CN116892064A - 一种微生物单细胞基因组学测序文库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于单细胞测序领域,公开了一种微生物单细胞基因组学测序文库的构建方法,其包括以下步骤:1)对微生物单细胞进行裂解;2)加入扩增反应混合物,进行全基因组扩增;3)加入片段化试剂,获得片段化扩增产物;4)加入微珠和扩增反应混合物,对片段化反应产物进行条形码化标记,以此获得构建微生物单细胞全基因组测序文库的原材料。使用本发明设计的转座酶复合体接头序列与建库方式,得到的有效文库分子能够兼容Illumina二代测序仪,并且能够和其他样本文库混样测序,大大降低测序成本。
Description
技术领域
本发明属于单细胞测序领域,具体涉及一种微生物单细胞基因组学测序文库的构建方法。
背景技术
随着测序技术的日趋成熟、分析技术的快速提升以及测序成本的不断降低,对微生物群的研究逐渐深入。目前针对微生物的研究中,主要包括扩增子测序、宏基因组测序和新兴的微生物单细胞基因组测序。微生物多样性扩增子测序是一种利用高通量测序技术对16S、18S、ITS等微生物特征序列进行PCR扩增并测序分析的研究方法,其中16S rDNA(即16SrRNA gene)应用较多。宏基因组测序技术,是研究环境或人体等样本中所有以DNA为基因组的微生物遗传物质的技术,它的发展开启了微生物研究的新时代。这种技术不依赖微生物分离培养,可直接对环境样本中的核酸进行检测,分析微生物群落、以及微生物与宿主之间的相互关系。宏基因组研究以环境中所有微生物的基因组为研究对象,通过对环境样本中的全基因组DNA进行高通量测序,获得单个样本的饱和数据。而单微生物基因组测序技术,能够从复杂的微生物群落中获得菌株分辨基因组,并对其全基因组进行扩增和条形码化,实现对单微生物的高通量测序。该技术不再基于提取的环境微生物总DNA对微生物展开研究,而是需要在复杂的环境样本中实现微生物细胞的分离,其能够解决主流微生物测序方法 16S 扩增子测序无法用于病毒基因组测序以及参考序列数据库不完整的弊端,将在传统测序方法的基础上进一步推动微生物领域对未知菌株的开发。但已有的单微生物基因组测序文库构建方法得到的文库分子结构比较特殊,无法常规兼容Illumina二代测序仪,无法与其他样本文库一起混样测序,大大增加了测序的成本。
发明内容
本发明提供了一种微生物单细胞基因组学测序文库的构建方法。该方法能够提高微生物单细胞全基因组扩增的质量以及基因组的纯度和测序覆盖率,使用本发明设计的转座酶复合体接头序列与建库方式,得到的有效文库分子能够兼容Illumina二代测序仪,并且能够和其他样本文库混样测序,降低测序成本。
本发明所提供的微生物单细胞基因组学测序文库的构建方法,包括:1) 将微生物单细胞分配至单一分区,获得多个包含有至多一个微生物细胞的独立分区,在分区内进行微生物单细胞的裂解;2) 在包含微生物单细胞基因组的分区内加入扩增反应混合物,进行微生物单细胞的全基因组扩增;3) 在包含微生物单细胞全基因组扩增产物的分区内加入片段化试剂,获得片段化扩增产物;4) 在包含片段化扩增产物的分区内加入珠子和扩增反应混合物,对片段化扩增产物进行条形码化标记,以此获得构建微生物单细胞全基因组测序文库的原材料。
具体地,第一方面,提供了一种微生物单细胞分离与裂解的方法。将微生物单细胞分配至单一分区,获得多个包含有至多一个微生物细胞的独立分区,在分区内进行微生物单细胞的裂解。
在一些实施方案中,所述分区为微液滴。优选地,使用微流控装置将单个微生物细胞与细胞裂解试剂封装为油包水乳液内的液滴,并在液滴内对细胞进行裂解,以得到包含有至多一个细胞基因组DNA的多个液滴。
在一些实施方案中,所述微生物单细胞的裂解方法为酶裂解法。
在一些实施方案中,所述裂解酶选自Labiase裂解酶、溶葡球菌酶、鸡蛋蛋白来源溶菌酶、人源溶菌酶、或消化肽酶等。
在一些实施方案中,所述酶裂解法的试剂可包括溶葡球菌酶(lysostaphin,Sigma)、溶酶菌(lysozyme, prepGEM Bacteria)、Green+ buffer(prepGEM Bacteria)和prepGEM(prepGEM Bacteria)。
