，横坐标为天数，纵坐标为电压值，如图5所示。
为了验证本发明检测方法的稳定性，选取30天、40天、50天、60天、80天和100天进行检测。由图5可知，本发明检测方法的稳定性良好，第1天与第30天的测量结果几乎相同。到100天的时候，电压值有所下降，但在可接受的范围，总体来看100天内电流值变化不大。
实施例五
基于Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料及葡萄糖和尿酸氧化酶纸基电化学生物传感器检测代谢物中葡萄糖和尿酸实时检测方法的重复性，包括以下步骤：
(1)将Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液和1mM葡萄糖和尿酸溶液从4℃冰箱中拿出，放置室温。
(2)量取40μL和50μL的混悬液通过滴注的方式对工作电极进行修饰，每次量取25μL，分三次进行修饰，每修饰完一次把电极放置于4℃冰箱中干燥2h。
(3)将葡萄糖氧化酶和尿酸氧化酶从-20℃冰箱中拿出，融解后，量取5μL葡萄糖氧化酶和10μL尿酸氧化酶对工作电极采用滴注的方式进行修饰，修饰好以后，将电极放置于4℃冰箱中干燥保存。
(4)打开电化学工作站，设置参数最大电流为10A，最小电流为1pA，时间设置为100s，预热20min。
(5)向步骤(4)修饰好的电极工作区域添加100μL 1mM葡萄糖和尿酸溶液，使溶液浸润工作电极，参比电极和对电极。
(6)绿色接工作电极，白色接参比电极，红色接对电极，黄色接另一个工作电极，连接好以后，直接点击开始。
(7)重复测量5次，记录每一次的电流值大小，计算其相对标准偏差。结果如表1和表2所示。
表1尿酸的重复性和重现性
表2葡萄糖的重复性和重现性
实施例六
基于Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料及葡萄糖和尿酸氧化酶纸基电化学生物传感器检测代谢物中葡萄糖和尿酸实时检测方法的的重现性，包括以下步骤：
(1)将Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液和1mM葡萄糖和尿酸溶液从4℃冰箱中拿出，放置室温。
(2)量取40μL和50μL的混悬液通过滴注的方式对3个不同的工作电极进行修饰，每次量取25μL，分三次进行修饰，每修饰完一次把电极放置于4℃冰箱中干燥2h。
(3)将葡萄糖氧化酶和尿酸氧化酶从-20℃冰箱中拿出，融解后，分别量取5μL葡萄糖氧化酶和10μL尿酸氧化酶对3个不同的工作电极采用滴注的方式进行修饰，修饰好以后，将电极放置于4℃冰箱中干燥保存即可。
(4)打开电化学工作站，设置参数最大电流为10A，最小电流为1pA，时间设置为100s，预热20min。
(5)向步骤(3)修饰好的3个不同电极工作区域添加100μL 1mM葡萄糖和尿酸溶液，使溶液分别浸润工作电极，参比电极和对电极。
(6)绿色接工作电极，白色接参比电极，红色接对电极，黄色接另一个工作电极，连接好以后，直接点击开始。
(7)通过电化学工作站测量可以得到每个纸基电极的电流值大小，计算其相对标准偏差。结果如表1和表2所示。
为了验证本发明检测方法的重复性和重现性，选取1mM葡萄糖和尿酸溶液进行测量。由表1和表2可知，葡萄糖的重复性和重现性相对标准偏差(RSD％)分别为0.016和0.042，尿酸的重复性和重现性相对标准偏差(RSD％)分别为0.005和0.118。结果表明所制备的基于Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料及葡萄糖和尿酸氧化酶纸基电化学生物传感器具有极好的可重复性和可再现性。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (10)
1.一种金属有机框架杂化纳米片，其特征在于，所述金属有机框架杂化纳米片为Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料。
2.根据权利要求1所述的金属有机框架杂化纳米片，其特征在于，所述Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料的制备方法包括以下步骤：
(1)将三水硝酸铜、聚乙烯吡咯烷酮、三氟乙酸混合，得到第一混合液，在搅拌下，向第一混合液中逐滴加入溶解在N,N-二甲基甲酰胺/乙醇溶液中的四(4-羧基苯基)氯化卟吩铁(Ⅲ)，得到第二混合液，所述第二混合液经超声处理后进行加热反应；
