CN116854807A - 一种重组人源ⅶ型胶原蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组人源Ⅶ型胶原蛋白及其制备方法与应用。本发明基于Ⅶ型胶原蛋白的理化性质和预测蛋白的三维结构，选取Ⅶ型胶原蛋白中亲水性良好的片段，同时设计改造pPICZ质粒中的信号肽序列，将基因片段插入质粒中，使其编码的胶原蛋白为完全人源化序列，不含任何标签和外源氨基酸序列。本发明中已经证实该Ⅶ型胶原蛋白不但能够实现Ⅶ型胶原蛋白于毕赤酵母的高效分泌表达，而且该胶原蛋白具有良好的亲水性，并且随着发酵时间增加，在诱导表达第9天未出现明显的降解，稳定性好，易于工业放大生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组人源Ⅶ型胶原蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
胶原蛋白是人体内最丰富的蛋白质家族，占人体总蛋白质的30％，是皮肤、肌肉、骨骼和结缔组织等的重要组成部分。Ⅶ型胶原蛋白主要由角质形成细胞和成纤维细胞合成。它作为一种锚定原纤维主要成分，能结合I型和III型胶原蛋白，为间质膜和基底膜结构提供稳定性，对维持细胞外基质的功能和稳定性至关重要。Ⅶ型胶原蛋白功能突变会引起大疱性表皮松解症，导致患者皮肤在受到摩擦或碰撞后易出现水疱及血疱，是一种严重影响身心健康的皮肤疾病。
Ⅶ型胶原蛋白包括2944个氨基酸，由中间胶原结构域和两侧的非胶原NC-1和NC-2结构域组成。中间胶原结构域呈现典型的胶原蛋白Gly-X-Y重复序列结构。相对其它胶原蛋白家族，在Ⅶ型胶原蛋白三螺旋结构域中，有一段39个氨基酸构成的“铰链”区域，该区域容易受到胃蛋白酶的蛋白水解消化。Ⅶ型胶原蛋白非胶原NC-1结构域大小约为145kDa，由粘附蛋白结构域组成，包括软骨基质蛋白、九个连续的III型纤连蛋白样结构域、血友病因子结构域以及富含半胱氨酸和脯氨酸的区域。羧基末端非胶原结构域NC-2相对较小，大约30kDa，包含一个与Kunitz蛋白酶抑制分子同源结构域。
Ⅶ型胶原蛋白对维持皮肤、肌肉细胞外基质的功能和稳定性至关重要，因此在化妆美容产品和相关运动医学材料领域受到青睐。然而由于Ⅶ型胶原胶原蛋白的全长分子量较大，体外重组表达难度极高，因此目前研究者通常截取Ⅶ型胶原蛋白中的三螺旋结构序列，进行全化学合成或重组表达。全化学合成的胶原蛋白往往较小，无法获得人们理想的胶原蛋白分子量。在建立重组表达体系时，研究者还可能会在编码框设计时添加纯化标签和分泌肽信号序列残留，导致最终获得的胶原蛋白并非完全人源化的Ⅶ型胶原蛋白。因此，设计开发简单操作、快速制备完全人源化Ⅶ型胶原蛋白的表达体系有着一定的研究价值和应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种完全人源化Ⅶ型胶原蛋白的表达制备体系。
基于上述目标，本发明提供了一种重组人源Ⅶ型胶原蛋白及其制备方法与应用来满足本领域内的这种需要。
一方面，本发明涉及一种重组人源Ⅶ型胶原蛋白，其编码基因的核苷酸序列如SEQID No.1；
或氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
另一方面，本发明涉及多核苷酸，所述多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质。
进一步地，本发明提供的多核苷酸中，所述多核苷的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
另一方面，本发明涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的多核苷酸。
另一方面，本发明涉及毕赤酵母蛋白载体，其选用pPICZ质粒，删除所述pPICZ质粒中α-factor分泌信号肽的Glu-Ala-Glu-Ala重复序列，将如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列序列克隆至所述信号肽的序列羧基端。
另一方面，本发明涉及工程菌或细胞，所述工程菌或细胞包含上述的重组表达载体，或上述的毕赤酵母蛋白载体。
进一步地，本发明提供的工程菌或细胞中，所述工程菌或细胞的宿主为毕赤酵母。
另一方面，本发明涉及重组人源Ⅶ型胶原蛋白的制备方法，其包括：将上述的毕赤酵母蛋白载体，加入PemⅠ限制性内切酶，制备线性化DNA；
将所述线性化DNA通过电转化置入毕赤酵母GS115中，筛选得到分泌表达所述重组人源Ⅶ型胶原蛋白的菌株；