在一些实施方案中,所述酶裂解程序为37℃,30 min;75℃,10 min,95℃ 5 min;4℃,+∞。
第二方面,提供了一种微生物单细胞全基因组扩增的方法。在包含裂解后微生物单细胞基因组的分区内加入扩增反应混合物,进行微生物单细胞的全基因组扩增。
在一些实施方案中,所述分区为微液滴。优选地,使用微流控装置将包含至多一个微生物细胞基因组DNA的多个液滴与包含扩增反应混合物的多个液滴按照一定比例进行融合,并在融合后的液滴内进行微生物全基因组的扩增。
在一些实施方案中,优选地,所述液滴融合比例为1:1。
在一些实施方案中,所述全基因组扩增方法选自MDA (Multiple displacementamplification)、PTA(Primary Template-directed Amplification)、MALBAC (MultipleAnnealing and Looping-Based Amplification Cycles)、或者LIANTI (Linearamplification via transposon insertion)。
第三方面,提供了一种微生物单细胞全基因组扩增产物片段化的方法。在包含微生物单细胞全基因组扩增产物的分区内加入片段化试剂,获得片段化扩增产物。
在一些实施方案中,所述分区为液滴。优选地,使用微流控装置将包含至多一个微生物细胞扩增后全基因组的多个液滴与包含片段化反应试剂的多个液滴按照一定比例进行融合,并在融合后的液滴内进行微生物基因组的片段化反应。
在一些实施方案中,优选地,所述液滴融合比例为1:1。
在一些实施方案中,所述片段化反应方法为酶切法。
在一些实施方案中,所述酶切法使用一种转座酶,插入到微生物单细胞基因组扩增产物中,并将其片段化。
在一些实施方案中,所述转座酶是自组装的。所述用于转座酶组装的接头组合包括ME-C序列(5'- GTTACAGAGGCTGCAGATGTGTATAAGAGACAG -3')、ME-B序列(5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'),以及ME-reverse序列(5'-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-NH2-3')。
第四方面,提供了一种微生物单细胞片段化基因组的条形码化标记方法。在包含片段化扩增产物的分区内加入珠子和扩增反应混合物,对片段化扩增产物进行条形码化标记,以此获得构建微生物单细胞全基因组测序文库的原材料。
在一些实施方案中,所述分区为微液滴。优选地,使用微流控装置将包含至多一个微生物细胞片段化基因组DNA的多个液滴与包含扩增反应混合物和至多一个微珠的多个液滴按照一定比例进行融合,并在融合后的液滴内进行片段化分子的条形码化标记。
在一些实施方案中,优选地,所述液滴融合比例为1:1。
在一些实施方案中,所述微珠包含与之连接的多个核酸条形码分子,所述同一微珠上的核酸条形码分子具有相同的碱基序列或者相同的包含非N的简并碱基符号的碱基序列作为条形码(barcode)序列,其中N为任意可与天然核酸进行碱基配对的随机核苷酸。
在一些实施方案中,所述微珠为不可降解的聚丙烯酰胺凝胶珠子。
在一些实施方案中,所述珠子与所述多个核酸条形码分子之间的连接是通过光(如UV)切割的。
每种条形码微珠上连接的核酸条形码序列不同。使得同一个小滴中的片段化扩增产物均来自同一个单细胞,且连接相同的核酸条形码分子;即不同的小滴中的片段化扩增产物均来自不同的单细胞,且连接不同的核酸条形码分子,使得测序时得以标记区分。
所述片段化试剂所用的转座酶复合体的组装是经过设计的,将常规转座酶复合体的ME-A序列替换为ME-C序列,所述微珠上连接的核酸条形码分子结构组成为5'-TruseqR1-barcode-和/或UMI-C sequence-3',其中UMI序列不是必需的,使用所述微珠上的核酸条形码分子序列对片段化产物进行条形码化标记后构建的文库可以混样测序,降低测序成本。
在一些实施方案中,其进一步包括打破液滴以回收纯化液滴内的单细胞条形码化标记分子产物。
在一些实施方案中,所述纯化方法选自磁珠纯化法、柱纯化法、切胶纯化法。
