CN116850273A - 重组水蛭素在制备用于增强as斑块稳定性的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了重组水蛭素在制备用于增强AS斑块稳定性的药物中的应用。本发明提供了重组水蛭素在制备增强动脉粥样硬化斑块稳定性的药物中的应用以及重组水蛭素在制备减小动脉粥样硬化斑块面积的药物中的应用。重组水蛭素具有抑制AS形成并增强AS斑块稳定性的作用；重组水蛭素可以改善凝血酶诱导的巨噬细胞的脂质蓄积、氧化应激、炎症及凋亡；重组水蛭素通过调控PAR‑1/NF‑κB信号通路途径产生抗AS及增强AS斑块稳定性的作用。本发明对于降低心脑血管意外具有重要意义。

Description

重组水蛭素在制备用于增强AS斑块稳定性的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及重组水蛭素在制备用于增强AS斑块稳定性的药物中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种主要存在于血管壁处的慢性炎症性疾病，多种因素可以影响其发生和发展，并且具有较高的发生率和死亡率。AS的发病机制包括：血管内皮功能损伤；体内炎症反应，巨噬细胞黏附、活化和迁移；局部氧化应激；脂质沉积及斑块的形成等。由于早期的AS没有明显的体征变化，因此常被人们所忽视。随着AS疾病的发展，会出现血管内膜增厚、斑块不断扩大等现象。经相关文献报道，根据AS斑块内组成成分不同和分子生物学反应程度差异，可以将斑块分为稳定型和不稳定型，而不稳定斑块容易破裂造成远端血管的栓塞，进而引起急性心脑血管意外，如卒中等。因此，对不稳定斑块的形成原因进行探讨以及研发增加AS斑块稳定性的药物，对于降低由于斑块破裂导致的心脑血管意外的发生就显得尤为重要，增强AS斑块稳定性的药物研发也就更加迫在眉睫。
在AS的形成机制中，巨噬细胞扮演着极为重要的角色，它是参与AS斑块形成最重要的细胞之一。根据大量相关文献报道，巨噬细胞容易受到多方面因素以及药物的诱导，导致大量的脂质在巨噬细胞内蓄积，而过度的脂质积累会使其向泡沫细胞转化，血管中的脂质、钙和一些其他物质可以与细胞内沉积出的胆固醇和胆固醇酯在动脉血管壁处作用形成斑块，与此同时巨噬细胞会分泌炎性因子和趋化因子，这两种因子会影响斑块的稳定性，巨噬细胞持续的炎症状态则会进一步促进AS的发展并降低斑块稳定性。
蛋白酶激活受体(PAR)是G蛋白偶联受体家族的成员，参与体内多个生理过程，包括止血、形成血栓以及炎症反应等。据报道，蛋白酶激活受体(PAR)在AS中起到信号传导的作用，PAR-1(Protease activated recepter-1)作为蛋白酶激活受体家族中的重要成员，与凝血酶有很高的亲和力，两者结合后可以活化PAR-1，这一过程可以导致炎症反应的发生，而AS发生发展过程中的PAR1受体表达上调与心血管疾病的发生与发展息息相关。NF-κB信号通路作为一种典型的炎症通路，在正常血管中很少表达，但是在AS斑块部分却可以被大量激活。它参与AS形成中的多个过程，如巨噬细胞的形成、炎性反应以及炎性脂质的形成等。活化的NF-κB还可以促进生长因子和促炎因子的转录，而这些都是造成AS斑块形成的重要因素。近年来，NF-κB p65在肿瘤的形成与发展、AS斑块形成中的作用越来越受到重视。而PAR-1与NF-κB信号通路之间是否存在联系，促进AS斑块的形成，降低斑块稳定性，目前尚无明确结论。
现有技术中，重组水蛭素用于增强AS进展期斑块稳定性未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供重组水蛭素在制备用于增强AS斑块稳定性的药物中的应用，探讨重组水蛭素对AS防治作用及对斑块稳定性的影响，并探究其可能的分子机制，为探讨AS的发病机制及增强AS斑块稳定性，降低心脑血管意外具有重要意义。
本发明提供了重组水蛭素在制备增强动脉粥样硬化斑块稳定性的药物中的应用。
所述应用中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路增强动脉粥样硬化斑块稳定性。
所述应用中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路的激活增强动脉粥样硬化斑块稳定性。
