CN1168832C - 修饰pcr扩增引物的应用及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种修饰的PCR扩增引物，引物对至少其一的5′末端增加了一段独特标示序列。本发明还提供了一种PCR扩增产物检测方法，该方法包括：制备m对本发明所述的引物，其中所述独特标示序列的数量为m×n，其中m为靶片段数量，n为样品份数；从而可在同一检测系统中根据标示序列检测不同样品中的不同扩增产物。本发明还提供了用于实施以上方法的试剂盒。

Description

修饰PCR扩增引物的应用及其试剂盒

                           发明领域

本发明主要涉及PCR扩增；尤其是PCR扩增产物的检测及其商品化的工具。

                           发明背景

PCR(Polymerase Chain Reaction)是聚合酶链反应技术的英文缩写，是基因扩增技术的一次重大飞跃，该技术1985年由美国PE公司遗传部的Kary B Mullis教授发明。PCR技术首先应用于人β-珠蛋白DNA扩增及镰刀状红细胞贫血症的产前诊断。由于此项技术可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测到单分子或每10万个细胞中仅含1个靶DNA分的样品，因而，此技术在短短的几年内就广泛的应用于分子生物学、医学、微生物学、遗传学等领域。

PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶(如Tag酶等)的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分三步：①变性(denaturation)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。②退火(annealling)：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补复性的机会较少。③延伸(extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷之磷酸底物及Mg²⁺存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制。决定PCR扩增特异性的引物是由人工合成的一段寡核苷酸。在反应的最初阶段，原来的DNA起着起始模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介异延伸的片段急剧地增多而成为主要模板。因此，绝大多数扩增产物将受到所加引物5′末端的限制，最终扩增产物是介于两种引物5′端之间的DNA片段。对于扩增产物的分析通常采用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，根据扩增产物的片段大小来判断扩增结果，也有其它分析扩增结果的方法。有关PCR技术及其应用可参阅以下文献：①《聚合酶链反应》；(美)穆里斯(K B Mullis)等著，陈受宜等译。北京：科学出版社，1997；②丁振若、苏明权主编《临床PCR基因诊断技术》，世界图书出版西安公司，1998。

但在目前的PCR方法中，从样品的扩增到PCR产物的分析检测，每个样品都必须分别独立进行。这种模式使得PCR扩增产物的检测效率低、操作繁锁。

                           发明目的

本发明的目的在于提供实现在同一检测系统中对多样品中多目标片段的PCR扩增产物进行检测的方法和工具。

                           技术发案

本发明目的是通过以下方案达到的。

本发明提供一种修饰的PCR扩增引物，引物对至少其一的5′末端增加了一段标示序列；该标示序列呈线性，长度为5-50个碱基，以15-25个为佳。

本发明还提供了一种PCR扩增产物检测方法，该方法包括：

1)制备m对本发明所述的修饰引物，其中所述标示序列的数量为m×n，其中m为靶片段数量，n为样品份数；各标示序列彼此不同，且不相互杂交，各标示序列与待扩增片段既不相同也不杂交。

2)用该修饰引物进行PCR扩增；

3)分离去除游离引物；

4)混合扩增产物；

5)检测标示序列。

本发明还提供了用于实施以上方法的试剂盒，其中包括：

分装于合适容器内的本发明所述修饰引物；

固定于固相支持物上的识别探针阵列，所述的识别探针可与所述标示序列或其互补序列特异性杂交；

以及说明书，其中说明，通过用所述引物所得靶片段扩增产物与所述识别探针阵列杂交来检测扩增片段。

本发明的修饰引物包括基本引物和加于5′末端的修饰部分即标示序列，基本引物根据模板DNA的序列，按通用的引物设计原则来设计(可参阅专著：《聚合酶链反应》；(美)穆里斯(K B Mullis)等著，陈受宜等译。北京：科学出版社，1997；)，也可以利用商业软件或从Internet网上下载专用的软件(如：primerpremier4.0)来设计引物对。本发明所述的修饰在于：其中至少一条基本引物的5端加有一段前文所述的标示序列。本发明引物的合成完全按照常规方法进行。