在一些实施方案中,所述打破液滴所用的试剂为含1% 全氟辛醇的氟化油HFE-7500。
在一些实施方案中,其进一步包括使用含有index标签的接头引物扩增条形码化标记分子,将分子两端带上能够结合在测序芯片上的P5/P7序列、用于结合测序引物的R1SP/R2 SP序列、和能够区分不同样本的index标签序列。
在一些实施方案中,其进一步包括对标签扩增后得到的产物进行片段纯化或分选的操作,以获得微生物单细胞全基因组的有效测序文库。所述有效测序文库能够兼容Illumina二代测序仪,并且进行混样测序,降低测序成本。
附图说明
通过附图说明,将会更加充分地描述本申请内容的上述和其他特征。这些附图仅描绘了本申请内容的若干实施方式,因此不应认为是对本申请内容范围的限定。通过采用附图,本申请将会得到更加明确和详细地说明。
图1是本发明中一种微生物单细胞基因组学测序文库构建方法的流程示意图。
图2是两种微生物单细胞基因组学测序文库构建的流程图对比。
图3是微生物单细胞全基因组扩增的荧光图像,其中图像中为绿色荧光的液滴即为包封有单个微生物细胞并进行了全基因组扩增的液滴。
图4不同转座酶投入量下基因组片段化产物的扩增结果的bioanalyzer 2100分析图。
图5自组装酶与Nextera转座酶片段化产物的扩增结果的bioanalyzer 2100分析图。
图6是微生物单细胞基因组条形码化标记的液滴图像。
图7是未经磁珠分选的测序文库的bioanalyzer 2100分析图。
图8是经磁珠分选后的测序文库的bioanalyzer 2100分析图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
本发明提供了一种微生物单细胞基因组学测序文库的构建方法。该方法能够提高微生物单细胞全基因组扩增的质量以及基因组的纯度和测序覆盖率, 使用本发明设计的转座酶复合体接头序列与建库方式,得到的有效文库分子能够兼容Illumina二代测序仪,并且能够和其他样本文库混样测序,降低测序成本。
本发明所提供的微生物单细胞基因组学测序文库的构建方法,包括:1) 将微生物单细胞分配至单一分区,获得多个包含有至多一个微生物细胞的独立分区,在分区内进行微生物单细胞的裂解;2) 在包含微生物单细胞基因组的分区内加入扩增反应混合物,进行微生物单细胞的全基因组扩增;3) 在包含微生物单细胞全基因组扩增产物的分区内加入片段化试剂,获得片段化扩增产物;4) 在包含片段化扩增产物的分区内加入珠子和扩增反应混合物,对片段化扩增产物进行条形码化标记,以此获得构建微生物单细胞全基因组测序文库的原材料。
在一些实施方案中,所述分区为微液滴。优选地,如图1所示,一种微生物单细胞基因组学测序文库的构建方法流程包括:1) 使用微流控装置将单个微生物细胞与细胞裂解试剂封装为油包水乳液内的水性液滴,并在液滴内对细胞进行裂解,以得到包含有至多一个细胞基因组DNA的多个液滴;2) 使用微流控装置将包含至多一个微生物细胞基因组DNA的多个液滴与包含扩增反应混合物的多个液滴按照一定比例进行融合,并在融合后的液滴内进行微生物全基因组的扩增;3) 使用微流控装置将包含至多一个微生物细胞扩增后全基因组的多个液滴与包含片段化反应试剂的多个液滴按照一定比例进行融合,并在融合后的液滴内进行微生物基因组的片段化反应;4) 使用微流控装置将包含至多一个微生物细胞片段化基因组DNA的多个液滴与包含扩增反应混合物和至多一个微珠的多个液滴按照一定比例进行融合,并在融合后的液滴内进行片段化分子的条形码化标记,以获得构建微生物单细胞全基因组测序文库的原材料。如图2(A)、(B)分别为使用本专利方法组装的转座酶复合体进行文库构建和使用常规转座酶复合体进行文库构建的流程图。使用常规转座酶复合体构建的文库分子无法进行Illumina二代测序仪的混样测序,增加了测序成本。
实施例1 微生物单细胞基因组的获得与全基因组扩增
本实施例利用液滴微流控装置将单个细胞封装在液滴内进行生物反应,实现微生物单细胞的高通量分离。
微流控装置的制备
