CN116917134A - 用于神经调节剂的包封和持续释放的聚合物纳米颗粒组合物 - Google Patents
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Abstract
公开了包含聚电解质纳米复合物的纳米颗粒或微凝胶、其制备方法以及治疗疾病或状况的方法，该聚电解质纳米复合物包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物，其中抗衡离子聚合物具有电荷，该电荷使抗衡离子聚合物能够与一种或更多种神经调节剂静电结合。
Description
背景
包括神经毒素的神经调节剂在美容和治疗领域两者中都是有效的。神经调节剂通常通过注射递送，并且麻痹肌体(muscle body)，对许多临床适应症具有出众的效力，包括提供对偏头痛的缓解以及减少关于面部美学的衰老的迹象。尽管在2018年由于44亿美元的总收入而有强劲的市场表现，但目前市场上的神经调节剂制剂遭受从注射部位的快速清除和仅14天的最大有效释放期之苦。因此，本领域中已知的神经调节剂制剂至少每三个月需要再注射。
概述
在一些方面中，本发明公开的主题提供了聚电解质纳米复合物(polyelectrolytenanocomplex)(PNC)，该聚电解质纳米复合物包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物，其中抗衡离子聚合物具有电荷，所述电荷使抗衡离子聚合物能够与所述一种或更多种神经调节剂静电结合。
在一些方面中，本发明公开的主题提供了包含PNC和非水溶性的生物可降解聚合物(non-water-soluble biodegradable polymer)的纳米颗粒；其中一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物的聚电解质纳米复合物(PNC)分布在整个非水溶性的生物可降解聚合物中。在这样的方面中，纳米颗粒是持续释放纳米颗粒。
在一些方面中，一种或更多种神经调节剂包括梭菌神经毒素(Clostridialneurotoxin)的治疗活性衍生物。在某些方面中，梭菌神经毒素包括肉毒杆菌毒素(botulinum toxin)的治疗活性衍生物。在某些方面中，肉毒杆菌毒素选自由A型肉毒杆菌毒素、B型肉毒杆菌毒素、包括C1型肉毒杆菌毒素的C型肉毒杆菌毒素、D型肉毒杆菌毒素、E型肉毒杆菌毒素、F型肉毒杆菌毒素和G型肉毒杆菌毒素以及它们的亚型的治疗活性衍生物及其混合物组成的组。在特定的方面中，一种或更多种神经调节剂选自由onabotulinumtoxin A、abobotulinumtoxin A、incobotulinumtoxin A、prabotulinumtoxin A、rimabotulinumtoxin B及其组合组成的组。
在一些方面中，载体分子包括选自由阳离子聚合物、蛋白质和多糖组成的组的聚电解质。在某些方面中，蛋白质选自由IgG、胶原、明胶和血清白蛋白组成的组。
在一些方面中，载体分子与一种或更多种神经调节剂的重量比可以从约1:1至约2000:1变化。在某些方面中，载体分子与一种或更多种神经调节剂的重量比是约500:1。
在一些方面中，抗衡离子聚合物选自由硫酸葡聚糖(DS)、肝素(硫酸肝素)、透明质酸及其组合组成的组。
在一些方面中，生物可降解聚合物是选自由聚(L-乳酸)(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、它们的聚乙二醇化的嵌段共聚物(PEGylated block copolymer)、及其组合组成的组的共聚物。在某些方面中，生物可降解聚合物选自由聚乙二醇(PEG)-b-PLLA、PEG-b-PLGA、PEG-b-PCL及其组合组成的组。在特定的方面中，纳米颗粒包含以下项中的一种：以m:1:1:n的比的onabotulinumtoxin A(BoNTA):载体蛋白:硫酸葡聚糖(DS):PEG-b-PLGA，其中m＝0.0005至1，并且n＝3至10；(BoNTA+载体):DS:PEG-b-PLGA是1:1:5；或者BoNTA:载体是1:1至1:2000。
在其他方面中，本发明公开的主题提供了用于产生多于一个纳米颗粒(aplurality of nanoparticles)的工艺，该工艺包括：
(a)通过使用第一连续混合工艺将一种或更多种神经调节剂和一种或更多种载体分子的预先形成的溶液与抗衡离子聚合物混合来形成聚电解质纳米复合物(PNC)；
(b)使用第二连续混合工艺使聚电解质纳米复合物(PNC)与生物可降解聚合物共沉淀；以及
(c)形成多于一个纳米颗粒，其中聚电解质纳米复合物(PNC)分布在整个生物可降解聚合物基质中。
在某些方面中，步骤(a)和步骤(b)同时进行。在某些方面中，第一连续混合工艺包括快速纳米复合(flash nanocomplexation)(FNC)工艺。在某些方面中，聚电解质纳米复合物(PNC)的形成是通过一种或更多种神经调节剂与抗衡离子聚合物之间的静电吸引。在某些方面中，聚电解质纳米复合物(PNC)和生物可降解聚合物的混合是通过溶剂诱导的快速纳米沉淀(flash nanoprecipitation)(FNP)。在某些方面中，纳米颗粒的形成通过生物可降解聚合物连同聚电解质纳米复合物(PNC)一起的沉淀而发生。
在其他方面中，本发明公开的主题提供了用于产生多于一个纳米颗粒的工艺，该工艺包括通过使用连续的快速纳米复合(FNC)工艺将一种或更多种神经调节剂和一种或更多种载体分子的预先形成的溶液与抗衡离子聚合物混合来形成聚电解质纳米复合物(PNC)。
在一些方面中，本发明公开的主题提供了用于制备包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)的方法，该方法包括：(a)制备或提供包含一种或更多种神经调节剂的水溶液；(b)制备或提供载体分子的水溶液；(c)将神经调节剂的水溶液和载体分子的水溶液混合，以形成蛋白质溶液；以及(d)通过快速纳米复合(FNC)工艺将蛋白质溶液与抗衡离子聚合物混合，以形成包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)。
在其他方面中，本发明公开的主题提供了微凝胶，该微凝胶包含：纳米颗粒或聚电解质纳米复合物(PNC)，该纳米颗粒或聚电解质纳米复合物包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物，其中抗衡离子聚合物具有电荷，该电荷使抗衡离子聚合物能够与一种或更多种神经调节剂静电结合；以及交联的亲水性聚合物，其中纳米颗粒或聚电解质纳米复合物(PNC)分布在整个交联的亲水性聚合物中。
在某些方面中，交联的亲水性聚合物包括水凝胶。在某些方面中，水凝胶包括天然的亲水性聚合物或合成的亲水性聚合物，该天然的亲水性聚合物或合成的亲水性聚合物选自由透明质酸、壳聚糖、肝素、藻酸盐、纤维蛋白、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物、及其共聚物组成的组。在特定的方面中，水凝胶包括交联的透明质酸。
在某些方面中，微凝胶包括具有球形形状或不对称形状的多于一个微凝胶颗粒。在特定的方面中，多于一个微凝胶颗粒具有在从约10μm至约1000μm的范围内的标称尺寸。在还更特定的方面中，微凝胶或多于一个微凝胶聚合物具有从约10Pa至约10,000Pa的剪切储能模量。
在某些方面中，微凝胶包含具有在从约20nm至约900nm的范围内的标称尺寸的聚电解质纳米复合物(PNC)。
在其他方面中，微凝胶还包含由生物可降解聚合物制备的纳米颗粒。在某些方面中，生物可降解聚合物选自由聚(L-乳酸)(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、它们的聚乙二醇化的嵌段共聚物、及其组合组成的组。在特定的方面中，生物可降解聚合物选自由聚乙二醇(PEG)-b-PLLA、PEG-b-PLGA、PEG-b-PCL及其组合组成的组。在某些方面中，微凝胶包含具有在从约20nm至约900nm的范围内的标称尺寸的纳米颗粒。
在一些方面中，交联的亲水性聚合物还包含被直接添加到其中的一种或更多种神经调节剂。在这样的方面中，被直接添加到交联的亲水性聚合物中的一种或更多种神经调节剂是纳米颗粒或聚电解质纳米复合物(PNC)中的一种或更多种神经调节剂的量的分数(fraction)。在特定的方面中，被直接添加到交联的亲水性聚合物中的一种或更多种神经调节剂的分数具有从约0至约1的范围。
在其他方面中，本发明公开的主题提供了用于产生多于一个微凝胶颗粒的工艺，该工艺包括：
(a)将包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物以及任选的生物可降解聚合物的纳米颗粒或聚电解质纳米复合物(PNC)与水凝胶前体混合；
(b)形成水凝胶，该水凝胶包含该包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物以及任选的生物可降解聚合物的纳米颗粒或聚电解质纳米复合物(PNC)；以及
(c)将水凝胶机械破碎成多于一个微凝胶颗粒。
在某些方面中，多于一个微凝胶颗粒具有在从约10μm至1,000μm的范围内的标称尺寸。
在其他方面中，本发明公开的主题提供了用于治疗疾病或状况的方法，该方法包括将本发明公开的纳米颗粒或微凝胶施用至需要治疗的受试者。在某些方面中，疾病或状况选自由美容状况、局灶性肌张力障碍、颈肌张力障碍(CD)、慢性流涎和肌肉痉挛组成的组。在特定的方面中，肌肉痉挛与过度活跃的肌肉运动(overactive muscle movement)有关，选自由脑瘫，中风后痉挛(post-stroke spasticity)，脊髓损伤后痉挛，头和颈部、眼睑、阴道、四肢、颌和声带的痉挛，与食道、颌、下尿路和膀胱以及肛门的肌肉相关的肌肉紧缩(clenching of muscle)，以及难治性过度活跃的膀胱组成的组。在某些方面中，疾病或状况包括肌肉紊乱(muscledisorder)，该肌肉紊乱选自由斜视、眼睑痉挛、半面痉挛、婴幼儿型内斜视(infantile esotropia)、由于与成人的中风相关的下肢痉挛引起的受限的踝关节运动以及两岁及更大的儿科患者的下肢痉挛组成的组。在特定的方面中，疾病或状况包括过度出汗。在某些方面中，疾病或状况选自由头痛、偏头痛、神经病理性疼痛、慢性疼痛、骨关节炎疼痛、关节炎疼痛、过敏症状、抑郁和早泄组成的组。
在某些方面中，该方法包括施用纳米颗粒或微凝胶的两种或更多种制剂，其中纳米颗粒或微凝胶的两种或更多种制剂各自具有不同的释放概况(release profile)。
在其他方面中，本发明公开的主题提供了药物组合物，该药物组合物包含本发明公开的纳米颗粒或微凝胶以及药学上可接受的载体。在又其他方面中，本发明公开的主题提供了试剂盒，该试剂盒包括本发明公开的纳米颗粒和/或微凝胶。
在其他方面中，本发明公开的主题提供了持续释放制剂，该持续释放制剂包含本发明公开的纳米颗粒或微凝胶，其中该制剂在软组织中提供有效浓度的一种或更多种神经调节剂持续在约3天至约200天之间的时间段。
在其他方面中，本发明公开的主题提供了用于治疗疾病或状况的方法，该方法包括施用包含本发明公开的纳米颗粒或微凝胶的持续释放制剂，该方法包括通过注射来局部施用持续释放制剂，其中一种或更多种神经调节剂在从约3天至约200天的时间段内从持续释放制剂中释放，从而治疗疾病或状况。
在某些方面中，疾病或状况选自由美容状况、局灶性肌张力障碍、颈肌张力障碍(CD)、慢性流涎和肌肉痉挛组成的组。
上文已经陈述了本发明公开的主题的某些方面，其全部或部分由本发明公开的主题所论述，当与下文作为最佳描述的所附实施例和附图相关联时，其他方面随着描述进行将变得明显。
附图简述
已经如此概括地描述了本发明公开的主题，现在将参考附图，附图不必按比例绘制，并且其中：
图1是本发明公开的纳米颗粒的两步(FNC-FNP)制备工艺的示意图，所述纳米颗粒具有包封的聚电解质纳米复合物(PNC)，包封的聚电解质纳米复合物(PNC)是蛋白质治疗剂(protein therapeutic)和抗衡离子聚电解质的包封的聚电解质纳米复合物(PNC)。对于第二步，此处示出了三入口装置。基于FNP工艺中对于溶剂交换的具体要求，可以将三入口装置转换为双入口或四入口混合室(来自2019年8月1日公布的、Mao等人的“Polymericnanoparticle compositions for encapsulation and sustained release of proteintherapeutics”的国际PCT专利申请公布第WO/2019/148147号)；
图2是使用四入口的多入口涡流混合器的蛋白治疗剂的单步包封的示意图。聚电解质纳米复合物(PNC)与生物可降解聚酯共沉淀形成纳米颗粒并且分布在整个聚合物纳米颗粒中(来自2019年8月1日公布的、Mao等人的“Polymeric nanoparticle compositionsfor encapsulation and sustained release of protein therapeutics”的国际PCT专利申请公布第WO/2019/148147号)；
图3是A型肉毒杆菌毒素(BoNTA)纳米颗粒的代表性TEM图像；
图4展示了本发明公开的NanoTox制剂提供了具有高度生物活性保留(bioactivity retention)的蛋白质的接近线性的释放；
图5展示了从本发明公开的NanoTox制剂中释放的BoNTA在28天内保留>80％的生物活性；
图6是代表性的动态光散射(DLS)图，其示出了本发明公开的BoNTA/硫酸葡聚糖(DS)聚电解质纳米复合物(PNC)制剂(本文中被称为“NP4”)的尺寸分布，以及关于NP4的ζ电位和多分散性指数(PDI)的评估数据，这些是用以1:500的比的2mg/mL的BoNTA和人血清白蛋白(HSA)以及2mg/mL的硫酸葡聚糖(DS)以10mL/min的流量产生的；
图7展示了BoNTA从本发明公开的BoNTA/DS聚电解质纳米复合物(PNC，NP4)中释放，其通过ELISA测量，在3天内释放87％的BoNTA；
图8是BoNTA从在37℃在PBS中的微凝胶颗粒制剂1(MP1)中的体外释放概况；
图9示出了从MP1制剂中释放的BoNTA的体外生物活性；
图10是BoNTA从微凝胶颗粒制剂2(MP2)中的体外释放概况；
图11示出了从MP2中释放的BoNTA样品的体外生物活性；
图12是BoNTA从微凝胶颗粒制剂3(MP3)中的体外释放概况；以及
图13示出了与游离BoNTA注射剂比较的、在不同NanoTox制剂的肌肉内注射(i.m.注射)之后的体内功能数据(受激握力(stimulated grip strength)恢复)。
详述
现在将在下文中参考附图更充分地描述本发明公开的主题，在附图中示出了本发明的某些实施方案而不是全部实施方案。相同的数字在全文中指的是相同的要素。本发明公开的主题可以以许多不同的形式来体现并且不应当被解释为局限于本文阐述的实施方案；相反，这些实施方案被提供以使得本公开内容将满足适用的法律要求。事实上，受益于前面的描述和相关附图中呈现的教导的本发明公开的主题所属领域的技术人员将想到本文阐述的本发明公开的主题的许多修改和其他实施方案。因此，应当理解，本发明公开的主题不限于所公开的特定实施方案并且修改和其他实施方案意图被包括在所附权利要求书的范围内。
用于神经调节剂的包封和持续释放的聚合物纳米颗粒和聚电解质纳米复合物组合物
本发明公开的主题提供了用于将包括神经毒素的一种或更多种神经调节剂递送至靶位点的平台(platform)。这种递送平台提供了神经调节剂的可调的持续释放概况和高的有效载荷能力(payload capacity)，同时还允许其生物活性的高保留。该平台利用已验证的可缩放的、高度可转换的(highly translational)制造工艺，该制造工艺实现了在cGMP条件下具有高收率的连续的颗粒生产。这种组合提供了采用快速微混合工艺的新颖的、工程化的生物可降解纳米颗粒，快速微混合工艺用于将包括神经毒素的一种或更多种神经调节剂包封在生物可降解聚合物中。
部分地由于在过饱和条件下产生纳米颗粒的快速微混合工艺，本发明公开的主题实现了高的神经调节剂有效载荷能力和高的包封效率(encapsulation efficiency)。在这些条件下形成的纳米颗粒提供了一种或更多种神经调节剂在延长的时间段内的持续并且延长的释放。
先前报告的用于包封蛋白质的纳米颗粒快速地释放有效载荷或者通过表面接合(surface conjugation)实现延长的存在，所述表面接合限制了负载容量(loadingcapacity)并且增加了对经由表面侵蚀的蛋白质损失的敏感性(susceptibility)。相比之下，本发明公开的工艺确保了纳米颗粒组装在平衡分配(equilibrium partition)和蛋白质解折叠之前完成，从而实现在释放和储存期间生物活性和稳定性的高水平的保持。
本发明公开的制造工艺还提供了组装工艺的高度一致性、所生产的纳米颗粒的高品质，并且是高度可缩放的。参见2019年10月15日授权的、Mao等人的、“Methods ofpreparing polyelectrolyte complex nanoparticles”的美国专利第10,441,549号，以及2019年8月1日公布的、Mao等人的“Polymeric nanoparticle compositions forencapsulation and sustained release of protein therapeutics”的国际PCT专利申请公布第WO/2019/148147号，其中每一个都以其整体并入本文。
