CN116875305B - 一种基于金属离子修饰ZnGeO:Mn纳米棒的时间分辨荧光探针及其应用 - Google Patents
一种基于金属离子修饰ZnGeO:Mn纳米棒的时间分辨荧光探针及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种基于金属离子修饰ZnGeO:Mn纳米棒的时间分辨荧光探针及其应用。本发明以牛血清白蛋白(BSA)为修饰外壳,对苯二胺(OPD)为还原剂,利用ZnGeO:Mn长余辉纳米棒(ZnGeO:Mn PLNRs)和Mn(Ⅱ)分别作为信号分子和猝灭剂,合成PBMO纳米探针。本发明PBMO纳米探针可应用于H2O2以及与H2O2相关的分析物检测。其中,本发明将PBMO纳米探针应用于AChE的检测,线性范围为0.08~10U L‑1,检出限为0.03U L‑1(3σ/s)。本发明所制备PBMO纳米探针能够准确检测人血清中乙酰胆碱的含量,而且检测方法简单,具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及时间分辨荧光探针领域,特别涉及一种基于金属离子修饰ZnGeO:Mn纳米棒的时间分辨荧光探针及其应用。
背景技术
乙酰胆碱酯酶(AChE)是一种丝氨酸水解酶,存在于神经肌肉连接处、脑突触和红细胞中。AChE参与的主要生理过程是水解神经递质乙酰胆碱(ATCh),从而导致胆碱能突触和神经肌肉连接处的信号传递终止。AChE还具有其他功能,包括形态调节、粘附、应激和发病机制研究等。研究表明AChE与细胞凋亡相关,在某些情况下甚至被认为是一种标志物。AChE与胰岛素依赖型糖尿病的发病机制及阿尔茨海默病的临床症状密切相关。因此,准确监测AChE活性对疾病的诊断和干预至关重要。
目前,检测AChE活性的方法多种多样,例如质谱、免疫分析、电化学分析、比色法和荧光光谱法等。其中,质谱分析设备不便且价格昂贵,免疫分析耗时费力,电化学分析通常制备能力差,比色法灵敏度低。时间分辨荧光(TRF)分析能够消除自身荧光和散射光的干扰,是最敏感的荧光分析法之一,该方法灵敏度高、稳定性好、操作简单、反应快,受到越来越多的关注。时间分辨荧光分析的应用领域包括免疫分析、传感和生物成像。
时间分辨荧光分析法需采用长寿命的发光材料,以确保荧光信号的延迟采集成功。作为一种新兴的纳米材料,长余辉发光纳米棒(PLNR)可以储存激发源的能量,并以光子发射的形式缓慢释放,提供长达数小时的余辉发光。与有机化合物相比,PLNR表现出突出的优点:(i)易制备,不需要复杂的合成过程;(ii)通过调控发射中心和宿主元素,可以获得不同发光性能和形态的PLNPs;(iii)通过表面改性获得良好的生物相容性和低毒性。利用发光共振能量转移(LRET)来给出PLNR的开关信号,能够显著提高检测灵敏度,其中PLNR是能量供体,其他材料作为能量受体。PLNR的长余辉发光被能量受体降低,伴随着分析物的加入,诱导其长余辉发光恢复。由于光谱重叠的程度严重影响探针的灵敏度,因此能量受体的选择尤为重要。金属离子具有较高的光猝灭效率,被广泛应用于与各种荧光团或者发光材料共同构建LRET体系。为了避免直接在水溶液中混合或锚定在纳米颗粒表面所开发的金属离子基LRET体系的不稳定性,研究人员利用介孔二氧化硅作为模板封装ZnGa2O4:Cr3+和金属离子。但封装过程繁琐,需要经历模板合成、离子浸渍、退火和外壳封装等一系列操作步骤。
发明内容
鉴于此,本发明提出一种基于金属离子修饰ZnGeO:Mn纳米棒的时间分辨荧光探针及其应用。
本发明的技术方案是这样实现的:
本发明提供PBMO纳米探针在检测H2O2以及与H2O2相关的分析物中的应用。