为了制造微流体装置,将聚(二甲基硅氧烷)(道康宁,Sylgard 184)倾倒在使用UV光刻在硅晶片(University Wafer)上图案化的负光致抗蚀剂(MicroChem,目录号SU-83025)上。将PDMS装置在烘箱中固化4小时,用金属刮刀萃取,并用0.7mm打孔器打孔以产生微流道入口和出口。使用氧等离子体清洁剂(Harrick Plasma)处理PDMS装置后将装置粘合到玻璃载片上,并在60℃下烘烤至少4h使得装置紧密键合在玻璃片上。用Aquapel(PPGIndustries)处理通道,并在60℃下烘烤10分钟以使其疏水。
细胞悬液的制备
将LB液体培养基培养后的单克隆大肠杆菌及枯草芽孢杆菌各取500 μL,1:1混匀,10 000 g,4℃离心5 min。离心完成后,弃900 μL上清,加入900 μL PBS缓冲液清洗细菌,并轻轻用枪头将细菌吹打混匀,再次10000 g,4℃离心5 min。重复上述清洗步骤2次,结束后弃900 μL上清,加入900 μL PBS缓冲液重新悬浮细菌,并轻轻用枪头将细菌吹打混匀。通过在显微镜下手动细胞计数测定细胞浓度,并稀释至合适浓度以进行单细胞封装。细胞悬液在进行下一步反应前在4℃或者冰盒上保存。
单细胞的裂解
细胞悬浮液:将细胞计数后计算的细胞溶液体积转移至1.5mL离心管(生工生物)中,并在总的细胞悬液体积中加入15%的微生物悬浮液添加剂(optiprep),涡旋混匀,得到细胞悬浮液。配制完成的细胞悬浮液在进行下一步反应前在4℃或者冰盒上保存。
细胞裂解液:按照表1所示的微生物裂解试剂配方,在1.5 mL离心管中配制320 μL细胞裂解液,涡旋混匀。配制完成的细胞裂解液在进行下一步反应前在4℃或者冰盒上保存。
微流体包封细胞与裂解液:将配制完成的细胞悬浮液、细胞裂解液和具有表面活性剂的HFE-7500氟化油(3M)装入单独的3mL注射器(BD)中,并分别以60、240、400 μL/hr的流速注入微流体装置中。将乳液收集在提前放有约50μL矿物油的PCR管中,并通过移液枪去除乳液下部的氟化油,加入具有更高浓度的表面活性剂的HFE-7500氟化油,在4℃孵育5min后通过移液枪去除部分氟化油使得乳液和氟化油的总体积在50μL及以下。将PCR管放入PCR仪中,按照表2所示的裂解程序对细菌细胞进行裂解。裂解后的乳液在进行下一步反应前在4℃保存。
表1 微生物裂解试剂配方
试剂名称 | 品牌 | 用量(μL) |
Green+ buffer | prepGEM Bacteria | 5 |
Lysozyme | prepGEM Bacteria | 0.5 |
Prepgem | prepGEM Bacteria | 0.5 |
Lysostaphin | Sigma | 0.5 |
Bovine Serum Albumin | Thermofisher | 1 |
Nuclease-Free Water | Thermofisher | 32.5 |
Total | 40μL |
表2 裂解程序
微生物单细胞全基因组的扩增
细胞裂解后乳液:去除PCR管中乳液顶部的矿物油以及乳液底部的氟化油,用移液枪和低吸附枪头将乳液小心转移至放有含表面活性剂的氟化油的3 mL注射器中。
扩增反应混合物:按照表3所示的MDA扩增反应混合物体系,在1.5 mL离心管中配制100 μL扩增反应混合物,涡旋混匀。配制完成的扩增反应混合物在进行下一步反应前在4℃或者冰盒上保存。
表3 MDA扩增反应混合物体系
试剂名称 | 用量(μL) |
10x Phi29 DNA polymerase buffer | 16 |
dNTP mix(2.5mM) | 2 |
BSA(20mg/ml) | 2 |
Phi29 DNA polymerase | 8 |
random primer(100uM) | 1.25 |
Nuclease-Free Water | 70.75 |
Total | 100μL |
其中,random hexamer序列为5'- d(NNNNNN) -3' -P。