采用甲醇诱导所述菌株表达制得所述重组人源Ⅶ型胶原蛋白。
本发明与现有技术相比有以下优点：
本发明基于Ⅶ胶原蛋白的理化性质和三维预测结构，选取Ⅶ胶原蛋白中亲水性良好的片段(1357-1931)。同时设计改造质粒中的信号肽序列，将所述人源Ⅶ型胶原蛋白的基因片段插入穿梭质粒中，使其编码的胶原蛋白为完全人源化序列，不含任何标签和外源氨基酸序列。随后将质粒线性化，电转化毕赤酵母GS115，通过高浓度抗生素快速筛选得到高效稳定表达的重组工程菌。后续经过发酵条件优化，确定高效稳定表达的菌株。
本发明方法简单操作，快速高效，在短时间内就能筛选出高效表达的工程菌，发明方法所提供的完全人源Ⅶ型胶原蛋白具有良好的亲水性，并且随着发酵时间增加，在诱导表达第9天未出现明显的降解，稳定性好，易于后续工业放大生产。并且发明所述Ⅶ型胶原蛋白的不含有任何重组表达标签和外源氨基酸序列，表达的蛋白序列只来源于人Ⅶ型胶原蛋白氨基酸序列，在美容化妆品、护肤品和相关生物医学材料领域等有应用潜力。
附图说明
图1为专利所述VII型胶原蛋白片段(1357-1931位)氨基酸疏水性分析图。
图2为pPICZ-Col7A质粒图谱。
图3为改造后信号肽序列。
图4为pPICZ-Col 7A质粒线性化结果。第1个泳道是DNA Marker，第2个泳道是酶切后样品，第3个泳道是未酶切质粒pPICZ-Col7A。
图5为重组工程菌表达5天样品蛋白电泳图。第1个泳道为BSA 2μg对照组，第2个泳道为蛋白电泳Marker，第3-12组分别为10个筛选菌株的VII胶原蛋白表达结果，第4泳道为专利所述菌株VII胶原蛋白表达结果。
图6为菌株表达量VII胶原蛋白电泳图。第1个泳道为蛋白电泳Marker,第2个泳道为诱导前，第3个泳道为诱导表达第3天，第4个泳道为诱导表达第4天，第5个泳道为诱导表达第5天，第6个泳道为诱导表达第7天，第7个泳道为诱导表达第9天，第8个泳道为BSA对照上样0.50μg，第9个泳道为BSA对照上样1μg，第10个泳道为BSA对照上样1.5μg，第11个泳道为BSA对照上样2μg。
图7为菌株表达量定量分析的标准曲线。
图8为蛋白质谱鉴定结果。
图9为匹配肽段结果。其中，匹配肽段以下划线显示。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本实施例提供了重组人源Ⅶ型胶原蛋白的设计及其制备与验证过程。
(1)设计构建表达质粒
分析VII胶原蛋白氨基酸序列，预测其理化性质以及蛋白结构。基于蛋白的预测结构，以蛋白片段尽可能较大(分子量>50KD)和亲水性良好的原则，理性设计选取VII胶原蛋白片段(1357-1931)，计算其疏水性，结果如图1所示，可见选取的VII胶原蛋白片段亲水性较高，具有良好的应用前景。
设计改造pPICZ质粒中的信号肽序列，修改结果如图3所示，删除α-factor分泌信号肽的Glu-Ala-Glu-Ala重复序列，避免其在分泌过程中未被STE13酶切割导致N端残留。将VII型胶原蛋白片段序列(1357-1931位氨基酸)克隆至改造后的信号肽序列羧基端，不添加任何标签序列和外源氨基酸序列，使最终分泌表达的VII型胶原蛋白片段为完全人源化序列。将质粒方案交给江苏金唯智公司合成pPICZ-Col7A质粒，具体如图2所示，并测序验证重组质粒序列如如SEQ ID No.3所示。
(2)制备线性化质粒
从江苏金唯智公司得到的即为带有测序正确的pPICZ-Col 3A的穿刺菌，将其培养于30mL LB液体培养基中，加入终浓度50μg/mL博来霉素，以200rpm转速，37℃摇菌16小时。使用质粒提取试剂盒提取pPICZ-Col 7A质粒，加入PemⅠ限制性内切酶，制备线性化DNA。使用琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应，结果如图4。图4显示PmeI限制性内切酶37℃酶切3小时后，质粒完全被线性化。
待酶切完全后，70℃孵育15分钟，加入等体积的异丙醇溶液，-20℃冰箱放置4小时。使用高速离心机以12000rpm转速离心10分钟，4℃。弃去离心上清，加入500μL 75％乙醇，反复轻柔吹打，12000rpm离心10min，4℃。去掉上清，500μL 75％乙醇清洗，12000rpm离心10min，4℃。去掉上清，在超净台中放置吹干20min，加入10μLddH2O重悬溶解。
(3)电转毕赤酵母GS115
将5μg回收的线性化质粒加入毕赤酵母GS115(购自上海唯地生物科技有限公司)感受态，使用电转仪以2kV电压参数设置电击，电转后，立即加入700μL 1M山梨醇，30℃复苏2小时。5000rpm离心2分钟，将菌体全部涂布在2mg/mL博来霉素的YPD固体培养基，30℃放置两天。