本发明提供PBMO纳米探针在乙酰胆碱酯酶的检测中的应用。
进一步的,本发明提供PBMO纳米探针在血清乙酰胆碱酯酶的检测中的应用。
更进一步的,本发明提供PBMO纳米探针在人血清乙酰胆碱酯酶的检测中的应用。
本发明提供PBMO纳米探针的制备方法:以牛血清白蛋白为修饰外壳,对苯二胺为还原剂,利用ZnGeO:Mn长余辉纳米棒和Mn(Ⅱ)分别作为信号分子和猝灭剂,制得PBMO纳米探针。
进一步的,所述PBMO纳米探针的制备方法,包括以下步骤:将牛血清白蛋白溶于水中,得到悬浮液,加入ZnGeO:Mn-OH PLNR;超声,搅拌后,边搅拌边依次加入硝酸锰水溶液、对苯二胺溶液、氢氧化钠溶液、戊二醛,在38~42℃下继续搅拌22~28h;离心,用水清洗,制得PBMO纳米探针。
进一步的,所述PBMO纳米探针的制备方法,包括以下步骤:将牛血清白蛋白溶于水中,料液质量体积比mg/mL为25:1.4~1.6,得到悬浮液,加入8~12mg mL-1ZnGeO:Mn-OHPLNR;超声14~16min,搅拌4~6min后,边搅拌边依次加入45~55mmol L-1硝酸锰水溶液,1.9~2.1mol L-1对苯二胺溶液,1.9~2.1mol L-1氢氧化钠溶液、戊二醛,在38~42℃下继续搅拌22~28h;所得产物以11000~13000转/分的速度离心,用水清洗,制得PBMO纳米探针;其中,各原料质量体积比例:牛血清白蛋白24~26mg、ZnGeO:Mn-OH PLNR 1.4~1.6mL、Mn(NO3)2水溶液1.4~1.6mL,对苯二胺溶液20~30μL,氢氧化钠溶液20~30μL,戊二醛8~12μL。
进一步的,所述PBMO纳米探针检测乙酰胆碱酯酶的方法包括以下步骤:将乙酰胆碱、待测样品溶液、磷酸盐缓冲液混合后,孵育;再加入H2O2,孵育;最后加入PBMO溶液和磷酸盐缓冲液,孵育后进行荧光测定。
进一步的,所述PBMO纳米探针检测乙酰胆碱酯酶的方法,包括以下步骤:将乙酰胆碱、待测样品溶液和,pH 7.3~7.5磷酸盐缓冲液的混合物在36.5~37.5℃下孵育8~12min;加入290~310mmol L-1H2O2,36.5~37.5℃孵育8~12min;最后加入PBMO溶液和pH8.4~8.6磷酸盐缓冲液,孵育4~6min后进行荧光测定。
进一步的,所述乙酰胆碱、待测样品溶液、pH 7.3~7.5磷酸盐缓冲液、H2O2、PBMO溶液为等体积,所述pH 8.4~8.6磷酸盐缓冲液的体积为乙酰胆碱、待测样品溶液、pH 7.3~7.5磷酸盐缓冲液、H2O2、PBMO溶液体积之和。
进一步的,检测体系中的PBMO、乙酰胆碱和H2O2的浓度分别为70~80μg mL-1、1.5~2.5mmol L-1和25~35μmol L-1。
进一步的,设有标准溶液作对照品,所述标准溶液为浓度为0.8~100U L-1乙酰胆碱酯酶溶液。将待测样品溶液替换标准溶液,按照上述方法进行检测。
进一步的,所述待测样品溶液的制备:取离体血液,离心,上清液经过滤得到血清样品;样品加入不同浓度的乙酰胆碱酯酶,然后加入NEM消除干扰,最后稀释得到待测样品溶液。
进一步的,所述待测样品的制备包括以下步骤:取离体血液,2500~3500rpm离心4~6min,上清液经0.22μm膜过滤器过滤得到血清样品;所述待测样品溶液的制备包括以下步骤:取离体血液,2500~3500rpm离心4~6min,上清液经膜过滤器过滤得到血清样品;将血清样品加入乙酰胆碱酯酶按照体积比为1000:0.8~1.2混合,最后稀释400~600倍,得到待测样品溶液。
进一步的,检测时间分辨荧光强度时,荧光激发波长为250nm,荧光发射波长为530nm。
