CN116870163A - Pich表达抑制剂在制备增强胃癌对5-fu化疗敏感性药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种PICH表达抑制剂在制备增强胃癌对5‑FU化疗敏感性药物中的应用。本发明发现PICH的表达影响5‑FU的化疗敏感性，其中PICH缺失提高了5‑FU的化疗敏感性，而高表达减弱了5‑FU的化疗敏感性，可用于预测/调控5‑FU的化疗敏感性；其次，本发明发现以PICH为靶点可用于制备增强胃癌对5‑FU化疗敏感性药物，所述药物以PICH基因/蛋白为靶点，抑制PICH基因/蛋白的表达；再次，本申请提供了一种靶向PICH的SgRNA，证明了所述PICH基因/蛋白的表达抑制剂能够增强胃癌对5‑FU化疗敏感性，其与5‑FU联用增强了胃癌的治疗效果，具有潜在的应用价值。

Description

PICH表达抑制剂在制备增强胃癌对5-FU化疗敏感性药物中的 应用

技术领域

本发明属于医疗领域，具体涉及PICH表达抑制剂在制备增强胃癌对5-FU化疗敏感性药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是世界范围内人类死亡的主要病因之一，是各个国家所关注的最重要的健康问题之一。随着全球人口数量的迅速增长、老龄化的比例增加、人类生活习惯的改变、社会经济的发展及自然环境的破坏，恶性肿瘤的发病率及病死率也逐渐增高。癌症已日益成为大多数国家居民病死率最高的疾病。其中，胃癌是我国最常见的消化系统肿瘤，由于在疾病早期缺乏明显和特异性的症状，大多数胃癌患者在疾病晚期确诊，并且预后较差。目前化疗是针对胃癌晚期患者以及术后复发患者的主要治疗方式，然而由于化疗药物产生的胃癌细胞耐药导致化疗效果受限。

目前胃癌治疗过程中，常用的一线化疗药物包括5-FU、顺铂、奥沙利铂、伊立替康等。但是，胃癌化疗方案的有效率多在50％左右，有部分患者出现原发耐药，也有一部分会出现继发耐药。如何提高胃癌化疗疗效，减少无效化疗是临床迫切需要解决的难题。NCCN胃癌临床实践指南(NCCN指南)明确指出手术联合化疗是晚期胃癌的标准化治疗，且以5-FU为基础的化疗仍然是当今胃癌术后患者治疗的基石。然而，基于5-FU化疗后患者的三年无复发生存率却低于50％。更重要的是，NCCN指南仍然没有推荐针对术后胃癌的靶向治疗和免疫治疗，而经验性化疗对一部分胃癌患者不仅无利且有害。因此，迫切需要深入了解5-FU耐药机制，以确定有价值的化疗敏感性预测因子，指导个体化治疗方案，改善术后胃癌患者的治疗效果。

PICH是SWI/SNF蛋白家族中的一种DNA解螺旋酶，全长包括1250个氨基酸，PICH具有双链DNA(dsDNA)转座酶活性，其对dsDNA结合亲和力随着张力诱导的DNA拉伸而增加，可在体外张力下优先与DNA结合，通过募集MAD2到中心粒或监测着丝粒和染色质的张力，实现对有丝分裂检查点的调控。近年来，PICH在恶性肿瘤中作用的广泛受到国内外研究人员的关注。研究发现其对肾癌、乳腺癌、结肠癌和肝癌等恶性肿瘤的发生发展均有一定影响。但是关于PICH是否与化疗药物的化疗敏感性相关，目前并无报道。

本发明在研究过程中发现，PICH的表达与抑制对奥沙利铂、伊立替康等药物的化疗敏感性并无直接影响，而特异性的影响氟尿嘧啶(5-FU)的化疗敏感性。可用于预测/调控癌症患者对5-FU的化疗敏感性；而且以PICH为靶点可用于制备增强癌症对5-FU化疗敏感性药物，具有潜在的应用价值。