在如本发明所述检测多样品中多片段扩增产物时，本发明的标示序列是用来标记各份样品中各目标核酸片段的一段独特核苷酸序列。即在同一次分析中，对于某份样品中的某一特定目标核酸，只有唯一的标示序列与之对应。为了保证PCR扩增的如常进行，各标示序列彼此不杂交，且不与待扩增片段杂交。此外，为了避免假阳性，以上独特标示序列与任一靶片段的序列不相同。根据样品数量、每个样品中目标核酸片段的数目、序列、需要获取的信息类型就可以确定所需独特标示序列的数量。而由于4种核苷酸与不同序列长度排列组合的无穷性，很容易实现所述数量的独特性要求。例如，有n份不同来源的样品，各有m种不同靶序列，则需要m×n种独特标示序列。本发明所述的多份样品可以是来自不同来源和/或代表不同的反应体系。

由于本发明的标示序列对于PCR扩增反应本身没有影响，因此，本发明的PCR过程完全参照常规进行。

为了避免游离引物造成假阳性，需要将扩增产物与游离的过量引物分离。本发明已知的多种方法均可采用。例如电泳法(参加《现代分子生物学实验技术》，卢圣东主编；《第四届全国毛细管电泳及相关微分离学术报告会论文集》等)，层析法(参加《分子克隆实验指南》等)，以及利用配体亲和力进行的分离。例如，可利用生物素和链亲和素的亲和作用设计固定化的捕获探针，将扩增产物捕获分离。具体方法如下：设计并合成一段序列与靶序列所在链互补的捕获探针，并用生物素标记，将其加入含链亲合素包裹磁珠的溶液中反应一定时间，形成捕获体。将各样品扩增产物变性并混合后加入含捕获体的杂交缓冲液中，在适当温度下保温一定时间，然后用磁分离器分离磁珠即可获得含靶序列的扩增产物混合物，小心吸净管中溶液，然后用3倍体积的适宜缓冲液(如3xSSC缓冲液)清洗磁珠三次。最后向管中加入适宜体积的纯水或预杂交缓冲液，在高于杂交体解链温度(Tm)10℃的温度下保温5分钟，以释放含靶序列的各扩增产物。也可以用链亲和素包壁的微量离心管代替链亲和素包裹的微磁珠来实现上述目的。还可以利用抗原和抗体之间，以及其它受体与配体之间的亲和作用代替生物素和链亲合素实施以上分离。

采用适当的方法分析扩增产物的标示序列，就可以将各样品的扩增产物混合后，在同一检测系统中测知各个样品中各种目标核酸片段的存在情况。可用的分析方法有例如：质谱法(参见：O’Donnell M.J.，Tang K，等，Analytical Chemistry，1997，69：2438-2443)，SPR(参见：Threil A.J.等，Analytical Chemistry，1997，69：4948-4956)以及固相杂交法。其中较好的分析方法是用固相杂交方法同时分析全部被测样品中目标核酸扩增产物的标示序列，包括以下步骤：

制备识别探针，并有序固定在固相支持物上形成阵列；

标记所述扩增产物；

所述扩增产物与识别探针固相杂交；

检测所述标记的位置和/或强度。

识别探针含有一段与标示序列或其互补序列基本互补或可特异性杂交的核酸序列。为了简化过程，实现在统一的杂交系统中完成来自多份样品的多种核酸扩增产物与各自识别探针的固相杂交，同时提高检测的准确性，不同识别探针与其互补序列形成的杂交体在方法选定的杂交条件下应具有相同或相近的解链温度。由于一定长度核酸序列中四种碱基的排列组合方式非常多，这使得本发明的扩增引物中标示序列的设计有非常大的选择余地，本领域技术人员根据现有技术不难做成这样的选择。

识别探针的制备方法与扩增引物相同。实施本发明时需要将识别探针有序固定在某种固相支持物上。所说固相支持物包括但不限于各种尼仑膜、硝酸纤维素膜、滤纸、经修饰的玻璃或硅片、云母片等。固定支持物和方法均为本领域的公知技术。

如果采用固相杂交法进行检测，需要先将扩增产物变性。变性PCR扩增产物也是本领域的常规技术。例如，通常可以将扩增产物加热至94～98℃，并保温2-15min，然后迅速置冰上。也可用碱变性然后中和的方法。

在如本发明所述对于多样品或多来源多目标分析时，各份样品的扩增产物可以先混合，然后一起变性，也可以先各自变性，然后再混合。

为了进行本发明的分析，可用本领域已知的各种标记技术对扩增产物进行标记。可以在本发明所述引物的5′端连接标记基团，所述标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)，生物素分子(Bio)，荧光基团(如：Cy3，Cy5等)，碱性磷酸酶(AP)，辣根过氧化物酶(HRP)。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术。也可以在目标核酸的扩增过程中标记扩增产物。例如可以采用引物标记法，也可以采用掺入法等，可参阅文献(王申五主编《基因诊断技术-非放射性操作手册》一书)。所述的标记包括但不限于同位素标记，以及荧光物质(如Cy3，Cy5，荧光素等)、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等非放射性物质标记。