所述应用中，重组水蛭素通过增加斑块纤维帽厚度增强动脉粥样硬化斑块稳定性。
所述应用中，重组水蛭素通过抑制炎症因子蛋白表达增强动脉粥样硬化斑块稳定性。所述炎症因子为ICAM-1和/或TNF-α和/或IL-6和/或VCAM-1和/或磷酸化p65蛋白。
所述应用中，重组水蛭素通过调节脂质稳态增强动脉粥样硬化斑块稳定性。调节脂质稳态体现为使血清中的LDL-C含量下降和/或TG含量下降和/或T-CHO含量下降和/或HDL-C含量升高。
所述应用中，重组水蛭素通过降低血清APC活性增强动脉粥样硬化斑块稳定性。
本发明提供了重组水蛭素在制备减小动脉粥样硬化斑块面积的药物中的应用。
所述应用中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路减小动脉粥样硬化斑块面积。
所述应用中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路的激活减小动脉粥样硬化斑块面积。
所述应用中，重组水蛭素通过抑制炎症因子蛋白表达减小动脉粥样硬化斑块面积。所述炎症因子为ICAM-1和/或TNF-α和/或IL-6和/或VCAM-1和/或磷酸化p65蛋白。
所述应用中，重组水蛭素通过调节脂质稳态减小动脉粥样硬化斑块面积。调节脂质稳态体现为使血清中的LDL-C含量下降和/或TG含量下降和/或T-CHO含量下降和/或HDL-C含量升高。
所述应用中，重组水蛭素通过降低血清APC活性减小动脉粥样硬化斑块面积。
本发明还提供了重组水蛭素在制备治疗动脉粥样硬化斑块的药物中的应用。
所述应用中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路治疗动脉粥样硬化斑块。
所述应用中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路的激活治疗动脉粥样硬化斑块。
所述应用中，重组水蛭素通过增加斑块纤维帽的厚度治疗动脉粥样硬化斑块。
所述应用中，重组水蛭素通过抑制炎症因子蛋白表达治疗动脉粥样硬化斑块。所述炎症因子为ICAM-1和/或TNF-α和/或IL-6和/或VCAM-1和/或磷酸化p65蛋白。
所述应用中，重组水蛭素通过调节脂质稳态治疗动脉粥样硬化斑块。调节脂质稳态体现为使血清中的LDL-C含量下降和/或TG含量下降和/或T-CHO含量下降和/或HDL-C含量升高。
所述应用中，重组水蛭素通过降低血清APC活性治疗动脉粥样硬化斑块。
本发明还提供了重组水蛭素在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
所述应用中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路治疗动脉粥样硬化。
所述应用中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路的激活治疗动脉粥样硬化。
所述应用中，重组水蛭素通过增加斑块纤维帽的厚度治疗动脉粥样硬化。
所述应用中，重组水蛭素通过抑制炎症因子蛋白表达治疗动脉粥样硬化。所述炎症因子为ICAM-1和/或TNF-α和/或IL-6和/或VCAM-1和/或磷酸化p65蛋白。
所述应用中，重组水蛭素通过调节脂质稳态治疗动脉粥样硬化。调节脂质稳态体现为使血清中的LDL-C含量下降和/或TG含量下降和/或T-CHO含量下降和/或HDL-C含量升高。
所述应用中，重组水蛭素通过降低血清APC活性治疗动脉粥样硬化。
以上任一所述应用中，重组水蛭素与凝血酶竞争PAR-1的表面结合位点从而抑制PAR-1激活从而发挥功能。
本发明还提供了一种增强动脉粥样硬化斑块稳定性的药物，其含有重组水蛭素。
所述药物中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路增强动脉粥样硬化斑块稳定性。
所述药物中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路的激活增强动脉粥样硬化斑块稳定性。
所述药物中，重组水蛭素通过增加斑块纤维帽厚度增强动脉粥样硬化斑块稳定性。
