CN116875709A

CN116875709A - 一种炭疽芽孢杆菌检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒

Info

Publication number: CN116875709A
Application number: CN202210522069.5A
Authority: CN
Inventors: 康洁; 刘建礼; 金鑫浩; 贾欣月; 张瑜; 高静; 蔡亦梅; 范东雨; 任鲁风
Original assignee: Beijing Linke Biotechnology Co ltd; Beijing Integrated Biosystems Co ltd
Current assignee: Beijing Linke Biotechnology Co ltd; Beijing Integrated Biosystems Co ltd
Priority date: 2022-05-13
Filing date: 2022-05-13
Publication date: 2023-10-13

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种炭疽芽孢杆菌检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本发明提供的引物探针组合物检测炭疽芽孢杆菌，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。本发明利用微流控芯片技术，通过集核酸提取、纯化、扩增和检测为一体的方式，解决病原体快速检测的问题，实现“样本进‑结果出”的POCT检测方案，取样后直接加入设备，纯化加扩增，60分钟内出结果。

Description

一种炭疽芽孢杆菌检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种炭疽芽孢杆菌检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。

背景技术

炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是一种棒状的革兰氏阳性菌，是炭疽病的病原体。炭疽病是我国法定的乙类传染病，这种细菌通常以内孢子形态出现在土壤中，人因为接触受污染的动物或接触被感染动物污染的土壤导致炭疽病。另一种重要的感染途径就是以气溶胶方式散布的炭疽芽孢能够同时大面积污染空气、水源、食物。临床上主要为皮肤炭疽，还有肺炭疽和肠炭疽，重时可继发败血症、炭疽芽孢杆菌性脑膜炎，人群普遍易感。如果及时进行积极、合理的治疗，几乎所有的皮肤炭疽患者都可存活，吸入性炭疽患者超过50％可以存活，消化道炭疽患者60％可以存活。因此对环境样品中的炭疽孢子进行定量分析对于准确检测和预防感染至关重要。

炭疽芽孢杆菌基因组大小约182kb，所有的炭疽芽孢杆菌都只带两个质粒。炭疽芽孢杆菌的主要致病因子都是质粒编码的，其中包括pXO1的约181kb环状结构与pXO2的93kb的环状结构。炭疽毒素有3个成分的基因，cya、lef和pag都位于质粒pXO1上。

目前检查病原体的病原学检测操作复杂、耗时长、灵敏度低，且不能用于疾病的早期诊断。实时荧光定量PCR技术是目前应用最广泛的用于病原体筛查的分子检测法，即实现了对病原体核酸的定量，又具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等特点。本发明采用TaqMan 实时荧光定量PCR，设计了特异性引物和探针，用于pXO1质粒上pag基因鉴定致病性炭疽芽孢杆菌菌株。

对于病原体的核酸检测，市场现有检测系统或方法通常需要在检测前进行样品处理，本申请人基于该问题，经过数年研发，与在先前申请CN202110057507.0中公开了一种新型现场化快速核酸扩增检测仪CarryOn P1000Q，该设备为“手持全自动封闭式核酸qPCR分析系统”，可在60分钟内完成新冠病毒的现场自动化核酸检测，能够实现“样品进，结果出”的快速检测。本申请即在该技术的基础上，进一步研发出的，能够更好的配合该设备的试剂类发明，即炭疽芽孢杆菌的微流控芯片试剂盒。

现有的检测试剂盒及方法较操作时间长，且操作步骤繁琐，因此，亟需提供一种灵敏度高、特异性强、覆盖面广、操作简便、省时且节约成本的炭疽芽孢杆菌检测试剂盒及其使用方法。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本申请提供了一种炭疽芽孢杆菌检测的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本发明所述的引物探针组合物检测炭疽芽孢杆菌，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种检测炭疽芽孢杆菌的引物探针组合物，所述的引物探针组合物包括检测炭疽芽孢杆菌的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物。