将分离出来的含标示序列的扩增产物混合物加至一定体积的预杂交缓冲液中，作为固相杂交缓冲液。固相杂交时，可先将识别探针组成的阵列与预杂交缓冲液在一定温度下进行一定时间的预杂交，当然也可以根据情况不预杂交；然后在一定温度下与固相杂交缓冲液进行一次一定时间的固相杂交操作。然后，根据标记信号在固相支持物上的位置、强度等信息获取多份被测样品中的多种目标核酸片段有关序列、含量、来源等信息。

本发明所用的固相杂交操作都是本领域的经典方法，本领域一般技术人员依据经验很容易确定有关缓冲液、探针和样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者，也可参照，王申五主编《基因诊断技术-非放射性操作手册》一书。

                            发明效果

本发明用含一段标示序列的扩增引物，代替常规的扩增引物来区别标记待测的各种目标核酸片段。这样，通过一次PCR扩增和一次固相杂交，使用一种检测标记，就可以实现一次性检测多样品中的多目标核酸扩增产物，同时获取核酸片段序列、来源、多态性，和含量等多方面信息。此外，本发明的试剂盒极大地方便了方法的使用者。因此，本发明推动PCR扩增方法在多样品多目标核酸分析中的应用。尤其适合生物芯片的开发与应用。

                            附图说明

图1是实施例一的检测结果。

图2是实施例二的检测结果。

                          优选实施方式

以下实施例是对本发明更详细的说明，而不是对本发明范围的限定。

                            实施例一

              三个样品中同一目标核酸片段的扩增分析

在本实施例中，前文所述的样品份数n等于3，靶片段数量m等于1。＿＿材料：

                                     购自：

pGEM 4Z质粒                         上海生工生物工程公司

dNTP(N＝A，T，C，G)                 上海生工生物工程公司

Tag酶(包括10×buffer)               上海生工生物工程公司

MgCl₂(25mM                         上海生工生物工程公司

DIG-dUTP                            Roche Inc

链亲合素包裹的磁珠                  Roche Inc

DIG核酸检测试剂盒(包括抗DIG-AP复合

物，封闭剂，NBT/BCIP)               Roche Inc

EasyHyb杂交液                       Roche Inc

尼龙膜                              Roche Inc

Bio-Rad真空点样系统                 Bio-Rad Laboratories Inc

                                    自配：

20×SSC                    88.2g/L柠檬酸钠，175.3g/L NaCl，pH7.0(20℃)

洗膜缓冲液I                2×SSC，0.1％SDS

洗膜缓冲液II               0.1×SSC，0.1％SDS

显色缓冲液I                0.1M顺丁烯二酸，1M NaCl，pH7.5(20℃)

显色缓冲液II               含1％封闭剂的显色缓冲液I

显色缓冲液III              100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mM MgCl₂，

                           pH9.5(20℃)

显色缓冲液IV               10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0(20℃)

磁珠结合缓冲液             100mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM NaCl，pH7.5

磁珠洗涤缓冲液             10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl，pH7.5

1.样品的制备

取pGEM 4Z(1μg/μl)质粒5μl置0.2ml微量离心管中，依次加入BamH I内切酶的10×缓冲液5μl，乙酰化BSA5μl，H₂O 34μl和BamH I内切酶1μl混匀，37℃保温2.5小时；然后将酶切产物中加5μl NaAc溶液(3mol/L，pH5.2)混匀，加入-20℃乙醇110μl混匀，-20℃放置1小时。12000g离心5min，弃去上清，晾干，加入H₂O 100μl，得线性pGEM 4Z溶液。本实施例以此线性化的pGEM 4Z质粒作为有待检测的靶序列片段。

取三支微量离心管分别记为Y1(即样品1)，Y2和Y3。其中的组成分别为

样品号        组成

Y1            1μl片段线性pGEM 4Z溶液+9μlH₂O

Y2            10μlH₂O

Y3            0.8μl线性pGEM4Z溶液+9.2μlH₂O

2.引物的设计和制备：

以前文所述线性化pGEM 4Z质粒为模板，按照常规设计基本扩增引物。然后，如本发明前文所述，为每份样品中的目标核酸片段设计独特的标示序列。将该标示序列置于基本引物之一(P1)的5′端，构成完整的本发明扩增引物。其中，下标表示用于不同的样品，序列中带下划线的是标示序列：