所述药物中，重组水蛭素通过抑制炎症因子蛋白表达增强动脉粥样硬化斑块稳定性。所述炎症因子为ICAM-1和/或TNF-α和/或IL-6和/或VCAM-1和/或磷酸化p65蛋白。
所述药物中，重组水蛭素通过调节脂质稳态增强动脉粥样硬化斑块稳定性。调节脂质稳态体现为使血清中的LDL-C含量下降和/或TG含量下降和/或T-CHO含量下降和/或HDL-C含量升高。
所述药物中，重组水蛭素通过降低血清APC活性增强动脉粥样硬化斑块稳定性。
本发明还提供了一种减小动脉粥样硬化斑块面积的药物，其含有重组水蛭素。
所述药物中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路减小动脉粥样硬化斑块面积。
所述药物中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路的激活减小动脉粥样硬化斑块面积。
所述药物中，重组水蛭素通过抑制炎症因子蛋白表达减小动脉粥样硬化斑块面积。所述炎症因子为ICAM-1和/或TNF-α和/或IL-6和/或VCAM-1和/或磷酸化p65蛋白。
所述药物中，重组水蛭素通过调节脂质稳态减小动脉粥样硬化斑块面积。调节脂质稳态体现为使血清中的LDL-C含量下降和/或TG含量下降和/或T-CHO含量下降和/或HDL-C含量升高。
所述药物中，重组水蛭素通过降低血清APC活性减小动脉粥样硬化斑块面积。
本发明还提供了一种治疗动脉粥样硬化斑块的药物，其含有重组水蛭素。
所述药物中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路治疗动脉粥样硬化斑块。
所述药物中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路的激活治疗动脉粥样硬化斑块。
所述药物中，重组水蛭素通过增加斑块纤维帽的厚度治疗动脉粥样硬化斑块。
所述药物中，重组水蛭素通过抑制炎症因子蛋白表达治疗动脉粥样硬化斑块。所述炎症因子为ICAM-1和/或TNF-α和/或IL-6和/或VCAM-1和/或磷酸化p65蛋白。
所述药物中，重组水蛭素通过调节脂质稳态治疗动脉粥样硬化斑块。调节脂质稳态体现为使血清中的LDL-C含量下降和/或TG含量下降和/或T-CHO含量下降和/或HDL-C含量升高。
所述药物中，重组水蛭素通过降低血清APC活性治疗动脉粥样硬化斑块。
本发明还提供了一种治疗动脉粥样硬化的药物，其含有重组水蛭素。
所述药物中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路治疗动脉粥样硬化。
所述药物中，重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路的激活治疗动脉粥样硬化。
所述药物中，重组水蛭素通过增加斑块纤维帽的厚度治疗动脉粥样硬化。
所述药物中，重组水蛭素通过抑制炎症因子蛋白表达治疗动脉粥样硬化。所述炎症因子为ICAM-1和/或TNF-α和/或IL-6和/或VCAM-1和/或磷酸化p65蛋白。
所述药物中，重组水蛭素通过调节脂质稳态治疗动脉粥样硬化。调节脂质稳态体现为使血清中的LDL-C含量下降和/或TG含量下降和/或T-CHO含量下降和/或HDL-C含量升高。
所述药物中，重组水蛭素通过降低血清APC活性治疗动脉粥样硬化。
以上任一所述药物中，重组水蛭素与凝血酶竞争PAR-1的表面结合位点从而抑制PAR-1激活从而发挥功能。
具体的，所述重组水蛭素为天津和睦健民生物科技有限公司产品。
具体的，所述重组水蛭素如CN101250530B专利公告文本中序列表的序列1所示。
具体的，所述重组水蛭素是由如CN101250530B专利公告文本中序列表的序列2所示DNA分子表达得到的。
具体的，所述重组水蛭素为CN101250530B专利公告文本中多形汉逊酵母205-17CGMCC No.2424表达得到的重组水蛭素。
具体的，所述重组水蛭素为CN101250530B专利公告文本中0084段得到的重组水蛭素。
在实际应用中，可以将重组水蛭素直接给予病人、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予病人，以达到治疗目的。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等。