进一步的,在H2O2检测中,发光增强效率(q1)由公式q1=F/F0-1计算得到,其中F和F0分别为加H2O2后和加H2O2前的PBMO时间分辨荧光强度。
进一步的,在乙酰胆碱酯酶检测中,发光猝灭效率(q2)由公式q2=1-F/F0计算得到,其中F和F0分别为含AChE和不含AChE的PBMO时间分辨荧光强度。
进一步的,通过以下关系式计算AChE浓度,其标准曲线方程为q2=0.0931log C+0.124,其中q2为发光猝灭效率,C为AChE浓度,线性范围为0.08~10U L-1,线性相关系数为0.997;检出限为0.03U L-1。
本发明制备了一种新型时间分辨荧光探针(PBMO,PLNR-BSA-Mn2+-OPD),用于乙酰胆碱酯酶(AChE)的无标记检测。在H2O2存在下,由于Mn(Ⅱ)的氧化,PBMO在530nm处的发光在30s内显著增强。AChE能够催化乙酰胆碱(ATCh)水解,产生胆碱(TCh)。由于TCh能够将H2O2还原,导致H2O2对PBMO发射荧光的增强效果减弱,因此,AChE的浓度间接与PBMO发射的荧光强度有关。
本发明将PBMO纳米探针应用于AChE的检测,线性范围为0.08~10U L-1,检出限为0.03U L-1(3σ/s)。通过对人血清样品中AChE含量的准确监测,证实了该PBMO纳米探针的实用性,加标回收率为96.2-103.6%。
本申请中简写与中文名称:
简写 | 全称 |
AChE | 乙酰胆碱酯酶 |
ATCh | 乙酰胆碱 |
TCh | 胆碱 |
BSA | 牛血清白蛋白 |
OPD | 对苯二胺 |
NEM | N-乙基马来酰亚胺 |
PB | 磷酸盐缓冲液 |
PBMO | PLNR-BSA-Mn2+-OPD时间分辨荧光探针 |
ZnGeO:Mn PLNRs | ZnGeO:Mn长余辉纳米棒 |
ZnGeO:Mn-OH PLNR | ZnGeO:Mn-OH长余辉纳米棒 |
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)本发明基于LRET原理制备了一种用于AChE无标记检测的新型时间分辨荧光纳米探针PBMO(PLNR-BSA-Mn2+-OPD),并提出了一种新型的LRET系统构建方法。PLNR用牛血清白蛋白(BSA)结合Mn(Ⅱ)和邻苯二胺(OPD)通过简单的一锅方法包载。其中,PLNR、Mn(Ⅱ)和OPD的作用分别为发光材料、猝灭剂和还原剂。BSA作为纳米载体,为Mn(Ⅱ)提供了一个壳腔,该壳腔不仅为Mn(Ⅱ)和H2O2提供了反应空间,而且缩短了能量供体和能量受体之间的距离。我们发现H2O2在530nm处显著提高了PBMO的时间分辨荧光的强度。因此,PBMO纳米探针可用于H2O2的测定。AChE酶解乙酰胆碱(ATCh)的过程中原位生成胆碱(TCh),TCh能够消耗H2O2,因此成功地将PBMO纳米探针用于乙酰胆碱(AChE)的测定,并成功地检测了人血清中乙酰胆碱的含量,提供了一种准确检测人血清中乙酰胆碱的含量的检测方法。
(2)将本发明制备的PBMO纳米探针应用于AChE的检测,线性范围为0.08-10U L-1,检出限为0.03U L-1(3σ/s)。通过对人血清样品中AChE含量的准确监测,该PBMO纳米探针具有较高的实用性,加标回收率为96.2-103.6%。
(3)本发明提供的PBMO纳米探针,能够准确检测人血清中乙酰胆碱的含量,而且检测方法简单,具有较高的应用价值。
附图说明