引物1(P1)：

P11：5′ ATATAGGTATGGATTAGGATGTAGTGCTCTTGCCCGGCGTCAATA 3′

P12：5′ AATTGGAATTGAGTATAGGGGATTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATA 3′

P13：5′ AGGTATAGGTATAGGTATAGGTATTGCTCTTGCCCGGCGTCAATA 3′

引物2(P2)：

P2    5’GATGCTGAAGATCAGTTGGGTGC 3’

将以上设计的引物用DNA合成仪分别合成1OD，向每种引物中加入100μlH₂O，振摇使溶解，加适量水，调整引物溶度为2.5μM。

3.捕获探针的设计和制备：

按要求为靶序列片段的扩增产物设计捕获探针：

5′Bio-TTTTTTTTTGGTTACATCGAACTGGATCTC 3′

将设计好的捕获探针用DNA合成仪合成1 OD，并加适量水溶液使终浓度为2.5μM。

4.识别探针的设计和制备：

根据引物P1₁，P1₂，P1₃中所含标示序列设计可与之杂交的识别探针如下：

T1：5′CTACATCCTAATCCATACCTATAT 3’

T2：5′AATCCCCTATACTCAATTCCAATT 3’

T3：5′ATACCTATACCTATACCTATACCT 3’

将设计好的识别探针分别用DNA合成仪合成1OD，并加适量水溶解，使终浓度为250μM。

5.靶序列的扩增：

取三支0.2ml薄壁微量离心管，各试管中加入：

试管编号	样品来源	引物1(P1)	引物2(P2)
				1	Y1   0.5μl	P11  5μl	5μl  P2
2	Y2   0.5μl	P12  5μl
			3	Y3   0.5μl	P13  5μl

然后向三支试管中加入相同的PCR扩增系统，组成如下：dATP(2mM)5μl，dCTP(2mM)5μl，dGTP(2mM)5μl，dTTP(2mM)4.8μl，DIG-dUTP(1mM)0.2μl，10×buffer(pH8.6-8.7)5μl，MgCl₂(25mM)5μl，Tag酶(2.5U)0.5μl，加水至50μl混匀，按下述程序在Bio-Rad的Therm Cycle^TM扩增仪上扩增：94℃，5min；(94℃，45S；55℃，45S；72℃，1min)×35；72℃，5min。

将各扩增管溶液混合，置98℃变性10min，迅速置冰上，备用。

6.磁珠捕获扩增产物，

吸取链亲合素包裹的磁珠(1mg/ml)10μl，置0.2ml离心管中，用磁分离器分离，弃去上清液，用200μl结合缓冲液洗磁珠三次。将磁珠悬浮于190μl结合缓冲液中，加入捕获探针(2.4μM)30μl，混匀，室温静置30min，分离磁珠，弃上清，用40μl洗涤液洗磁珠3次，5×SSC 40μl洗1次，分离磁珠，弃上清，然后向磁珠管中加入5×SSC 50μl和15μl混合变性扩增产物，室温杂交捕获30min分离磁珠，用40μl洗涤缓冲液洗三次，40μl H₂O洗一次，然后将磁珠悬浮于10μl H₂O中，98℃保温10min，取出迅速分离磁珠，吸取上清液加入50μl EasyHyb溶液中，混匀备用。

7.识别探针的点样。

将尼龙膜在双蒸水中浸湿。

将湿的尼龙膜置于真空点样器上，拧紧紧固螺丝，确保各样品孔间不会产生交叉渗漏。

在每一点样孔中加入0.5mlTE缓冲液，真空抽尽溶液后关闭真空泵。

分别吸取每种识别探针溶液1μl分置于3支0.5ml微量离心管中，各加入0.4mol/L NaOH，10mmol/L EDTA溶液至终体积为100μl。然后，如图1所示，分别将上述溶液全部加入相应的点样孔，形成3×4的矩阵，每种识别探针点1排，每排为代表4次平行实验的4点。打开真空泵至溶液刚好抽干关闭泵。