重组水蛭素的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体活性成分，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。
本发明中体内试验的结果：与AS模型组相比，重组水蛭素可以减轻小鼠主动脉血管壁增厚失去弹性等特征以及增加斑块稳定性；重组水蛭素降低小鼠主动脉中TNF-α、TF、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、IL-6等炎症因子的蛋白表达；重组水蛭素降低小鼠血清中TG、TC、LDL-C的水平并升高HDL-C的水平；重组水蛭素抑制小鼠主动脉中AS相关指标蛋白PAI、PAR-4和TAFI的表达水平；重组水蛭素下调小鼠主动脉中斑块稳定性相关蛋白MMP-2、MMP-9的水平；免疫组化结果提示，重组水蛭素降低小鼠主动脉斑块中巨噬细胞内蛋白(F4/80)、MMP-2、MMP-9和α-SMA蛋白丰度。
本发明中体外试验的结果：重组水蛭素可以明显抑制凝血酶诱导的巨噬细胞Raw264.7的氧化应激和细胞凋亡；重组水蛭素可以降低凝血酶诱导的巨噬细胞Raw264.7的MDA的活性，抑制LDH的释放；重组水蛭素可以增加SOD和GSH的活性；重组水蛭素抑制动脉粥样硬化相关蛋白MCP-1、PAI、PAR-4和TAFI的表达水平；重组水蛭素可以抑制巨噬细胞Raw264.7中TF、ICAM-1、VCAM-1、Nox-4等炎症相关蛋白的表达；重组水蛭素可以抑制巨噬细胞Raw264.7中动脉粥样硬化斑块稳定性相关指标蛋白MMP-2及MMP-9的表达；沉默细胞内PAR-1基因后，重组水蛭素抑制下游蛋白MMP-9、Caspase-3、ICAM-1、VCAM-1的表达程度降低，说明重组水蛭素对斑块稳定性的增强作用在沉默PAR-1基因后减弱；用PDTC(pyrrolidinedithiocarbamate)阻断NF-κB信号通路后，重组水蛭素抑制MMP-9、Caspase-3蛋白表达的作用减弱，证明重组水蛭素增强斑块稳定性的作用在阻断NF-κB信号通路后减弱。由此说明，重组水蛭素发挥抗炎、抗凋亡过程及增强斑块稳定性作用可能与PAR-1/NF-κB信号通路有关。
本发明的结论：重组水蛭素具有抑制AS形成并增强AS斑块稳定性的作用；重组水蛭素可以改善凝血酶诱导的巨噬细胞的脂质蓄积、氧化应激、炎症及凋亡；重组水蛭素通过调控PAR-1/NF-κB信号通路途径产生抗AS及增强AS斑块稳定性的作用。
附图说明
图1为实施例1中重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠体内脂质稳态的影响的结果。
图2为实施例1中重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠血浆活化蛋白C水平的影响的结果。
图3为实施例1中重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的抑制作用的结果。
图4为实施例1中重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉MMP-9、MMP-2、α-SMA蛋白表达及巨噬细胞含量的影响的结果。
图5为实施例2中重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠体内脂质稳态的影响的结果。
图6为实施例2中重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠血浆活化蛋白C水平的影响的结果。
图7为实施例2中重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉血管动脉粥样硬化的保护作用的结果。
图8为实施例2中重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉组织炎症相关因子蛋白表达的影响的结果。
图9为实施例2中重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉组织中动脉粥样硬化斑块稳定性相关蛋白指标表达的影响的结果。