图1PBMO TEM图像(A);ZnGeO:Mn-OH PLNR和PBMO的XRD图谱(B);PBMO的XPS图谱(C);ZnGeO:Mn-OH PLNR和PBMO的FT-IR光谱(D);PBMO的紫外-可见吸收光谱(a)、荧光激发光谱(λem=530nm,b)和荧光发射光谱(λex=250nm,c),无5μmol L-1H2O2时PBMO的荧光发射光谱(d),无10U L-1AChE时PBMO纳米探针的荧光发射光谱(e)(E);PBMO的发光衰减曲线(F)。
图2不同浓度Mn(NO3)2(A)和OPD(B)制备的PBMO在加入5μmol L-1H2O2条件下的荧光增强效率(q1)。
图3PBMO纳米探针对H2O2的响应机理示意图。
图4含OPD(A)和不含OPD(B)制备的PBMO中Mn 2p的高分辨率XPS光谱。
图5在0.4-10μmol L-1的H2O2浓度范围内,q1(F/F0-1)与log C的线性关系。
图6PBMO浓度(A)、ATch和H2O2浓度(B)对AChE检测的影响(AChE浓度:1.0U L-1);荧光猝灭效率(q2)与AChE浓度对数(0.08-10U L-1)的关系(C);探针对各种生物分子和离子(AChE、酶、其他蛋白质和离子的浓度为1U L-1,1U L-1,10μg mL-1,100mmol L-1)的响应(D)。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容,下面提供具体实施例,对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例
1、实验部分
1.1试剂与仪器
Zn(NO3)2·6H2O,GeO2,Mn(NO3)2·6H2O,NH3·H2O,邻苯二胺(OPD),N-乙基马来酰亚胺(NEM)购自阿拉丁试剂公司(上海,中国)。戊二醛(50wt%)、H2O2(30wt%)、NaOH、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·12H2O、FeCl3·6H2O、Na2SO4、CH3COOK、(NH4)2SO4购自国药化学试剂有限公司(上海,中国)。牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶、胰蛋白酶、ALP、人血清白蛋白(HSA)、IgG、α-球蛋白(α-GLB)和β-球蛋白(β-GLB)购自Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI,USA)。
时间分辨荧光测量和UV-vis吸收光谱在spectra Max M5e(Molecular DevicesCo.Ltd,USA)上进行。利用日本JEOL公司的Jem-2100F场发射电子显微镜对PBMO纳米探针的形貌进行了表征。在Thermo ScientificTMK-AlphaTM+光谱仪上记录了ZnGeO:Mn PLNR和PBMO的x射线光电子能谱(XPS)表征。x射线衍射(XRD)分析采用D8 Advance粉末衍射仪(Bruker,德国)进行测量。傅里叶变换红外(FT-IR)光谱采用Tensor-27 FT-IR光谱仪(Bruker,德国)进行。
1.2PBMO纳米探针的合成
采用水热法制备ZnGeO:Mn PLNR:将50mg ZnGeO:Mn PLNR加入20ml氢氧化钠溶液(5mmol L-1)中,搅拌24h,制得ZnGeO:Mn-OH PLNR,清洗并溶于蒸馏水备用。合成PBMO具体合成步骤如下:将25mg BSA溶于1.5mL H2O中,得到悬浮液,加入1.5mL ZnGeO:Mn-OH PLNR(10mg mL-1)。超声15min,搅拌5min后,边搅拌边依次加入1.5mL Mn(NO3)2水溶液(50mmol L-1)、25μL OPD(2mol L-1,DMF做溶剂)、25μL氢氧化钠(2mol L-1)、10μL戊二醛,在40℃下继续搅拌24h。所得产物以12000转/分的速度离心,用水清洗三次,备用。