每孔再加0.2ml 0.4mol/L NaOH，10mmol/L EDTA溶液，真空抽干后关闭泵。

使系统连通大气后，拆下点样器，取出膜在2×SSC缓冲液中浸一下，在空气中凉干，然后置80℃烘烤1小时，备用。

8.固相杂交：

将固定有各识别探针的尼龙膜置于大小适当的塑料袋中。

向袋中加入1ml EasyHyb缓冲液，然后35℃水浴保温5min。

将袋剪去一角，倾出预杂交液。

向袋中加入捕获分离的扩增产物的EasyHyb溶液。

将袋置35℃水浴中保温1小时。

取出袋，剪去一角，倾出探针溶液。

向袋中加入等量适量的洗膜缓冲液I，室温洗膜30min。

倾出洗膜缓冲液I，再向袋中加入等量适量的洗膜缓冲液II，洗膜30min。

9.显色：

将袋剪开，取出膜作上标记，按以下步骤显色：

在适量显色缓冲液I中洗膜1min。

在适量显色缓冲液II中室温放置30min。

用显色缓冲液II以1∶5000比例稀释Anti-DIG-AP复合物溶液(取0.5μl抗DIG-AP复合物+2.5ml显色缓冲液II)。

将膜置上述溶液中室温放置30min。

将膜置适量显色缓冲液I中洗2次，每次15min。

将膜置适量显色缓冲液III中平衡2min。

取20μl NBT/BCIP贮备液加至1ml显色缓冲液III中，混匀。

将膜置于上述新鲜配制的1ml显色液中暗处放置至显出斑点为止，勿振摇。

将膜取出，置适量显色缓冲液IV中1min以终止反应。

将膜拍照，凉干保存。

10.结果

如附图1所示，其中，第一排为识别探针T1，识别加入样品Y1的引物P1₁。此排杂交阳性，说明样品Y1扩增后产物阳性。第二排为识别探针T2，识别加入样品Y2的引物P1₂。此排杂交阴性，说明样品Y2未发生可测扩增。第三排为识别探针T3，识别加入样品Y3的引物P1₃。此排杂交阳性，说明样品Y3扩增后产物阳性。以上试验结果与已知情况完全吻合。

                         实施例二

二个样品中乙肝病毒DNA P区基因片段和Pre C区基因片段的同时检测

在本实施例中，前文所述的样品份数n等于2，靶片段数量m等于2。

材料：

同实施例一，但还需以下试剂：

1.裂解液(K蛋白酶10mg/ml，10mM Tris-HCl(pH7.8)，10mM EDTA，2％SDS)

2.酚/氯仿/异戊醇(体积比：25∶24∶1)

3.预冷100％乙醇

4.预冷75％乙醇

1.样品的制备：

分别取100μl乙肝病人血清两份，记为Y1和Y2，加300μl裂解液，60℃保温2小时；加入400μl酚/氯仿/异戊醇，充分震荡混匀，13000转/秒离心10分钟，取上清液300μl加800μl预冷100％乙醇，混匀后于-70℃静置40分钟。13000转/秒离心15分钟后弃去上清，用200μl预冷75％乙醇清洗沉淀，然后离心弃去上清，沉淀风干后用20μl无菌水溶解，备用。

2.引物的设计和制备：

如实施例1所述，为两个样品中乙肝病毒(HBV)DNA的P区基因片段和Pre C区基因片段设计如下扩增引物，其中的下标数字代表样品来源即样品编号，下标字母表示该引物对应的模板：

引物1(P1)编号    序列

Y1中的P区

P1_1P             5′- ATGGATTAGGATGTAGCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC-3′

Y1中的Pre C区

P1_1PC            5′- TTGAGTATAGGGGATTAGGAGTTGGGGGAGGAGATT-3′

Y2中的P区

P1_2P             5′- GTATAGGTATAGGTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC-3′

Y2中的Pre C区

P1_2PC            5′- TGGTAATGGTAATGGTAGGAGTTGGGGGAGGAGATT-3′

引物2(P2)：       序列

P区的P2_P         5′-GGTAAAAAGGGACTCAAGATG-3′

Pre C区的P2_PC    5′-TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT-3′

以上，下划线表示标示序列所在，共16个核苷酸。将以上设计的引物用DNA合成仪分别合成1OD，向每种核酸探针中加入适量水振摇使溶解，调整引物溶度为10pmol/μl。

3.捕获探针的设计和制备：

如实施例1所述，分别为乙肝病毒DNA的P区和Pre C区基因片段的扩增产物设计捕获探针(D1和D2)：

P区-D1：        Bio-5′-TTTTTTTTTGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGA-3′

Pre C区-D2：    Bio-5′-TTTTTTTTTGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACT-3′