微流体包封细胞裂解物和扩增反应混合物:将配制完成的扩增反应混合物、和具有表面活性剂的HFE-7500氟化油(3M)装入单独的3mL注射器(BD)中,在微流控装置中,首先形成油包封扩增反应混合物的液滴,然后通过电极使得包含细胞裂解物的液滴与包封有扩增反应混合物的液滴按照一定比例进行融合。将乳液收集在提前放有约50μL矿物油的PCR管中,并通过移液枪去除乳液下部的氟化油,加入具有更高浓度的表面活性剂的HFE-7500氟化油,在4℃孵育5min后通过移液枪去除部分氟化油使得乳液和氟化油的总体积在50μL及以下。将PCR管放入PCR仪中,按照表4所示的扩增程序对细胞裂解物进行全基因组扩增。扩增后的乳液在进行下一步反应前在4℃保存。
另外,需要可视化微生物单细胞全基因组扩增结果时,可在MDA扩增体系中加入1XEVAGREEN,使用1X EVAGREEN对扩增后的DNA产物进行染色并在荧光显微镜下成像,如图3所示。
表4 MDA扩增程序
实施例2 微生物单细胞全基因组的片段化与条形码化标记
转座酶复合体的组装及活性测定
已有方法中使用的珠子所连接的多个核酸条形码分子的序列结构为:5'-TruseqR1-barcode-UMI-Nextera R1-3',对应使用的片段化转座酶为Illumina市售的Nextera转座酶,最终得到的测序文库结构为:5'-P5-index2-Truseq R1-barcode-UMI-Nextera R1 --- DNA Insert --- Nextera R2-index1-P7-3'。当文库分子P5端同时存在两种R1测序引物(Truseq R1 primer和Nextera R1 primer)的结合位点时,文库无法兼容Illumina二代测序仪的正常运行,可以通过更换测序试剂使得试剂中只有Truseq R1 primer,但此方法导致文库无法和其他文库进行混样测序,会大大增加测序成本。
而本发明中用于组装的接头序列是重新设计的,使用的微珠上所连接的多个核酸条形码分子的序列结构为:5'-Truseq R1-barcode-UMI-Nextera RC-3', 最终得到的测序文库结构为:5'-P5-index2-Truseq R1-barcode-UMI-Nextera RC --- DNA Insert ---Nextera R2-index1-P7-3'。其中Nextera RC和Nextera R1序列是不同的,因此避免了文库P5端同时出现两种R1测序引物结合位点的情况。
相比现有接头:使用本发明设计的接头序列与建库方式,得到的有效文库分子能够兼容Illumina二代测序仪,并且能够和其他样本文库混样测序,不用包flow cell测序或用户自定义更换测序试剂,大大降低了测序成本。
用于转座酶组装的接头组合包括ME-C序列、ME-C序列和ME-reverse序列。ME-reverse序列分别与ME-C、ME-B退火,形成部分ME部分双链的C接头和B接头,其中B接头与目前市售的Illumina Nextera转座酶上B接头一致。
用于组装的接头序列:
ME-C序列:5'- GTTACAGAGGCTGCAGATGTGTATAAGAGACAG -3'
ME-B序列:5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3';
ME-reverse序列:5'-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-NH2-3'。
接头制备:
生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述ME-C、ME-B和ME-reverse序列,使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司TruePrep Tagment Enzyme(S601-01)进行转座酶的自组装。
使用Annealing Buffer将ME-C、ME-B和ME-reverse溶解至10uM。将ME-C和ME-reverse等体积混合、ME-B和ME-reverse等体积混合,振荡混匀并短暂离心,置于PCR仪中,进行表5所示的反应程序。反应结束后,将两个反应等体积混合,即为制备好的接头混合物。
表5 接头制备程序
温度(℃) | 时间 | 循环数 |
75 | 15 min | 1 |
60 | 10 min | 1 |
50 | 10 min | 1 |