发明内容

针对上述技术问题，本发明意外发现：PICH的表达特异性的影响5-FU的化疗敏感性，可用于预测/调控5-FU的化疗敏感性；以PICH为靶点可用于制备增强胃癌对5-FU化疗敏感性药物，所述药物以PICH基因/蛋白为靶点，抑制PICH基因/蛋白的表达；而且本申请提供了一种靶向PICH的SgRNA，证明了所述PICH基因/蛋白的表达抑制剂能够增强胃癌对5-FU化疗敏感性，其与5-FU联用增强了胃癌的治疗效果，具有潜在的应用价值。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种检测PICH基因/蛋白表达的试剂在制备用于预测和/或调控癌症患者对于5-FU化疗敏感性的试剂中的应用。

优选地，所述癌症为胃癌。

第二方面，本发明提供了一种PICH基因/蛋白作为靶点在制备增强癌症对5-FU化疗敏感性药物中的应用，所述药物以PICH基因/蛋白为靶点，抑制PICH基因/蛋白的表达。

优选地，所述癌症为胃癌。

第三方面，本发明提供了PICH基因/蛋白表达抑制剂在制备增强癌症对5-FU化疗敏感性药物中的应用。

优选地，所述癌症为胃癌。

优选地，所述抑制剂为干扰PICH基因/蛋白表达的RNA片段，或靶向PICH的SgRNA，或下调PICH基因/蛋白表达的小分子化合物。

优选地，所述靶向PICH的SgRNA的序列如SEQ ID NO.1-3任一所示。

优选地，所述SgRNA是由SEQ ID NO.4和5所示序列退火形成的双链；或，所述SgRNA是由SEQ ID NO.6和7所示序列退火形成的双链；或，所述SgRNA是由SEQ ID NO.8和9所示序列退火形成的双链。

第四方面，本发明提供了一种治疗癌症的组合物，所述组合物包括5-FU和PICH基因/蛋白表达抑制剂。

优选地，所述抑制剂为干扰PICH基因/蛋白表达的RNA片段，或靶向PICH的SgRNA，或下调PICH基因/蛋白表达的小分子化合物。

优选地，所述靶向PICH的SgRNA的序列如SEQ ID NO.1-3任一所示。

优选地，所述SgRNA是由SEQ ID NO.4和5所示序列退火形成的双链；或，所述SgRNA是由SEQ ID NO.6和7所示序列退火形成的双链；或，所述SgRNA是由SEQ ID NO.8和9所示序列退火形成的双链。

第五方面，本发明提供了上述第四方面所述的组合物在制备治疗癌症药物中的应用。

优选地，所述癌症为胃癌。

本发明的有益效果是：(1)本发明发现PICH的表达与抑制对奥沙利铂、伊立替康等药物的化疗敏感性并无直接影响，而特异性的影响氟尿嘧啶(5-FU)的化疗敏感性，其中PICH缺失提高了5-FU的化疗敏感性，而高表达减弱了5-FU的化疗敏感性，可用于预测/调控癌症患者对5-FU的化疗敏感性；(2)本发明发现以PICH为靶点可用于制备增强胃癌对5-FU化疗敏感性药物，所述药物以PICH基因/蛋白为靶点，抑制PICH基因/蛋白的表达；(3)本发明提供了一种靶向PICH的SgRNA，证明了所述PICH基因/蛋白的表达抑制剂能够增强胃癌对5-FU化疗敏感性，其与5-FU联用增强了胃癌的治疗效果，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1PICH敲除效率检测结果；

图2敲除PICH可以抑制胃癌细胞的生长和迁移的结果；其中A为MTT检测PICH敲除前后细胞增殖图；B为高内涵活细胞计数PICH敲除前后细胞增殖图；C为细胞划痕实验检测PICH敲除前后细胞迁移情况图；D为Transwell实验检测PICH敲除前后细胞侵袭情况图；