神经调节剂-聚阴离子聚电解质纳米复合物(PNC)对于生物活性保留和调节蛋白质的释放速率是至关重要的。在没有这样的聚电解质纳米复合物(PNC)的情况下，不可能以高的包封效率和负载水平来负载蛋白质并且产生持续释放概况。
由于独特的组装工艺(动力学控制的非均质组装(heterogeneous assembly))，实现了均一分布。均一分布对于实现蛋白质的长期持续释放以及对于能够在高控制水平的情况下以预定比率负载不同蛋白质(例如，载体蛋白)也是至关重要的。
A.分布在整个生物可降解聚合物中的包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物的聚电解质纳米复合物(PNC)或纳米颗粒
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了聚电解质纳米复合物(PNC)，所述聚电解质纳米复合物包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物的，其中抗衡离子聚合物具有电荷，所述电荷使所述抗衡离子聚合物能够与所述一种或更多种神经调节剂静电结合。
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了包含聚电解质纳米复合物(PNC)和非水溶性的生物可降解聚合物的纳米颗粒，其中聚电解质纳米复合物(PNC)分布在整个非水溶性的生物可降解聚合物中。
在某些实施方案中，纳米颗粒是持续释放纳米颗粒，该持续释放纳米颗粒包含：聚电解质纳米复合物(PNC)，该聚电解质纳米复合物包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和具有电荷的抗衡离子聚合物，该电荷使抗衡离子聚合物能够与一种或更多种神经调节剂和载体分子静电结合；以及非水溶性的生物可降解聚合物；其中包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物的聚电解质纳米复合物(PNC)分布在整个非水溶性的生物可降解聚合物中。
在一些实施方案中，一种或更多种神经调节剂包括梭菌神经毒素的治疗活性衍生物。在一些实施方案中，梭菌神经毒素包括来源于肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinum)的治疗活性神经毒素，肉毒梭状芽孢杆菌是具有产生神经毒素肉毒杆菌的能力的、革兰氏阳性的、杆状的、厌氧的、形成孢子的、可移动的细菌。肉毒杆菌毒素可以诱导人类的弛缓性麻痹，弛缓性麻痹的特征是无力(weakness)、麻痹和降低的肌肉张力。在一些实施方案中，一种或更多种神经调节剂包括肉毒杆菌毒素的治疗活性衍生物。
在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素选自由A型肉毒杆菌毒素、B型肉毒杆菌毒素、包括C1型肉毒杆菌毒素的C型肉毒杆菌毒素、D型肉毒杆菌毒素、E型肉毒杆菌毒素、F型肉毒杆菌毒素和G型肉毒杆菌毒素以及它们的亚型的治疗活性衍生物及其混合物组成的组。参见例如美国专利第8,501,187B2号，其通过引用以其整体并入本文。
如本文使用的，“肉毒杆菌毒素”意指由肉毒梭状芽孢杆菌产生的神经毒素、以及由非梭菌属物种(non-Clostridial species)重组地制成的肉毒杆菌毒素(或其轻链或重链)。如本文使用的，术语“肉毒杆菌毒素”涵盖肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G以及它们的亚型及其任何其他类型的亚型，或在每种情况下前述任一种的任何再工程化的蛋白质(re-engineered protein)、类似物、衍生物、同系物、部分、亚部分(sub-part)、变体或变型(version)。
如本文使用的“肉毒杆菌毒素”还涵盖“改性的肉毒杆菌毒素”。此外，如本文使用的“肉毒杆菌毒素”还涵盖肉毒杆菌毒素复合物(例如300kDa、600kDa和900kDa的复合物)，以及未与复合蛋白质(complex protein)缔合的肉毒杆菌毒素的神经毒性部分(150kDa)。
“梭菌衍生物”指的是包含梭菌毒素的任何部分的分子。如本文使用的，术语“梭菌衍生物”涵盖天然或重组的神经毒素、重组改性的毒素(recombinant modified toxin)、其片段、靶向囊泡胞吐调节剂(Targeted vesicular Exocytosis Modulator)(TEM)，或其组合。
“梭菌毒素”指的是由梭菌毒素菌株产生的任何毒素，该梭菌毒素菌株能够执行整体细胞机制(overall cellular mechanism)由此梭菌毒素使细胞中毒，并且“梭菌毒素”涵盖梭菌毒素与低亲和力或高亲和力的梭菌毒素受体的结合、毒素/受体复合物的内化、梭菌毒素轻链向细胞质中的移位(translocation)以及梭菌毒素底物的酶促改性。
在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素可以是重组的肉毒杆菌神经毒素，诸如由大肠杆菌(E.coli.)产生的肉毒杆菌毒素。在一些实施方案中，肉毒杆菌神经毒素可以是改性的神经毒素，所述改性的神经毒素是与天然毒素相比其氨基酸中的至少一个被删除、改性或替代的肉毒杆菌神经毒素，或者改性的肉毒杆菌神经毒素可以是重组体产生的肉毒杆菌神经毒素或其衍生物或片段。在某些实施方案中，改性的毒素对感兴趣的神经元细胞或非神经元细胞具有改变的细胞靶向能力。这种改变的能力是通过用对存在于非肉毒杆菌毒素靶细胞中的非肉毒杆菌毒素受体显示出选择性结合活性的靶向结构域(targeting domain)替换肉毒杆菌毒素的天然存在的靶向结构域来实现的。对靶向结构域的这样的改性导致能够与存在于非肉毒杆菌毒素靶细胞上的非肉毒杆菌毒素受体(靶受体)选择性地结合(再靶向)的改性的毒素。具有对非肉毒杆菌毒素靶细胞的靶向活性的改性的肉毒杆菌毒素可以与存在于非肉毒杆菌毒素靶细胞上的受体结合，移位到细胞质中，并且发挥其对靶细胞的SNARE复合物的蛋白质水解作用。实质上，通过选择适当的靶向结构域，包含酶结构域的肉毒杆菌毒素轻链被细胞内递送至任何期望的细胞。
在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素包括包含天然的重链和改性的轻链的改性的肉毒杆菌毒素。参见，例如，2015年11月17日授权的、Frevert等人的“PEGylated mutatedClostridium botulinum toxin”的美国专利第9,186,396号；2014年12月16日授权的、Frevert等人的“PEGylated mutated clostridium botulinum toxin”的美国专利第8,912,140号；2012年10月30日授权的、Frevert等人的“PEGylated mutated Clostridiumbotulinum toxin”的美国专利第8,298,550号；2011年8月23日授权的、Frevert等人的“Pegylated mutated clostridium botulinum toxin”的美国专利第8,003,601号。
在一些实施方案中，一种或更多种神经调节剂包括肉毒杆菌神经毒素，所述肉毒杆菌神经毒素与相应的野生型神经毒素相比关于其蛋白质结构被改变。参见，例如，2014年6月10日授权的、Frevert的“Clostridial neurotoxins with altered persistency”的美国专利第8,748,151号。
用于制备肉毒杆菌毒素的发酵工艺在本领域中是已知的。参见，例如，以下项中的制备方法：2011年4月19日授权的、Doelle等人的“Device and method for theproduction of biologically active compounds by fermentation”的美国专利第7,927,836号；2019年11月5日授权的、Ton等人的“Process and system for obtainingbotulinum neurotoxin”的美国专利第10,465,178号。
通过在允许产生肉毒杆菌毒素的条件下培养肉毒梭状芽孢杆菌并且然后从肉毒杆菌毒素中分离神经毒性组分，可以制备高纯度的肉毒杆菌毒素。参见2020年5月19日授权的、Pfeil等人的“Highly pure neurotoxic component of a botulinum toxin and usesthereof”的美国专利第10,653,754号(提供具有小于1.70wt.％的单链含量和至少99.90wt.％的总纯度的神经毒素)；2018年4月10日授权的、Pfeil等人的“Highly pureneurotoxic component of a botulinum toxin,process for preparing same,and usesthereof”的美国专利第9,937,245号。
代表性的商业上的神经调节剂包括但不限于肉毒杆菌毒素A，诸如onabotulinumtoxin A((Allergan，Inc.))、abobotulinumtoxin A(/>和(Galderma Laboratories，L.P.))、incobotulinumtoxin A(和/>(Pharma GmbH&Co.KGaA))和prabotulinumtoxin A((Evolu(由Daewoong制造)))、BTX-A(Lontox和Prosigne(Lanzhou Instituteof Biological Products(兰州生物制品研究所))和Neuronox(MedyTox，Inc.))；以及肉毒杆菌毒素B，诸如rimabotulinumtoxin B(/>和/>(SolsticeNeurosciences，Inc))。
因此，在一些实施方案中，一种或更多种神经调节剂可以选自由onabotulinumtoxin A、abobotulinumtoxin A、incobotulinumtoxin A、prabotulinumtoxin A、rimabotulinumtoxin B、及其组合组成的组。
神经调节剂，诸如肉毒杆菌毒素，是足够有效的以需要施用微量的功能蛋白。然而，在不使用载体分子的情况下，很难直接负载治疗活性的神经调节剂。因此，神经调节剂-聚阴离子纳米复合物的形成对于调节神经调节剂的释放以及调节神经调节剂的生物活性的保留是至关重要的。在没有形成神经调节剂-聚阴离子纳米复合物的情况下，不可能以高包封效率和高负载水平来负载该蛋白。此外，不可能产生如本文公开的持续释放概况。
具有与神经调节剂相同的净电荷的聚电解质可以起载体的作用，所述聚电解质包括合成的聚合物、蛋白质和多糖。由于载体蛋白和神经调节剂之间的结构和电荷密度的相似性，蛋白质是必然的选择。适合用作本发明公开的制剂中的载体的代表性蛋白质包括但不限于：IgG、胶原、明胶和血清白蛋白，包括人血清白蛋白和小鼠血清白蛋白，及其组合。在特定的实施方案中，载体分子包括血清白蛋白。
适合用于本发明公开的组合物和方法的其他阳离子聚合物包括但不限于：壳聚糖、PAMAM树枝状大分子、聚乙烯亚胺(PEI)、鱼精蛋白、聚(精氨酸)、聚(赖氨酸)、聚(β-氨基酯)和阳离子肽，及其衍生物。
具有较宽范围的等电点(例如，从约4.5至约11)的不同蛋白质可以被包封到这样的制剂中。在一些实施方案中，被选择用于本发明公开的制剂的一种或更多种神经调节剂和载体具有在约5.0至约8.0的范围内的等电点，包括约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0的等电点。
载体与神经调节剂的重量比可以从约1:1至约2000:1变化，包括以下的载体与神经调节剂的重量比：约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、100:1、110:1、115:1、120:1、125:1、130:1、135:1、140:1、145:1、150:1、155:1、160:1、165:1、170:1、175:1、180:1、185:1、190:1、195:1、200:1、210:1、215:1、220:1、225:1、230:1、235:1、240:1、245:1、250:1、255:1、260:1、265:1、270:1、275:1、280:1、285:1、290:1、295:1、300:1、310:1、315:1、320:1、325:1、330:1、335:1、340:1、345:1、350:1、355:1、360:1、365:1、370:1、375:1、380:1、385:1、390:1、395:1、400:1、410:1、415:1、420:1、425:1、430:1、435:1、440:1、445:1、450:1、455:1、460:1、465:1、470:1、475:1、480:1、485:1、490:1、495:1、500:1、510:1、515:1、520:1、525:1、530:1、535:1、540:1、545:1、550:1、555:1、560:1、565:1、570:1、575:1、580:1、585:1、590:1、595:1、600:1、610:1、615:1、620:1、625:1、630:1、635:1、640:1、645:1、650:1、655:1、660:1、665:1、670:1、675:1、680:1、685:1、690:1、695:1、700:1、710:1、715:1、720:1、725:1、730:1、735:1、740:1、745:1、750:1、755:1、760:1、765:1、770:1、775:1、780:1、785:1、790:1、795:1、800:1、810:1、815:1、820:1、825:1、830:1、835:1、840:1、845:1、850:1、855:1、860:1、865:1、870:1、875:1、880:1、885:1、890:1、895:1、900:1、910:1、915:1、920:1、925:1、930:1、935:1、940:1、945:1、950:1、955:1、960:1、965:1、970:1、975:1、980:1、985:1、990:1、995:1、1000:1、1010:1、1015:1、1020:1、1025:1、1030:1、1035:1、1040:1、1045:1、1050:1、1055:1、1060:1、1065:1、1070:1、1075:1、1080:1、1085:1、1090:1、1095:1、1100:1、1110:1、1115:1、1120:1、1125:1、1130:1、1135:1、1140:1、1145:1、1150:1、1155:1、1160:1、1165:1、1170:1、1175:1、1180:1、1185:1、1190:1、1195:1、1200:1、1210:1、1215:1、1220:1、1225:1、1230:1、1235:1、1240:1、1245:1、1250:1、1255:1、1260:1、1265:1、1270:1、1275:1、1280:1、1285:1、1290:1、1295:1、1300:1、1310:1、1315:1、1320:1、1325:1、1330:1、1335:1、1340:1、1345:1、1350:1、1355:1、1360:1、1365:1、1370:1、1375:1、1380:1、1385:1、1390:1、1395:1、1400:1、1410:1、1415:1、1420:1、1425:1、1430:1、1435:1、1440:1、1445:1、1450:1、1455:1、1460:1、1465:1、1470:1、1475:1、1480:1、1485:1、1490:1、1495:1、1500:1、1510:1、1515:1、1520:1、1525:1、1530:1、1535:1、1540:1、1545:1、1550:1、1555:1、1560:1、1565:1、1570:1、1575:1、1580:1、1585:1、1590:1、1595:1、1600:1、1610:1、1615:1、1620:1、1625:1、1630:1、1635:1、1640:1、1645:1、1650:1、1655:1、1660:1、1665:1、1670:1、1675:1、1680:1、1685:1、1690:1、1695:1、1700:1、1710:1、1715:1、1720:1、1725:1、1730:1、1735:1、1740:1、1745:1、1750:1、1755:1、1760:1、1765:1、1770:1、1775:1、1780:1、1785:1、1790:1、1795:1、1800:1、1810:1、1815:1、1820:1、1825:1、1830:1、1835:1、1840:1、1845:1、1850:1、1855:1、1860:1、1865:1、1870:1、1875:1、1880:1、1885:1、1890:1、1895:1、1900:1、1910:1、1915:1、1920:1、1925:1、1930:1、1935:1、1940:1、1945:1、1950:1、1955:1、1960:1、1965:1、1970:1、1975:1、1980:1、1985:1、1990:1、1995:1和2000:1。
