CN116869942A - 一种多联微球包覆的药物载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多联微球包覆的药物载体及其制备方法和应用。所述药物载体以负载药物的凹凸棒土颗粒为内核，并以相互连接的PLGA微球包覆所述内核表面，且所述药物载体表面凹凸不平且为多孔状。所述药物载体的制备方法为：通过喷雾造粒得到凹凸棒土颗粒，将药物负载至所述凹凸棒土颗粒中，再对凹凸棒土颗粒进行PLGA表面包覆。本发明提供的药物载体缓释性能良好、安全性好，对抗肿瘤药物传递具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种利用纳米无机材料与高分子材料结合改善药物释放速率的药物载体，以及该药物载体的制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症是人类生命健康的最大杀手也是当今医学界所面临的重大难题之一，化学治疗是癌症治疗最重要的手段，但传统的化学疗法存在毒副作用大、药物生物利用率低、药物突释问题严重等缺点，限制了其在癌症治疗中的应用与发展，且多数化学治疗药物缺少到达肿瘤组织的能力，对肿瘤细胞缺乏选择杀伤作用，在杀伤肿瘤细胞的同时也伤及正常细胞，特别是癌细胞因为给药处理产生耐药性，为了克服癌细胞的耐药性需要给予更高的抗癌药剂量，从而对正常细胞造成较大的副作用，甚至中断治疗；另一方面，多数抗肿瘤药物的功效由于其自身性质，如水溶性差、治疗窗口窄等也限制了肿瘤治疗。
从上世纪70年代开始，药物载体作为化疗药物传递系统用于癌症治疗引起了人们的极大关注。用于药物传递系统的粒子其粒径在10～1000nm，可以有多种材料构成，包括聚合物、脂质、病毒和有机金属复合物等，随着研究的进一步深入，该领域逐渐扩展到包括树枝状大分子、胶束、聚合物纳米球和无机纳米材料（如金、硅、金属、氧化铁）。基于纳米技术的药物传递是癌症治疗的新兴领域之一。
目前，虽然各种材料已经非常前端，对于该领域的探索还远远不够，尤其对于制备方法和药物载体结构的突破却非常少见。目前使用传统的乳化溶剂挥发技术、喷雾干燥技术和层层自组装技术等都是制备药物载体的常用手段，能否脱离或相互结合创新出新型制备手段是有待解决的问题，同时由于人体组织各部位的生理环境存在着巨大的差异，以及针对不同的疾病和药物，常常需要量身定制治疗方法应对不同的场景。利用纳米材料作为抗肿瘤药物的载体，构建新型的智能响应体系，可实现药物的缓释并稳定血液中药物浓度，从而降低其对病人的毒副作用，提高肿瘤的治疗效果，也是当下研究热点。
发明内容
有鉴于此，本发明利用纳米无机材料和高分子材料构建了一种新型药物载体，该药物载体能够提高水溶性药物包封率、改善药物突释问题，并有效解决大尺寸药物载体导致的栓塞。
本发明的技术方案具体如下：
本发明第一方面提供了一种多联微球包覆的药物载体，所述药物载体以负载药物的凹凸棒土颗粒为内核，并以相互连接的PLGA微球包覆所述内核表面，所述药物载体表面凹凸不平且为多孔状。
本发明利用凹凸棒土（ATT）对药物分子的较强吸附能力实现药物负载，再对负载药物的凹凸棒土颗粒进行包覆，有利于提高药物包封率。而且在包覆时，利用了凹凸棒土的纳米尺寸效应形成了多联微球的独特结构，使得药物载体表面既为多孔结构又呈凹凸不平的状态，从而有利于药物释放和载体降解，有效避免了传统乳化溶剂挥发法制备的载体因粒径尺寸太大且PLGA降解速率慢而进入人体组织内血管导致的栓塞问题。另外，本发明将凹凸棒土无机纳米材料造粒并与生物相容性较好的高分子材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）结合，形成的药物载体对人体副作用较小，在有效呈递药物的同时有效减少了对人体的毒副作用。
优选地，在上述药物载体中，所述凹凸棒土颗粒为球形且尺寸为15-30μm，所述PLGA微球的尺寸为200-500nm。
更为优选地，在上述药物载体中，所述药物载体的整体尺寸在30-50μm之间。