图3敲除PICH在CDX及PDX小鼠模型中对5-FU化疗敏感性的影响结果；其中A为CDX模型中5-FU处理的代表性策略；B为5-FU处理SgCtrl与SgPICH组小鼠的肿瘤图；C为5-FU处理SgCtrl与SgPICH组小鼠的肿瘤体积统计图；D为5-FU处理SgCtrl与SgPICH组小鼠的肿瘤重量统计图；E为在PDX模型中，PICH^High与PICH^Low组原发性肿瘤的H&E及免疫组化图以及PDX小鼠肿瘤图；F为5-FU处理PICH^High与PICH^Low组小鼠的肿瘤体积统计图；D为5-FU处理PICH^High与PICH^Low组小鼠的肿瘤重量统计图；

图4PICH对胃癌类器官5-FU化疗敏感性的影响结果；其中A为不同样本原发性肿瘤及类器官的H&E染色图以及5-FU处理Ctrl与PICH^OE组类器官图；B为5-FU处理Ctrl与PICH^OE组类器官IC₅₀计算统计图；

图5PICH在临床具有成为5-FU化疗敏感性预测因子的潜在价值的结果；其中A为IHC染色和定量PICH的表达水平在接受5-FU治疗的124名胃癌患者中；B为ROC曲线分析PICH对接受5-FU治疗的患者生存的预测价值；C为Kaplan-Meier生存预后分析接受5-FU治疗的患者PICH表达水平与生存之间的关系；

图6PICH对5-FU、奥沙利铂和伊利替康化疗敏感性的影响结果；其中A为敲除PICH对5-FU的影响；B为过表达PICH对5-FU的影响；C为敲除PICH对奥沙利铂的影响；D为敲除PICH对伊利替康的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施例仅用于举例说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市购获得的常规产品。实施例1敲除PICH抑制胃癌细胞的生长和迁移

1.PICH-sgRNA重组质粒构建

(1)sgRNA靶点的设计

在NCBI中查询人源PICH(Gene ID：54821)基因序列，基于张峰实验室网站http://crispr.mit.edu/设计sgRAN，分别设计三条sgRNA，PICH-sgRNA-1，PICH-sgRNA-2和PICH-sgRNA-3：

所述PICH-sgRNA-1的靶向序列为：TATGAGACTCTTGTAAAGCG(SEQ ID NO.1)；所述PICH-sgRNA-1由PICH-sgRNA-1-F：5’-TGTGGAAAGGACGAAACACCGTATGAGACTCTTGTAAAGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’(SEQ ID NO.4)和PICH-sgRNA-1-R：5’-TGCTATTTCTAGCTCTAAAACCGCTTTACAAGAGTCTCATACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’(SEQ ID NO.5)退火形成的双链；

所述PICH-sgRNA-2的靶向序列为：CCTCGGCTTCCGGAAACCTT(SEQ ID NO.2)；所述PICH-sgRNA-2由PICH-sgRNA-2-F：5’-TGTGGAAAGGACGAAACACCGCCTCGGCTTCCGGAAACCTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’(SEQ ID NO.6)和PICH-sgRNA-2-R：5’-TGCTATTTCTAGCTCTAAAACAAGGTTTCCGGAAGCCGAGGCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’(SEQ ID NO.7)退火形成的双链。

所述PICH-sgRNA-3的靶向序列为：TTTGAGACTCGAATTCAACG(SEQ ID NO.3所示)；所述PICH-sgRNA-3由PICH-sgRNA-3-F：5’-TGTGGAAAGGACGAAACACCGTTTGAGACTCGAATTCAACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’(SEQ ID NO.8)和PICH-sgRNA-3-R：5’-TGCTATTTCTAGCTCTAAAACCGTTGAATTCGAGTCTCAAACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’(SEQ ID NO.9)退火形成的双链。