1.3H2O2的检测
取10μL H2O2溶液(浓度在4~100μmol L-1之间)、10μL PBMO溶液(400μg mL-1)和80μL PB(10mmol L-1,pH 8.5),在黑色96孔板中混合,37℃振动5min。在250nm激发下记录530nm处的时间分辨荧光强度。发光增强效率(q1)由公式q1=F/F0-1计算得到,其中F和F0分别为加H2O2后和加H2O2前,PBMO的时间分辨荧光强度。
1.4AChE的检测
为了检测AChE,将10μL ATCh(20mmol L-1)、新制备的具有不同活性的AChE(10μL,0.8-100U L-1)和10μL PB(10mmol L-1,pH 7.4)的混合物在37℃下孵育10min。加入10μLH2O2(300mmol L-1),37℃孵育10min。最后,在溶液中加入10μL PBMO溶液(750μg mL-1)和50μL PB溶液(10mmol L-1,pH 8.5),孵育5min后进行荧光测定。发光猝灭效率(q2)由公式q2=1-F/F0计算得到,其中F和F0分别为含AChE和不含AChE的时间分辨荧光强度。为了评价PBMO纳米探针对AChE的选择性,分别探究了一些非特异性酶、蛋白质和离子对AChE检测的影响。
1.5实际样品分析
人体血液样本来自海南医学院第一附属医院。3000rpm离心5min,上清液经0.22μm膜过滤器过滤得到人血清样品。1000μL样品加1μLAChE混合后,取混合液1μL,然后加入1μL、25mmol/LNEM溶液消除干扰,再加入498μL PB缓冲液,即稀释500倍。按照上述步骤对制备的样品进行检测。w
2、结果与讨论
2.1表征
为了赋予ZnGeO:Mn PLNR更好的水溶性,首先将其羟基化。然后,ZnGeO:Mn-OHPLNR和BSA通过氢键在水中很好地进行预混合。用戊二醛作为交联剂,在Mn2+和OPD的存在下,在ZnGeO:Mn-OH PLNR表面包载BSA层。在碱性条件下,由Mn2+和OPD产生的MnO和2,3-二氨基吩嗪(DAP)同时包载在BSA外壳中形成PBMO。PBMO的棒状形态如图1A所示。PBMO具有均匀的核壳结构,其长度和直径分别为56.3±3.1和22.3±2.2nm,壳层厚度为3.9±0.6nm。XRD结果表明,PBMO与ZnGeO:Mn-OH PLNR的XRD谱匹配良好(图1B),说明BSA改性后的结晶过程没有发生变化。PBMO的XRD图谱与标准卡[JCPDS No.11-0687]匹配良好,为菱面体相的结晶。此外,PBMO(图1C)的XPS谱在1021.1eV、31.7eV、641.1eV、284.8eV、399.5eV、530.7eV出现的峰分别归属于Zn、Ge、Mn、C、N和O元素,其相对含量分别4.49%、6.53%、1.62%、50.79%、10.57%和26.01%。
ZnGeO:Mn-OH PLNR表面包载BSA外壳后,在FT-IR光谱中,PBMO呈现出几个新的吸收带。在3410cm-1处出现一个宽峰,在3250cm-1处出现一个弱峰,对应于DAP的-NH2基团(图1D)。在1531cm-1,1657cm-1,2870cm-1,2927cm-1,2958cm-1,3080cm-1处的红外吸收峰分别归属于PBMO中的C═C伸缩振动、-CO-NH-伸缩振动、-CH2-对称伸缩振动、-CH2-不对称伸缩振动、-C-H伸缩振动和═C-H伸缩振动。这些结果证实了BSA和DPA的成功包覆。