具体地，所述的检测炭疽芽孢杆菌的引物探针组合物为Banth引物探针组合物。

具体地，所述的检测内参的引物探针组合物为IPC引物探针组合物。

进一步具体地，

(1)所述的Banth引物探针组合物为：

F(SEQ ID NO:1)：5'-TGGTCAAGCGATGGAGTTT-3'；

R(SEQ ID NO:2)：5'-TGTCCTTGCCTGCTAATGTAA-3'；

P(SEQ ID NO:3)：5'-ACTGGGCTGTTTGTTAGGTGGTTTG-3'；

(2)所述的IPC引物探针组合物为：

F(SEQ ID NO:4)：5'-AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTA-3'；

R(SEQ ID NO:5)：5'-TCGACGAGACTCTGCTGTTAA-3'；

P(SEQ ID NO:6)：5'-CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA-3'。

具体地，所述的炭疽芽孢杆菌的引物探针组合物用于检测炭疽芽孢杆菌pXO1质粒上的 pag基因。

具体地，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，所述探针的3'端标记有淬灭基团；所述荧光报告基团为CY3、CY5、CY5.5、FAM、HEX、VIC、JOE或ROX中的一种或多种，所述淬灭基团为荧光淬灭基团。

进一步具体地，所述的检测炭疽芽孢杆菌的探针用FAM标记，所述的检测内参IPC的探针用CY5标记。

另一方面，本发明提供了上述引物探针组合物在制备检测炭疽芽孢杆菌产品中的应用。

具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

又一方面，本发明提供了一种检测炭疽芽孢杆菌的产品，所述的产品包括上述引物探针组合物。

具体地，所述的产品还包括纯化试剂、冻干试剂和IPC质控品。

进一步具体地，所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X-100，所述的洗脱液包括Tris-HCl，所述的裂解液和洗脱液的体积比为 1:2-2.5，所述的磁珠为干化磁珠。

进一步具体地，所述的裂解液包括6M盐酸胍、0.4M pH4.7醋酸钠和2％Triton X-100，所述的洗脱液包括10mM pH8.5 Tris-HCl。

进一步具体地，所述的冻干试剂包括脂多糖、羧丙基甲基纤维素、甘露醇、海藻糖、普鲁兰多糖、2-羟丙基-β-环糊精、脱氧核糖核酸聚合酶、牛血清白蛋白、消泡剂、脱氧核苷三磷酸、KCI、Tris-HCI(pH 9.0)、MgCl₂、Tween 20。

进一步具体地，所述的IPC质控品以冻干球的形式存在于微流控芯片中；

所述的IPC质控品的人工合成序列为SEQ ID NO:8；

所述的IPC质控品是DNA质粒；

所述的IPC质控品的冻干体系包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、2-羟丙基-β-环糊精、消泡剂、Tris-HCl(pH 8.0)、NaCl、Tween20。

又一方面，本发明还提供了一种检测炭疽芽孢杆菌的微流控芯片试剂盒，所述的试剂盒包括上述引物探针组合物。

具体地，所述的试剂盒还包括纯化试剂、冻干试剂和IPC质控品。

所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X-100，所述的洗脱液包括Tris-HCl，所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5，所述的磁珠为干化磁珠；

所述的冻干试剂包括脂多糖、羧丙基甲基纤维素、甘露醇、海藻糖、普鲁兰多糖、2-羟丙基-β-环糊精、脱氧核糖核酸聚合酶、牛血清白蛋白、消泡剂、脱氧核苷三磷酸、KCI、Tris-HCI (pH 9.0)、MgCl₂、Tween 20。

所述的IPC质控品以冻干球的形式存在于微流控芯片中；

所述的IPC质控品的人工合成序列为SEQ ID NO:8；

所述的IPC质控品是DNA质粒；

所述的试剂盒在微流控芯片上完成样本的核酸提取、纯化、扩增和检测。具体地，所述的微流控芯片试剂盒可用于CarryOn P1000Q快速核酸扩增检测仪。

又一方面，本发明提供了上述引物探针组合物、产品或试剂盒在检测炭疽芽孢杆菌中的应用。

又一方面，本发明提供了一种检测炭疽芽孢杆菌的方法，所述的方法为非疾病诊断和治疗方法，所述的方法包括利用上述引物探针组合物、产品或试剂盒对待测样本中炭疽芽孢杆菌进行检测。