sgRNA的退火杂交：将sgRNA上、下游序列合成产物稀释至100μmol/L后，取上、下游引物各1μL，并加入10×Buffer for T4 DNA Ligase with 10mM ATP 1μL，以及ddH₂O 7μL，共10μL体系。按照95℃，5min；85℃，1min；75℃，1min；65℃，1min；55℃，1min；45℃，1min；35℃，1min；25℃，1min梯度退火处理，使上下游引物形成双链。退火结束后，于10μL退火产物中添加190μL ddH₂0进行稀释后，用于Gibson连接。

pLenti-CRISPR-V2载体的酶切：利用限制性内切酶BsmBI酶切pLenti-CRISPR-V2载体，按照NEB Buffer 5μL、pLenti-CRISPR-V2载体5μg，BsmBI 2μL、补ddH₂O至50μL，共50μL反应体系，37℃酶切4-8h，胶回收酶切产物；

酶切载体与sgRNA的连接：配制20μL连接反应体系，其中，pLenti-CRISPR-V2酶切片段3μL、退火后的sgRNA 2μL，Gibson连接体系15μL，置50℃连接1h；

pLenti-CRISPR-V2-sgRNA连接产物转化：将连接产物转化Trans5α感受态细胞，涂布于含Amp的LB固体培养皿上，37℃过夜培养，挑取菌落振荡培养后，提取质粒，测序。使用MegAlign软件对测序结果与目的基因序列进行对比，成功构建具有靶向PICH基因不同外显子的sgRNA重组质粒，重组质粒分别命名为：pLenti-CRISPR-V2-PICH-sgRNA-1、pLenti-CRISPR-V2-PICH-sgRNA-2和pLenti-CRISPR-V2-PICH-sgRNA-3。

(2)细胞的转染

复苏AGS细胞传代1-2次，当细胞性状稳定且状态良好时，用0.25％ EDTA胰酶消化细胞，按3×10⁵个细胞/孔的密度接种至6孔板中，置含5％ CO₂的37℃细胞培养箱中培养，待细胞密度生长至40％-50％时进行转染。将4-6μg pLenti-CRISPR-V2-PICH-sgRNA重组质粒加入细胞中轻柔混匀，再加入8μL polybrene转染试剂于培养的6孔板细胞中，将细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养72h。

(3)嘌呤霉素加压筛选阳性细胞

为了剔除大量sgRNA阴性细胞，用0.25％ EDTA胰酶消化转染pLenti-CRISPR-V2-PICH-sgRNA重组质粒72h后的AGS细胞，把细胞按照1：3传代比例接种到新的细胞6孔板中，同时每孔细胞中加入2-4μg/mL的嘌呤霉素，将细胞重新置于37℃、5％ CO₂培养箱中培养加压筛选3天，更换新鲜培养基使阳性细胞正常生长。

(4)亚克隆筛选阳性单克隆细胞株

挑选已通过嘌呤霉素加压筛选且状态良好的细胞孔，用0.25％ EDTA胰酶消化后，用1mL DMEM培养基吹打均匀进行细胞计数，然后用DMEM完全培养基将细胞稀释至10个细胞/mL，将稀释后的细胞悬液加入96孔板中，0.1mL/孔，即每孔中有1个细胞。将细胞培养板置含5％CO₂的37℃培养箱中培养5-7d后观察，剔除双克隆、多克隆细胞孔，标记单克隆且细胞状态良好的细胞孔，用0.25％ EDTA胰酶消化后，加入400μL DMEM完全培养基培养基吹打混匀，传代至48孔板中继续培养，待细胞长满后依次传代至12孔板、6孔板中进行扩大培养。

(5)单克隆细胞株的测序鉴定

取野生型细胞与各个待鉴定单克隆细胞株，按照细胞微量DNA提取试剂盒说明书分别提取DNA，扩增含有sgRNA靶向位点的片段，经1％琼脂糖凝胶电泳后，胶回收扩增产物，测序。将待鉴定单克隆细胞株与野生型细胞株扩增产物的测序结果进行序列分析，将显示因碱基插入或碱基缺失而导致基因序列产生移码突变的对应细胞株以及序列比对没有发生碱基改变的细胞株，分别标记为SgCtrl和SgPICH。