将设计好的二个捕获探针用DNA合成仪各合成1 OD，并加适量水溶液使终浓度为2.5μM。

4.识别探针的设计和制备：

根据引物P1_1P，P1_1PC，P1_2P，P1_2PC中所含标示序列设计可与之杂交的识别探针如下：

T1_P：    5′-CTACATCCTAATCCAT-3′

T1_PC：    5′-AATCCCCTATACTCAA-3′

T2_P：     5′-ATACCTATACCTATAC-3′

T2_PC：    5′-ACCATTACCATTACCA-3′

将设计好的识别探针分别用DNA合成仪合成1 OD，并加适量水溶解，使终浓度为500μM，然后加等体积的6×SSC缓冲液。

5.靶核酸的扩增：

取两支0.2ml薄壁微量离心管，各试管中加入：

试管编号	样品来源	引物1(P1)	引物2(P2)
				1	Y1，3μl；	P11p，2μl；P11pc，2μl；	P2p，2μl；P2pc，2μl；
2	Y2，3μl	P12p，2μl；P12pc，2μl；

然后向三支试管中加入相同的PCR扩增系统，组成如下：dATP(2.5mM)3μl，dCTP(2.5mM)3μl，dGTP(2.5mM)3μl，dTTP(2.5mM)2.8μl，DIG-dUTP(1mM)0.2μl，10×缓冲液(pH8.6-8.7)3μl，MgCl₂(25mM)3μl，Tag酶(2.5U)1μl，加水至30μl混匀，按下述程序在Bio-Rad的Therm Cycle TM扩增仪上扩增：94℃，5min；(94℃，30s；45℃，30s；72℃，30s)×35；72℃，5min。

将各扩增管溶液混合，置98℃变性10min，迅速置冰上，备用。

6.磁珠捕获扩增产物，

吸取链亲合素包裹的磁珠(1mg/ml)10μl，置0.2ml离心管中，用磁分离器分离，弃去上清液，用200μl结合缓冲液洗磁珠三次。将磁珠悬浮于180μl结合缓冲液中，加入两种捕获探针D1和D2(2.5μM)各20μl，混匀，室温静置30min，分离磁珠，弃上清，用40μl洗涤缓冲液洗磁珠3次，5×SSC 40μl洗1次，分离磁珠，弃上清，然后向磁珠管中加入5×SSC 50μl和15μl混合变性扩增产物，室温杂交捕获30min，分离磁珠，用40μl洗涤缓冲液洗三次，40μl H₂O洗一次，然后将磁珠悬浮于10μl H₂O中，98℃保温10min，取出迅速分离磁珠，吸取上清液加入40μl 6.2×SSC溶液中，混匀备用。

7.识别探针的点样。

用排针蘸取各识别探针溶液点在预先洗干净的载玻片上，每种探针重复4次。将点好的载玻片用8W紫外灯(最好是将载玻片倒扣在紫外分析仪的窗口上)照射30分钟，然后置沸水中浸15秒，取出晾干。

8.固相杂交：

1)向90μl变性的混合扩增产物溶液中加入30μl 20×SSC缓冲溶液混匀，取20μl加至识别探针微阵列上，小心盖上盖玻片，不要有气泡，在湿盒中25℃杂交1小时。取出载玻片，用2×SSC，0.1％SDS缓冲液冲掉盖玻片，然后将载玻片迅速置于2×SSC，0.1％SDS缓冲液中室温洗10min，然后再置于0.1×SSC缓冲液中洗5min，取出，晾干。

9.显色：

1)用显色缓冲液II以1∶5000比例稀释Anti-DIG-AP复合物溶液(取0.5μ1抗DIG-AP复合物+2.5ml显色缓冲液II)。

2)取20μl上述溶液加至识别探针微阵列上，小心盖上盖玻片，不要有气泡，室温放置30min。

3)将载玻片用适量显色缓冲液I洗2次，每次1min。

4)将载玻片用适量显色缓冲液III平衡2min。

5)取20μl NBT/BCIP贮备液加至1ml显色缓冲液III中，混匀。

6)取一块面积略大于微阵列的尼龙膜置于上述新鲜配制的1ml显色液中浸透，取出漓干，然后将载玻片上的微阵列反扣在膜上暗处放置至显出斑点为止。

7)将膜置适量显色缓冲液IV中1min以终止反应。

8)将膜拍照，凉干保存。

10.结果

如图2所示，第一排为探针T1_p，识别标示序列引物P1_1p；第二排为探针T1_pc，识别标示序列引物P1_1pc；第三排为探针T2_p，识别标示序列引物P1_2p；第四排为探针T2_pc，识别标示序列引物P1_2pc。结果显示杂交均呈阳性，由此判断样品Y1和Y2都同时含有HBV DNA的P区基因片段和Pre C区基因片段。而且，一式四份平行试验具有良好的重复性。表明检测结果与已知的实际情况完全吻合。