(2)反应后，将体系冷却并进行离心、洗涤、干燥，得到Cu-TCPP(Fe)粉末；
(3)将Mxene水溶液与步骤(2)得到的Cu-TCPP(Fe)粉末混合，搅拌处理后离心分离掉未复合的材料，将所得固体真空干燥，得到所述Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料。
3.根据权利要求2所述的金属有机框架杂化纳米片，其特征在于，
步骤(1)中，相比1mg三水硝酸铜，聚乙烯吡咯烷酮的加入量为4-5mg，三氟乙酸的加入量为16-17μL，四(4-羧基苯基)氯化卟吩铁(Ⅲ)的加入量为1.5-2mg，N,N-二甲基甲酰胺/乙醇溶液的加入量为4-6mL；N,N-二甲基甲酰胺/乙醇溶液中N,N-二甲基甲酰胺与乙醇的体积比为2.5-3.5：1；所述加热反应的温度为75-85℃，时间为3-5h；
步骤(2)中，离心的转速为8000-12000转/min，离心的时间为10-20min；离心后得到红色固体；所述洗涤的方法包括：加入乙醇后，振荡使固体溶解，再超声处理、离心分离；
步骤(3)中，将Mxene水溶液与Cu-TCPP(Fe)粉末于室温下搅拌混合，Mxene水溶液的浓度为8-12mg/L，相比1mg Mxene，Cu-TCPP(Fe)粉末的加入量为800-1200mg；离心的条件包括：转速8000-12000转/min，时间为10-20min。
4.一种金属有机框架复合材料和氧化酶修饰三电极双通道体系纸基电极，其特征在于，所述电极包括以下组分：
(1)工作电极：修饰的碳加石墨烯电极；
(2)参比电极：Ag/AgCl；
(3)对电极：碳加石墨烯电极；
其中，所述修饰的碳加石墨烯电极为依次经权利要求1-3中任意一项中所述的Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料和氧化酶修饰的电极，所述修饰的碳加石墨烯电极能够对葡萄糖和尿酸进行氧化还原反应；
所述氧化酶包括葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶。
5.根据权利要求4所述的电极，其特征在于，所述修饰的方法包括：
(a)将葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶用PBS溶液溶解；
(b)通过丝网打印技术制备三电极双通道体系的纸基电极；
(c)将Cu-TCPP(Fe)/Mxene溶液滴涂到步骤(b)所得的纸基电极的工作电极上，放置于4℃冰箱中干燥；
(d)通过滴涂的方法向步骤(c)干燥后的工作电极上修饰步骤(a)的氧化酶溶液，得到所述修饰的碳加石墨烯电极。
6.一种基于Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料和氧化酶的纸基电化学生物传感器，其特征在于，包括：
i)权利要求1-3中任意一项中所述的Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料；
ii)氧化酶，所述氧化酶包括葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶；
iii)三电极双通道体系的纸基电极，优选通过丝网打印技术制备；
iv)便携式电化学工作站。
7.一种实时检测代谢物中葡萄糖和尿酸含量的方法，其特征在于，该方法基于权利要求4或5所述的电极、或权利要求6所述的电化学生物传感器进行，包括以下步骤：
(1)获取金属有机框架纳米片Cu-TCPP(Fe)；
(2)将Cu-TCPP(Fe)与Mxene溶液反应，形成Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料溶液；
(3)将葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶用PBS溶液溶解；
(4)通过丝网打印技术制备三电极双通道体系的纸基电极；
(5)将步骤(2)所得Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料溶液滴涂到步骤(4)所得的纸基电极的工作电极上，放置于4℃冰箱中干燥；
(6)向步骤(5)干燥后的工作电极上通过滴涂的方法修饰步骤(3)制备的氧化酶溶液，得到修饰好的电极；