(6)Western blot分析

分别收集经测序鉴定的细胞样品，加入适量1×SDS loading buffer充分搅拌裂解后，吸取至相应标记好的1.5mL离心管中，放入金属浴100℃变性12min，4℃，12000rpm离心2min，取上清10μL上样进行SDS-PAGE。蛋白样品经SDS-PAGE电泳后通过湿转法，在冰浴中100V恒压转膜1.5h，印记到NC膜上。5％脱脂奶粉封闭1h后，分别加入经抗体稀释液1：1000倍稀释的兔抗PICH抗体和鼠抗GAPDH抗体作为一抗，4℃孵育过夜；用TBST溶液重复清洗NC膜3次，置于快速摇床震荡，每次5min；再分别加入经TBST溶液1：1000倍稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG抗体作为二抗，室温孵育2h；再次采用同样的方法清洗NC膜3次，最后用ECL化学发光显色液检测，图片经Image Lab 4.1(BIO-RAD)扫描成像。

结果如图1所示，与SgCtrl相比，SgPICH-1，SgPICH-2和SgPICH-3细胞系中均检测不到PICH的蛋白表达。上述结果表明，PICH基因敲除AGS细胞系构建成功，分别命名为SgPICH-1，SgPICH-2和SgPICH-3。以同样方法构建成功了PICH基因敲除MKN45细胞系。

2.SgPICH对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响

(1)细胞增殖实验

①将细胞以3×10³铺于96孔板，体积100μL每孔。

②分别于0h，24h，48h，72h，96h每孔加入20μLMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养1h。在酶联免疫检测仪OD₄₉₀nm处测量各孔的吸光值。或者利用高内涵活细胞成像技术分别于0h，10h，20h，30h，40h，50h，60h进行计数统计。

(2)细胞迁移实验

①将细胞以6×10³铺于12或24孔板，待16-24小时，细胞贴壁后，进行划痕处理，并测量距离。

②培养24小时后，再次进行距离测量。

③统计敲除组与对照组数据，计算迁移率。

(3)细胞侵袭实验

基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃，30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。

制备细胞悬液：

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×10⁵/ml。

接种细胞：

①取细胞悬液100μL加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600μL含20S的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

③培养细胞：常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞侵袭力外。处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

结果统计：直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。

取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。

0.1％结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。

400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。

结果显示，利用本申请实施例1中所述的sgRNA在胃癌细胞中敲除PICH后，胃癌的细胞的增殖和迁移侵袭均受到了明显抑制。其中以本申请实施例1中所述的PICH-sgRNA-3为例构建的PICH敲除胃癌细胞中胃癌的细胞的增殖明显受到了抑制(结果如图2中A和B所示)，且对比对照组，敲除组的细胞迁移侵袭均受到了抑制(如图2中C和D所示)，因此敲除PICH具有抑制胃癌细胞的生长和迁移的作用。

实施例2PICH在CDX及PDX小鼠模型中对5-FU化疗敏感性的影响

通过构建CDX(cell derived xenograft)，PDX(patient derived xenograft)小鼠模型，检测PICH基因对5-FU化疗敏感性的影响。

CDX模型主要是将肿瘤细胞系移植到裸鼠。其要点如下：分别将MKN45-Luci转染的细胞(对照组)，PICH敲除的胃癌MKN45-Luci细胞(实验组，以实施例1所述的PICH-sgRNA-3为例，构建的PICH敲除胃癌细胞，PICH-sgRNA-1和2与PICH-sgRNA-3效果一致)悬液，分别皮下注射至裸鼠形成移植瘤。在适当的条件喂养。待7天肿瘤长出后，开始给与小鼠每周2次的5-FU皮下注射，每三天记录一次肿瘤大小及体积，至21天处死裸鼠。计算分析PICH基因对5-FU化疗裸鼠成瘤能力、生长曲线以及肿瘤的转移能力的影响。小鼠模型分组具体如表1所示。