在一些实施方案中，载体蛋白与神经调节剂的重量比是约500:1。
如本文使用的，术语“抗衡离子聚合物”包括以下的聚合物：该聚合物具有电荷，使得该聚合物能够与一种或更多种神经调节剂静电结合。实例包括带净正电荷的蛋白质与带净负电荷的抗衡离子聚合物结合或反之亦然。
在一些实施方案中，抗衡离子聚合物带负电荷。在特定的实施方案中，抗衡离子聚合物选自由硫酸葡聚糖(DS)、肝素(硫酸肝素)、透明质酸及其组合组成的组。
适合用于本发明公开的组合物和方法的其他阴离子聚合物包括但不限于：聚(天冬氨酸)、聚(谷氨酸)、带负电荷的嵌段共聚物、藻酸盐、三聚磷酸盐(TPP)和低聚(谷氨酸)。
在一些实施方案中，生物可降解聚合物是选自由聚(L-乳酸)(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、它们的聚乙二醇化的嵌段共聚物、及其组合组成的组的共聚物。在特定的实施方案中，生物可降解聚合物选自由聚乙二醇(PEG)-b-PLLA、PEG-b-PLGA、PEG-b-PCL及其组合组成的组。在一些实施方案中，本发明公开的制剂包括以下项中的一种：以m:1:1:n的比的BoNTA:硫酸葡聚糖(DS):PEG-b-PLGA，其中m＝0.0005至1，并且n＝3至10；(BoNTA+载体):DS:PEG-b-PLGA是1:1:5；或者BoNTA:载体是1:1至1:2000。
在一些实施方案中，纳米颗粒的尺寸范围为直径从约20nm至约500nm，包括约20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、155nm、160nm、165nm、170nm、175nm、180nm、185nm、190nm、195nm、200nm、205nm、210nm、215nm、220nm、225nm、230nm、235nm、240nm、245nm、250nm、255nm、260nm、265nm、270nm、275nm、280nm、285nm、290nm、295nm、300nm、305nm、310nm、315nm、320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm、350nm、355nm、360nm、365nm、370nm、375nm、380nm、385nm、390nm、395nm、400nm、405nm、410nm、415nm、420nm、425nm、430nm、435nm、440nm、445nm、450nm、455nm、460nm、465nm、470nm、475nm、480nm、485nm、490nm、495nm和500nm。例如，在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒具有小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm、小于约200nm以及小于约100nm(均一直径(homogenous diameter))的平均颗粒尺寸。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约100nm的平均颗粒尺寸。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有低于约0.3的多分散性指数。在某些实施方案中，纳米颗粒具有在从约0.05至约0.3的范围内的多分散性指数，包括约0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29和0.30的多分散性指数。
B.用于制备分布在整个生物可降解聚合物中的纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物
在其他实施方案中，本发明公开的主题提供了用于产生多于一个纳米颗粒的工艺，该工艺包括：
(a)通过使用第一连续混合工艺将一种或更多种神经调节剂和一种或更多种载体分子的预先形成的溶液与抗衡离子聚合物混合来形成聚电解质纳米复合物(PNC)；
(b)使用第二连续混合工艺使聚电解质纳米复合物(PNC)与生物可降解聚合物共沉淀；以及
(c)形成多于一个纳米颗粒，其中聚电解质纳米复合物(PNC)分布在整个生物可降解聚合物基质中。
在一些实施方案中，步骤(a)和步骤(b)同时进行。
在一些实施方案中，第一连续混合工艺包括快速纳米复合(FNC)工艺。FNC工艺在2019年10月15日授权的、Mao等人的“Methods of preparing polyelectrolyte complexnanoparticles”的美国专利第10,441,549号中描述，该美国专利通过引用以其整体并入本文。
在其他实施方案中，本发明公开的主题提供了用于产生多于一个纳米颗粒的工艺，该工艺包括通过使用连续快速纳米复合(FNC)工艺将一种或更多种神经调节剂和一种或更多种载体分子的预先形成的溶液与抗衡离子聚合物混合来形成聚电解质纳米复合物(PNC)。
如本文使用的，术语“聚电解质纳米复合物(PNC)”(还被称为聚电解质团聚体(polyelectrolyte coacervate))是在带相反电荷的聚合物之间形成的、具有在从20nm至900nm的范围内的尺寸的缔合复合物(association complex)(例如聚合物-聚合物、聚合物-药物以及聚合物-药物-聚合物)。聚电解质纳米复合物(PNC)是由于在带相反电荷的聚离子(即水溶性的聚阳离子与水溶性的聚阴离子)之间的静电相互作用而形成的。如本文使用的，术语“水溶性的”指的是化合物能够溶解在水中的能力。如本文使用的，术语“连续的”或“连续地”指的是在时间上不间断的过程，诸如在至少两个本发明公开的流流入到封闭室(confined chamber)中时产生聚电解质纳米复合物(PNC)。
在一些实施方案中，聚电解质纳米复合物(PNC)的形成是通过在一种或更多种神经调节剂与抗衡离子聚合物之间的静电吸引。
在一些实施方案中，聚电解质纳米复合物(PNC)和生物可降解聚合物的混合是通过溶剂诱导的快速纳米沉淀(FNP)。
快速纳米沉淀(FNP)提供了连续的并且可缩放的工艺，该工艺已经被用于生产嵌段共聚物纳米颗粒。通过使用受限撞击射流(confined impinging jet)(CIJ)装置或多入口涡流混合器(MIVM)装置，快速纳米沉淀(FNP)使用动力学控制的过程来以连续的并且可缩放的方式产生纳米颗粒。FNP的快速微混合条件(大约1毫秒)证实了使用嵌段共聚物自组装的均匀的过饱和条件和疏水性溶质(有机的或无机的)的受控沉淀。与批量制备方法相比，FNP工艺允许在连续流动操作过程中形成具有可调尺寸的均匀的聚集体，这适合于扩大规模的生产。该工艺还提供了较高程度的通用性和对颗粒尺寸和分布的控制、较高的药物包封效率，以及改善的胶体稳定性。
在一些实施方案中，纳米颗粒的形成通过生物可降解聚合物连同聚电解质纳米复合物(PNC)一起的沉淀而发生。
在特定的实施方案中，包含一种或更多种神经调节剂、一种或更多种载体分子和一种或更多种抗衡离子聚合物的聚电解质纳米复合物(PNC)通过快速纳米复合(FNC)被产生，并且然后在FNP溶剂交换过程中与一种或更多种生物可降解聚合物共沉淀。
这种用于形成包含PNC的纳米颗粒的两步法在图1中提供(来自2019年8月1日公布的、Mao等人的“Polymeric nanoparticle compositions for encapsulation andsustained release of protein therapeutics”的国际PCT专利申请公布第WO/2019/148147号)。在该工艺中，将聚阳离子溶液(即，包含一种或更多种神经调节剂的溶液)、聚阴离子溶液(即，一种或更多种抗衡离子聚合物，例如硫酸葡聚糖、硫酸肝素及类似物)和溶解在水混溶性溶剂中的嵌段共聚物以一组优化的流量引入到受限的室(defined chamber)中以实现有效的混合，因此获得具有一种或更多种神经调节剂的有效负载的纳米颗粒。
在某些实施方案中，聚电解质纳米复合物复合(通过FNC工艺)和作为快速纳米沉淀(FNP)的结果的聚合物纳米颗粒形成的两个工艺被组合在单步相分离工艺中。该工艺涉及连续地注入以下的溶液射流：(1)溶解在处于低于蛋白质的等电点(pi)的pH的水性溶剂中的一种或更多种神经调节剂；(2)溶解在水性溶剂中的聚阴离子例如硫酸葡聚糖(DS)、肝素(硫酸肝素)和透明质酸及类似物；(3)溶解在水混溶性有机溶剂中的生物可降解聚合物；以及(4)另外的溶剂射流，以维持或实现特定的溶剂极性，以便通过受限撞击射流混合器或多入口涡流混合器以一组预定的流量来诱导有效的相分离和纳米颗粒形成，导致包含聚电解质纳米复合物(PNC)的纳米颗粒的形成。图2中提供了使用四入口的多入口涡流混合器进行蛋白质治疗剂的单步包封的代表性实施方案。(来自2019年8月1日公布的、Mao等人的“Polymeric nanoparticle compositions for encapsulation and sustained releaseof protein therapeutics”的国际PCT专利申请公布第WO/2019/148147号)。
在一些实施方案中，水混溶性有机溶剂选自由乙腈(ACN)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇、异丙醇(IPA)、六氟异丙醇(HFIP)及其组合组成的组。
本发明公开的方法产生包含整体基质(monolithic matrix)的纳米颗粒，所述整体基质包含生物可降解聚合物，其中包含一种或更多种神经调节剂的聚电解质纳米复合物分布在整个生物可降解聚合物基质中。本发明公开的工艺导致能够具有较宽范围的负载容量的纳米颗粒。在该工艺中，离散的聚电解质纳米复合物(PNC)被包封在疏水性聚合物纳米颗粒中，在该疏水性聚合物纳米颗粒中，聚电解质纳米复合物(PNC)充当与疏水性聚合物共沉淀的核(nucleus)，导致具有在整个核中均匀地分布的聚电解质纳米复合物(PNC)的多核(multi-core)基质纳米颗粒。更具体地，在单步工艺中，聚电解质纳米复合物(PNC)瞬间形成并且充当核以诱导疏水性聚合物纳米颗粒的共沉淀，也产生聚电解质纳米复合物(PNC)在整个纳米颗粒中的均匀分布。
在一些实施方案中，所述多于一个纳米颗粒具有约20nm至约900nm的Z平均颗粒尺寸，包括约20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm和900nm的Z平均颗粒尺寸，并且具有约0.1至约0.4的尺寸分布(PDI)，包括约0.1、0.2、0.3和0.4的尺寸分布。
在一些实施方案中，所述多于一个纳米颗粒具有负的表面电荷，该负的表面电荷具有约-10mV至约-35mV的平均ζ电位，包括约-10mV、-15mV、-20mV、-25mV、-30mV和-35mV的平均ζ电位。
在一些实施方案中，所述多于一个纳米颗粒具有约60％至约95％的包封效率，包括约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％的包封效率。
在一些实施方案中，所述多于一个纳米颗粒具有约2％至约50％的负载水平，包括约2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％和50％的负载水平。
在一些实施方案中，所述多于一个纳米颗粒具有约7天至约180天的释放持续时间，包括约7天、8天、9天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天和180天的释放持续时间。
C.用于制备包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)的方法
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了用于制备包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)的方法，该方法包括：
(a)制备或提供包含一种或更多种神经调节剂的水溶液；
(b)制备或提供载体分子的水溶液；
(c)将神经调节剂的水溶液和载体分子的水溶液混合，以形成蛋白质溶液；以及
(d)通过快速纳米复合(FNC)工艺将蛋白质溶液与抗衡离子聚合物混合，以形成包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)。
在一些实施方案中，一种或更多种神经调节剂包括梭菌神经毒素的治疗活性衍生物。在某些实施方案中，梭菌神经毒素包括肉毒杆菌毒素的治疗活性衍生物。在特定的实施方案中，肉毒杆菌毒素选自由A型肉毒杆菌毒素、B型肉毒杆菌毒素、包括C1型肉毒杆菌毒素的C型肉毒杆菌毒素、D型肉毒杆菌毒素、E型肉毒杆菌毒素、F型肉毒杆菌毒素和G型肉毒杆菌毒素以及它们的亚型的治疗活性衍生物及其混合物组成的组。在特定的实施方案中，一种或更多种神经调节剂选自由onabotulinumtoxin A、abobotulinumtoxin A、incobotulinumtoxin A、prabotulinumtoxin A、rimabotulinumtoxin B及其组合组成的组。
在一些实施方案中，载体分子包括选自由阳离子聚合物、蛋白质和多糖组成的组的聚电解质。在一些实施方案中，蛋白质选自由IgG、胶原、明胶和血清白蛋白组成的组。
在一些实施方案中，载体分子与一种或更多种神经调节剂的重量比可以从约1:1至约2000:1变化。在特定的实施方案中，载体分子与一种或更多种神经调节剂的重量比是约500:1。
在一些实施方案中，抗衡离子聚合物选自由硫酸葡聚糖(DS)、肝素(硫酸肝素)、透明质酸及其组合组成的组。
在一些实施方案中，该方法还包括将一种或更多种神经调节剂和载体分子的混合物调节至约3的pH，包括约2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4和3.5的pH。
在一些实施方案中，包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)具有约20nm至约900nm的Z平均颗粒尺寸，包括约20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm和900nm的Z平均颗粒尺寸，并且具有约0.1至约0.4的尺寸分布(PDI)，包括约0.1、0.2、0.3和0.4的尺寸分布。
在其他实施方案中，包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)具有约60nm的Z平均颗粒尺寸，包括约50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、59nm和60nm的Z平均颗粒尺寸，并且具有约0.1的尺寸分布(PDI)，包括约0.08、0.09、0.1、0.11和0.12的尺寸分布。
在一些实施方案中，包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)具有负的表面电荷，该负的表面电荷具有约-45mV的平均ζ电位，包括约-35mV、-36mV、-37mV、-38mV、-39mV、-40mV、-41mV、-42mV、-43mV、-44mV、-45mV、-46mV、-47mV、-48mV、-49mV和-50mV的平均ζ电位。
在一些实施方案中，包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)具有约80％至约99％的包封效率，包括约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的包封效率。
在一些实施方案中，该方法包括约50％的负载水平，包括约35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％和65％的负载水平。
在一些实施方案中，包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)具有：在约24小时内的约70％的神经调节剂的释放率，包括约65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％和75％的释放率；在约3天内的约87％的释放率，包括约85％、86％、87％、88％和89％的释放率；以及在约4天内的约90％的释放率，包括约90％、91％、92％、93％、94％和95％的释放率。
在一些实施方案中，包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)具有约10％至约70％的负载水平，包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％和70％的负载水平。