所得PBMO纳米探针的发光性能与ZnGeO:Mn-OH PLNR一致。PBMO在250nm处的吸收较窄(图1E,线a)。在发光光谱中,PBMO的最大激发和最大发射波长分别为250nm和530nm(图1E,线b和线c)。PBMO的发光衰减曲线如图1F所示,使用双指数法推导出其发光寿命为13.21ms。
2.2H2O2响应机理
初步实验证明,ZnGeO:Mn-OH PLNR的发光强度不受H2O2的影响。经BSA、Mn(Ⅱ)和OPD包覆后,加入H2O2可引起PBMO的时间分辨荧光显著增强。为了探讨其响应机理,研究了由不同浓度的Mn(NO3)2和OPD制备所得PBMO对5μmol L-1H2O2的响应。当OPD浓度仅为2mol L-1时,PBMO的长余辉发光最强,对H2O2无响应。H2O2对PBMO的长余辉发光增强效率随着制备时加入Mn(NO3)2的增多而提高,用50mmol L-1Mn(NO3)2制得PBMO的发光增强效率最高(图2A)。由于沉淀的产生,随着Mn(NO3)2浓度的继续增加,发光增强效率反而降低。
只含有50mmol L-1Mn(NO3)2的原料制得的PBMO对H2O2有响应。H2O2对PBMO的长余辉发光增强效率随着原料中OPD浓度(0-2mol L-1)的增加而增加,当OPD浓度大于2mol L-1时,发光增强效率趋于平稳(图2B)。产生这种现象的原因可能是牛血清白蛋白壳内所含OPD已达到饱和。
PBMO纳米探针对H2O2的响应机理如图3所示。
结合上述实验结果,初步判断对PBMO中对H2O2具有响应的关键因素是锰元素,其响应机制如图1所示。制备PBMO的过程中,当Mn(NO3)2存在时,加入高浓度NaOH溶液会得到无定形Mn(OH)2,随后,Mn(OH)2在溶液中被氧化转化为Mn3O4。部分Mn3O4被后续加入的OPD还原为Mn(Ⅱ),通过Mn 2p的高分辨率XPS谱在641.0eV处的峰验证了这一点。其余部分的Mn3O4在加热条件下被O2进一步氧化为Mn(Ⅳ),这一点通过Mn 2p的高分辨率XPS谱中在641.9eV处的峰值得到验证(图4A)。加入H2O2可能导致BSA壳层内的Mn(Ⅱ)在碱性条件下发生氧化反应,诱导Mn3O4的产生,由于Mn3O4对核层内ZnGeO:Mn-OH PLNR长余辉发光的猝灭强度弱于Mn(Ⅱ),因此PBMO的长余辉发光增强。当无OPD存在时,PBMO中Mn(Ⅱ)的百分比从48%下降到30%,对H2O2的响应几乎不明显(图4B)。
3.3H2O2的时间分辨荧光检测
为了探索PBMO的分析应用,在最优条件下研究了其对H2O2的时间分辨荧光响应。实验结果表明,加入不同浓度的H2O2溶液后,30s内PBMO在530nm处的时间分辨荧光显著增强。如图5所示,在0.4-10μmol L-1范围内,发光增强效率(q1)与H2O2浓度的对数呈线性关系,其回归方程为q1=0.326logC+0.175(R=0.995)。根据空白信号的三倍标准差与标准曲线斜率的比值(3σ/s,n=11),算得H2O2的检出限为0.14μmol L-1。
3.4AchE分析
AChE是生物神经传导的关键酶,能水解ATCh生成TCh。TCh的巯基使其具有还原性,易被H2O2氧化。因此,我们假设可以通过抑制TCh对H2O2触发的时间分辨荧光增强来检测AChE的活性。通过记录不同条件下时间分辨荧光强度,验证了使用PBMO纳米探针测定AChE的可行性。ATCh或AChE对H2O2引发的时间分辨荧光增强无明显影响。然而,在AChE与ATch孵育后,加入H2O2,PBMO的发光强度明显弱于仅加入H2O2时的时间分辨荧光(图1E,e线)。探究了检测体系中的PBMO、ATCh及H2O2浓度对AChE检测的影响(图6A和图6B)。结果表明,PBMO、ATCh和H2O2的最佳浓度分别为75μg mL-1、2mmol L-1和30μmol L-1。