40 | 10 min | 1 |
25 | 30 min | 1 |
转座酶组装:
在灭菌PCR管中依次添加表6所示的反应组分,并使用移液器轻轻吹打20次充分混匀,将反应置于30℃下反应1h,反应产物即为组装后的转座酶复合体。
表6 转座酶组装反应体系
试剂名称 | 用量(μL) |
TruePrep Tagment Enzyme (500 ng/μl) | 4 |
接头混合物 | 7 |
Coupling Buffer | 39 |
Total | 50μL |
酶活性验证:
按照表7所示在PCR管中配制片段化反应体系,涡旋混匀,置于55℃下10min进行片段化反应。对片段化产物进行扩增,所得扩增产物进行bioanalyzer 2100检测,如图4所示。图4A)、B)、C)、D)分别是片段化体系1、3、4、5产物的PCR结果,随着体系中转座酶量的增加,底物DNA被打断所得的片段越短。
表7 片段化反应体系
实验组 | 体系1 | 体系3 | 体系4 | 体系5 |
ddH2O | 6.4ul | 4.4ul | 3.4ul | 2.4ul |
5x Tagment buffer L | 2ul | 2ul | 2ul | 2ul |
MDA纯化产物(50ng/ul) | 0.6ul | 0.6ul | 0.6ul | 0.6ul |
转座酶复合体 | 1ul | 3ul | 4ul | 5ul |
总计 | 10ul | 10ul | 10ul | 10ul |
自组装转座酶活性与市售Illumina Nextera转座酶做对比:在同一片段化体系中,加入等量的自组装转座酶或Illumina Nextera转座酶进行片段化反应,然后进行片段化产物扩增,对扩增产物进行bioanalyzer 2100检测,如图5所示。图5A)和C)、B)和D)分别是等量转座酶下两者的片段化后扩增结果。自组装转座酶活性与市售Illumina Nextera转座酶活性基本一致。
实施例3 微生物单细胞全基因组的片段化反应
MDA后乳液:去除PCR管中乳液顶部的矿物油以及乳液底部的氟化油,用移液枪和低吸附枪头将乳液小心转移至放有含表面活性剂的氟化油的3 mL注射器中。
片段化反应试剂:按照表8所示的片段化反应体系,在1.5 mL离心管中配制90 μL片段化反应混合物,涡旋混匀。配制完成的扩增反应混合物在进行下一步反应前在4℃或者冰盒上保存。
表8 片段化反应混合物体系
试剂名称 | 用量(μL) |
5x 片段化缓冲液 | 24 |
转座酶复合体 | 12 |
BSA(20mg/ml) | 1.8 |
Nuclease-Free Water | 52.2 |
Total | 90μL |
微流体包封全基因组扩增产物和片段化反应混合物:将配制完成的片段化反应混合物、和具有表面活性剂的HFE-7500氟化油(3M)装入单独的3mL注射器(BD)中,在微流控装置中,首先形成油包封片段化反应混合物的液滴,然后通过电极使得包含单细胞全基因组扩增产物的液滴与包封有片段化反应混合物的液滴按照一定比例进行融合。将乳液收集在提前放有约50μL矿物油的PCR管中,并通过移液枪去除乳液下部的氟化油,加入具有更高浓度的表面活性剂的HFE-7500氟化油,在4℃孵育5min后通过移液枪去除部分氟化油使得乳液和氟化油的总体积在50μL及以下。将PCR管放入PCR仪中,55℃反应10min以对基因组扩增产物进行片段化。片段化后的乳液在进行下一步反应前在4℃保存。
实施例4 单细胞基因组片段化反应产物的条形码化标记
片段化后乳液:去除PCR管中乳液顶部的矿物油以及乳液底部的氟化油,用移液枪和低吸附枪头将乳液小心转移至放有含表面活性剂的氟化油的3 mL注射器中。
珠子:4℃取出连接有多个核酸条形码分子的珠子,用DNA buffer清洗3次后,5000g离心1min,去除上清。使用注射器将珠子转移至PE2管中备用。连接在珠子上的核酸条形码分子序列结构包括5'端用于连接测序接头的引物序列(Truseq R1)、条形码序列、分子标签序列以及3'端用于扩增片段化产物的接头序列。
扩增反应混合物:按照表9所示的预扩增反应混合物体系,在1.5 mL离心管中配制280 μL预扩增反应混合物,涡旋混匀。配制完成的扩增反应混合物在进行下一步反应前在4℃或者冰盒上保存。
