CN116854875A - 一种核酸响应型COFs纳米晶体材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核酸响应型COFs纳米晶体材料及其制备方法和应用，属于生物纳米材料制备技术领域。所述核酸响应型COFs纳米晶体材料包括所述的富含羧基的COFs纳米晶体材料以及通过酰胺键连接其表面的单链DNA，所述单链DNA为含Cy3基团的单链DNA，所述单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。本发明可将抗病毒药物或RNA干扰素等药物包载在富含羧基的COFs纳米晶体材料内部，ssDNA再通过共价键链接在富含羧基的COFs纳米晶体材料结构上，实现药物的可控释放，进而对病毒选择性识别和捕获，达到抑制病毒的目的。

Description

一种核酸响应型COFs纳米晶体材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物纳米材料制备技术领域，特别是涉及一种核酸响应型COFs纳米晶体材料及其制备方法和应用。
背景技术
H1N1流感病毒是一种常见的呼吸道病毒，具有高传染性和高致死率，对人类健康造成了严重威胁。传统的治疗方法主要是使用抗病毒药物和疫苗，但由于病毒的易变性和耐药性等问题，治疗效果并不理想。因此，开发新型的病毒阻断策略与治疗手段对于H1N1流感病毒的防治具有重要意义。近年来随着人们对病毒感染型可控治疗系统的高度关注，纳米治疗系统因其优异的靶向性、可控性受到广泛关注。
共价有机框架(COFs)是一种具有周期性网络结构的新型有机多孔晶体材料，其主要由轻元素(如：碳、氢、氧、氮等)通过共价缩合构建而成。自2005年以来，COFs就因其优异的可设计性、独特的结构多样性、永久孔隙率和有序的孔道结构而备受关注，并被广泛应用于生物医疗领域，特别是在药物的可控释放及靶向治疗方面越来越受欢迎，这也为病毒感染的靶向治疗提供了新的机会。然而，当前COFs在病毒可控治疗方面的研究依然较少，因此，建立一种基于COFs纳米材料的智能可控型靶向治疗系统必将提高病毒感染的治疗水平，也会对患者顺应性的增加、药物副作用的降低、病毒的早期隔断及治疗等具有重大临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种核酸响应型COFs纳米晶体材料及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该材料可以特异识别目标RNA，具备药物可控释放性能，能有效实现病毒抑制。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种富含羧基的COFs纳米晶体材料，其化学式为(C14H8NO6)n，结构式如下所示：
优选的是，包括：以氨基苯甲酸类化合物与三甲酰间苯三酚为原料，通过醛胺缩合得到所述富含羧基的COFs纳米晶体材料，其中，所述氨基苯甲酸化合物与所述三甲酰间苯三酚的摩尔比为3:2。
优选的是，所述氨基苯甲酸化合物包括4,4'-二氨基-[1,1'-联苯]-3,3'-二羧酸和2,5-二氨基对苯二甲酸，但不限于此，还可为其它含有双氨基基团的苯甲酸类化合物；所述三甲酰间苯三酚为1,3,5-三甲酰间苯三酚；
所述醛胺缩合的溶剂包括邻二氯苯、正丁醇、均三甲苯或1,4-二氧六环溶剂中的一种或多种，更优选的是均三甲苯与1,4-二氧六环的混合溶液；更优选的是均三甲苯与1,4-二氧六环的溶剂体积比例为3/1，总体积为2.0mL。温度为90～150℃，更优选的是110～120℃；时间为36～120h，更优选的是，72～120h；更优选的是72h。
本发明还提供一种核酸响应型COFs纳米晶体材料，包括所述的富含羧基的COFs纳米晶体材料以及通过酰胺键连接其表面的单链DNA，所述单链DNA为含Cy3基团的单链DNA，含有30个碱基，核苷酸序列为aca acg gcg aag atg cta cag cag gtc tta(5，to3，，SEQID NO：1)。更优选的是，含有35个碱基，核苷酸序列为aca acg gcg aag atg cta cag caggtc tta aaa aa(5，to3，，SEQ ID NO：2)。
本发明还提供一种所述的核酸响应型COFs纳米晶体材料的制备方法，将所述富含羧基的COFs纳米晶体材料和所述单链DNA通过酰胺键脱水缩合而成。