在一些实施方案中，包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)具有约1天至约7天的释放持续时间，包括约1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天的释放持续时间。
D.包含一种或更多种神经调节剂的微凝胶
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了包含一种或更多种神经调节剂的微凝胶或微凝胶颗粒。
微凝胶颗粒起以下作用：将复合物保留在注射部位持续延长的时间段，保护复合物不被巨噬细胞或其他组织细胞内噬，改善储存稳定性，以及便于冻干和重构(reconstitution)。
在其他实施方案中，本发明公开的主题提供了微凝胶，该微凝胶包含：纳米颗粒或聚电解质纳米复合物(PNC)，该纳米颗粒或聚电解质纳米复合物包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物，其中抗衡离子聚合物具有电荷，该电荷使抗衡离子聚合物能够与一种或更多种神经调节剂静电结合；以及交联的亲水性聚合物，其中纳米颗粒或聚电解质纳米复合物(PNC)分布在整个交联的亲水性聚合物中。
在某些实施方案中，交联的亲水性聚合物包括水凝胶。在某些实施方案中，水凝胶包括天然的亲水性聚合物或合成的亲水性聚合物，该天然的亲水性聚合物或合成的亲水性聚合物选自由透明质酸、壳聚糖、肝素、藻酸盐、纤维蛋白、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物及其共聚物组成的组。在特定的实施方案中，水凝胶包括交联的透明质酸。
在某些实施方案中，微凝胶包括具有球形形状或不对称形状的多于一个微凝胶颗粒。在特定的实施方案中，所述多于一个微凝胶颗粒具有在从约10μm至约1,000μm的范围内的标称尺寸。在还更特定的实施方案中，微凝胶或多于一个微凝胶聚合物具有从约10Pa至约10,000Pa的剪切储能模量。
在某些实施方案中，微凝胶包含具有在从约20nm至约900nm的范围内的标称尺寸的聚电解质纳米复合物(PNC)。
在其他实施方案中，微凝胶还包含生物可降解聚合物。在某些实施方案中，生物可降解聚合物选自由聚(L-乳酸)(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、它们的聚乙二醇化的嵌段共聚物、及其组合组成的组。在特定的实施方案中，生物可降解聚合物选自由聚乙二醇(PEG)-b-PLLA、PEG-b-PLGA、PEG-b-PCL及其组合组成的组。在某些实施方案中，微凝胶包含具有在从约20nm至约900nm的范围内的标称尺寸的纳米颗粒。
在其他实施方案中，一种或更多种神经调节剂也可以添加到水凝胶相中，以在注射时提供单次给药剂量(bolus dose)。在这样的实施方案中，负载在微凝胶相中的神经调节剂在注射的制剂的总剂量中的分数可以是从约0至约0.9，包括0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9。例如，在某些实施方案中，50％的BoNTA可以负载在复合物中，并且剩余的50％的BoNTA可以以游离形式负载在微凝胶相中。还可以包括具有不同释放概况的两种或更多种纳米颗粒制剂，作为改善治疗结果的方式。
在其他实施方案中，本发明公开的主题提供了用于产生多于一个微凝胶颗粒的工艺，该工艺包括：
(a)将包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物以及任选的生物可降解聚合物的纳米颗粒或聚电解质纳米复合物(PNC)与水凝胶前体混合；
(b)形成水凝胶，所述水凝胶包含包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物以及任选的生物可降解聚合物的所述纳米颗粒或聚电解质纳米复合物(PNC)；以及
(c)将水凝胶机械破碎成多于一个微凝胶颗粒。
在某些实施方案中，所述多于一个微凝胶颗粒具有在从约10μm至1,000μm的范围内的标称尺寸。
E.用于向受试者递送一种或更多种神经调节剂的方法及其治疗方法
在其他实施方案中，本发明公开的主题提供了用于向受试者递送一种或更多种神经调节剂的方法，该方法包括：
施用包含复合物和基质的纳米颗粒或微凝胶，所述复合物包含药剂和抗衡离子聚合物，其中抗衡离子聚合物具有电荷，该电荷使抗衡离子聚合物能够与药剂静电结合；所述基质包含分布在整个生物可降解聚合物中的复合物。在一些实施方案中，该方法预防或治疗疾病。在一些实施方案中，与未施用纳米颗粒或微凝胶的参考受试者相比，该方法预防或治疗疾病。
在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用本发明公开的纳米颗粒或微凝胶以预防或治疗疾病。
神经调节剂可以用于美容用途和治疗用途。
在美容应用中，神经调节剂可以用于减少面部皱纹，特别是面部的最上面的三分之一，包括前额、眉间皱眉线(glabellar frown line)和鱼尾纹。神经调节剂还可以用于治疗所谓的“露龈笑(gummy smile)”，其中神经调节剂被注射到上唇的极度活跃的肌肉中，这造成唇的向上运动的减少，从而导致具有较少牙龈暴露的笑容。为此，神经调节剂通常被注射在汇聚于鼻翼的外侧面上的三块唇提肌(lip elevator muscle)中；提上唇肌(LLS)中、提上唇鼻翼肌(LLSAN)中和颧小肌(ZMi)中。
神经调节剂的治疗用途包括但不限于治疗：
局灶性肌张力障碍，诸如颈肌张力障碍(CD)，以减小成人的与CD相关的异常头位(abnormal head position)和颈部疼痛的严重程度；
成人的慢性流涎，即流口水；
肌肉痉挛，即以过度活跃的肌肉运动为特征的紊乱，包括上运动神经元综合征，诸如脑瘫，中风后痉挛，脊髓损伤后痉挛，头和颈部、眼睑、阴道、四肢、颌和声带的痉挛，或包括食道、颌、下尿路和膀胱以及肛门的肌肉的肌肉紧缩，以及难治性过度活跃的膀胱；
其他肌肉紊乱，包括斜视即不适当的眼睛对准(improper eye alignment)、眼睑痉挛、半面痉挛、婴幼儿型内斜视、由于与成人的中风相关的下肢痉挛引起的受限的踝关节运动以及两岁及更大的儿科患者的下肢痉挛；
过度出汗，包括不明原因的过度腋下出汗；
偏头痛，包括慢性偏头痛的预防性治疗。在这样的治疗中，神经调节剂被注射到头部和/或颈部中；
神经病理性疼痛；
慢性疼痛，诸如骨关节炎疼痛，参见例如美国专利第10,537,619号，包括改善骨关节炎的进展，参见例如美国专利第10,149,893号，治疗患关节炎的关节以减少疼痛和改善活动范围；
过敏症状；
抑郁，参见例如美国专利第8,940,308号；以及
早泄。
更具体地，在一些实施方案中，疾病或状况选自由美容状况、眼睑痉挛、半面痉挛、痉挛性斜颈、痉挛状态(spasticities)、肌张力障碍、偏头痛、下背痛(low back pain)、颈椎功能紊乱、斜视、多汗症和唾液分泌过多组成的组。在一些实施方案中，美容状况是明显的起皱纹。
在一些实施方案中，治疗方法包括减少面部线条(facial line)或皮肤的皱纹或者消除面部不对称。在这样的实施方案中，组合物通过皮下注射或肌肉内注射非致死剂量被局部施用到一个或更多个面部肌肉或参与皮肤皱纹或不对称的形成的肌肉中，或者被局部施用在一个或更多个面部肌肉或参与皮肤皱纹或不对称的形成的肌肉附近。2017年2月21日授权的、Marx等人的“High frequency application of botulinum toxin therapy”的美国专利第9,572,871号。
在一些实施方案中，组合物被注射到皱眉线、额横线(horizontal foreheadline)、鱼尾纹、鼻口周皱褶(nose perioral fold)、颏裂(mental cease)、起伏的下巴(popply chin)或颈阔肌带(platysmal band)中。在一些实施方案中，注射的肌肉选自由皱眉肌、眼轮匝肌、降眉间肌、枕额肌的额肌腹、眼轮匝肌的眶部、鼻肌(nasalis)、上唇、口轮匝肌、下唇、降口角肌、颏肌和颈阔肌组成的组，这些肌肉参与形成这样的皱纹。2013年10月15日授权的、Marx等人的“High frequency application of botulinum toxin therapy”的美国专利第8,557,255号。
在其他实施方案中，肉毒杆菌毒素可以用于治疗多种与头痛相关的紊乱，包括：偏头痛，1998年2月3日授权的美国专利第5,714,468号；头痛，2005年1月18日提交的美国专利申请公布第2005019132号，序号11/039,506；药物过度使用性头痛，2004年2月26日提交的美国专利申请公布第20050191320号，序号10/789,180；神经精神紊乱，2010年10月12日授权的美国专利第7,811,587号；其中的每一个都通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素可以用于预防性治疗患有慢性偏头痛的受试者的头痛、减少所述头痛的发生或减轻所述头痛。在一些实施方案中，该方法包括将梭菌神经毒素诸如肉毒杆菌神经毒素局部施用至受试者的额肌、皱眉肌、降眉间肌、枕肌(occipitalis muscle)、颞肌、斜方肌和颈椎旁肌(cervical paraspinal muscle)。注射可以是达到以特定的注射角度进行的限定的组织深度，其中施用至每个注射部位的肉毒杆菌神经毒素单位的频率和数量变化。参见例如，2020年8月4日授权的、Blumenfeld等人的“Injection paradigm for administration of botulinum toxins”的美国专利第10,729,751号(提供了用于治疗头痛的注射方案)。例如，在一种实施方案中，约20个单位在额肌的四个注射部位之间分配；约10个单位在皱眉肌的两个注射部位之间分配；约5个单位到达降眉间肌的一个注射部位；约30个单位在枕肌的六个注射部位之间分配至约40个单位在枕肌的八个注射部位之间分配；约40个单位在颞肌的8个注射部位之间分配直至50个单位在颞肌的十个注射部位之间分配；约30个单位在斜方肌的六个注射部位之间分配直至约50个单位在斜方肌的十个注射部位之间分配；以及约20个单位在颈椎旁肌的四个注射部位之间分配。
本公开内容的实施方案提供了采用特定的最小数量和体积的注射剂的、涉及特定组的肌肉的、靶向的、固定的注射范例，并且还提供了另外的肉毒杆菌毒素向所选肌肉的特定部位的另外的/任选的施用。在一种实施方案中，将固定剂量(即，根据包装说明书(package insert)或处方信息中指定的固定量和位置的最小剂量的量)的肉毒杆菌毒素施用至患者的额肌、皱眉肌、降眉间肌、枕肌、颞肌、斜方肌和颈椎旁肌，并且另外可以将可变量的另外的肉毒杆菌毒素添加到七个头/颈区域中的四个或更少区域，使得所施用的肉毒杆菌毒素的总量不超过按照伴随包含肉毒杆菌毒素的药物的包装说明书或处方信息中指示的最大总剂量。
在一些实施方案中，该方法包括治疗药物过度使用性头痛障碍，包括曲普坦过度使用性紊乱(triptan overuse disorder)、阿片类药物过度使用性紊乱、及其组合。在一些实施方案中，所施用的肉毒杆菌神经毒素的总量是从约155个单位至约195个单位的onabotulinumtoxin A。在一些实施方案中，施用是通过注射，包括皮下注射和肌肉内注射。参见，例如，2019年9月10日授权的、Turkel等人的“Injection paradigm foradministration of botulinum toxins”的美国专利第10,406,213号。
在一些实施方案中，该方法包括治疗外部引起的偏头痛(externally-causedmigraine headache)。在一些实施方案中，外部引起的慢性偏头痛与创伤后应激障碍(PTSD)或创伤性脑损伤(TBI)有关。参见，例如，2014年11月11日授权的、Binder的“Treatment of traumatic-induced migraine headache”的美国专利第8,883,143号，其通过引用以其整体并入本文；还参见2013年4月16日授权的、Binder的“Extramusculartreatment of traumatic-induced migraine headache”的美国专利第8,420,106号，其通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，该方法包括治疗偏头痛相关的眩晕。参见，例如，2014年5月13日授权的、Binder的“Method of treating vertigo”的美国专利第8,722,060号，其通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，该方法包括通过将神经毒素肌肉外注射到在新生神经出口点(emerging nerve exit point)处的无髓鞘C纤维(unmyelinated C fiber)来治疗偏头痛，其中所述神经出口点是耳大神经出口点、耳颞神经出口点、眶上神经出口点、滑车上神经出口点、滑车下神经出口点、眶下神经出口点或颏神经出口点中的一个或更多个。参见，例如，2013年12月31日授权的、Binder的“Treatment of migraine headache with diffusionof toxin in non-muscle related foraminal sites”的美国专利第8,617,569号，其通过引用以其整体并入。在其他实施方案中，该方法包括肌肉外注射到头皮中的额部、颅顶骨和枕部的深筋膜(occipital aponeurotic fascia)中的一个或更多个中。参见，例如，2013年7月23日授权的、Binder的“Treatment of migraine headache with diffusion of toxinin non-muscle related areas of the head”的美国专利第8,491,917号，其通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，该方法使与梭菌毒素施用相关的副作用最小化。在一些实施方案中，该副作用包括上睑下垂、颈部疼痛/无力、头痛、及其组合。在一些实施方案中，特定的施用方案或给药方案可以用于预防或最小化与梭菌毒素诸如肉毒杆菌毒素的施用相关的副作用，用于治疗或减轻患有慢性偏头痛的患者的头痛，该方法包括定位一个或更多个施用靶点，隔离一个或更多个施用靶点，向隔离的一个或更多个施用靶点施用治疗有效量的梭菌毒素；其中施用步骤是通过注射，并且其中施用步骤包括将注射限制到限定的组织深度和注射角度。在一些实施方案中，副作用包括上睑下垂、颈部疼痛和/或无力、头痛、或其组合。
在一些实施方案中，本发明公开的方法包括治疗由肌肉的极度活跃的胆碱能神经支配引起的或与肌肉的极度活跃的胆碱能神经支配相关的疾病或状况，包括严重的运动障碍或严重的痉挛(例如，通过施用总剂量为从约500U至约2000U的神经毒性组分)。参见，例如，2020年10月6日授权的、Marx等人的“High frequency application of botulinumtoxin therapy”的美国专利第10,792,344号，其通过引用以其整体并入本文。
如本文使用的，术语“极度活跃的胆碱能神经支配”与突触有关，特征是异常高量的乙酰胆碱释放到突触间隙中为。在一些实施方案中，疾病或状况是或涉及肌肉的肌张力障碍。在一些实施方案中，肌张力障碍选自由以下项组成的组：颅肌张力障碍，睑痉挛，颌张开或颌闭合型的口下颌肌张力障碍，磨牙症，Meige综合征，舌肌张力障碍，眼睑张开的失用症，颈肌张力障碍，颈项前屈(antecollis)、颈后倾(retrocollis)、侧颈(laterocollis)、斜颈，咽肌张力障碍，喉肌张力障碍，内收肌型的痉挛性发音障碍，外展肌型的痉挛性发音障碍，痉挛性呼吸困难(spasmodic dyspnea)，肢体肌张力障碍，手臂肌张力障碍，任务特异性肌张力障碍(task specific dystonia)，书写痉挛，音乐家痉挛，高尔夫球手痉挛(golfer's cramp)，涉及大腿内收、大腿外展、膝屈曲、膝伸展、踝屈曲、踝伸展的腿肌张力障碍、马蹄内翻足畸形(equinovarus deformity)，涉及纹状体趾、趾屈曲、趾伸展的足肌张力障碍，轴向肌张力障碍(axial dystonia)，比萨综合征(Pisa syndrome)，肚皮舞者肌张力障碍(belly dancer dystonia)，节段性肌张力障碍，偏身肌张力障碍(hemidystonia)，全身性肌张力障碍(generalised dystonia)，Lubag肌张力障碍(dystonia in Lubag)，皮质基底节变性肌张力障碍(dystonia in corticobasal degeneration)，迟发性肌张力障碍，脊髓小脑共济失调中的肌张力障碍，帕金森病中的肌张力障碍，亨廷顿舞蹈病中的肌张力障碍，哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden Spatz disease)中的肌张力障碍，多巴诱导的运动障碍/多巴诱导的肌张力障碍，迟发性运动障碍/迟发性肌张力障碍，阵发性运动障碍/肌张力障碍，运动源性的、非运动源性的和动作诱发的运动障碍/肌张力障碍。在一些实施方案中，肌张力障碍涉及选自由斜颈、侧颈、颈后倾、垂颈症(anterocollis)、弯曲的肘部、旋前的前臂、弯曲的手腕、拇指内收(thumb-in-palm)和握紧的拳头组成的组的临床模式。