(7)分别量取葡萄糖、尿酸标准溶液加入步骤(6)修饰好的电极的工作区域，该区域为亲水区域；
(8)测量步骤(7)所得反应产物溶液的电流信号，建立葡萄糖、尿酸标准溶液浓度与电流信号的标准曲线；优选采用循环伏安法测量所述电流信号，测量条件优选包括：最大电流10A，最小电流值1pA，测量时间为100s；
(9)将含有葡萄糖、尿酸的待测液进行上述测试，将得到的电流信号值代入步骤(8)的标准曲线，计算待测液中葡萄糖、尿酸的浓度。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中，修饰工作电极的Cu-TCPP(Fe)/Mxene的体积的量的确定包括如下步骤：
(1)将Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液、葡萄糖标准溶液和尿酸标准溶液置于室温；
(2)取6个纸基电极，编号为①，②，③，④，⑤，⑥，在工作电极上分别修饰20μL，30μL，40μL，50μL，60μL，70μL的Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液和5μL葡萄糖氧化酶、10μL尿酸氧化酶，置于4℃冰箱保存；
(3)将修饰了Cu-TCPP(Fe)/Mxene杂化纳米片、与所述氧化酶的纸基电极与所述纸基电极连接的电化学工作站打开，设置好参数后，预热20min；
(4)分别量取100μL 1mM葡萄糖和尿酸标准溶液滴加到纸基电极的工作区域，使其浸润工作电极，参比电极和对电极，然后绿色接工作电极，白色接参比电极，红色接对电极，黄色接另一个工作电极，连接好以后，直接点击开始，比较不同体积的Cu-TCPP(Fe)/Mxene的电流值大小，确定最佳反应体积为葡萄糖50μL，尿酸40μL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中，修饰工作电极的氧化酶的体积的量的确定包括如下步骤：
(1)将Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液、葡萄糖标准溶液和尿酸标准溶液置于室温；
(2)取6个纸基电极，编号为①，②，③，④，⑤，⑥，在工作电极上分别修饰50μL和40μLCu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液和3μL，4μL，5μL，6μL，7μL和8μL的葡萄糖氧化酶以及7μL，8μL，9μL，10μL，11μL，12μL放置于4℃冰箱保存；
(3)将修饰了Cu-TCPP(Fe)/Mxene复合材料、与所述氧化酶的纸基电极与所述纸基电极连接的电化学工作站打开，设置好参数后，预热20min；
(4)分别量取100μL 1mM葡萄糖和尿酸标准溶液滴加到纸基电极的工作区域，使其浸润工作电极，参比电极和对电极，然后绿色接工作电极，白色接参比电极，红色接对电极，黄色接另一个工作电极，连接好以后，直接点击开始，比较不同体积氧化酶的电流值大小，确定葡萄糖氧化酶最佳体积为5μL，尿酸氧化酶最佳体积为10μL。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中缓冲液pH值的确定包括如下步骤：
(1)将Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液置于室温；
(2)取6个纸基电极，编号为①，②，③，④，⑤，⑥，在工作电极上分别修饰修饰50μL和40μL Cu-TCPP(Fe)/Mxene混悬液和葡萄糖氧化酶5μL，尿酸氧化酶10μL，放置于4℃冰箱保存；
(3)将电化学工作站打开，设置好参数后，预热20min；
(4)分别量取100μL pH＝4.40、pH＝5.40、pH＝6.40、pH＝7.40、pH＝8.40、pH＝9.40的1×PBS缓冲溶液滴加到纸基电极的工作区域，使其浸润工作电极，参比电极和对电极，然后绿色接工作电极，白色接参比电极，红色接对电极，黄色接另一个工作电极，连接好以后，直接点击开始，比较不同pH的1×PBS缓冲溶液的电流值大小，确定pH＝7.40为葡萄糖最佳测试条件，pH＝5.40为尿酸最佳测试条件。
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