实验结果表明,在0.08-10U L-1范围内,530nm处的时间分辨荧光强度随着AChE浓度的增加而逐渐降低,发光猝灭效率(q2)与AChE浓度的对数具有良好的线性关系,其标准曲线方程为q2=0.0931log C+0.124(R=0.997)(图6C)。根据3σ/s规则计算出的检测限可低至0.03U L-1。
本发明建立的时间分辨荧光分析法的线性范围和检测限(LOD)与之前报道的AChE测定方法进行了比较,如表1所示。本发明制备的PBMO纳米探针具有灵敏度高、响应时间短、操作简单等明显优势。为了检验本发明PBMO纳米探针的选择性,测量了在人类血清中潜在干扰物质存在时时间分辨荧光的强度变化,包括酶(溶菌酶,胰蛋白酶,ALP),高丰度蛋白质(HSA,IgG,α-GLB,β-GLB)和离子(Zn2+,Ca2+,Mg2+,Na+,NH4 +,K+,NO3 -,Cl-,CO3 2-,CO3COO-),结果如图6D所示。从图可以看出,上述干扰物质对PBMO纳米探针的发光不产生任何干扰,表明该传感器对AChE具有良好的检测选择性。
表1PBMO纳米探针与各种荧光探针对AChE检测性能的比较
3.5实际样品中的AChE分析
为了评估该PBMO纳米探针在真实样品中的实用性,检测了人血清中AChE的含量。人血清中的Cys和GSH干扰AChE的检测,因此在样本中加入巯基阻断试剂NEM。
如表2所示,健康志愿者稀释后的人血清中AChE的浓度分别1.30±0.09、1.51±0.07和1.09±0.06U L-1。采用加标回收评价该方法的准确性。人体血清样品的加标回收率在96.2~103.6%之间,这表明该PBMO纳米探针在分析复杂样品方面具有潜力。
表2实际样品中AChE含量测定(n=3,95%置信水平)
4、结论
本发明通过BSA结合Mn(Ⅱ)和OPD对ZnGeO:Mn PLNR进行修饰,合成了用于AChE分析的PBMO纳米探针。Mn(Ⅱ)与H2O2的特异性反应显著诱导PBMO的荧光增强。ZnGeO:Mn PLNR优异的长余辉发光、Mn(Ⅱ)较高的荧光猝灭效率以及能量供体与能量受体之间的近距离,为H2O2高灵敏、快速的时间分辨荧光检测提供了基础。AChE可催化ACh生成TCh,TCh易被H2O2氧化。该方法简便、灵敏度高,成功地应用于人血清中AChE的测定。该方法为基于PLNR的探针的设计和应用开辟了新的途径。此外,本发明的PBMO纳米探针还可以用于其他与H2O2相关的分析物检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种PBMO纳米探针,其特征在于,所述PBMO纳米探针的制备方法:以牛血清白蛋白为修饰外壳,对苯二胺为还原剂,利用ZnGeO:Mn长余辉纳米棒和Mn(Ⅱ)分别作为信号分子和猝灭剂,制得PBMO纳米探针。
2.根据权利要求1所述的PBMO纳米探针,其特征在于,所述PBMO纳米探针的制备方法,包括以下步骤:将牛血清白蛋白溶于水中,得到悬浮液,加入ZnGeO:Mn长余辉纳米棒;超声,搅拌后,边搅拌边依次加入硝酸锰水溶液、对苯二胺溶液、氢氧化钠溶液、戊二醛,在38~42℃下继续搅拌22~28 h;离心,用水清洗,制得PBMO纳米探针。