在一些实施方案中，受影响的肌肉选自由以下项组成的组：同侧的夹肌、对侧的胸锁乳突肌、同侧的胸锁乳突肌、头夹肌(splenius capitis)、斜角肌复合体(scalenecomplex)、肩胛提肌、椎后肌(postvertebralis)、同侧的斜方肌、肩胛提肌、双侧的头夹肌、上斜方肌、深椎后肌(deep postvertebralis)、双侧的胸锁乳突肌、斜角肌复合体、颏下复合体、肱桡肌、肱二头肌(biceps brachialis)、旋前方肌、旋前圆肌、桡侧腕屈肌(flexorcarpi radialis)、尺侧腕屈肌(flexor carpi ulnaris)、拇长屈肌(flexor pollicislongus)、拇内收肌、拇短屈肌/对向肌、指浅屈肌和指深屈肌。
在一些实施方案中，疾病或状况是或涉及肌肉的痉挛。在一些实施方案中，痉挛是在以下项中的痉挛状况或与在以下项中的痉挛状况相关：与自身免疫过程相关的脑炎和脊髓炎、多发性硬化、横贯性脊髓炎、德维克综合征(Devic syndrome)、病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、真菌感染、遗传性痉挛性轻瘫痪(hereditary spastic paraparesis)、由半球梗死(hemispheric infarction)引起的卒中后综合征、由脑干梗死引起的卒中后综合征、由脊髓梗死引起的卒中后综合征、中枢神经系统创伤、中枢神经系统出血、脑内出血、蛛网膜下出血(subarachnoidal hemorrhage)、硬膜下出血、脊髓出血(intraspinalhemorrhage)、肿瘤形成、中风后痉挛和由脑瘫引起的痉挛。在一些实施方案中，肌肉是平滑肌或横纹肌。
在一些实施方案中，疾病或状况与极度活跃的外分泌腺有关。在一些实施方案中，极度活跃的外分泌腺选自由汗腺、泪腺、唾液腺和黏液腺(mucosal gland)组成的组。2017年2月21日授权的、Marx等人的“High frequency application of botulinum toxintherapy”的美国专利第9,572,871号；2015年8月4日授权的、Marx等人的“High frequencyapplication of botulinum toxin therapy”的美国专利第9,095,523号。
在一些实施方案中，该方法包括用于通过向额肌、皱眉肌、降眉间肌、枕肌、颞肌、斜方肌和颈椎旁肌局部施用肉毒杆菌神经毒素来减少患者的抑郁。参见，例如，2015年1月27日授权的、Turkel等人的“Methods for treating depression”的美国专利第8,940,308号，其通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，疾病或状况包括伤害感受性疼痛(nociceptive pain)。如本文使用的，术语“伤害感受性疼痛”被定义为由对非神经元组织的实际的或潜在的损伤而产生的并且是由于伤害感受器的生理激活的疼痛。如本文使用的，术语“神经病理性疼痛”被定义为作为躯体感觉神经系统的损害或疾病的直接结果而产生的疼痛。
在一些实施方案中，疾病或状况的治疗包括治疗或减轻骨关节炎疼痛。参见，例如，2020年1月21日授权的、Turkel等人的“Methods for treating osteoarthritis pain”的美国专利第10,537,619号，其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，该方法包括向受试者的受骨关节炎影响的部位局部施用治疗有效量的梭菌衍生物。在一些实施方案中，治疗有效量是从约200个单位至约800个单位，包括约200个单位、250个单位、300个单位、350个单位、400个单位、450个单位、500个单位、550个单位、600个单位、650个单位、700个单位、750个单位和800个单位。在一些实施方案中，受骨关节炎影响的部位选自由膝关节、髋关节、手关节、肩关节、踝关节、足关节、肘关节、腕关节、骶髂关节、脊柱关节及其组合组成的组。在一些实施方案中，施用是通过关节内注射到关节间隙(joint space)中。
在一些实施方案中，该方法包括用于改变与骨关节炎介导的软骨降解(cartilagedegradation)相关的至少一种剂的水平和/或活性的方法。参见，例如，2018年12月11日授权的、Jiang等人的“Methods for modifying progression of osteoarthritis”的美国专利第10,149,893号，其通过引用以其整体并入本文。在这样的实施方案中，治疗有效量可以是从约300个单位至约500个单位。在一些实施方案中，与骨关节炎介导的软骨降解相关的至少一种剂包括软骨降解剂、软骨形成组分，或其混合物。在某些实施方案中，软骨降解剂是蛋白酶。在特定的实施方案中，蛋白酶选自由金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶(aspartate proteinases)、丝氨酸蛋白酶及其组合组成的组。在某些实施方案中，软骨形成组分选自由聚集蛋白聚糖、蛋白聚糖、胶原蛋白、透明质酸(hyaluronan)及其组合组成的组。在一些实施方案中，受骨关节炎影响的部位选自由膝关节、髋关节、手关节、肩关节、踝关节、足关节、肘关节、腕关节、骶髂关节、脊柱关节及其组合组成的组。在一些实施方案中，该方法还包括减轻骨关节炎相关的疼痛。
在其他实施方案中，本发明公开的主题提供了用于使用本发明公开的持续释放制剂的方法，该方法包括通过注射来局部施用持续释放制剂，其中一种或更多种神经调节剂在约3天至约200天之间的时间段内从持续释放制剂中释放，从而治疗选自由美容状况、局灶性肌张力障碍、颈肌张力障碍(CD)、慢性流涎和肌肉痉挛组成的组的疾病或状况，所述时间段包括约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、100天、105天、110天、115天、120天、125天、130天、135天、140天、145天、150天、155天、160天、165天、170天、175天、180天、185天、190天、195天和200天。
如本文使用的，术语“i.m.”指的是通过肌肉内途径的施用，在所述肌肉内途径中，治疗剂被直接注入到血管肌肉组织中。
如本文使用的，术语“关节内注射”指的是直接注射到关节或门静脉(portal)中。
如本文使用的，术语“关节外注射”指的是在关节间隙外的注射。
如本文使用的，术语“关节周围注射”指的是注射到关节周围的区域。
如本文使用的，术语“局部施用”意指通过非全身途径(non-systemicroute)将梭菌衍生物施用至患者中受关节炎影响的部位或施用至患者中受关节炎影响的部位的附近。因此，局部施用排除了诸如静脉内施用或口服施用的全身施用途径。
如本文使用的，术语“外周施用”意指向远离有症状位置的位置的施用，与局部施用相反。
如本文使用的，术语“施用(administration)”或“施用(to administer)”意指向受试者或者可选择地接受药物组合物的受试者给予(即施用)肉毒杆菌毒素的步骤。本发明的方法可以通过包括以下的施用途径进行：肌肉内施用、非肌肉内施用、关节内施用、关节外施用、关节周围施用、真皮内施用、皮下施用、局部施用(使用液体制剂、乳膏制剂、凝胶制剂或片剂制剂)、鞘内施用、腹膜内施用、静脉内输注、植入(例如，缓慢释放装置诸如聚合物植入物或微渗透泵(miniosmotic pump)的植入)，或其组合。
如本文所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指暂时地或永久地预防、减少不期望的状况的发生、减轻或消除不期望的状况，所述不期望的状况例如头痛。
如本文使用的，术语“减轻”意指减少不期望的状况或其症状，例如头痛强度或与头痛相关的症状。因此，减轻包括某些减少、显著减少、接近完全减少和完全减少。在向患者施用梭菌衍生物之后的1天至7天之间或之后的某个时间，临床上可能不出现减轻效果。
如本文使用的，术语“治疗有效量”指的是足以获得期望的治疗效果的量。除非另有说明，否则治疗有效量通常指的是每次患者治疗期间每个注射部位所施用的量。
梭菌衍生物例如肉毒杆菌毒素的治疗有效量可以根据以下变化：毒素的效力和正被治疗的状况的特定特征，包括其严重程度，以及其他多种患者变量，包括尺寸、重量、年龄和对治疗的响应度。
神经毒素的生物活性通常以小鼠单位(MU)表示。如本文使用的，1MU是在腹膜内注射之后杀死50％的指定的小鼠群体(例如，一组18只至20只雌性Swiss-Webster小鼠，每只重约20克)的神经毒性组分的量，即小鼠i.p.LD50(Schantz&Kauter，1978)。术语“MU”和“单位”或“U”是可互换的。可选择地，生物活性可以以致死剂量单位(LDU)/ng蛋白质(即神经毒性组分)表示。术语“MU”在本文与术语“U”或“LDU”可互换地使用。存在用于确定梭菌神经毒素的生物活性的测定。参见，例如，2016年4月12日授权的、Wilk等人的“In vitro assayfor quantifying clostridial neurotoxin activity”的美国专利第9,310,386号。
本领域普通技术人员将认识到，可商购的肉毒杆菌毒素制剂不具有相同的效力单位。在说明性实例中，一个单位的(onabotulinumtoxin A)，从Allergan,Inc.可获得的A型肉毒杆菌毒素，具有约等于3个至5个单位的/>(abobotulinumtoxin A)的效力单位，/>也是A型肉毒杆菌毒素，是从Ipsen Pharmaceuticals可获得的。在一些实施方案中，在本发明的方法中施用的abobotulinumtoxin A(诸如/>)的量是施用的onabotulinumtoxin A(诸如/>)的量的约3倍至4倍，因为比较研究已经表明，一个单位的onabotulinumtoxin A具有约等于3个至4个单位的abobotulinumtoxin A的效力。/>从Elan可获得的B型肉毒杆菌毒素，相对于/>具有低得多的效力单位。
在一些实施方案中，肉毒杆菌神经毒素可以是纯的毒素，不含复合蛋白，诸如(incobotulinumtoxin A)。一个单位的incobotulinumtoxin A具有约等于一个单位的onabotulinumtoxin A的效力。施用的毒素的量及其施用频率将由负责治疗的医生决定，并且将与安全性的问题和由特定毒素制剂产生的效果相称。
为了指导从业者，在一些实施方案中，例如为了治疗头痛，典型地，每次患者治疗期间、每个注射部位施用不少于约1个单位且不超过约25个单位的A型肉毒杆菌毒素(诸如)。对于A型肉毒杆菌毒素，诸如/>每次患者治疗期间、每个注射部位施用不少于约2个单位且不超过约125个单位的A型肉毒杆菌毒素。对于B型肉毒杆菌毒素，诸如/>每次患者治疗期间、每个注射部位施用不少于约40个单位且不超过约1500个单位的B型肉毒杆菌毒素。
在一些实施方案中，对于每次患者治疗期间、每个注射部位施用不少于约2个单位且不超过约20个单位的A型肉毒杆菌毒素；对于/>每次患者治疗期间、每个注射部位施用不少于约4个单位且不超过约100个单位；以及对于/>每次患者治疗期间、每个注射部位施用不少于约80个单位且不超过约1000个单位。
在其他实施方案中，每次患者治疗期间、每个注射部位分别施用：对于不少于约5个单位且不超过约15单位的A型肉毒杆菌毒素；对于/>不少于约20个单位且不超过约75个单位；以及对于/>不少于约200个单位且不超过约750个单位。
通常，适合于施用至受试者的肉毒杆菌毒素的总量分别不应超过每次治疗期间约300个单位、约1,500个单位或约15,000个单位，这取决于所施用的特定肉毒杆菌毒素的生物活性或效力。更具体地，肉毒杆菌毒素可以以在约1个单位和约3,000个单位之间、或在约2个单位和约2000个单位之间、或在约5个单位和约1000个单位之间、或在约10个单位和约500个单位之间、或在约15个单位和约250个单位之间、或在约20个单位和约150个单位之间、或在25个单位和约100个单位之间、或在约30个单位和约75个单位之间、或在约35个单位和约50个单位之间的量或类似的量被施用。
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了神经调节剂制剂的持续释放概况，该持续释放概况具有至少120天最大有效释放期，并且在一些实施方案中，将总的作用持续时间延长至在约6个月和约9个月之间，包括约6个月、7个月、8个月和9个月。因此，本发明公开的制剂提供了神经调节剂的长期释放，其中释放持续时间范围为从约1个月至9个月，包括约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月和9个月。在一些实施方案中，释放持续时间是约5个月，例如约150天。在一些实施方案中，释放持续时间在约3天至约200天之间，包括约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、100天、105天、110天、115天、120天、125天、130天、135天、140天、145天、150天、155天、160天、165天、170天、175天、180天、185天、190天、195天和200天。
通过本公开内容的方法在其许多实施方案中治疗的受试者合意地是人类受试者，然而应当理解的是，本文描述的方法对于所有脊椎动物物种都有效，所有脊椎动物物种意图被包括在术语“受试者”中。因此，“受试者”可以包括用于医疗目的，诸如用于现存状况或疾病的治疗或用于防止状况或疾病的发作的预防性治疗的人类受试者，或用于医疗的、兽医的目的或发育目的的动物受试者。合适的动物受试者包括哺乳动物，哺乳动物包括但不限于：灵长类动物，例如人类、猴、猿等；牛科动物，例如，家牛、公牛等；绵羊类(ovines)，例如，绵羊(sheep)等；山羊类(caprines)，例如，山羊(goat)等；猪类(porcines)，例如，小猪(pig)、肉猪(hog)等；马科动物(equines)，例如，马、驴、斑马等；猫科动物，包括野生猫和家养猫；犬类(canines)，包括狗；兔类动物，包括家兔、野兔等；和啮齿类动物，包括小鼠、大鼠等。动物可以是转基因动物。在一些实施方案中，受试者是人类，包括但不限于：胎儿、新生儿、婴儿、少年和成年的受试者。此外，“受试者”可以包括罹患或怀疑罹患状况或疾病的患者。因此，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用。术语“受试者”也指来自受试者的有机体、组织、细胞或细胞集合。
在某些实施方案中，该方法包括施用纳米颗粒或微凝胶的两种或更多种制剂，其中纳米颗粒或微凝胶的两种或更多种制剂各自具有不同的释放概况。
在一些实施方案中，本发明公开的方法还包括与本发明公开的纳米颗粒组合地施用一种或更多种另外的治疗剂。
术语“组合”以其最广泛的意义使用，并且意指受试者被施用至少两种剂，更具体地，本发明公开的纳米颗粒和至少一种另外的治疗剂。更特别地，术语“组合”指的是共同施用两种(或更多种)活性剂来治疗疾病状态例如单一疾病状态。如本文使用的，活性剂可以被组合并且以单一剂型施用，可以作为单独剂型同时施用，或者可以作为在相同或不同的日期交替或依次施用的单独剂型来施用。在本公开内容的主题的一种实施方案中，活性剂被组合并且以单一剂型施用。在另一种实施方案中，活性剂以单独剂型施用(例如，其中期望的是改变一种的量而不改变另一种的量)。单一剂型可以包括用于治疗疾病状态的另外的活性剂。
此外，本文描述的纳米颗粒可以单独地或与增强纳米颗粒制剂的稳定性的佐剂组合地施用，单独地或与一种或更多种剂(包括其他活性成分)组合地施用，在某些实施方案中促进包含它们的药物组合物的施用，提供增加的溶解或分散，增加抑制活性，提供辅助疗法等。有利地，这样的组合疗法使用较低剂量的常规治疗剂，因此避免了当这些剂作为单一疗法使用时引起的可能的毒性和不利的副作用。
本发明公开的纳米颗粒和至少一种另外的治疗剂的施用时机可以改变，只要实现这些剂的组合的有益效果。因此，短语“与...组合”指的是同时地、依次地或其组合地施用本发明公开的纳米颗粒和至少一种另外的治疗剂。因此，施用了本发明公开的纳米颗粒和至少一种另外的治疗剂的组合的受试者可以在相同时间(即，同时地)或在不同时间(即，在同一天或在不同天，以任何次序依次地)接受本发明公开的纳米颗粒和至少一种另外的治疗剂，只要在受试者中实现两种剂的组合的效果。
当依次施用时，剂可以在彼此间隔1分钟、5分钟、10分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟或更长的时间内被施用。在其他实施方案中，被依次施用的剂可以在彼此间隔1天、5天、10天、15天、20天或更多天内被施用。在同时施用本发明公开的纳米颗粒和至少一种另外的治疗剂的情况下，它们可以作为单独的药物组合物(每种药物组合物包含本发明公开的纳米颗粒或至少一种另外的治疗剂)施用至受试者，或者它们可以作为包含两种剂的单一药物组合物施用至受试者。