优选的是，所述脱水缩合的条件为：黑暗条件下反应，反应溶剂包括甲醇、乙醇或PBS溶液，更优选的是PBS溶液；反应温度为0～50℃，更优选的是20～25℃。
本发明还提供一种负载药物的核酸响应型COFs纳米晶体材料的制备方法，将所述的富含羧基的COFs纳米晶体材料分散在含有药物的有机溶剂中，使得所述药物负载在所述富含羧基的COFs纳米晶体材料的孔道，然后再与单链DNA进行脱水缩合反应，得到负载药物的核酸响应型COFs纳米晶体材料；所述单链DNA为含Cy3基团的单链DNA，含有30个碱基，核苷酸序列为aca acg gcg aag atg cta cag cag gtc tta(5，to3，，SEQ ID NO：1)。更优选的是，含有35个碱基，核苷酸序列为aca acg gcg aag atg cta cag cag gtc tta aaa aa(5，to3，，SEQ ID NO：2)。上述药物包括抗病毒药物或者干扰素RNA，抗病毒药物T705为普适性抗病毒药物，例如：拉米夫定、利巴韦林或法匹拉韦等。
优选的是，所述负载的条件为：有机溶剂包括甲醇、丙酮或乙醇，更优选的是甲醇；温度为0～50℃，更优选的是25～30℃；时间为12～36h，更优选的是20～30h，更优选的是24h。对负载药物后的COFs纳米晶体材料提纯的过程为：将反应后的固体材料进行离心，然后用溶剂洗涤。对负载药物后的核酸响应型COFs纳米晶体材料提纯的过程为：将反应后的固体材料离心，然后用溶剂洗涤即得。
本发明还提供一种负载药物的核酸响应型COFs纳米晶体材料，其由所述的负载药物的核酸响应型COFs纳米晶体材料的制备方法制得。
本发明还提供一种所述的富含羧基的COFs纳米晶体材料，或者所述的核酸响应型COFs纳米晶体材料，或所述的负载药物的核酸响应型COFs纳米晶体材料在抑制病毒中的应用。将感染后细胞与负载药物的核酸响应型COFs纳米晶体材料(T705@DATA-COF-Por)共同孵育一段时间进行病毒阻隔，实现抑制病毒的目的。以H1N1为例，H1N1病毒阻隔体系浓度为100TCID50/mL；T705@DATA-COF-Por浓度为(50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL)中的一种。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过共价缩合制备富含羧酸的COFs纳米晶体材料，并利用后修饰反应将端基为氨基的单链DNA探针引入到COFs中，实现对H1N1流感病毒RNA的识别和捕获。
本发明以所制备的核酸响应型COFs纳米晶体材料(DATA-COFs)为基础，可以将抗病毒药物或RNA干扰素等药物包载在材料内部，为抗病毒药物提供稳定、有序的孔道微环境，以实现客体药物分子的长效释放。
本发明基于核酸响应型COFs纳米晶体材料负载药物后，在细胞层面上治疗H1N1病毒感染即可实现靶向病毒及调控药物释放性能。通过COFs纳米晶体的特殊响应性释放药物，进而实现对病毒的高效抑制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为DATA-COF的合成结构图；
图2为原料及DATA-COF的IR红外谱图；
图3为DATA-COF的粉末衍射谱图；
图4为77K下DATA-COF的N2吸附曲线；
图5为DATA-COF的TEM照片；
图6为DATA-COF的DLS粒径分布谱图；
图7为T705@DATA-COF-Por的IR红外谱图；
图8为T705@DATA-COF-PorXRD的粉末衍射谱图；
图9为77K下T705@DATA-COF-Por的N2吸附曲线；
图10为T705@DATA-COF-Por的SEM照片；
图11为T705@DATA-COF-Por的DLS粒径分布谱图；
图12为药物法匹拉韦的紫外-可见光谱；
图13为药物法匹拉韦的甲醇标准曲线；
图14为T-705@DATA-COF-Por的细胞毒性谱图；
图15为T-705@DATA-COF-Por的荧光响应曲线；
图16为T-705@DATA-COF-Por的荧光恢复谱图；
图17为T-705@DATA-COF-Por的目标RNA特异性识别；T1为部分错序型ssDNA，T2和T3为完全错序型ssDNA；
图18为T-705@DATA-COF-Por的药物释放曲线；