图10为实施例2中免疫组化法检测重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉中MMP-9、MMP-2、α-SMA蛋白表达及巨噬细胞含量的影响的结果。
图11为实施例2中重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉中AS指标蛋白表达的影响的结果。
图12为实施例3中重组水蛭素提高凝血酶作用下的巨噬细胞生存能力的结果。
图13为实施例3中重组水蛭素对凝血酶诱导的巨噬细胞氧化应激和炎症表达的影响的结果。
图14为实施例3中重组水蛭素对凝血酶诱导的巨噬细胞凋亡的影响的结果。
图15为实施例3中重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路下调凝血酶诱导的巨噬细胞中AS斑块稳定性相关指标蛋白的表达的结果(野生型细胞试验)。
图16为实施例3中重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路下调凝血酶诱导的巨噬细胞中AS斑块稳定性相关指标蛋白的表达的结果(si-RNA相关试验以及PDTC相关试验)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。使用GraphPad Prism 8和SPSS 17.0软件对实验中所得出的数据进行统计分析，所有数据用平均值±标准偏差表示；各组间采单因素方差分析(ANOVA)中的最小显著性差异法来进行评估。
MTT检测试剂盒以及DAPI染色试剂盒均为索莱宝(中国北京)产品。凝血酶(thrombin)：索莱宝(中国北京)。NF-κB信号通路阻断剂(PDTC)：美国MedChemExpress公司。APC，全称为血浆活化蛋白C。实施例中所用的重组水蛭素为天津和睦健民生物科技有限公司产品(制备方法见公告号为CN101250530B的专利文献，即其中0084段中得到的重组水蛭素，该专利文献的申请号为200810103154.8)。辛伐他汀(Simvastatin)(CAS号：79902-63-9)：大连美仑生物科技有限公司，批号MB1222。ApoE-/-雄性小鼠：该小鼠的背景小鼠为C57BL/6J小鼠；北京维通利华实验动物技术有限公司。Raw264.7细胞(小鼠巨噬细胞)：北京中生奥邦生物科技有限公司。正常饮食：即江苏美迪森生物医药有限公司的“大小鼠生长繁殖饲料”，货号MD17111，产品形状为颗粒高脂饮食(High Fat Diet,HFD)：即江苏美迪森生物医药有限公司的“动脉粥样硬化模型动物诱导饮食”，货号MD12015。
实施例1、采用早期AS模型评价药效
一、分组处理
20只8周龄ApoE-/-雄性小鼠随机分为2组(每组10只)，即正常对照组和单独给药组。50只8周龄ApoE-/-雄性小鼠随机分为5组(每组10只)，即AS模型组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组和阳性对照组。
正常对照组：无给药处理，正常饮食喂养；
单独给药组：给予重组水蛭素(皮下注射，每天两次)，重组水蛭素的单次给药剂量为0.6mg/kg体重；正常饮食喂养；
AS模型组：无给药处理，高脂饮食喂养；
低剂量治疗组：给予重组水蛭素(皮下注射，每天两次)，重组水蛭素的单次给药剂量为0.3mg/kg体重；高脂饮食喂养；
中剂量治疗组：给予重组水蛭素(皮下注射，每天两次)，重组水蛭素的单次给药剂量为0.6mg/kg体重；高脂饮食喂养；
高剂量治疗组：给予重组水蛭素(皮下注射，每天两次)，重组水蛭素的单次给药剂量为1.2mg/kg体重；高脂饮食喂养；
阳性对照组：给予辛伐他汀(灌胃，每天两次)，辛伐他汀的单次给药剂量为10mg/kg体重；高脂饮食喂养；
试验周期为8周。
二、药效评价
完成整个试验周期后，麻醉处死小鼠，一方面进行眼球取血，另一方面取主动脉。
血液静置半小时，然后4℃、3000rpm离心10min，收集上清液，即为血清。
1、重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠体内脂质稳态的影响