当组合施用时，引起特定生物响应的剂中的每一种的有效浓度可以小于每种剂在单独施用时的有效浓度，从而允许一种或更多种剂的剂量相对于如果该剂作为单一的剂施用将需要的剂量的减少。
F.制剂和施用方法
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了包含本发明公开的纳米颗粒的持续释放制剂，其中该制剂在软组织中提供有效浓度的一种或更多种神经调节剂持续在约3天至约200天之间的时间段，包括约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、100天、105天、110天、115天、120天、125天、130天、135天、140天、145天、150天、155天、160天、165天、170天、175天、180天、185天、190天、195天和200天。
在特定的实施方案中，受试者可以被给予或施用包含一种或更多种神经调节剂的纳米颗粒。纳米颗粒可以以固体、液体或气溶胶的形式施用至受试者。纳米颗粒可以如将由本领域普通技术人员已知的静脉内、皮内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、局部(topically)、肌内、皮下、粘膜、口服、局部(topically)、局部(locally)、吸入(例如气溶胶吸入)、注射、输注、连续输注、直接局部灌注浸浴靶细胞(localized perfusionbathing target cells directly)、经由导管、经由灌洗、以乳状物形式、以脂质组合物形式(例如脂质体)施用或者通过其他方法或者以上方式的任何组合施用(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，Mack Printing Company,1990，通过引用并入本文)。
此外，本发明公开的纳米颗粒可以在具有或没有惰性稀释剂的情况下在药学上可接受的载体中提供。载体应当是可同化的，并包括液体载体、半固体(即糊剂)载体或固体载体。任何常规介质、剂、稀释剂或载体在用于实践本发明方法的可施用组合物中使用是合适的，除非其对受体或包含在其中的组合物的疗效有害。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填料等或其组合。组合物还可以包含各种抗氧化剂，以减缓一种或更多种组分的氧化。此外，防止微生物的作用可以通过防腐剂来实现，防腐剂诸如各种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
本发明公开的纳米颗粒可以以任何方便且实用的方式与载体组合，即，通过溶解、悬浮、乳化、掺和、包封、吸收或类似方式。对于本领域技术人员来说，这样的程序是常规的。
在一些实施方案中，本发明公开的纳米颗粒可以与半固体载体或固体载体充分组合或混合。混合可以以任何方便的方式诸如研磨来进行。在混合工艺中，还可添加稳定剂，以保护组合物免于损失治疗活性，即，在胃内变性。用于在组合物中使用的稳定剂的实例包括缓冲液、氨基酸诸如甘氨酸和赖氨酸、糖类诸如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇及类似物。
在另外的实施方案中，本发明公开的主题包括药用脂质媒介物组合物的使用，该组合物包含本发明公开的纳米颗粒和一种或更多种脂质以及水性溶剂。如本文使用的，术语“脂质”包括特征上不溶于水并且用有机溶剂可提取的宽范围的物质中的任一种物质。实例包括含有长链脂肪烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然存在的或合成的(即由人类设计或生产的)。天然存在的脂质是本领域中熟知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜类化合物、溶血脂(lysolipids)、糖鞘脂、糖脂、硫脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合脂质及其组合。除本文具体描述的化合物之外的被本领域技术人员理解为脂质的化合物也被本发明公开的组合物和方法涵盖。
本领域普通技术人员将熟悉可被采用以将一种或更多种纳米颗粒分散在脂质媒介物中的一系列技术。例如，一种或更多种本发明的纳米颗粒可以被分散在含有脂质的溶液中、用脂质溶解、用脂质乳化、与脂质混合、与脂质组合、与脂质共价键合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束或脂质体中或与其复合，或另外通过本领域普通技术人员所知的任何方式与脂质或脂质结构缔合。分散可以导致或可以不导致脂质体的形成。
施用至受试者的本发明公开的纳米颗粒的实际剂量可以根据物理和生理因素诸如体重、状况严重程度、待治疗疾病的类型、先前或同时进行的治疗干预措施、患者的特发病和施用途径确定。取决于剂量和施用途径，优选剂量和/或有效量的施用次数可根据受试者的反应而有所不同。不管怎样，负责施用的从业人员将确定组合物中的活性成分浓度，以及用于个体受试者的适合剂量。
在一些实施方案中，本发明公开的纳米颗粒可以经由肠胃外途径施用。如本文使用的，术语“肠胃外”包括避开消化道的途径。具体地，本文公开的药物组合物可以例如但不限于皮内施用、肌内施用、或皮下施用。
本发明公开的制剂可以在与表面活性剂诸如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。分散体还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中来制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须是流动的，达到存在可易于注射的程度。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须被保存抵抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇或类似的多元醇)、其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。合适的流动性可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需要的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂来维持。可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及类似物来实现阻止微生物的作用。
在一些实施方案中，包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
对于以水溶液形式进行的肠胃外施用，例如，如果需要，溶液应当是适当缓冲的，并且用充足的盐水或葡萄糖使液体稀释剂首先实现等渗。这些特定水溶液尤其适于静脉内施用、肌内施用、皮下施用和腹膜内施用。在这一点上，可以采用的无菌水性介质将是本领域技术人员根据本公开内容所已知的。例如，可以将一个剂量溶解于等渗NaCl溶液中，并且添加皮下灌注术流体或注射在建议的输注部位(参见例如，“Remington's PharmaceuticalSciences”第15版，第1035-1038和1570-1580页)。取决于待治疗的受试者的状况，剂量必然将发生一些变化。不管怎样，负责施用的人员将确定用于个体受试者的适合剂量。此外，对于人类施用，制品应当满足无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
无菌可注射溶液通过将所需量的活性化合物并入适当的溶剂中，然后通过过滤灭菌(filtered sterilization)来制备，所述溶剂根据需要具有多种上文列举的其他成分。通常，分散体通过将多种灭菌的活性成分并入到无菌媒介物中来制备，所述无菌媒介物包含基础分散介质和来自上文列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥技术和冷冻干燥技术，所述技术从活性成分加任何另外的期望的成分的先前无菌过滤的溶液产生其粉末。在具有或没有稳定剂的情况下，将粉状组合物与液体载体诸如例如水或盐水溶液组合。
在一些实施方案中，组合物包含pH缓冲液。在一些实施方案中，pH缓冲液是乙酸钠。在一些实施方案中，组合物包含冷冻保护剂。在一些实施方案中，冷冻保护剂是多元醇。在一些实施方案中，多元醇选自甘露糖醇、肌醇、乳糖醇、异麦芽酮糖醇(isomalt)、木糖醇、赤藓糖醇、山梨醇及其混合物中的一种或更多种。在一些实施方案中，组合物包含糖。在一些实施方案中，糖选自单糖、二糖、多糖及其混合物。参见，例如，2018年10月23日授权的、Taylor的“Therapeutic composition with a botulinum neurotoxin”的美国专利第10,105,421号。
在一些实施方案中，制剂包含洗涤剂。如本文使用的术语“洗涤剂”涉及用于使另一种物质溶解或稳定的任何物质，该物质可以是制剂中的药物活性成分或另一种赋形剂。洗涤剂可以空间地或静电地使所述蛋白质或肽稳定。术语“洗涤剂”与术语“表面活性剂(surfactant)”或“表面活性剂(surface active agent)”同义地使用。
在一些实施方案中，洗涤剂选自由非离子型表面活性剂组成的组。术语“非离子型表面活性剂”指的是不具有正电荷或负电荷的表面活性剂。在一些实施方案中，非离子型表面活性剂选自由以下项组成的组：脱水山梨糖醇酯类(脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯)、聚山梨醇酯类(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(聚山梨醇20(Polysorbate 20))、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)-脱水山梨糖醇-单油酸酯(吐温80(Tween80)/聚山梨酯80))、聚环氧丙烷类非离子型表面活性剂(poloxamers)(泊洛沙姆407、泊洛沙姆188)、克列莫佛(cremophor)，及其混合物。
在一些实施方案中，洗涤剂是阴离子型表面活性剂。术语“阴离子型表面活性剂”指的是包含阴离子亲水基团的表面活性剂。在一些实施方案中，阴离子型表面活性剂选自由十四烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、月桂醇聚醚硫酸酯钠(sodium laurethsulphate)、十二烷基硫酸钠(SDS)、溴化十六烷基三甲铵、十六烷基三甲基溴化铵及其混合物组成的组。
在一些实施方案中，洗涤剂是阳离子型表面活性剂。术语“阳离子型表面活性剂”包括包含阳离子亲水基团的表面活性剂。在一些实施方案中，阳离子型表面活性剂选自由苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、氯化十六烷基吡啶鎓(CPC)、苄索氯铵(BZT)及其混合物组成的组。参见，例如，2015年12月1日授权的、Burger等人的“Formulation forstabilizing proteins,which is free of mammalian excipient”的美国专利第9,198,856号；2015年11月3日授权的、Taylor等人的“Formulation suitable for stabilizingproteins,which is free of mammalian excipients”的美国专利第9,173,944号。
G.试剂盒
在一些实施方案中，本发明公开的主题包括包含本发明公开的组合物的试剂盒。在非限制性的实例中，试剂盒可以包括本发明公开的纳米颗粒(例如，包含一种或更多种神经调节剂的纳米颗粒)。试剂盒可以包括适当等分的纳米颗粒以及(在一些实施方案中)一种或更多种另外的剂。试剂盒的组分可以以水性介质或以冻干形式来包装。试剂盒的容器通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器，组分可以被放置在所述容器中并且优选地被合适地等分。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，试剂盒通常还将包括第二、第三或其他另外的容器，另外的组分可以单独放置在这样的容器中。在其他实施方案中，小瓶中可以包含成分的多种组合。本发明的试剂盒通常还将包括用于商业销售的呈紧密封闭形式的用于容纳一种或更多种本发明的纳米颗粒的装置和任何其他试剂容器。这样的容器可以包括注射模制或吹塑模制的塑料容器，期望的小瓶被保存在所述塑料容器中。
当试剂盒的组分在一种和/或更多种液体溶液中提供时，液体溶液是水溶液，无菌水溶液是特别优选的。一种或更多种纳米颗粒可以被配制成可注射的组合物。在这种情况下，容器装置本身可以是注射器、移液管和/或其他这样类似的装置，从该装置可以将制剂应用至身体的感染区域，注射到动物中，和/或甚至应用至试剂盒的其他组分和/或与试剂盒的其他组分混合。在其他实施方案中，试剂盒的组分还可以作为干燥粉末被提供。当试剂和/或组分作为干燥粉末被提供时，粉末可以通过添加合适的溶剂来重构。设想溶剂还可以在另一容器装置中提供。
在一些实施方案中，试剂盒包括包含本发明公开的纳米颗粒的预填充的玻璃注射器或塑料注射器。参见，例如，2020年2月4日授权的、Vogt的“Botulinum toxin prefilledglass syringe”的美国专利第10,549,042号和2019年9月10日授权的、Vogt的“Botulinumtoxin prefilled plastic syringe”的美国专利第10,406,290号，它们中的每一个通过引用以其整体并入本文。
在其他实施方案中，用于在患者的膀胱壁(bladder wall)中的多个注射部位处注射onabotulinumtoxin A以减轻过度活跃的膀胱状况的医疗注射组件在2019年5月14日授权的、Snoke等人的“Medical injection assemblies for onabotulinumtoxin Adelivery and methods of use thereof”的美国专利第10,286,159号中公开，该专利通过引用以其整体并入。
遵循长期存在的专利法惯例，术语“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”当用于本申请(包括权利要求书)时指的是“一个或更多个”。因此，例如，提及“受试者(a subject)”包括多于一个受试者，除非上下文清楚地是意思相反的(例如，多于一个受试者)等等。
贯穿本说明书和权利要求书，术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”以非排他性含义使用，除了在上下文另有要求的情况下。同样地，术语“包括(include)”及其语法变体意图是非限制性的，使得列表中项目的列举不排除可以被取代或被添加至所列项目中的其他类似的项目。
为了本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示量、尺寸、维度、比例、形状、配方、参数、百分比、数量、特征、及其他数值的所有数字在所有情况下都应理解为由术语“约”修饰，即使术语“约”可能未明确地与该值、量或范围一起出现。因此，除非相反地指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数不是且不需要是精确的，而是如所期望的可以是近似的和/或更大或更小，反映了公差、换算系数、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素，取决于本发明公开的主题寻求获得的期望性质。例如，当指值时，术语“约”可以意图包括指定的量的以下变化：在一些实施方案中±100％、在一些实施方案中±50％、在一些实施方案中±20％、在一些实施方案中±10％、在一些实施方案中±5％、在一些实施方案中±1％、在一些实施方案中±0.5％、以及在一些实施方案中±0.1％，在这样的变化对于进行所公开的方法或采用所公开的组合物是适当的的情况下。
此外，当与一个或更多个数值或数值范围共同使用时，术语“约”应被理解为涉及所有这样的数值，包括范围内的所有数值以及通过将边界延伸至高于和低于所列出的数值修改该范围。通过端点陈述的数值范围包括归入该范围内的所有数值例如全部的整数，包括其分数(例如，1至5的陈述包括1、2、3、4和5，以及它们的分数，例如1.5、2.25、3.75、4.1等)以及在该范围内的任何范围。
实施例
包括以下实施例以提供本领域普通技术人员用于实践本发明公开的主题的代表性实施方案的指导。根据本公开内容和本领域中的一般技术水平，技术人员可以理解，以下实施例意图仅是示例性的，并且可以采用许多变化、修改和改变而不偏离本发明公开的主题的范围。以下的合成描述和特定实例仅意图用于说明的目的，而不应被解释为以任何方式限制通过其他方法制备本公开内容的化合物。
实施例1
关于肉毒杆菌毒素A(BoNTA)和BoNTA类毒素的代表性实施方案