优选地，在上述药物载体中，药物可以为水溶性药物。目前大多数现有技术制备的药物载体均对温度、光照较为敏感的水溶性药物的包封效果不好，或由于高温导致材料失活，或在水溶液中制备导致药物大量流失。而本发明提供的新型药物载体能够有效改善水溶性药物包封率低的问题，如当水溶性药物为盐酸阿霉素（DOX）时，其整体包封率可达到95%以上。
在本发明一实施例中，所述水溶性药物为盐酸阿霉素，所得药物载体在宏观上为红色颗粒物状，须保持避光2-8℃低温储存。由于凹凸棒土具有优秀的吸水性能，盐酸阿霉素主要以孔道吸附形式存在于凹凸棒土颗粒中，同时盐酸阿霉素溶于水为酸性，而凹凸棒土的OH-使其也有一定的结合能力。
本发明第二方面提供了一种制备上述多联微球包覆的药物载体的方法，具体包括以下步骤：
S1、将含有凹凸棒土、粘结剂和分散剂的浆料混匀后喷雾造粒，得到凹凸棒土颗粒；
S2、将药物负载至所述凹凸棒土颗粒中；
S3、对步骤S2所得负载药物的凹凸棒土颗粒进行PLGA表面包覆，以改善其释药速率。
优选地，在上述方法中，步骤S1所述浆料中含有：凹凸棒土 20-30wt%，分散剂1.5-3.0wt%和粘结剂0.2-1.0wt%。在本发明一实施例中，所述浆料由凹凸棒土、聚丙烯酸铵（分散剂）、聚乙烯醇（粘结剂）和去离子水组成。
优选地，在上述方法中，所述凹凸棒土在制备成浆料前进行了煅烧预处理，以去除杂质、表面吸附水和孔道水，提高凹凸棒土的药物负载能力。更为优选地，所述煅烧预处理的加热方式为：慢速升温并将最终温度控制在200℃以上且不超过450℃，保持时间10h以上。
优选地，在上述方法中，所述浆料可采用球磨的方式混匀。
在上述方法中，喷雾造粒时的进料速度和温度是影响凹凸棒土颗粒形状和尺寸的关键因素，故在喷雾造粒过程中，进料速度不宜过快，如可保持在12mL/min左右，且该过程温度应控制在120℃以上。
优选地，在上述方法中，待喷雾造粒形成颗粒均匀、尺寸符合要求的凹凸棒土颗粒后，对所述凹凸棒土颗粒进行脱脂处理，以除去对人体有害的分散剂并起到固化颗粒的作用。
更为优选地，所述凹凸棒土颗粒在不高于420℃的条件下进行脱酯处理，且升温方式为慢速升温。
在上述方法中，可根据药物性质不同，选择不同的方式将所述药物负载至凹凸棒土颗粒中。如在本发明一实施例中，药物为水溶性药物盐酸阿霉素，采用了以下方式进行负载：将凹凸棒土颗粒混悬至水溶液中并保持搅拌，将盐酸阿霉素溶液与之混合，进行避光处理同时使用200-500r/min的转速匀速搅拌24h后即完成药物负载；再将负载盐酸阿霉素凹凸棒土的混悬液直接倒入培养皿中，在-40℃的冰箱中至完全结冰无液体存在，再将其覆盖保鲜膜并扎孔进行冷冻干燥处理，获得干燥的负载盐酸阿霉素的凹凸棒土颗粒。
优选地，在上述方法中，当药物为盐酸阿霉素时，所述凹凸棒土颗粒与所述盐酸阿霉素的质量比应不超过4:1。
优选地，在上述方法中，步骤S3具体为：将步骤S2所得负载药物的凹凸棒土颗粒分散于溶解有PLGA的溶剂中，加入PVA溶液，乳化后加入到PBS溶液，待所述溶剂完全挥发且载药微粒固化后，离心洗涤，冷冻干燥即得所述药物载体。
在上述方法中，本发明利用凹凸棒土纳米尺寸效应，在包覆阶段PLGA固化成球的过程中以喷雾造粒后负载盐酸阿霉素的凹凸棒土颗粒（DOX-ATT-MS）表面的纳米针状材料作为核，独自在表面沉积成大量的纳米球；进一步通过对PLGA和DOX-ATT-MS 的投料比进行控制，最终可以形成由尺寸在200-500nm的PLGA微球相互联结构成的表面凹凸不平并多孔的药物载体结构。
更为优选地，所述 PLGA具体为酯封端PLGA且其分子量为3-5w。在本发明的实验过程中发现，PLGA分子量的不同会影响其与凹凸棒土颗粒表面的结合能力，当分子量在3w-5w之间时，所得药物载体具有较好的效果；当采用不同类型的PLGA时，包覆效果也有着显著区别，如采用端羧基PLGA往往会导致PLGA单独成球，不能形成很好的包覆作用。
更为优选地，步骤S3所述PLGA与所述负载药物的凹凸棒土颗粒的质量比为3:2。
更为优选地，步骤S3所述溶剂为挥发性的有机溶剂，包括但不限于二氯甲烷、四氢呋喃等；可以理解的是，在该步骤中，溶剂的使用目的包括实现乳化，溶解PLGA，并在后期处理过程中逐渐挥发实现PLGA沉积等，故原则上满足上述目的的溶剂均可使用。