表9 预扩增反应混合物体系
试剂名称 | 用量(μL) |
2x 预扩增缓冲液 | 200 |
扩增引物(10uM) | 16 |
BSA(20mg/ml) | 4 |
Nuclease-Free Water | 60 |
Total | 280μL |
微流体包封片段化反应产物、珠子和预扩增反应混合物:将配制完成的预扩增反应混合物、和具有表面活性剂的HFE-7500氟化油(3M)装入单独的3mL注射器(BD)中,在微流控装置中,首先形成油包封扩增反应混合物和至多一个珠子的液滴,然后通过电极使得包含片段化反应产物的液滴与包封有珠子和预扩增反应混合物的液滴按照一定比例进行融合。将乳液收集在提前放有约50μL矿物油的PCR管中,并通过移液枪去除乳液下部的氟化油,加入具有更高浓度的表面活性剂的HFE-7500氟化油,在4℃孵育5min后通过移液枪去除部分氟化油使得乳液和氟化油的总体积在50μL及以下。将PCR管放入PCR仪中,按照表10所示的扩增程序对单细胞基因组片段化反应产物进行扩增和条形码化标记,以得到单细胞测序文库。条形码化标记后的乳液在进行下一步反应前在4℃保存,乳液在显微镜下的成像如图6所示。
表10 预扩增反应程序
实施例5 微生物单细胞基因组测序文库的构建
单细胞基因组条形码化产物的回收:用移液枪小心去除PCR管顶部的矿物油和底部的氟化油,然后向PCR管中加入100μL回收剂(含1% PFO的HFE-7500),涡旋30s,掌上离心机离心1min,可明显看到液滴被打破,溶液被分为上层内容物和下层氟化油两层。用移液枪小心去除底部的氟化油,然后将上层内容物转移至带有滤芯的离心管中,10000xg离心5min,通过滤膜去除内容物中的珠子,回收DNA产物。
单细胞基因组条形码化产物的纯化:向上述回收的DNA产物中加入1X磁珠,涡旋混匀,室温孵育5min使DNA结合到磁珠上;瞬时离心后,置于磁力架上,静置3min左右使溶液变澄清后,小心移除上清;保持样品始终处于磁力架上,加入200μL新鲜配制的80%乙醇溶液漂洗磁珠,室温孵育30s,小心移除上清;重复漂洗步骤一次,共计两次;保持样品始终处于磁力架上,室温开盖干燥磁珠约3-5min;将样品从磁力架上取出,加入适量DNA elutionbuffer,涡旋振荡或使用移液枪充分吹打混匀,室温静置2min;将样品放回磁力架上静置3min待溶液澄清后,小心吸取上清至一个新的无核酸酶离心管中。使用Qubit仪定量纯化后的DNA浓度。
单细胞基因组条形码化产物的文库标签扩增:使用含有index标签的P5和P7扩增引物扩增条形码化标记分子,以获得微生物单细胞全基因组的测序文库。使用0.5X+0.3X磁珠对上述文库进行片段纯化以去除引物或引物二聚体。使用Qubit仪定量纯化后的DNA浓度。使用安捷伦2100生物分析仪和高灵敏度DNA芯片定量文库分子,如图7是未经磁珠分选的文库的bioanalyzer分析图,图8是经磁珠分选后的文库的bioanalyzer分析图。将文库送二代测序。
Claims (16)
1.一种微生物单细胞基因组学测序文库的构建方法,所述方法包括:
1)单细胞裂解:将微生物单细胞分配至单一分区,获得包含有至多一个微生物细胞的独立分区,在独立分区内进行微生物单细胞的裂解;
2)全基因组扩增:在1)所述裂解后的分区内加入基因组扩增反应混合物,进行微生物单细胞的全基因组扩增;
3)片段化反应:在2)所述扩增后的分区内加入片段化试剂,获得片段化产物;
4)条形码标记:在3)所述片段化反应后的分区内加入微珠和扩增反应混合物,对片段化产物进行条形码化标记,以此获得构建微生物单细胞全基因组测序文库的原材料;
所述片段化试剂所用的转座酶复合体的组装是经过设计的,将常规转座酶复合体的ME-A序列替换为ME-C序列,所述微珠上连接的核酸条形码分子结构组成为5'-Truseq R1-barcode-和/或UMI-C sequence-3',使用所述微珠上的核酸条形码分子序列对片段化反应产物进行条形码化标记后构建的文库可以混样测序,降低测序成本。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述分区选自微孔板、微液滴、微凝胶中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述的裂解的方法是酶裂解法。