检测血清中的LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)含量、HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)含量、TG(甘油三酯)含量以及T-CHO(总胆固醇)含量。用于检测LDL-C的试剂盒，全称为低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒(双试剂直接法)(分光光度计)，购自南京建成生物技术研究所有限公司，产品目录号为A113-2-1。用于检测HDL-C的试剂盒，全称为高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒(双试剂直接法)(分光光度计)，购自南京建成生物技术研究所有限公司，产品目录号为A112-2-1。用于检测TG的试剂盒，全称为甘油三酯(TG)测定试剂盒(单试剂GPO-PAP法)(分光光度计)，购自南京建成生物技术研究所有限公司，产品目录号为A110-2-1。用于检测T-CHO的试剂盒，全称为总胆固醇(TC/TCH)测定试剂盒(单试剂GPO-PAP法)(分光光度计)，购自南京建成生物技术研究所有限公司，产品目录号为A111-2-1。
结果见图1(与AS模型组相比，*p<0.05，**p<0.01；与正常对照组相比，##p<0.01)。与正常对照组相比，AS模型组小鼠血清中LDL-C、TG、T-CHO的含量上升；与AS模型组相比，重组水蛭素治疗组小鼠的三种指标的含量下降并呈剂量依赖性。与正常对照组相比，AS模型组小鼠血清HDL-C的含量下降；与AS模型组相比，重组水蛭素治疗组小鼠的HDL-C的含量呈剂量依赖性升高。结果表明，重组水蛭素可以调节高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠的脂质稳态。
2、重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠血浆活化蛋白C水平的影响
检测血清中的APC含量。用于检测APC的试剂盒，全称为小鼠活化蛋白C(APC)ELISA试剂盒，购自上海茁彩生物科技有限公司，产品目录号为ZC-38255。
结果见图2(与AS模型组相比，*p<0.05，**p<0.01；与正常对照组相比，##p<0.01)。与正常对照组相比，AS模型组小鼠血清APC活性明显增加；与AS模型组相比，重组水蛭素治疗组小鼠APC活性呈剂量依赖性下降。
3、重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的抑制作用
取主动脉，分别进行油红O染色和HE染色。油红O染色采用油红O染液，购自南京建成生物技术研究所有限公司，产品目录号为D027-1-3。
油红O染色的结果见图3的A。AS模型组小鼠的主动脉呈现大面积橘红色，表明有很多斑块；与AS模型组相比，重组水蛭素治疗组小鼠的主动脉橘红色斑块面积明显变小而且数量减少。
HE染色的结果见图3的B。AS模型组小鼠的主动脉内膜AS斑块面积明显增多；与AS模型组相比，重组水蛭素治疗组小鼠的上述现象被逆转。
结果表明：重组水蛭素能够抑制高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉动脉粥样硬化斑块形成并呈剂量依赖性。
4、重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉MMP-9、MMP-2、α-SMA蛋白表达及巨噬细胞含量的影响
F4/80是小鼠成熟巨噬细胞的标志物。MMP(matrix metalloproteinase)是一种生物蛋白酶，其主要作用是降解细胞外基质，可以由巨噬细胞分泌，参与AS的整个进程，而MMP-2和MMP-9作为MMP家族的成员，与AS斑块稳定性程度密不可分，α-SMA(alpha smoothmuscle Actin)则是小鼠血管平滑肌细胞的标志物。