更为优选地，步骤S3所述PVA溶液的浓度为2 wt%；在乳化过程中，所述溶剂与2wt% PVA溶液的最佳体积比为1:2。
更为优选地，步骤S3所述离心洗涤的条件为7000-8500rpm离心3-10min，以充分除去药物载体表面附着的PVA。
本发明第三方面提供了上述多联微球包覆的药物载体在制备药物中的应用。
如在本发明的一实施例中，所述药物载体负载的是抗肿瘤药物盐酸阿霉素，且实验数据表明，负载盐酸阿霉素的药物载体在实际药物浓度相同的情况下体外抗癌效果更好，可见该药物载体在药物制备领域具有重要意义。
本发明的有益效果为：
（1）本发明创造性地利用凹凸棒土的纳米尺寸效应，在其表面包覆一层由无数个纳米尺寸的PLGA微球形成的保护层，在实现药物有效缓释的同时加快药物载体本身的解构，有效减少大尺寸载药微球出现栓塞的可能性。
（2）相比于直接使用凹凸棒土负载药物时，由于其纳米尺寸导致药物释放速率过快而起不到缓释效果的问题；本发明创造性地先进行喷雾造粒使其团聚成颗粒，再将其进行药物负载，不仅能有效避免高温导致的药物失活，而且颗粒在缓释过程中逐渐分解，减少其药物突释，增强缓释能力。
（3）本发明在使用吸附能力较强的凹凸棒土颗粒进行药物负载后，随以PLGA对负载药物的凹凸棒土颗粒进行包覆，大大改善了药物（尤其是水溶性药物）包封率低的问题，整体包封率可达到95%以上。
（4）本发明通过凹凸棒土这种无机纳米材料造粒和PLGA这种生物相容性较好的高分子材料的结合，形成对人体副作用较小的药物缓释体系，在对肿瘤造成杀伤的同时减少对人体的毒副作用。
附图说明
图1为本发明制备的DOX-ATT-PLGA-MS的红外谱图。
图2为本发明制备的DOX-ATT-PLGA-MS的XRD图。
图3为本发明制备的DOX-ATT-PLGA-MS在进行PLGA表面包覆前后的SEM对比图。
图4为本发明制备的DOX-ATT-PLGA-MS在体外的累积释放曲线图。
图5为本发明制备的DOX-ATT-PLGA-MS在体外的药物突释曲线图。
图6为本发明制备的DOX-ATT-PLGA-MS的抗癌活性检测结果图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例及其附图进一步阐明本发明的内容。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
以盐酸阿霉素为例，本例制备了一种多联微球包覆的抗肿瘤缓释药物载体，其制备过程如下：
（1）原始凹凸棒土的预处理。
称取20g原始凹凸棒土，使用马弗炉进行热煅烧，每10min升温5℃升至220℃，在220℃处保持24h。经过 TG-DSC分析得知该加热制度可以成功除去表面附着水、油脂和大部分孔道水。
（2）制备浆料并喷雾造粒。
在球磨罐中加入200mL去离子水、7g 10%聚乙烯醇、4.5g聚丙烯酸铵和70g凹凸棒土，配制完成后在球磨机中球磨24h，利用 HOLVES SPARY DRYER 进料量为12mL/min，干燥温度为150℃制备凹凸棒土颗粒。通过SEM的电镜观察可知，制备出的凹凸棒土颗粒尺寸在15-30μm之间，且颗粒形态均为球形，较为均匀。
（3）脱酯处理。
使用脱酯炉对步骤（2）制备出凹凸棒土颗粒中的分散剂进行去除并对其进行固化，每10min升温5℃升至330℃，通过红外图谱分析可知分散剂聚丙烯酸铵被除去。
（4）药物负载。
使用175mg的凹凸棒土颗粒分散于10mL去离子水中保持5min，同时将35mg盐酸阿霉素完全溶解于10mL去离子水中，随后将溶解好的盐酸阿霉素溶液加入到凹凸棒土颗粒分散液中，进行避光处理同时使用200-300r/min的转速匀速搅拌24h后即完成药物负载，将负载盐酸阿霉素凹凸棒土的混悬液直接倒入培养皿中，在-40℃的冰箱中进行预冷1h，再将其覆盖保鲜膜并扎孔进行冷冻干燥处理，获得干燥的负载盐酸阿霉素的凹凸棒土颗粒。