图19为T-705@DATA-COF-Por对感染的MDCK细胞治疗后，H1N1-RNA的含量；
图20为MDCK细胞治疗后的蛋白免疫印迹图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明提供了一种核酸响应型COFs纳米晶体材料，可作为药物递送载体的原理为：COFs材料长程有序的孔道结构，可以为药物分子提供稳定的微环境及快速的释放通道。由富含羧基的COFs纳米晶体材料(DATA-COF)与端基为氨基的单链DNA(ssDNA)通过酰胺键链接形成。将抗病毒药物或RNA干扰素等药物包载在COFs纳米晶体材料内部，ssDNA再通过共价键链接在DATA-COF结构(DATA-COF的表面及其孔道内)上。ssDNA中的序列能与H1N1病毒碱基互补配对，从而实现对病毒的选择性识别和捕获。COFs材料为DATA-COF是未经修饰的席夫碱型共价有机框架纳米材料。本发明所制备的核酸响应型COFs纳米晶体为二维纳米材料，可以与单链DNA形成良好的π-π相互作用，ssDNA被二维材料表面吸附后，表现出荧光猝灭行为，可以用于保护药物泄露；而与双链DNA(dsDNA)的作用能力相当弱，不会发生荧光猝灭。因此，在目标H1N1病毒RNA存在的情况下，被COFs表面吸附的荧光探针ssDNA与H1N1病毒RNA形成稳定的双链后，负载在COFs材料内的药物分子正常释放，会由猝灭状态转为荧光状态。
本发明所制备的核酸响应型COFs纳米晶体材料对病毒具有抑制作用，以H1N1病毒为例，该材料可以在细胞层面上治疗H1N1病毒感染。DATA-COF表面密集包裹的ssDNA可以防止药物泄漏。当在目标RNA存在的情况下，可形成稳定的双链，用于控制释放治疗药物。COFs纳米晶体材料作为药物递送载体，核酸响应性共价有机框架纳米材料还可以通过调节材料的物理化学性质和表面化学反应性，利用核酸分子的特异性识别能力，将材料表面的核酸修饰序列设计成与H1N1流感病毒RNA互补，实现对H1N1流感病毒的识别和捕获。这种方法可以在病毒感染早期实现对病毒的快速识别和捕获，从而为治疗提供更加有力的支持。
为了对上述技术更进一步说明，下面以具体实施例方式加以说明。
实施例1DATA-COF晶体材料的制备
将2,5-二氨基对苯二甲酸(14.7mg，0.075mmol)、1,3,5-三甲酰基间苯三酚(10.5mg，0.05mmol)和HOAc(6M，0.2mL)加入均三甲苯/1,4-二氧六环(2.0mL，3/1，v/v)的混合溶液中。在液氮浴中快速冷冻并脱气，循环三次后，耐压管在120℃下加热72h。反应结束后，离心收集沉淀物，并用THF和乙醇洗涤。固体在120℃真空下干燥12h，得到黑红色晶体(DATA-COF，结构式(C14H8NO6)n，20.0mg，产率88.7％)。其中，上述1,3,5-三甲酰基间苯三酚由常规方法合成，如文献：J.Mater.Chem.A,2018,6,11140-11146(Pd loaded andcovalent-organic framework involved chitosan aerogels and their applicationfor continuous flow-through aqueous CB decontamination,J.Mater.Chem.A,2018,6,11140-11146)。
DATA-COF的合成结构式如图1所示；DATA-COF的IR红外谱图如图2所示，1705cm-1处为2,5-二氨基对苯二甲酸中羰基的伸缩振动峰；DATA-COF的XRD粉末衍射谱图，证明其具有较高的晶化程度(见图3)；DATA-COF在77K下的N2吸附量为230.3cm3/g(见图4)；如图5所示为TEM透射电镜图，DATA-COF形貌为纳米棒状；粒径分析证明DATA-COF的平均粒径为460.8nm(见图6)。
实施例2T705@DATA-COF-Por材料的制备