3.根据权利要求2所述的PBMO纳米探针,其特征在于,所述PBMO纳米探针的制备方法,包括以下步骤:将牛血清白蛋白溶于水中,料液质量体积比mg / mL为25:1.4~1.6,得到悬浮液,加入8~12 mg mL−1ZnGeO:Mn长余辉纳米棒 ;超声14~16 min,搅拌4~6 min后,边搅拌边依次加入45~55 mmol L−1 硝酸锰水溶液,1.9~2.1 mol L−1对苯二胺溶液,1.9~2.1 mol L−1氢氧化钠溶液、戊二醛,在38~42℃下继续搅拌22~28 h;所得产物以11000~13000转/分的速度离心,用水清洗,制得PBMO纳米探针;其中,各原料质量体积比例:牛血清白蛋白24~26mg、ZnGeO:Mn长余辉纳米棒 1.4~1.6mL、Mn(NO3)2水溶液1.4~1.6mL,对苯二胺溶液20~30μL,氢氧化钠溶液20~30 μL,戊二醛8~12μL。
4.权利要求1-3任一项所述的PBMO纳米探针在检测H2O2中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的PBMO纳米探针在检测乙酰胆碱酯酶中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,利用PBMO纳米探针检测乙酰胆碱酯酶的方法包括以下步骤:将乙酰胆碱、待测样品溶液、磷酸盐缓冲液混合后,孵育;再加入H2O2,孵育;最后加入PBMO溶液和磷酸盐缓冲液,孵育后进行荧光测定。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,利用PBMO纳米探针检测乙酰胆碱酯酶的方法,包括以下步骤:将乙酰胆碱、待测样品溶液和pH 7.3~7.5磷酸盐缓冲液的混合物在36.5~37.5℃下孵育8~12 min;加入H2O2,36.5~37.5℃孵育8~12 min;最后加入PBMO溶液和pH8.4~8.6磷酸盐缓冲液,孵育4~6 min后进行荧光测定。
8.根据权利要求6-7任一项所述的应用,其特征在于,检测体系中的PBMO、乙酰胆碱和H2O2的浓度分别为70~80 μg mL−1、1.5~2.5mmol L−1和25~35 μmol L−1。
9.根据权利要求6-7任一项所述的应用,其特征在于,所述待测样品溶液的制备包括以下步骤:取离体血液,2500~3500 rpm离心4~6 min,上清液经膜过滤器过滤得到血清样品;将血清样品加入乙酰胆碱酯酶按照体积比为1000:0.8~1.2混合,最后稀释400~600倍,得到待测样品溶液。
10.根据权利要求5-7任一项所述的应用,其特征在于,
在乙酰胆碱酯酶检测中,荧光激发波长为250 nm,荧光发射波长为530 nm,发光猝灭效率q 2由公式q 2 = 1−F/F 0计算得到,其中F和F 0分别为含AChE和不含AChE的PBMO时间分辨荧光强度;
通过以下关系式计算AChE浓度,其标准曲线方程为q 2 = 0.0931 log C+0.124,其中q 2为发光猝灭效率,C为AChE浓度,线性范围为0.08~10 U L−1,线性相关系数为0.997;检出限为0.03 U L−1。
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Time-resolved fluorescence determination of albumin using ZnGeO:Mn luminescence nanorods modified with polydopamine nanoparticles;Gao, LF;等;MICROCHIMIC ACTA;第188卷(第12期);429 * |
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