使用肉毒杆菌毒素A(BoNTA)和BoNTA类毒素(即BoNTA的部分失活形式)两者进行实验，以测试释放概况和可再现性。基于NanoTox制剂的组成，即BoNTA、填料蛋白(fillerprotein)、聚阴离子和PLGA聚合物的含量或重量百分比，BoNTA的释放持续时间可以从几十小时被调节到几十周。例如，具有BoNTA或BoNTA类毒素的NanoTox的一种特定的制剂示出类似的持续释放动力学，在84天的时段内具有约65％的蛋白质释放，具有接近线性的概况(图4)，预计总计超过3.5个月的释放持续时间。此释放持续时间为单独地与只能实现14天的释放持续时间的目前市场领先者Botox相比，释放时段的8×延长。值得注意的是，在室温储存持续70天的NanoTox制剂没有示出显著不同的释放动力学(图4)。
考虑到BoNTA的高效力和极低的EC50，以及对其靶点的再合成和轴突运输的需求，作用的持续时间可以外推至超过6个月至9个月。
更重要地，已经展示了BoNTA在该制剂中高的生物活性保留水平。与游离形式的BoNTA相比，从NanoTox体系中释放的BoNTA在37℃在28天之后保留大于85％的生物活性(图5)。
实施例2
包封神经调节剂的纳米颗粒的制备
本发明公开的主题部分地描述了使用(A型肉毒杆菌毒素)、或BoNTA类毒素、或BoNTA亚基(重链)来制备纳米颗粒制剂。将BoNTA或BoNTA类毒素或BoNTA重链以2mg/mL的浓度溶解在去离子(DI)水中。将填料蛋白人血清白蛋白(HSA)或小鼠血清白蛋白(MSA)以2mg/mL的浓度溶解在去离子水中。将botox溶液与HSA溶液以1:500的蛋白质重量比混合，随后通过添加0.1M HCl溶液将pH调节至3.0。然后将1毫升的该蛋白质溶液与等体积的葡聚糖硫酸钠溶液(DS，2mg/mL，pH调节至3.0)通过快速纳米复合(FNC)工艺快速地混合，所述快速纳米复合工艺使用具有两个入口的受限撞击射流(CIJ)混合器，对于这两个入口均是以范围为0.5mL/min至20mL/min的流量。CIJ混合器的出口连接到具有三个入口的另一个CIJ混合器。混合器的另外两个入口流动有10mg/mL的分别在乙腈和去离子水中的PEG5K-b-PLGA20K(50:50)，两者均是以2mL/min的流量。获得包封蛋白质的纳米颗粒(BoNTA，NP1；BoNTA类毒素，NP2；BoNTA重链，NP3)。
使用具有截留分子量(MWCO)3.5KDa的渗析膜将纳米颗粒用去离子水进行渗析持续12小时，以去除乙腈，其中每2小时更换水。将获得的溶液通过超滤来纯化以去除过量的蛋白质和DS，所述超滤使用具有MWCO 100KDa的过滤器以4,500rpm持续20min。
通过BCA测定来测量未被包封的蛋白质的量，并且使用以下公式计算包封效率(EE)：
EE(％)＝(m总-m游离)/m总×100％，
其中m总代表总进料蛋白质的质量并且m游离代表上清液中的游离蛋白质的质量。
实施例3
纳米颗粒的表征
使用动态光散射(DLS)Zetasizer Nano(Malvern Instruments，Worcestershire，UK)通过颗粒尺寸和ζ电位来表征纳米颗粒。每个样品测量三次，并且以三次读数的平均值±标准差来报告数据。
通过将10微升的纳米颗粒溶液添加到覆盖有碳膜的电离的铜网(ionized coppergrid)上来制备用于TEM成像的样品。10min后，将溶液吸出，并且将6微升2％乙酸铀酰滴剂添加到网。30秒后，将溶液移除，并且将网留在室温干燥。然后使用Technai FEI-12电子显微镜对样品成像。
表1.纳米颗粒中BoNTA蛋白质的颗粒尺寸、PDI、ζ电位、EE和负载水平的总结
用三种不同的botox类似物、以相同的蛋白质与聚合物的比率和相同的流量来制备包封BoNTA的PLGA纳米颗粒(NP1至NP3)，其示出Z平均颗粒尺寸范围为从86nm至103nm，具有窄的尺寸分布(PDI值～0.17-0.23)(表1)。所有纳米颗粒均示出负的表面电荷，具有范围从-25mV至-30mV的ζ电位。包封效率在从83％至88％的范围内，而负载水平在13.4％至14.2％的范围内。
实施例4
NP1-NP3的释放试验及数据分析
BoNTA/类毒素/重链的体外释放通过500微升的包含0.5mg蛋白质(BoNTA+HSA)的负载蛋白质的纳米颗粒悬浮液来进行，所述纳米颗粒悬浮液与相同体积的2×PBS混合进入1.5mL的Eppendorf离心管中。将离心管放入具有100rpm的搅拌速率的37℃的孵育箱中。以相同方法制备多个管。在每个指定的时间点，从孵育箱中获得三个管，并且然后以50,000rcf超速离心持续30min。收集上清液并通过冻干浓缩，并且使用100微升的去离子水进一步重构。采用ELISA测定来定量所释放的毒素的量。
NP1-NP3全部示出持续释放，在30天内具有30％-35％的释放(图4)。毒素释放持续时间可以外推至118天，并且类毒素释放持续时间可以外推至147天。在室温储存持续70天的NP2也重复了这种趋势。如果假设100％释放，则具有包封的重链的NP3可以外推至110天。
实施例5
从NP1-NP3中释放的BoNTA的生物活性
释放的毒素的生物活性通过荧光SNAPtide裂解测定(fluorogenic SNAPtidecleavage assay)进行。将释放的毒素冻干并且用复原缓冲液(20mM HEPES，pH 8.0，5mMDTT，0.3mM ZnSO4和0.1％吐温20)重构。将毒素的浓度标准化为与毒素的标准样品相同。在37℃孵育30分钟之后，将100μL的溶液添加到96孔板中，该96孔板具有150μL的反应缓冲液(20mM HEPES，pH 8.0，1.25mM DTT，0.75mM ZnSO4和0.1％吐温20)。在37℃孵育过夜之后，接着通过荧光计以激发波长320nm和发射波长420nm来分析该96孔板。释放的毒素的生物活性被保持，持续28天没有显著变化，而类毒素不具有生物活性(图5)。
实施例6
包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC，NP4)的制备
本发明公开的主题部分地描述了使用(A型肉毒杆菌毒素)、或BoNTA类毒素、或BoNTA亚基(重链)来制备聚电解质纳米复合物(PNC)制剂。使用下文示例性程序中描述的工艺，制备了一种具有A型肉毒杆菌毒素的聚电解质纳米复合物(PNC)制剂(NP4)。
将BoNTA以2mg/mL的浓度溶解在去离子(DI)水中。将填料蛋白人血清白蛋白(HSA)或小鼠血清白蛋白(MSA)以2mg/mL的浓度溶解在去离子水中。将BoNTA溶液与HSA溶液以1:500的蛋白质重量比混合，随后通过添加0.1M HCl溶液将pH调节至3.0。然后将1毫升的该蛋白质溶液与等体积的葡聚糖硫酸钠溶液(DS，2mg/mL，pH调节至3.0)通过快速纳米复合(FNC)工艺快速地混合，所述快速纳米复合工艺使用具有两个入口的受限撞击射流(CIJ)混合器，这两个入口均是以10mL/min(范围：0.5mL/min至20mL/min)的流量。收集BoNTA/HSA/DS聚电解质纳米复合物(PNC)(NP4)并且通过在4℃用去离子水渗析来纯化。可选择地，获得的聚电解质纳米复合物(PNC)悬浮液通过超滤来纯化以去除过量的蛋白质和DS，所述超滤使用具有MWCO 100KDa的过滤器以4,500rpm持续20min。获得的聚电解质纳米复合物(PNC)制剂被称为NP4。
实施例7
聚电解质纳米复合物(PNC)制剂NP4的表征
通过使用Zetasizer Nano(Malvern Instruments)的动态光散射(DLS)、通过颗粒尺寸和ζ电位来表征NP4中的聚电解质纳米复合物(PNC)。每个样品测量三次，并且以三次读数的平均值±标准差来报告数据。包封BoNTA的聚电解质纳米复合物(PNC)示出61.2nm的Z颗粒尺寸，具有窄的尺寸分布(PDI＝0.11)。聚电解质纳米复合物(PNC)示出负的表面电荷，其具有-46.7mV的平均ζ电位(图6)。
通过BCA测定来测量NP4中的未被包封的蛋白质的量，并且使用以下公式计算包封效率(EE)：
EE(％)＝(m总-m游离)/m总×100％，
其中m总代表总进料蛋白质的质量并且m游离代表上清液中的游离蛋白的质量。包封效率是98％，并且负载水平是49％。
实施例8
NP4的释放试验及数据分析
使用肉毒杆菌毒素A(BoNTA)进行实验以测试释放概况和可再现性。BoNTA从NP4中的体外释放通过500微升的包含0.5mg蛋白质(BoNTA和HSA)的负载蛋白质的纳米颗粒悬浮液来进行，所述纳米颗粒悬浮液与相同体积的2×PBS混合进入1.5mL的Eppendorf离心管中。将管中的多个样品在37℃在振荡孵育箱(shaker incubator)中以100rpm搅拌。在每个指定的时间点，从孵育箱中获得三个管，并且然后以50,000rcf超速离心持续30min。收集上清液并通过冻干浓缩，并且使用100微升的去离子水进一步重构。采用ELISA测定来定量所释放的毒素的量。观察到BoNTA从NP4中相对快的释放速率，其中约70％的BoNTA在24小时内释放，85％的BoNTA在3天内释放，并且91％的BoNTA在4天内释放(图7)。
实施例9
负载有NP4的微凝胶颗粒制剂1(MP1)
9.1微凝胶颗粒制剂1(MP1)的制备
将聚电解质纳米复合物(PNC，NP4)以0.4mg/mL(可能的范围：0.01mg/mL-10mg/mL，包括0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL和10mg/mL)的总蛋白(神经调节剂+HSA)的浓度分散于在PBS中的5mg/mL(可能的范围：1mg/mL-40mg/mL，包括1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL、31mg/mL、32mg/mL、33mg/mL、34mg/mL、35mg/mL、36mg/mL、37mg/mL、38mg/mL、39mg/mL和40mg/mL)丙烯酸化的透明质酸(acrylatedhyaluronic acid)(HA-Ac，丙烯酸化度5％-20％，包括5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％和20％)中。将预定量的硫醇化的PEG(PEG-SH；浓度范围：4mg/mL-12.8mg/mL，包括4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL和12.8mg/mL)添加到悬浮液中，并且在37℃孵育过夜。将交联的水凝胶进一步加工成微凝胶颗粒(MP)以改善可注射性。微凝胶颗粒可以与9.5％(w/w)海藻糖一起冻干，并且储存在-20℃冷冻器中。这种制剂被称为MP1。
9.2BoNTA从MP1中的释放概况
在已经填充有5mL的PBS的离心管中以0.5mg总蛋白/mL重构MP1。将MP悬浮液在37℃在100rpm搅拌的情况下孵育。在指定的时间点，悬浮液以4,500rpm离心持续10min以沉淀MP1。收集上清液的等分试样(0.5mL)，并且再填充相同量的新制的PBS。然后将离心管放回到孵育箱中。将收集的上清液冻干并且用100mL去离子水重构，随后是ELISA测量。图8示出BoNTA从在PBS中在37℃孵育的MP1(负载在HA水凝胶中的NP4)中的释放概况。如图7中示出的，观察到BoNTA从NP4中相对快的释放速率；而当NP4负载在MP1中时，观察到稍微平缓的释放概况，并且全部的BoNTA在7天内被释放出来(图8)。
9.3从MP1中释放的BoNTA的生物活性
从MP1中释放的BoNTA的生物活性通过先前在实施例5中描述的荧光SNAPtide裂解测定进行。如图9中示出的，释放的BoNTA的释放概况和生物活性保持没有显著变化持续7天。
实施例10
负载有NP1的微凝胶颗粒制剂2(MP2)
10.1微凝胶颗粒制剂2(MP2)的制备
将NP1以0.4mg/mL(可能的范围：0.01mg/mL-10mg/mL，包括0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL和10mg/mL)的总蛋白(神经调节剂+HSA)的浓度分散在PBS中的5mg/mL(可能的范围：1mg/mL-40mg/mL，包括1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL、31mg/mL、32mg/mL、33mg/mL、34mg/mL、35mg/mL、36mg/mL、37mg/mL、38mg/mL、39mg/mL和40mg/mL)的丙烯酸化透明质酸(HA-Ac，丙烯酸化度5％-20％，包括5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％和20％)中。将预定量的硫醇化的PEG(PEG-SH；浓度范围：4mg/mL-12.8mg/mL，包括4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、12.5mg/mL和12.8mg/mL)添加到悬浮液中，并且在37℃孵育过夜。将交联的水凝胶进一步加工成微凝胶颗粒以改善可注射性。微凝胶颗粒可以与9.5％(w/w)海藻糖一起冻干，并且储存在-20℃冷冻器中。这种制剂被称为MP2。
10.2BoNTA从MP2中的释放概况
在已经填充有5mL的PBS的离心管中以0.5mg总蛋白/mL重构MP2。将MP悬浮液在37℃在100rpm搅拌的情况下孵育。在指定的时间点，悬浮液以4,500rpm离心持续10min以沉淀MP2。收集上清液的等分试样(0.5mL)，并且再填充相同量的新制的PBS。然后将离心管放回到孵育箱中。将收集的上清液冻干并且用100μL去离子水重构，随后是ELISA测量。图10示出了BoNTA从在37℃在PBS中孵育的MP2的释放概况。对于来自这种微凝胶颗粒制剂的BoNTA，维持了持续释放概况。
10.3从MP2中释放的BoNTA的生物活性
从MP2中释放的BoNTA的生物活性通过先前在实施例5中描述的荧光SNAPtide裂解测定进行。如图11中示出的，所释放的BoNTA的释放概况和生物活性保持没有显著变化持续7天。
实施例11
微凝胶颗粒制剂3(MP3)：负载在纳米纤维-水凝胶复合物(NHC)中的NP1
11.1微凝胶颗粒制剂3(MP3)的制备
将NP1以0.4mg/mL(可能的范围：0.01mg/mL-10mg/mL，包括0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL和10mg/mL)的总蛋白(神经调节剂+HSA)的浓度分散于在PBS中的5mg/mL(可能的范围：1mg/mL-40mg/mL，包括1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL、31mg/mL、32mg/mL、33mg/mL、34mg/mL、35mg/mL、36mg/mL、37mg/mL、38mg/mL、39mg/mL和40mg/mL)丙烯酸化透明质酸(HA-Ac，丙烯酸化度5％-20％，包括5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％和20％)中，并且10mg/mL[范围：5mg/mL-50mg/mL，包括5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL、31mg/mL、32mg/mL、33mg/mL、34mg/mL、35mg/mL、36mg/mL、37mg/mL、38mg/mL、39mg/mL、40mg/mL、41mg/mL、42mg/mL、43mg/mL、44mg/mL、45mg/mL、46mg/mL、47mg/mL、48mg/mL、49mg/mL和50mg/mL]静电纺丝的聚己内酯纳米纤维片段(electrospun polycaprolactonenanofiber fragment)(纤维直径在0.2μm至2μm的范围内，包括0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、和1.9μm以及2μm；长度在20μm至100μm的范围内，包括20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm和100μm)均匀地悬浮在溶液中。将预定量的硫醇化的PEG(PEG-SH；浓度范围：4mg/mL-12.8mg/mL，包括4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、12.5mg/mL和12.8mg/mL)添加到悬浮液中，并且在37℃孵育过夜。将交联的水凝胶进一步加工成微凝胶颗粒以改善可注射性。微凝胶颗粒可以与9.5％(w/w)海藻糖一起冻干，并且储存在-20℃冷冻器中。该制剂被称为MP3。
11.2BoNTA从MP3中的释放概况
在已经填充有5mL的PBS的离心管中以0.5mg总蛋白/mL重构MP3。将MP悬浮液在37℃在100rpm搅拌的情况下孵育。在指定的时间点，悬浮液以4,500rpm离心持续10min以沉淀MP3。收集上清液的等分试样(0.5mL)，并且再填充相同量的新制的PBS。然后将离心管放回到孵育箱中。将收集的上清液冻干并且用100mL去离子水重构，随后是ELISA测量。图12示出了BoNTA从在37℃在PBS中孵育的MP2的释放概况。对于来自这种微凝胶颗粒制剂的BoNTA，获得了持续释放概况。