具体地，所述的方法包括以下步骤：

(1)提取样本的DNA并采用上述纯化试剂进行纯化；

(2)利用上述引物探针组合物扩增步骤(1)提取并纯化的样本DNA；

(3)对扩增结果进行分析。

进一步具体地，上述步骤采用CarryOn P1000Q快速核酸扩增检测仪，在微流控一体化芯片上进行。

与现有技术相比，本发明提供的试剂盒具有如下有益效果：

(1)采用本发明提供的引物探针组合物同时检测炭疽芽孢杆菌，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。

(2)利用芯片上微流控的方式解决病原体快速检测的问题，实现“样本进-结果出”的 POCT检测方案，取样后直接加入设备，纯化加扩增，60分钟内出结果。

附图说明

图1为灵敏度检测结果图。

图2为准确度检测结果图。

图3为特异性检测结果曲线图，其中，A为蜡样芽孢杆菌检测结果，B为苏云金芽孢杆菌检测结果，C为蕈状芽孢杆菌检测结果。

图4为微流控芯片示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

1.试剂及仪器

(1)本申请所用的试剂信息详见下表1。

表1试剂及厂家

(2)本申请所用的仪器信息详见下表2。

表2仪器

仪器	厂家	型号
			万分之一天平	梅特勒-托利多公司	AL104
qPCR仪	Thermo Fisher Scientific	ABI 7500
			涡旋混匀仪	杭州米欧仪器有限公司	MIX-28+
手掌型离心机	江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司	LX-100
			冷冻干燥机	四环科仪(天津)科技有限公司	LGJ-20

本申请所用的PCR反应装置详见专利202110057507.0，用于核酸检测的芯片装置详见 202110055537.8。

实施例1.一种检测炭疽芽孢杆菌的引物探针组合物

所述的引物探针组合物包括检测炭疽芽孢杆菌的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物。

所述的检测炭疽芽孢杆菌的引物探针组合物为Banth引物探针组合物。

所述的检测内参的引物探针组合物为IPC引物探针组合物。

(1)所述的Banth引物探针组合物为：

F(SEQ ID NO:1)：5'-TGGTCAAGCGATGGAGTTT-3'；

R(SEQ ID NO:2)：5'-TGTCCTTGCCTGCTAATGTAA-3'；

P(SEQ ID NO:3)：5'-ACTGGGCTGTTTGTTAGGTGGTTTG-3'；

(2)所述的IPC引物探针组合物为：

F(SEQ ID NO:4)：5'-AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTA-3'；

R(SEQ ID NO:5)：5'-TCGACGAGACTCTGCTGTTAA-3'；

P(SEQ ID NO:6)：5'-CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA-3'。

本申请所述的炭疽芽孢杆菌的引物探针组合物用于检测炭疽芽孢杆菌pXO1质粒上的 pag基因。

实施例2一种检测炭疽芽孢杆菌的微流控芯片试剂盒

(1)包括实施例1所述的引物探针组合物，各引物探针浓度均为0.2μM。

(2)还包括纯化试剂、冻干试剂和IPC质控品。

1)所述的纯化试剂包括裂解液400μL、洗脱液850μL和磁珠15μL，所述的裂解液包括 6M盐酸胍、0.4M pH4.7醋酸钠和2％Triton X-100，所述的洗脱液包括10mM pH8.5Tris-HCl，将纯化试剂加入芯片的加样层，所述的磁珠干化方法见专利202110222434.6

2)所述冻干试剂体系如下表3所示。

表3冻干试剂体系

成分	(1×)
		脂多糖	0.05％
羧丙基甲基纤维素	0.006％
		甘露醇Mannitol	2.5％
海藻糖Trehalose	2.5％
		普鲁兰Pullulan	0.5％
2-羟丙基-β-环糊精	0.5％
		脱氧核糖核酸聚合酶Taq Glycerol-free	0.4U/μL
牛血清白蛋白BSA	0.04mg/mL
		消泡剂SE-15	0.009％
脱氧核苷三磷酸dNTPs	0.2mM
		KCl	70mM
Tris-HCl(pH9.0)	50mM
		MgCl₂·6H₂O	3.2mM
Tween20	0.05％