(4)筛选高表达菌株
挑取10个单克隆分别至15mL YPD培养基内，以200rpm转速30℃培养24小时。5000rpm，离心5分钟，去掉上清。加入15mL 2XYP培养基，并补加终浓度1％的甲醇。随后每隔24小时补加终浓度1％的甲醇，并在第3天、第5天、第7天加入1mL 15X YP培养基补充氮源。通过SDS-PAGE电泳判断VII胶原蛋白表达量，根据第5天菌株表达情况，本发明设计的完全人源VII型胶原蛋白具有良好的亲水性，结果如图5。如图5所示，随着发酵时间增加，在诱导表达第9天仍未出现明显的胶原蛋白降解，稳定性好，易于后续工业放大生产。
为了确定高表达菌株产量，测得所述菌株表达量VII胶原蛋白电泳图如图6所示。第1个泳道为蛋白电泳Marker,第2个泳道为诱导前，第3个泳道为诱导表达第3天，第4个泳道为诱导表达第4天，第5个泳道为诱导表达第5天，第6个泳道为诱导表达第7天，第7个泳道为诱导表达第9天，第8个泳道为BSA对照上样0.50μg，第9个泳道为BSA对照上样1μg，第10个泳道为BSA对照上样1.5μg，第11个泳道为BSA对照上样2μg。第2-7泳道培养基上清上样体积20μL。
将图6电泳结果在ImageJ软件中进行灰度值计算，根据BSA对照组(0.5μg、1μg、1.5μg、2μg)灰度值和质量关系进行作图及公式计算，得到BSA对照品定量分析的标准曲线。试验结果如表1和表2所示。
表1：表达天数、灰度值与VII胶原蛋白产量
| 表达天数 | 灰度值 | VII胶原蛋白产量(μg) |
| 5 | 20903.167 | 0.320628512 |
| 7 | 27213.045 | 0.628367392 |
| 9 | 28789.338 | 0.705244733 |
表2：BSA对照与灰度值
| BSA对照(μg) | 灰度值 |
| 0.5 | 22646.317 |
| 1 | 37823.56 |
| 1.5 | 44909.803 |
| 2 | 54457.338 |
按照图6的公式换算第9天VII胶原蛋白电泳上样量为0.71μg，而培养基上样体积为20μL，计算得知菌株表达量为0.35g/L。
图8和图9为蛋白质谱结果，通过分析质谱结果置信度排名、肽段相对含量搜索排名和质谱鉴定多肽序列与目标序列的比对结果，可以得知质谱匹配肽段氨基酸为530个，占专利所述VII型胶原蛋白(1357-1931位氨基酸)的92％，并结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果，验证可知菌株分泌表达的蛋白为设计的VII型胶原蛋白片段。
以上所述的实施例是是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。在依据本发明构思的条件下本领域普通技术人员进行的相关推演和替换，在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (8)
1.一种重组人源Ⅶ型胶原蛋白，其特征在于，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1；
或氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
4.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2或3中任一项所述的多核苷酸。
5.毕赤酵母蛋白载体，其特征在于，选用pPICZ质粒，删除所述pPICZ质粒中α-factor分泌信号肽的Glu-Ala-Glu-Ala重复序列，将如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列序列克隆至所述信号肽的序列羧基端。
6.工程菌或细胞，其特征在于，所述工程菌或细胞包含权利要求4所述的重组表达载体，或权利要求5所述的毕赤酵母蛋白载体。
7.根据权利要求6所述的工程菌或细胞，其特征在于，所述工程菌或细胞的宿主为毕赤酵母。
8.权利要求1所述的重组人源Ⅶ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求5所述的毕赤酵母蛋白载体，加入PemⅠ限制性内切酶，制备线性化DNA；
将所述线性化DNA通过电转化置入毕赤酵母GS115中，筛选得到分泌表达所述重组人源Ⅶ型胶原蛋白的菌株；采用甲醇诱导所述菌株表达制得所述重组人源Ⅶ型胶原蛋白。
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