首先，将T-705(法匹拉韦，157mg，1mmol)和DATA-COF(10mg)混合在甲醇(25mL)中，28℃并搅拌24h。离心收集产物，用甲醇洗涤3次，将未负载的药物彻底清洗后，真空(60℃，12h)干燥备用。然后，将3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(3μL，30mg/mL)和N-羟基琥珀酰亚胺(1μL，100mg/mL)加入上述备用固体(100μL，1mg/mL)中，所得混合物搅拌30min，离心收集。最后，将得到的沉淀物重新分散在PBS(496μL)中，加入4μLCy3标记的ssDNA，并在黑暗中22℃摇晃24h，通过离心所得沉淀即为T-705@DATA-COF-Por。其中，上述Cy3标记的ssDNA，其序列顺序为aca acg gcg aag atg cta cag cag gtc tta(5’-3’)，或aca acg gcg aag atgcta cag cag gtc tta aaa aa(5’-3’)。
T705@DATA-COF-Por的红外谱图如图7所示，1650cm-1处为酰胺键的伸缩振动峰，证明Cy3标记的ssDNA修饰成功；T-705@DATA-COF-Por的XRD粉末衍射谱图，证明单链DNA的修饰并未影响材料的晶化程度(见图8)；由于单链DNA的修饰，使得T-705@DATA-COF-Por在77K下的N2吸附量下降为78.3cm3/g(见图9)；如图10所示SEM扫描电镜图，T-705@DATA-COF-Por形貌依然为纳米棒状；粒径分析证明DATA-COF的平均粒径为516.6nm(见图11)。如图12和图13所示，通过紫外-可见光谱及标准曲线测得药物法匹拉韦在T-705@DATA-COF中的负载能力为9.27wt％。
实施例3T705@DATA-COF-Por的细胞毒性实验
T-705@DATA-COF-Por的细胞毒性采用CCK-8细胞计数试剂盒(Boster生物技术有限公司，武汉)，每组取6个平行样本，以消除实验误差。37℃下MDCK细胞用含有不同浓度的灭菌T-705@DATA-COF-Por(40-240μg/mL)处理24h，以未处理的对应细胞作为对照。然后，每孔中加入CCK-8溶液(10μL)，进一步孵育30min。每一组均以活细胞相对于对照组的百分比表示，结果表明160μg/mL以内，T-705@DATA-COF-Por具备细胞安全性(见图14)。
实施例4T705@DATA-COF-Por的目标RNA识别实验
将目标RNA(50nM)加入T-705@DATA-COF溶液(100μg/mL)中，在室温下孵育60min以充分杂交。在室温下每3min测量一次荧光，记录响应过程(Ex＝525nm)，如图15-图16所示，当溶液中含有目标RNA(H1N1流感病毒的RNA)时，T705@DATA-COF-Por对具有优异荧光响应性，30min即可达到较高荧光值。
实施例5T705@DATA-COF-Por的目标RNA选择性检测
将T-705@DATA-COF-Por溶液加入目标RNA(50nM)与三种错序ssDNA(50nM)溶液中，室温下孵育30min后检测其荧光(Ex＝525nm)，如图17所示证明T-705@DATA-COF-Por对目标RNA具有特异性识别。
实施例6T705@DATA-COF-Por的药物可控释放实验
在37℃下，将T-705@DATA-COF-Por(10mg)浸泡在100mL PBS溶液中，在规定的时间间隔内取2.0mL溶液，并用新鲜PBS代替，直到提取液中T-705的浓度保持不变。采用323nm处的紫外吸光度测定样品中T-705的浓度，以评价T-705@DATA-COF-Por对药物分子的可控释放。如图18所示，当溶液中含有目标RNA时，T705@DATA-COF-Por中的药物分子才得以释放且可以长效维持药物浓度水平，证明DATA-COF-Por对孔道中的药物分子具有控制释放的性能。
实施例7T705@DATA-COF-Por的细胞治疗实验
在24孔板中将MDCK细胞与消毒后的T-705@DATA-COF-Por或DMEM在37℃下孵育2h。接下来，25μL的H1N1(100TCID50/mL)和175μL的DMEM加入到MDCK细胞中，感染1h后去除。单层细胞分别用500μL T-705@DATA-COF-Por(0、25、50和75μg含有2％FBS胎牛血清的DMEM)或T-705(6.9μg DMEM作为阳性对照)在37℃下培养24h。用PBS洗涤3次，收集细胞，反复冻融3次，收集H1N1的RNA，逆转录后，通过qPCR检测样品细胞内的病毒含量，以证明T-705@DATA-COF-Por对感染H1N1后MDCK细胞的治疗效果。结果证明T-705@DATA-COF-Por含量与治疗效果成线性关系，相较于50μg/mL、100μg/mL及纯法匹拉韦实验组，150μg/mL的治疗效果最优(见图19)。