表1CDX小鼠模型分组

PDX模型是将胃癌肿瘤组织以组织的形势移植至NSG小鼠体内，从而很好的保持了肿瘤的异质性。其要点如下：分别获取新鲜的PICH高表达与低表达胃癌组织切成小块组织，与基质胶充分混合，再将用套管针将肿瘤块穿刺至免疫缺陷小鼠NSG皮下，并用灭菌棉签按压进针部位，避免出血及组织溢出。在适当的条件喂养。待7天肿瘤长出后，开始给与小鼠每周2次的5-FU皮下注射，每三天记录一次肿瘤大小及体积，至21天处死裸鼠。计算分析PICH基因对5-FU化疗NSG小鼠成瘤能力、生长曲线以及肿瘤的转移能力的影响。小鼠模型分组具体如表2所示。

表2PDX小鼠模型分组

结果如图3所示：对于CDX小鼠模型，5-FU治疗适度减缓了SgCtrl小鼠的肿瘤的生长，而它显著降低了SgPICH小鼠的肿瘤的生长(如图3中A–D所示)。而对于PDX小鼠模型，5-FU治疗在PICH^Low组中比在PICH^High组中更大程度地抑制了肿瘤生长(如图3中E–G所示)，表明无论在CDX还是PDX模型中，PICH敲除(SgPICH)和低表达PICH(PICH^Low)的实验组均明显提高了5-FU的化疗敏感性。

实施例3PICH对胃癌类器官5-FU化疗敏感性的影响

(1)构建胃癌类器官模型：①手术室获取新鲜胃癌组织，经PBS清洗后剪碎，加入1mg/mL胶原酶XI消化裂解60min，使用细胞筛过滤消化产物得到细胞悬液；②离心后弃上清，获得肿瘤干细胞，将肿瘤干细胞与基质胶混合均匀后种于细胞培养板，加入生长培养基进行培养得到胃癌类器官(Ctrl-organoid)；

(2)将PICH过表达慢病毒载体(购于吉凯)过表达于胃癌类器官。待类器长满后，通过IHC验证过表达后，重新将过表达PICH类器官(PICH-OE-organoid)酶解消化后用40μm细胞筛进行过滤，过滤所得类器官，使用基质胶重悬，按每孔10μL(约20个球形体)种植于96孔板，加入培养基后培养3天；3天后，更换培养基；Ctrl-organoid和PICH-OE-organoid组均设立不同的5-FU浓度梯度实验组包括0μM，0.1μM，1μM，5μM，10μM，50μM，100μM，500μM，1000μM，5000μM进行加药处理，持续作用6天；药物作用期间，每2天更换新鲜培养基，并加入相应药物。待药物作用6天后使用3d cell viability assay试剂盒检测各孔中耐热萤光素酶活性的测量值，以确定类器官不同药物不同浓度下的活力。

结果如图4所示，相比对照组，过表达PICH的胃癌类器官对5-FU的化疗敏感性明显降低(图4中A和B所示)。

实施例4PICH在临床具有成为5-FU化疗敏感性预测因子的潜在价值

通过收集筛选5-FU化疗病人大样本，应用组织芯片、IHC检测PICH表达水平，结合临床资料，应用ROC和生存分析方法，明确PICH与胃癌临床病理特征和预后的相关性，阐明PICH作为胃癌5-FU化疗耐药潜在的预测因子的研究与应用价值。