提取部分负载盐酸阿霉素完成的凹凸棒土颗粒混悬液，离心处理得到的上清液，进行紫外分光光度测试可知，药物包封率在96%，负载效果良好。
（5）多联微球包覆过程。
用4.5W分子量、85:15的酯封端PLGA进行表面包覆，先将前一步制备的50mg负载盐酸阿霉素凹凸棒土颗粒分散在提前溶解好75mg PLGA的5mL二氯甲烷溶液中，然后将提前溶解好2% PVA的溶液10mL与其（体积比为2:1）在超声乳化器中充分乳化。超声乳化机的具体超声制度为：超声3秒，停止2秒，共超声3分钟，40%功率，冰水浴处理（3，2，3min，40%）。
随后加入到提前配制好的60mL PBS溶液中，先高速搅拌1min，随后均匀且缓慢搅拌10h 使二氯甲烷完全挥发并使药物载体固化，制备完成后在离心机中以7000rpm的转速保持5min充分洗净表面附着的PVA重复5次，取出后放在一次性培养皿中在-40℃的冰箱中进行预冷1h，再将其覆盖保鲜膜并扎孔进行冷冻干燥处理，获得干燥的多联微球包覆新型抗肿瘤缓释释药的药物载体，记为DOX-ATT-PLGA-MS。
对比例1
与实施例1不同的是，本例不包括步骤（5），其他同实施例1一致。
对比例2
本例不对凹凸棒土进行喷雾造粒，即按照实施例1中的步骤（1）和步骤（4）制备未经喷雾造粒且负载有盐酸阿霉素的凹凸棒土。
对实施例1合成的药物载体进行以下检测：
1、红外检测。
为了说明模型药物（即盐酸阿霉素）成功负载于本发明的载药体系中且PLGA包覆在表面，以裸药盐酸阿霉素（DOX）、85:15酯封端PLGA、凹凸棒土（ATT）和DOX-ATT-PLGA-MS的傅里叶变换红外光谱（FTIR）结果比对进行化学成分证明。
红外检测结果如图1所示，其中从上到下依次为凹凸棒土的红外谱图，PLGA(85:15)的红外谱图，盐酸阿霉素的红外谱图，DOX-ATT-PLGA-MS的红外谱图。
经分析可知1190cm-1处的典型吸收峰归属于负载DOX的C-N的伸缩振动，1414cm-1的峰可能归因于DOX的C-C单键骨架的平面内拉伸振动3527cm-1和3326 cm-1为N-H的弯曲振动。PLGA大分子的红外吸收峰主要有4个，2947cm-1和2997cm-1处是由碳氢键引起的振动峰，1752cm-1是由羰基酮基振动引起的，1456cm-1位置是由亚甲基伸缩振动峰引起的。对于凹凸棒土，3546cm-1和343cm-1处的吸收峰是ATT中水的O-H拉伸振动。1654 cm-1处的吸收带是通道中被吸收水的弯曲振动，985cm-1的吸收带为纤维状粘土矿物的指纹。DOX-ATT-PLGA-MS的红外光谱上可见1188cm-1处的C-N伸缩振动峰可知DOX成功负载于载药体系中，在2947cm-1和2997cm-1处可以看到很明显的PLGA碳氢键振动峰，也存在985cm-1的指纹特征峰，因此可以从化学成分证明几种材料均存在于载药体系中。
2、XRD分析。
XRD检测结果如图2所示，其中从上到下依次为凹凸棒土（ATT）的XRD图，PLGA(85:15)的XRD图，盐酸阿霉素（DOX）的XRD图，DOX-ATT-PLGA-MS的XRD图。
从图中可知，DOX-ATT-PLGA-MS表面没有明显的盐酸阿霉素衍射峰，只有较为微弱的凹凸棒土衍射峰。表明负载盐酸阿霉素的凹凸棒土颗粒确实成功被PLGA纳米多联微球包覆在药物载体内部。
3、SEM检测。
SEM检测结果如图3所示，其中A为DOX-ATT-PLGA-MS的SEM图，B为未进行PLGA 包覆的负载盐酸阿霉素的凹凸棒土颗粒（DOX-ATT-MS）的SEM图。
从图3可知，凹凸棒土负载盐酸阿霉素后利用其纳米尺寸效应使PLGA在其表面覆盖了一层纳米尺寸的多联微球结构，实现了DOX-ATT-PLGA-MS表面凹凸不平和多孔的表面状态。
4、药物缓释和突释检测。
将实施例1和对比例1-2制备的载盐酸阿霉素药物载体在pH=5.5的PBS缓冲溶液中进行药物缓释检测，并绘制体外累积释放曲线。
将实施例1和对比例1-2制备的载盐酸阿霉素药物载体在pH=5.5的PBS缓冲溶液中进行药物突释检测，并绘制药物突释曲线。