3)所述IPC质控品包括IPC质粒的制备和冻干体系。

按照IPC基因(SEQ ID NO:8)序列信息，由擎科生物有限公司合成dsDNA并克隆在pUC18载体上，得到携带IPC基因的质粒。

所述IPC质控品冻干体系如下表4所示。

表4 IPC质控品冻干体系

成分
		IPC质粒	1×10⁵copies/mL
甘露醇Mannitol	10％
		海藻糖Trehalose	10％
牛血清白蛋白BSA	0.5mg/mL
		2-羟丙基-β-环糊精HP-β-CD	0.1％
消泡剂SE-15	0.009％
		Tris-HCl(pH 8.0)	10mM
NaCl	50mM
		Tween20	0.05％

将上述表3试剂加入硅胶模具中；将上述表4试剂每5μL滴到液氮中制成冻干球，放入西林瓶中按照下表5的冷冻干燥机冻干程序进行冻干。

表5冻干程序

将冻干片与冻干球放入微流控芯片中，组装成一体化检测试剂盒。

实施例3炭疽芽孢杆菌检测试剂盒的使用方法

采用CarryOn P1000Q进行本申请所述的炭疽芽孢杆菌的检测，具体检测步骤如下表6所示。

表6

实时定量PCR反应程序为：55℃10min；95℃1min；(95℃10s，60℃20s)，45cycles。

实验例1灵敏度检测

按照炭疽芽孢杆菌pag基因(NCBI ACCESSION NO：NC_007322.2:142328-143005bp； SEQ ID NO:7)序列信息，由擎科生物有限公司合成dsDNA并克隆在pUC18载体上，测序正确后，调整质粒浓度为每反应5×10⁶copies、5×10⁵copies、5×10⁴copies、5×10³copies、5×10²copies，按照上述实施例1-3的体系和步骤对核酸样品进行检测，其检测结果如下表7所示，检测曲线如图1所示。

表7

由上表7可知，本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的灵敏度，可对每反应 5×10²copies的样品进行检测。

实验例2准确性检测

按照炭疽芽孢杆菌pag基因(NCBI ACCESSION NO：NZ_CP021520.1:142328-143005bp； SEQ ID NO:7)序列信息，由擎科生物有限公司合成dsDNA并克隆在pUC18载体上，测序正确后，调整质粒浓度为每反应1×10²copies，按照上述实施例1-3的体系和步骤对核酸样品进行检测，重复检测六次，检测结果如下表8所示。

表8

其检测结果图如图2所示，由表8可知，本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的准确性。

实验例3特异性检测

蜡样芽孢杆菌(ATCC14579)和苏云金芽孢杆菌(ATCC10792)、蕈状芽孢杆菌(ATCC10206)均购自莱耀生物科技有限公司，调整浓度为每反应1×10⁴CFU，取200μL菌液加到CarryOn P1000Q快速核酸扩增检测仪样品仓内，用于核酸扩增检测实验。

按照上述实施例1-3的体系和步骤对上述样品进行检测，其检测结果如下表9所示。

表9

样品	内对照Ct值	靶标检测结果
			蜡样芽孢杆菌	30.72	阴性
苏云金芽孢杆菌	31.16	阴性
			蕈状芽孢杆菌	31.57	阴性

其中，蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌检测结果Ct值为内参扩增结果。本申请所述的炭疽芽孢杆菌引物探针组合物未扩增到产物。因此，其检测结果为阴性。