结果如图5所示：对于124例接受基于5-FU的化疗的胃癌患者，耐药组的PICH表达明显更高(图5中A所示)。受试者工作特征(ROC)分析显示，PICH对胃癌中5-FU化疗敏感性具有较高的诊断价值，ROC曲线面积(AUC)为0.88(敏感性：85.88％，特异性：92.31％；图5中B所示)。此外，我们将患者分为PICH低(IHC评分<155)和高(IHC评分≥155)组，发现高PICH蛋白水平组与接受基于5-FU的化疗患者的预后呈负相关(HR＝7.412；图5中C所示)。因此，PICH具有良好的预测价值。

实施例5PICH在胃癌细胞中表达对5-FU、奥沙利铂和伊立替康化疗敏感性的影响

1.取敲除PICH或过表达PICH的胃癌细胞以6×10³/mL的细胞密度接种于96孔培养板中，每孔100μL，置37℃、5％ CO₂及饱和湿度的条件下培养过夜。

2.待其贴壁后，分别加入5-FU，Oxaliplatin，Irinotecan使其终浓度达到0μM，0.1μM，1μM，5μM，10μM，50μM，100μM，500μM，1000μM，5000μM，每组设4个复孔，每孔终体积为200μL。对照组加入等量的DMEM培养液。

3.培养48h后，每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，继续培养1h。

4.酶标仪于490nm波长测定吸光度(D)，计算不同时间、不同浓度的5-FU，Oxaliplatin，Irinotecan对胃癌细胞的IC₅₀。

结果如图6所示，我们测定了5-FU，Oxaliplatin，Irinotecan在SgPICH和SgCtrlAGS和MKN-45细胞中的IC₅₀。发现PICH缺失(以实施例1中所述的PICH-sgRNA-3为例构建的PICH敲除胃癌细胞)显著地提高胃癌细胞对5-FU的化疗敏感性(图6中A所示)。一致地，PICH过表达(以PICH过表达慢病毒载体(购于吉凯)转染胃癌细胞)降低了AGS和MKN-45细胞对5-FU的化疗敏感性(图6中B所示)。然而，PICH的缺失对Oxaliplatin，Irinotecan化疗敏感性无明显影响(图6中C所示)。因而，抑制PICH的表达对奥沙利铂、伊立替康等药物的化疗敏感性并无直接影响，而特异性的影响氟尿嘧啶(5-FU)的化疗敏感性。

综上结果表明，通过抑制PICH基因表达，能够特异性且显著性的增强氟尿嘧啶(5-FU)的化疗敏感性。因此，以PICH为靶点可用于制备增强胃癌对5-FU化疗敏感性药物，所述药物以PICH基因/蛋白为靶点，抑制PICH基因/蛋白的表达；而且所述PICH基因/蛋白的表达抑制剂能够增强胃癌对5-FU化疗敏感性，其与5-FU联用增强了胃癌的治疗效果，具有潜在的应用价值。

Claims (10)

1.检测PICH基因/蛋白表达的试剂在制备用于预测和/或调控癌症患者对于5-FU化疗敏感性的试剂中的应用。

2.PICH基因/蛋白作为靶点在制备增强癌症对5-FU化疗敏感性药物中的应用，所述药物以PICH基因/蛋白为靶点，抑制PICH基因/蛋白的表达。

3.PICH基因/蛋白表达抑制剂在制备增强癌症对5-FU化疗敏感性药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为干扰PICH基因/蛋白表达的RNA片段，或靶向PICH的SgRNA，或下调PICH基因/蛋白表达的小分子化合物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述靶向PICH的SgRNA的序列如SEQ IDNO.1-3任一所示。

6.一种治疗癌症的组合物，其特征在于，所述组合物包括5-FU和PICH基因/蛋白表达抑制剂。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述抑制剂为干扰PICH基因/蛋白表达的RNA片段，或靶向PICH的SgRNA，或下调PICH基因/蛋白表达的小分子化合物。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述靶向PICH的SgRNA的序列如SEQ IDNO.1-3任一所示。

9.如权利要求6-8任一所述的组合物在制备治疗癌症药物中的应用。

10.如权利要求1-3和权利要求9任一所述的应用，其特征在于，所述癌症为胃癌。