实施例12
释放的BoA在Sprague-Dawley大鼠中的靶肌肉中的生物活性和治疗功能
为了测试体内性能，在单次肌肉内注射到Sprague-Dawley大鼠的前肢(趾深屈肌、趾浅屈肌)中之后，测量了NanoTox治疗对肌肉松弛的作用。未包封的BoNTA注射剂(以4U/kg和8U/kg)被用作对照。以这些测试的剂量，在所有接受注射剂的动物中观察到完全的麻痹。对大鼠每周评估前肢的受激握力，并且记录施加的最大力三份，并且该最大力被用于与注射之前测量的基线进行比较，并且以握力恢复的百分比报告。图13比较了两种NanoTox制剂(NanoTox 1和NanoTox 2)以及以4U/kg和8U/kg剂量水平的单次给药BoNTA注射剂的功能恢复率。
在说明书中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献表示本发明公开的主题所属领域的技术人员的水平。所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献在此通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物、专利申请、专利和其他参考文献被具体地和单独地指明通过引用并入。将理解，尽管许多专利申请、专利和其他参考文献在本文中被提及，这样的参考文献并不构成对任何这些文件形成本领域公知常识的部分的承认。
虽然为了清楚理解的目的通过说明和实例的方式相当详细地描述了前述主题，但是本领域技术人员将理解，在所附权利要求的范围内可以进行某些改变和修改。
Claims (71)
1.一种聚电解质纳米复合物(PNC)，包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物，其中所述抗衡离子聚合物具有电荷，所述电荷使所述抗衡离子聚合物能够与所述一种或更多种神经调节剂静电结合。
2.一种纳米颗粒，包含根据权利要求1所述的聚电解质纳米复合物(PNC)和非水溶性的生物可降解聚合物，其中所述聚电解质纳米复合物(PNC)分布在整个所述非水溶性的生物可降解聚合物中。
3.根据权利要求1所述的PNC或根据权利要求2所述的纳米颗粒，其中所述一种或更多种神经调节剂包括梭菌神经毒素的治疗活性衍生物。
4.根据权利要求3所述的PNC或纳米颗粒，其中所述梭菌神经毒素包括肉毒杆菌毒素的治疗活性衍生物。
5.根据权利要求4所述的PNC或纳米颗粒，其中所述肉毒杆菌毒素选自由A型肉毒杆菌毒素、B型肉毒杆菌毒素、包括C1型肉毒杆菌毒素的C型肉毒杆菌毒素、D型肉毒杆菌毒素、E型肉毒杆菌毒素、F型肉毒杆菌毒素和G型肉毒杆菌毒素以及它们的亚型的治疗活性衍生物及其混合物组成的组。
6.根据权利要求5所述的PNC或纳米颗粒，其中所述一种或更多种神经调节剂选自由onabotulinumtoxin A、abobotulinumtoxin A、incobotulinumtoxin A、prabotulinumtoxin A、rimabotulinumtoxin B及其组合组成的组。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的PNC或纳米颗粒，其中所述载体分子包括聚电解质，所述聚电解质选自由阳离子聚合物、蛋白质和多糖组成的组。
8.根据权利要求7所述的PNC或纳米颗粒，其中所述蛋白质选自由IgG、胶原、明胶和血清白蛋白组成的组。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的PNC或纳米颗粒，其中所述载体分子与所述一种或更多种神经调节剂的重量比能够从约1:1至约2000:1变化。
10.根据权利要求9所述的PNC或纳米颗粒，其中所述载体分子与所述一种或更多种神经调节剂的重量比是约500:1。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的PNC或纳米颗粒，其中所述抗衡离子聚合物选自由硫酸葡聚糖(DS)、肝素(硫酸肝素)、透明质酸及其组合组成的组。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的PNC或纳米颗粒，其中所述生物可降解聚合物是选自由聚(L-乳酸)(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、它们的聚乙二醇化的嵌段共聚物、及其组合组成的组的共聚物。
13.根据权利要求12所述的PNC或纳米颗粒，其中所述生物可降解聚合物选自由聚乙二醇(PEG)-b-PLLA、PEG-b-PLGA、PEG-b-PCL及其组合组成的组。
14.根据权利要求13所述的PNC或纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含以下项中的一种：以m:1:1:n的比的onabotulinumtoxin A(BoNTA):载体蛋白:硫酸葡聚糖(DS):PEG-b-PLGA，其中m＝0.0005至1，并且n＝3至10；(BoNTA+载体):DS:PEG-b-PLGA是1:1:5；或者BoNTA:载体是1:1至1:2000。
15.一种微凝胶，包含：
根据权利要求1所述的聚电解质纳米复合物(PNC)或根据权利要求2所述的纳米颗粒，所述聚电解质纳米复合物(PNC)或所述纳米颗粒包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物，其中所述抗衡离子聚合物具有电荷，所述电荷使所述抗衡离子聚合物能够与所述一种或更多种神经调节剂静电结合；以及
交联的亲水性聚合物，其中根据权利要求1所述的聚电解质纳米复合物(PNC)或根据权利要求2所述的纳米颗粒分布在整个所述交联的亲水性聚合物中。
16.根据权利要求15所述的微凝胶，其中所述微凝胶包含根据权利要求1所述的聚电解质纳米复合物(PNC)或根据权利要求2所述的纳米颗粒，其中所述微凝胶具有在从约0至约1的范围内的聚电解质纳米复合物(PNC)与纳米颗粒的重量比率。
17.根据权利要求15所述的微凝胶，其中所述微凝胶包含所述交联的亲水性聚合物与纳米纤维的复合物。
18.根据权利要求17所述的微凝胶，其中所述复合物包含具有小于约200微米的平均长度的多于一根聚己内酯纤维，所述多于一根聚己内酯纤维与所述交联的亲水性聚合物共价地连接。
19.根据权利要求15-17中任一项所述的微凝胶，其中所述交联的亲水性聚合物包括水凝胶。
20.根据权利要求19所述的微凝胶，其中所述水凝胶包括天然的亲水性聚合物或合成的亲水性聚合物，所述天然的亲水性聚合物或合成的亲水性聚合物选自由透明质酸、壳聚糖、肝素、藻酸盐、纤维蛋白、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物、及其共聚物组成的组。
21.根据权利要求20所述的微凝胶，其中所述水凝胶包括交联的透明质酸。
22.根据权利要求15-21中任一项所述的微凝胶，其中所述微凝胶包括具有球形形状或不对称形状的多于一个微凝胶颗粒。
23.根据权利要求22所述的微凝胶，其中所述多于一个微凝胶颗粒具有在从约10μm至约1,000μm的范围内的标称尺寸。
24.根据权利要求15-23中任一项所述的微凝胶，其中所述微凝胶或多于一个微凝胶聚合物具有从约10Pa至约10,000Pa的剪切储能模量。
25.根据权利要求15-24中任一项所述的微凝胶，其中所述微凝胶包含具有在从约20nm至约900nm的范围内的标称尺寸的聚电解质纳米复合物(PNC)。
26.根据权利要求15-24中任一项所述的微凝胶，其中所述PNC或所述纳米颗粒包含选自由聚(L-乳酸)(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、它们的聚乙二醇化的嵌段共聚物、及其组合组成的组的生物可降解聚合物。
27.根据权利要求26所述的微凝胶，其中所述生物可降解聚合物选自由聚乙二醇(PEG)-b-PLLA、PEG-b-PLGA、PEG-b-PCL、及其组合组成的组。
28.根据权利要求26-27中任一项所述的微凝胶，其中所述微凝胶包含具有在从约20nm至约900nm的范围内的标称尺寸的纳米颗粒。
29.根据权利要求15-28中任一项所述的微凝胶，其中所述交联的亲水性聚合物还包含被直接添加到其中的一种或更多种神经调节剂。
30.根据权利要求29所述的微凝胶，其中被直接添加到所述交联的亲水性聚合物中的所述一种或更多种神经调节剂是在所述纳米颗粒或聚电解质纳米复合物(PNC)中的所述一种或更多种神经调节剂的量的分数。
31.根据权利要求30所述的微凝胶，其中被直接添加到所述交联的亲水性聚合物中的所述一种或更多种神经调节剂的所述分数具有从约0至约1的范围。
32.一种用于制备包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)的工艺，所述工艺包括：
(a)将一种或更多种神经调节剂的水溶液和载体分子的水溶液混合，以形成蛋白质溶液；以及
(b)通过快速纳米复合(FNC)工艺将所述蛋白质溶液与抗衡离子聚合物混合，以形成包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)。
33.根据权利要求32所述的工艺，其中所述一种或更多种神经调节剂包括梭菌神经毒素的治疗活性衍生物。
34.根据权利要求33所述的工艺，其中所述梭菌神经毒素包括肉毒杆菌毒素的治疗活性衍生物。
35.根据权利要求34所述的工艺，其中所述肉毒杆菌毒素选自由A型肉毒杆菌毒素、B型肉毒杆菌毒素、包括C1型肉毒杆菌毒素的C型肉毒杆菌毒素、D型肉毒杆菌毒素、E型肉毒杆菌毒素、F型肉毒杆菌毒素和G型肉毒杆菌毒素以及它们的亚型的治疗活性衍生物及其混合物组成的组。
36.根据权利要求35所述的工艺，其中所述一种或更多种神经调节剂选自由onabotulinumtoxin A、abobotulinumtoxin A、incobotulinumtoxin A、prabotulinumtoxin A、rimabotulinumtoxin B及其组合组成的组。
37.根据权利要求32-36中任一项所述的工艺，其中所述载体分子包括聚电解质，所述聚电解质选自由阳离子聚合物、蛋白质和多糖组成的组。
38.根据权利要求37所述的工艺，其中所述蛋白质选自由IgG、胶原、明胶和血清白蛋白组成的组。
39.根据权利要求32-38中任一项所述的工艺，其中所述载体分子与所述一种或更多种神经调节剂的重量比能够从约1:1至约2000:1变化。
40.根据权利要求39所述的工艺，其中所述载体分子与所述一种或更多种神经调节剂的重量比是约500:1。
41.根据权利要求32-40中任一项所述的工艺，其中所述抗衡离子聚合物选自由硫酸葡聚糖(DS)、肝素(硫酸肝素)、透明质酸、及其组合组成的组。
42.根据权利要求32-41中任一项所述的工艺，其中所述包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)具有约20nm至约900nm的Z平均颗粒尺寸，并且具有约0.1至约0.4的尺寸分布(PDI)。
43.根据权利要求32-42中任一项所述的工艺，其中所述包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)具有负的表面电荷，所述负的表面电荷具有约-30mV至约-50mV的平均ζ电位。
44.根据权利要求32-43中任一项所述的工艺，包括约80％至约99％的包封效率。
45.根据权利要求32-44中任一项所述的工艺，包括约10％至约70％的负载水平。
46.根据权利要求32-45中任一项所述的工艺，其中所述包封神经调节剂的聚电解质纳米复合物(PNC)具有约1天至约7天的释放持续时间。
47.一种用于产生多于一个纳米颗粒的工艺，所述工艺包括：
(a)通过使用第一连续混合工艺将一种或更多种神经调节剂和一种或更多种载体分子的预先形成的溶液与抗衡离子聚合物混合来形成聚电解质纳米复合物(PNC)；
(b)使用第二连续混合工艺使所述聚电解质纳米复合物(PNC)与非水溶性的生物可降解聚合物共沉淀；以及
(c)形成多于一个纳米颗粒，其中包含所述一种或更多种神经调节剂、一种或更多种载体分子和抗衡离子聚合物的所述聚电解质纳米复合物(PNC)分布在整个所述非水溶性的生物可降解聚合物中。
48.根据权利要求47所述的工艺，其中步骤(a)和步骤(b)同时进行。
49.根据权利要求47所述的工艺，其中所述第一连续混合工艺包括快速纳米复合(FNC)工艺。
50.根据权利要求47所述的工艺，其中所述聚电解质纳米复合物(PNC)的形成是通过所述一种或更多种神经调节剂与所述抗衡离子聚合物之间的静电吸引。
51.根据权利要求47所述的工艺，其中所述聚电解质纳米复合物(PNC)和所述非水溶性的生物可降解聚合物的混合是通过溶剂诱导的快速纳米沉淀(FNP)。
52.根据权利要求47所述的工艺，其中所述多于一个纳米颗粒的形成通过所述非水溶性的生物可降解聚合物连同所述聚电解质纳米复合物(PNC)一起的沉淀而发生。
53.根据权利要求47-52中任一项所述的工艺，其中所述多于一个纳米颗粒具有约20nm至约900nm的Z平均颗粒尺寸，并且具有约0.1至约0.4的尺寸分布(PDI)。
54.根据权利要求47-53中任一项所述的工艺，其中所述多于一个纳米颗粒具有负的表面电荷，所述负的表面电荷具有约-10mV至约-35mV的平均ζ电位。
55.根据权利要求47-54中任一项所述的工艺，包括约60％至约95％的包封效率。
56.根据权利要求47-55中任一项所述的工艺，包括约2％至约50％的负载水平。
57.根据权利要求47-56中任一项所述的工艺，其中所述多于一个纳米颗粒具有约7天至约180天的释放持续时间。
58.一种用于产生多于一个微凝胶颗粒的工艺，所述工艺包括：
(a)将包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物以及任选的生物可降解聚合物的纳米颗粒或聚电解质纳米复合物(PNC)与水凝胶前体混合；
(b)形成水凝胶，所述水凝胶包含包含一种或更多种神经调节剂、载体分子和抗衡离子聚合物以及任选的生物可降解聚合物的所述纳米颗粒或聚电解质纳米复合物(PNC)；以及
(c)将所述水凝胶机械破碎成多于一个微凝胶颗粒。
59.根据权利要求58所述的工艺，其中所述多于一个微凝胶颗粒具有在从约10μm至1,000μm的范围内的标称尺寸。
60.一种用于治疗疾病或状况的方法，所述方法包括将根据权利要求1-14中任一项所述的纳米颗粒或根据权利要求15-31中任一项所述的微凝胶施用至需要治疗的受试者。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述疾病或状况选自由美容状况、局灶性肌张力障碍、颈肌张力障碍(CD)、慢性流涎和肌肉痉挛组成的组。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述肌肉痉挛与过度活跃的肌肉运动有关，选自由脑瘫，中风后痉挛，脊髓损伤后痉挛，头和颈部、眼睑、阴道、四肢、颚和声带的痉挛，与食道、颚、下尿路和膀胱以及肛门的肌肉相关的肌肉紧缩，以及难治性过度活跃的膀胱组成的组。
63.根据权利要求60所述的方法，其中所述疾病或状况包括肌肉紊乱，所述肌肉紊乱选自由斜视、眼睑痉挛、半面痉挛、婴幼儿型内斜视、由于与成人的中风相关的下肢痉挛引起的受限的踝关节运动以及两岁及更大的儿科患者的下肢痉挛组成的组。
64.根据权利要求60所述的方法，其中所述疾病或状况包括过度出汗。
65.根据权利要求60所述的方法，其中所述疾病或状况选自由头痛、偏头痛、神经病理性疼痛、慢性疼痛、骨关节炎疼痛、关节炎疼痛、过敏症状、抑郁和早泄组成的组。
66.根据权利要求60-65中任一项所述的方法，包括施用所述纳米颗粒或所述微凝胶的两种或更多种制剂，其中所述纳米颗粒或所述微凝胶的所述两种或更多种制剂各自具有不同的释放概况。
67.一种药物组合物，包含根据权利要求1-14中任一项所述的纳米颗粒或根据权利要求15-31中任一项所述的微凝胶以及药学上可接受的载体。
68.一种试剂盒，包括根据权利要求1-14中任一项所述的PNC或纳米颗粒和/或根据权利要求15-31中任一项所述的微凝胶。
69.一种持续释放制剂，包含根据权利要求1-14中任一项所述的PNC或纳米颗粒或者根据权利要求15-31中任一项所述的微凝胶，其中所述制剂在软组织中提供有效浓度的所述一种或更多种神经调节剂持续在约3天至约200天之间的时间段。
70.一种用于治疗疾病或状况的方法，所述方法包括施用持续释放制剂，所述持续释放制剂包含根据权利要求1-14中任一项所述的PNC或纳米颗粒或者根据权利要求15-31中任一项所述的微凝胶，所述方法包括通过注射来局部施用所述持续释放制剂，其中所述一种或更多种神经调节剂在从约3天至约200天的时间段内从所述持续释放制剂中释放，从而在2周至40周内以可测量的效果治疗疾病或状况。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述疾病或状况选自由美容状况、局灶型肌张力障碍、颈肌张力障碍(CD)、慢性流涎和肌肉痉挛组成的组。
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