                         实施例三

二个样品中乙肝病毒DNA P区基因片段和Pre C区基因片段的同时检测

本实施例与实施例二不同之处在于修饰引物5′端的标示序列长度为6个核苷酸

1.引物的设计和制备：

引物1(P1)编号        序列

Y1中的P区

P1_1P             5′- ATGTAGCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC-3′

Y1中的Pre C区

P1_1PC            5′ GGGATTAGGAGTTGGGGGAGGAGATT-3′

Y2中的P区

P1_2P             5′ AGGTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC-3′

Y2中的Pre C区

P1_2PC            5′- AATGGTAGGAGTTGGGGGAGGAGATT-3′

引物2(P2)：       序列

P区的P2_P         5′-GGTAAAAAGGGACTCAAGATG-3′

Pre C区的P2_PC    5′-TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT-3′

将以上设计的引物用DNA合成仪分别合成1OD，向每种核酸探针中加入适量水振摇使溶解，调整引物溶度为10pmol/μl。

2.识别探针的设计和制备：

根据引物P1_1P，P1_1PC，P1_2P，P1_2PC中所含标示序列设计可与之杂交的识别探针如下：

T1_P：      5′-ACCTTGCTACAT-3′

T1_PC：     5′-ACTCCTAATCCC-3′

T2_P：      5′-ACCTTGATACCT-3′

T2_PC：     5′-ACTCCTACCATT-3′

将设计好的识别探针分别用DNA合成仪合成1 OD，并加适量水溶解，使终浓度为500μM，然后加等体积的6×SSC缓冲液。

由于识别探针较短，固相杂交的温度应调整为20℃，其他操作、条件、样品、材料等均与实施例二相同。所得结果与实施例二类似。

                         实施例四

二个样品中乙肝病毒DNA P区基因片段和Pre C区基因片段的同时检测

本实施例与实施例二不同之处在于修饰引物5’端的标示序列为50mer。

1.引物的设计和制备：

引物1(P1)编号       序列

Y1中的P区           5′-

P1_1P               AAGCTACGTACGGAACTTAACTTGATGTCTCTAAGCACGTTATCGATACTCAAGGTATGTTGC

                    CCGTTTGTCC-3′

Y1中的Pre C区       5′-

P1_1PC              CCAATAGAGCACCCGGTGAACAAATAAATCAACGGCAAAACATCTGTATAAGGAGTTGGGGGA

                    GGAGATT-3′

Y2中的P区           5′-

P1_2P               TTCTGCTGCCTCTACTCGCCATCATTTGTTTCCACAGTATTAATACAAGACAAGGTATGTTGC

                    CCGTTTGTCC-3′

Y2中的Pre C区       5′-

P1_2PC              CACCGTTTCAGGTTACATTAAAGATCTATTGCGATATGATTGCGGTTAGCAGGAGTTGGGGGA

                    GGAGATT-3′

引物2(P2)：        序列

P区的P2_P           5′-GGTAAAAAGGGACTCAAGATG-3′

Pre C区的P2_PC      5′-TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT-3′

将以上设计的引物用DNA合成仪分别合成1OD，向每种核酸探针中加入适量水振摇使溶解，调整引物溶度为10pmol/μl。

4.识别探针的设计和制备：

根据引物P1_1P，P1_1PC，P1_2P，P1_2PC中所含标示序列设计可与之杂交的识别探针如下：

T1_P：   5’-AGTATCGATAACGTGCTTAGAGACATCAAGTTAAGTTCCGTACGTAGCTT-3’

T1_PC：  5′-TATACAGATGTTTTGCCGTTGATTTATTTGTTCACCGGGTGCTCTATTGG-3′

T2_P：   5′-TCTTGTATTAATACTGTGGAAACAAATGATGGCGAGTAGAGGCAGCAGAA-3′

T2_PC：  5′-GCTAACCGCAATCATATCGCAATAGATCTTTAATGTAACCTGAAACGGTG-3′

将设计好的识别探针分别用DNA合成仪合成1 OD，并加适量水溶解，使终浓度为500μM，然后加等体积的6×SSC缓冲液。

由于识别探针较长，固相杂交的温度应调整为50℃，其他操作、条件、样品、材料等均与实施例二相同。所得结果与实施例二类似。

                            实施例五

                             试剂盒

本试剂盒是用于扩增检测12个水溶液样品中是否会含有pGEM 4Z的。本试剂盒应贮存于4℃。

本试剂盒的组成：

1.14支扩增管：

取14支扩增管，分别编号。其中，1-12号管为样品扩增管，第13号为阳性对照扩增管，第14号为阴性对照扩增管。每管分别含有引物P1_1-14和引物P2以及10×缓冲液，dATP，dCTP，dGTP，dTTP，dUTP-Cy5，Mg²⁺，Tag酶，H₂O等组成的扩增系统。

2.阳性对照管：

含5μl 1ng/μl的线性pGEM 4Z质粒。

3.含捕获探针的磁珠溶液.