4.根据权利要求3所述的方法,所述酶裂解法选择的试剂包括溶葡球菌酶、溶酶菌、Green+ buffer和prepGEM。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述全基因组扩增的方法选自MDA、PTA、MALBAC、LIANTI中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述微珠包含与之连接的多个核酸条形码分子,所述微珠上的核酸条形码分子具有相同的碱基序列或者相同的包含非N的简并碱基符号的碱基序列作为条形码序列,其中N为任意可与天然核酸进行碱基配对的随机核苷酸。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述转座酶复合体为自组装的,其接头组合包括ME-C序列、ME-B序列以及ME-reverse序列,所述ME-C序列代替常规转座酶复合体的ME-A序列。
8.根据权利要求7所述的方法,所述ME-C序列5'- GTTACAGAGGCTGCAGATGTGTATAAGAGACAG -3',ME-B序列为5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3',ME-A序列为5'- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG -3',ME-reverse序列为5'-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-NH2-3'。
9.根据权利要求2所述的方法,当所述分区为微液滴时,包括:
1) 单细胞裂解:使用微流控装置将单个微生物细胞与细胞裂解试剂封装为油包水乳液内的水性液滴,并在液滴内对细胞进行裂解,以得到包含有至多一个细胞基因组DNA的多个液滴;
2) 全基因组扩增:使用微流控装置将包含至多一个微生物细胞基因组DNA的多个液滴与包含扩增反应混合物的多个液滴按照一定比例进行融合,并在融合后的液滴内进行微生物全基因组的扩增;
3) 片段化反应:使用微流控装置将包含至多一个微生物细胞扩增后全基因组的多个液滴与包含片段化反应试剂的多个液滴按照一定比例进行融合,并在融合后的液滴内进行微生物基因组的片段化反应;
4) 条形码标记:使用微流控装置将包含至多一个微生物细胞的片段化基因组DNA的多个液滴与包含扩增反应混合物和至多一个微珠的多个液滴按照一定比例进行融合,并在融合后的液滴内进行片段化分子的条形码化标记。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述液滴融合比例为1:1。
11.根据权利要求9所述的方法,其中4)还包括通过UV切割释放连接在微珠上的核酸条形码分子至融合后的液滴,以进行片段化分子的条形码化标记。
12.根据权利要求11所述的方法,其进一步包括打破液滴以回收纯化液滴内的单细胞条形码化标记分子产物。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述纯化的方法选自磁珠纯化法、柱纯化法或切胶纯化法。
14.根据权利要求12所述的方法,其进一步包括使用含有index标签的接头引物扩增条形码化标记分子,将分子两端带上能够结合在测序芯片上的P5/P7序列、用于结合测序引物的R1 SP/R2 SP序列和能够区分不同样本的index标签序列。
15.根据权利要求14所述的方法,其进一步包括对标签扩增后得到的产物进行片段纯化或分选的操作,以获得微生物单细胞全基因组的有效测序文库。
16.根据权利要求15所述的方法,所述有效测序文库能够兼容Illumina二代测序仪,并且进行混样测序。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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