其检测结果图如图3所示，由上表9可知，本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的特异性。

以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京中科生仪科技有限公司

<120> 一种炭疽芽孢杆菌检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

tggtcaagcg atggagttt 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

tgtccttgcc tgctaatgta a 21

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

actgggctgt ttgttaggtg gtttg 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

agttgcagtg taaccgtcat gta 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

tcgacgagac tctgctgtta a 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

cagtaatctg cgtcgcacgt gtgca 25

<210> 7

<211> 136

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

tggtcaagcg atggagtttc tttaaatcta gatgaagatg taaatcaagc actatctgga 60

tatatgcttc aaataaaaaa accttcaaac cacctaacaa acagcccagt tacaattaca 120

ttagcaggca aggaca 136

<210> 8

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

agttgcagtg taaccgtcat gtaccagtaa tctgcgtcgc acgtgtgcac ctagtctaat 60

cacttatgac tcagataact taacagcaga gtctcgtcga 100

Claims

1.一种检测炭疽芽孢杆菌的引物探针组合物，其特征在于：所述的引物探针组合物包括检测炭疽芽孢杆菌的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物；

所述的检测炭疽芽孢杆菌的引物探针组合物为Banth引物探针组合物；

所述的检测内参的引物探针组合物为IPC引物探针组合物；

所述的Banth引物探针组合物为：

F：SEQ ID NO:1：5'-TGGTCAAGCGATGGAGTTT-3'；

R：SEQ ID NO:2：5'-TGTCCTTGCCTGCTAATGTAA-3'；

P：SEQ ID NO:3：5'-ACTGGGCTGTTTGTTAGGTGGTTTG-3'；

所述的IPC引物探针组合物为：

F：SEQ ID NO:4：5'-AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTA-3'；

R：SEQ ID NO:5：5'-TCGACGAGACTCTGCTGTTAA-3'；

P：SEQ ID NO:6：5'-CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA-3'。

2.权利要求1所述的引物探针组合物在制备检测炭疽芽孢杆菌产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的产品包括独立试剂、芯片或试剂盒。

4.一种检测炭疽芽孢杆菌的产品，其特征在于：所述的产品包括权利要求1所述的引物探针组合物。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述的产品还包括纯化试剂、冻干试剂和IPC质控品。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X-100，所述的洗脱液包括Tris-HCl，所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5，所述的磁珠为干化磁珠。

7.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述的冻干试剂包括脂多糖、羧丙基甲基纤维素、甘露醇、海藻糖、普鲁兰多糖、2-羟丙基-β-环糊精、脱氧核糖核酸聚合酶、牛血清白蛋白、消泡剂、脱氧核苷三磷酸、KCI、Tris-HCI(pH 9.0)、MgCl₂、Tween 20。

8.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述的IPC质控品以冻干球的形式存在于微流控芯片中；

所述的IPC质控品的人工合成序列为SEQ ID NO:8；

所述的IPC质控品是DNA质粒；

9.一种检测炭疽芽孢杆菌的微流控芯片试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1所述的引物探针组合物；

所述的试剂盒还包括纯化试剂、冻干试剂和IPC质控品；

所述的冻干试剂包括脂多糖、羧丙基甲基纤维素、甘露醇、海藻糖、普鲁兰多糖、2-羟丙基-β-环糊精、脱氧核糖核酸聚合酶、牛血清白蛋白、消泡剂、脱氧核苷三磷酸、KCI、Tris-HCI(pH 9.0)、MgCl₂、Tween 20；

所述的IPC质控品以冻干球的形式存在于微流控芯片中；

所述的IPC质控品的人工合成序列为SEQ ID NO:8；

所述的IPC质控品是DNA质粒；

所述的IPC质控品的冻干体系包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、2-羟丙基-β-环糊精、消泡剂、Tris-HCl(pH 8.0)、NaCl、Tween20；

所述的试剂盒在微流控芯片上完成样本的核酸提取、纯化、扩增和检测。

10.一种检测炭疽芽孢杆菌的方法，所述的方法为非疾病诊断和治疗方法，其特征在于：所述的方法包括利用权利要求1所述的引物探针组合物、权利要求4-8任一项所述的产品或权利要求9所述的试剂盒对待测样本中炭疽芽孢杆菌进行检测。