含10μl 1mg/ml结合有生物素标记捕获探针的链亲合素包壁磁珠。

4.洗涤缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl，pH7.5

5.杂交缓冲液：5×SSC，20mM磷酸缓冲液，5×Denhardt氏溶液，1.0％硫酸葡聚糖，100ug/ml变性的鲑鱼精DNA片段。

6.识别探针阵列：

在载玻片上由十二个识别探针和1个阳性对照识别探针1个阴性识别探针组成的2×7的微阵列。

7.试剂盒使用说明书：

使用本试剂盒时，还需要使用者自备以下材料：

30×SSC：132.3g/L柠檬酸钠，263.0g/L NaCl，pH7.0(20℃)；

10％SDS；

盖玻片。

1.样品中目标核酸的扩增：

取12份样品分别标为1号，2号……12号，每支管吸取5 μl分别加至对应管号的扩增管中，混匀。另取阳性对照5μl加至13号管中，再加5μl H₂O至14号管中作为阴性对照，按以下程序扩增：94℃，5min；(94℃，45s；55℃，45s；72℃，1min)×35；72℃，5min。

2.扩增产物的捕获：

将各扩增产物混合后98℃保温10min，迅速置冰上，吸取70μl加至含磁珠溶液的管中，加30×SSC缓冲液10μl，轻轻摇匀，室温放置30min，然后用磁珠分离器分离磁珠，弃上清，并用120μl洗涤缓冲液洗3次，120μl H₂O洗1次，最后将磁珠悬浮于30μl H₂O中，98℃保温10min，迅速分离磁珠。小心吸取全部上清液加入10μl 20×SSC杂交缓冲液中。

3.固相杂交：

将上述杂交溶液加至识别探针微阵列上，小心盖上盖玻片，不要有气泡，在湿盒中35℃杂交1小时。取出载玻片，用2×SSC，0.1％SDS缓冲液冲掉盖玻片，然后将载玻片迅速置于2×SSC，0.1％SDS缓冲液中室温洗10min，然后再置于0.1×SSC缓冲液中洗5min，取出，晾干。

4.检测：

将载玻片置于激光共聚焦扫描仪的平台上，在合适的条件下检测杂交产生的荧光信号。根据阳性信号和阴性信号是否正常判定检测的可信度，根据荧光信号的位置来判定1号-12号样品中所含pGEM 4Z质粒的情况。

Claims (7)

1.一种检测PCR扩增产物的方法，该方法包括：

1)制备m对修饰的PCR扩增引物，所述的修饰在于引物对中至少其一的5′末端增加一段标示序列，该标示序列呈线性，长度为5-50个碱基，其中所述标示序列的数量为m×n，其中m为靶片段数量，n为样品份数，各标示序列彼此不同，且不相互杂交，各标示序列与待扩增片段既不相同也不杂交；

2)用所述引物进行PCR扩增；

3)分离去除游离引物；

4)混合扩增产物；

5)检测标示序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰的PCR扩增引物的长度为15-25个碱基。

3.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括：制备识别探针，并有序固定在固相支持物上形成阵列，所述识别探针含有一段与标示序列或其互补序列基本互补的核酸序列；标记所述扩增产物；变性扩增产物；并通过固相杂交法检测标示序列。

4.一种用权利要求1所述方法检测PCR扩增产物的试剂盒，其中包括：

分装于容器内的修饰的PCR扩增引物，所述的修饰在于引物对中至少其一的5′末端增加一段标示序列，该标示序列呈线性，长度为5-50个碱基；

固定于固相支持物上的识别探针阵列，所述的识别探针含有与所述标示序列或其互补序列基本互补的核酸序列；

以及说明书，其中说明用所述修饰的PCR扩增引物扩增靶片段，通过所得扩增产物与所述识别探针阵列杂交来检测扩增片段。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述修饰的PCR扩增引物的长度为15-25个碱基。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其中还包括：固定有捕获探针的磁珠溶液，所述捕获探针与目标扩增片段特异性杂交。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，所述的磁珠为结合有生物素标记捕获探针的链亲合素包壁磁珠。

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