取主动脉，通过免疫组化检测主动脉内F4/80、MMP-9、MMP-2及α-SMA四种蛋白表达情况。用于检测F4/80的抗体为F4/80Polyclonal Antibody(武汉三鹰生物技术有限公司，产品目录号为29414-1-AP)。用于检测MMP-9的抗体为MMP9(N-Terminal)PolyclonalAntibody(武汉三鹰生物技术有限公司，产品目录号为10375-2-AP)。用于检测MMP-2的抗体为MMP2 Polyclonal Antibody(武汉三鹰生物技术有限公司，产品目录号为10373-2-AP)。用于检测α-SMA的抗体为Smooth Muscle Actin Specific Monoclonal Antibody(武汉三鹰生物技术有限公司，目录号：67735-1-Ig)。
结果见图4(A：F4/80；B：MMP-9；C：MMP-2；D：α-SMA)。与正常对照组相比，AS模型组小鼠主动脉斑块处出现大面积棕黄色，表明F4/80、MMP-9、MMP-2、α-SMA四种蛋白大量表达。与AS模型组相比，重组水蛭素治疗组小鼠AS斑块中橘黄色面积明显减少，F4/80、MMP-9、MMP-2、α-SMA蛋白阳性表达也明显减少。
实施例2、采用晚期AS模型评价药效
一、分组处理
试验周期为16周。
其他同实施例1的步骤一。
二、药效评价
基本同实施例1的步骤二，因此仅对差异步骤进行描述。
1、重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠体内脂质稳态的影响
结果见图5(与AS模型组相比，*p<0.05，**p<0.01；与正常对照组相比，##p<0.01)。
结果趋势同实施例1的步骤二的1。
结果说明，重组水蛭素对于长期高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠体内的脂质稳态同样具有调节作用。
2、重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠血浆活化蛋白C水平的影响
结果见图6(与AS模型组相比，*p<0.05，**p<0.01；与正常对照组相比，##p<0.01)。
结果趋势同实施例1的步骤二的2。
3、重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉血管动脉粥样硬化的保护作用
取主动脉，分别进行油红O染色、HE染色、弹力纤维素染色、Von Kossa染色、masson染色和天狼猩红染色。
油红O染色的结果见图7的A。AS模型组小鼠的主动脉中斑块数量明显比其他组多并且出现大面积橘红色。与AS模型组小时相比，重组水蛭素治疗组小鼠的主动脉橘红色斑块面积明显变小而且数量减少。
HE染色的结果见图7的B。与正常对照组相比，AS模型组小鼠的主动脉内膜坏死核心区面积明显增多，斑块纤维帽变薄，表面有明显破损。与AS模型组相比，重组水蛭素治疗组逆转了上述现象，纤维帽明显增厚。
弹力纤维素染色的结果见图7的C。AS模型组小鼠主动脉内弹性纤维形态明显改变，病变纤维帽较薄。与AS模型组相比，重组水蛭素治疗组小鼠病变纤维帽明显增厚。
Von Kossa染色的结果见图7的D。AS模型组小鼠主动脉内可见黑色钙结节颗粒沉积，而重组水蛭素可以减少钙结节的产生。
masson染色的结果见图7的E。AS模型组小鼠主动脉周围血管基质增多，出现大量蓝色胶原纤维，给予重组水蛭素后蓝色胶原纤维有所减少。
天狼猩红染色的结果见图7的F。AS模型组小鼠主动脉出现胶原纤维异常增生，重组水蛭素则可以减少红色胶原纤维的存在，保持小鼠主动脉的正常形态。
以上结果说明，重组水蛭素抑制AS病变形成，并可以增加纤维帽的厚度，使斑块稳定性增加。
4、重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉组织炎症相关因子蛋白表达的影响
NF-κB作为一种重要的核转录调节因子，在炎症的发生发展中发挥着至关重要的作用，它可以诱导许多炎症相关基因(如ICAM-1、VCAM-1和MCP-1等)的过度表达。
取主动脉，提取总蛋白，采用western blot检测炎症相关蛋白。
结果见图8(与AS模型组相比，*p<0.05，**p<0.01；与正常对照组相比，##p<0.01)。与正常对照组相比，AS模型组小鼠主动脉组织中ICAM-1、TNF-α、IL-6、VCAM-1蛋白和磷酸化p65蛋白的水平显著增加。与AS模型组相比，重组水蛭素治疗组小鼠的ICAM-1、TNF-α、IL-6、VCAM-1蛋白水平降低，并且p65的磷酸化明显降低。结果表明，重组水蛭素能够明显抑制高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉组织中NF-κB通路的激活及炎症因子的蛋白表达，且该作用呈剂量依赖性。