实施例8Western印迹
为了直观地检测病毒感染细胞的细胞病变效应，在每组培养的细胞中加入150μL的裂解缓冲液。将全细胞提取物在SDS蛋白样品缓冲液中煮沸后，对样品进行10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。最后，测定H1N1 NP蛋白的表达量，GADPH蛋白的数量代表对照的管家蛋白，如图20所示，50μg/mL的治疗组细胞中的H1N1 NP蛋白表达量最低，进一步佐证了图19的实验结果，证明T-705@DATA-COF-Por对H1N1的感染治疗具有良好效果。
从上述实施例结果数据可以看出，本发明的核酸响应型COFs纳米晶体材料可以通过表面修饰具有亲和力的分子，如抗体或寡核苷酸序列，实现对病毒的选择性捕获，这种方法可以实现对病毒的高灵敏度识别。同时，核酸响应性COFs纳米晶体材料可以作为药物递送载体，实现对H1N1流感病毒感染的治疗。本发明的核酸响应型COFs纳米晶体材料具有响应性、生物相容性、可控释放性等优点，可用于构筑基于COFs纳米材料的可控型靶向治疗系统，用作对抗病毒感染。通过核酸响应型COFs纳米晶体材料的特殊响应性释放药物，实现对病毒的高效抑制。这种方法可以提高药物的靶向性和生物利用度，从而减少药物的副作用和毒性，提高治疗效果。核酸响应型COFs纳米晶体材料在H1N1流感病毒感染的特殊成像和治疗研究中必将具有广阔的应用前景和潜在的临床应用价值。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种富含羧基的COFs纳米晶体材料，其特征在于，其化学式为(C14H8NO6)n，结构式如下所示：
2.如权利要求1所述的富含羧基的COFs纳米晶体材料的制备方法，其特征在于，包括：以氨基苯甲酸类化合物与三甲酰间苯三酚为原料，通过醛胺缩合得到所述富含羧基的COFs纳米晶体材料，其中，所述氨基苯甲酸化合物与所述三甲酰间苯三酚的摩尔比为3:2。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述氨基苯甲酸化合物包括4,4'-二氨基-[1,1'-联苯]-3,3'-二羧酸和2,5-二氨基对苯二甲酸，所述三甲酰间苯三酚为1,3,5-三甲酰间苯三酚；
所述醛胺缩合的溶剂包括邻二氯苯、正丁醇、均三甲苯或1,4-二氧六环溶剂中的一种或多种，温度为90～150℃，时间为36～120h。
4.一种核酸响应型COFs纳米晶体材料，其特征在于，包括权利要求1所述的富含羧基的COFs纳米晶体材料以及通过酰胺键连接其表面的单链DNA，所述单链DNA为含Cy3基团的单链DNA，所述单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
5.一种如权利要求4所述的核酸响应型COFs纳米晶体材料的制备方法，其特征在于，将所述富含羧基的COFs纳米晶体材料和所述单链DNA通过酰胺键脱水缩合而成。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述脱水缩合的条件为：黑暗条件下反应，反应溶剂包括甲醇、乙醇或PBS溶液，反应温度为0～50℃，反应时间24h。
7.一种负载药物的核酸响应型COFs纳米晶体材料的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的富含羧基的COFs纳米晶体材料分散在含有药物的有机溶剂中，使得所述药物负载在所述富含羧基的COFs纳米晶体材料的孔道中，然后再与单链DNA进行脱水缩合反应，得到负载药物的核酸响应型COFs纳米晶体材料；所述单链DNA为含Cy3基团的单链DNA，所述单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述负载的条件为：有机溶剂包括甲醇、丙酮或乙醇，温度为0～50℃，时间为12～36h。
9.一种负载药物的核酸响应型COFs纳米晶体材料，其特征在于，其由权利要求7或8所述的制备方法制得。
10.一种如权利要求1所述的富含羧基的COFs纳米晶体材料，或者权利要求4所述的核酸响应型COFs纳米晶体材料，或权利要求9所述的负载药物的核酸响应型COFs纳米晶体材料在抑制病毒中的应用。
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