检测结果如图4和图5所示，未包覆多联微球的负载盐酸阿霉素凹凸棒土，无论是否进行喷雾造粒，其释放速率均明显快于包覆多联微球的药物载体。表明该药物载体无论在药物缓释和药物突释上均有一定的性能改善。
5、抗癌活性检测。
通过以下方法进行检测：分别设定空白微球（按照实施例1步骤（1）至（3）制备得到）、裸药、未包覆载体组（对比例1制备）和多联微球包覆组（即DOX-ATT-PLGA-MS）测定抗肿瘤活性，每组设置 6 个平行对照组，材料在超净工作台紫外照射半天。细胞培养 24 小时后去掉培养液，选择与裸药盐酸阿霉素等效浓度的未包覆药物载体和多联微球包覆（0.01-100μg/mL，20μL 完全培养基）培养液加入到接种细胞密度为 5×103的96孔板中。48小时后加入CCK-8溶液孵育（10μL，2h），于波长450nm处在酶标仪上读取吸光度值测定细胞存活率。检测结果如图6中A所示。
此外，采用相同方法测定 MG63人骨肉瘤细胞与等效盐酸阿霉素浓度（0.01-100μg/mL）的未包覆药物载体和多联微球包覆孵育24、48和72小时后的细胞存活率，来比较它们的抗肿瘤效果。检测结果如图6中B所示。
从上述检测结果可知，DOX-ATT-PLGA-MS在实际药物浓度相同的情况下体外抗癌效果更好。
本发明所列举的各物质的上下限、区间取值，以及工艺参数的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举。
综上所述，本发明通过喷雾干燥技术和乳化溶剂挥发技术与凹凸棒土的纳米尺寸效应相结合，制备出了缓释性能良好的药物载体，且该药物载体表面存在一定的孔隙率的同时具有凹凸不平的结构，有利于药物释放和载体降解，从而减少了大尺寸载药微球出现栓塞的可能性，该药物载体还改善了以盐酸阿霉素为例的水溶性药物在水溶液中制备导致包封率较差的问题，可见该药物载体具有广阔的应用前景。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种多联微球包覆的药物载体，其特征在于，所述药物载体以负载药物的凹凸棒土颗粒为内核，并以相互连接的PLGA微球包覆所述内核表面，所述药物载体表面凹凸不平且为多孔状。
2.根据权利要求1所述多联微球包覆的药物载体，其特征在于，所述凹凸棒土颗粒为球形且尺寸为15-30μm，所述PLGA微球的尺寸为200-500nm。
3.根据权利要求1所述多联微球包覆的药物载体，其特征在于，所述药物为水溶性药物。
4.根据权利要求3所述多联微球包覆的药物载体，其特征在于，所述药物为盐酸阿霉素。
5.一种制备如权利要求1~4任一项所述多联微球包覆的药物载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将含有凹凸棒土、粘结剂和分散剂的浆料混匀后喷雾造粒，得到凹凸棒土颗粒；
S2、将药物负载至所述凹凸棒土颗粒中；
S3、对步骤S2所得负载药物的凹凸棒土颗粒进行PLGA表面包覆。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述浆料中，所述凹凸棒土的含量为20-30wt%，所述分散剂的含量为1.5-3.0wt%，所述粘结剂的含量为0.2-1.0wt%。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对所述凹凸棒土颗粒进行脱脂处理后再进行药物负载。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S3具体为：将负载药物的凹凸棒土颗粒分散于溶解有PLGA的溶剂中，加入PVA，乳化后加入到PBS溶液，待所述溶剂完全挥发且载药微粒固化后，离心洗涤，冷冻干燥即得所述药物载体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PLGA为酯封端PLGA且其分子量为3-5w。
10.如权利要求1~4任一项所述多联微球包覆的药物载体在制备药物中的应用。
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