5、重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉组织中动脉粥样硬化斑块稳定性相关蛋白指标表达的影响
取主动脉，提取总蛋白，采用western blot检测动脉粥样硬化斑块稳定性相关蛋白(MMP-2和MMP-9)。
结果见图9(与AS模型组相比，*p<0.05，**p<0.01；与正常对照组相比，##p<0.01)。与正常对照组相比，AS模型组小鼠主动脉中MMP-9和MMP-2的蛋白表达水平明显增多。与AS模型组相比，给予重组水蛭素可以降低MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平并呈剂量依赖性，提示重组水蛭素可以增加AS斑块稳定性。
6、免疫组化法检测重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉中MMP-9、MMP-2、α-SMA蛋白表达及巨噬细胞含量的影响
取主动脉，通过免疫组化检测主动脉内F4/80、MMP-9、MMP-2及α-SMA四种蛋白表达情况。
结果见图10(A：F4/80；B：MMP-9；C：MMP-2；D：α-SMA)。与正常对照组相比，AS模型组小鼠主动脉出现大量的斑块，并且在斑块处可以观察到大面积橘黄色，F4/80、MMP-9、MMP-2、α-SMA四种蛋白大量表达。与AS模型组相比，重组水蛭素治疗组小鼠斑块中棕黄色部分逐渐减少，F4/80、MMP-9、MMP-2、α-SMA蛋白表达逐渐减少，小鼠主动脉逐渐恢复正常形态。
结果提示，重组水蛭素具有增强AS斑块稳定性的作用。
7、重组水蛭素对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉中AS指标蛋白表达的影响
取主动脉，提取总蛋白，采用western blot检测TAFI、PAI、PAR-1和PAR-4蛋白。用于检测TAFI的抗体为Carboxypeptidase B2 Polyclonal Antibody(武汉三鹰生物技术有限公司，产品目录号为10672-1-AP)。用于检测PAI的抗体为PAI-1Monoclonal Antibody(武汉三鹰生物技术有限公司，产品目录号为1H4A5)。用于检测PAR-1的抗体为MARK2Polyclonal Antibody(武汉三鹰生物技术有限公司，产品目录号为15492-1-AP)。用于检测PAR-4的抗体为F2RL3 Polyclonal Antibody(武汉三鹰生物技术有限公司，产品目录号为25306-1-AP)。
结果见图11(与AS模型组相比，*p<0.05，**p<0.01；与正常对照组相比，##p<0.01)。与正常对照组相比，AS模型组小鼠主动脉中PAR-1、PAR-4、TAFI和PAI蛋白水平显著上调，而给予重组水蛭素可以降低这四种的蛋白表达水平并呈剂量依赖性。结果提示重组水蛭素抑制AS作用及增强斑块稳定性的作用与其与凝血酶竞争PAR-1的表面结合位点并抑制PAR-1的激活有关。
实施例3、体外试验
一、重组水蛭素提高凝血酶作用下的巨噬细胞生存能力
1、将Raw264.7细胞接种至96孔板中，采用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养1天。
2、完成步骤1后，加入凝血酶并使其在体系中的浓度为2U/mL，培养5小时。
设置不加入凝血酶的空白孔。
3、完成步骤2后，吸弃培养上清，加入含药物的培养基，培养24小时。
设置不加入药物的阴性孔。
含药物的培养基是将药物加入高糖DMEM培养基得到的。药物为重组水蛭素，药物在体系中的浓度分别设置为：25U/mL、50U/mL或100U/mL。
4、完成步骤3后，进行MTT染色，然后用酶标仪测吸光度值(波长为570nm)。
结果见图12(n＝8；与阴性孔相比，*p<0.05，**p<0.01；与空白孔相比，##p<0.01)。阴性孔Raw264.7细胞的存活率约为60％，给予重组水蛭素后细胞生存率呈剂量依赖性的提高。说明重组水蛭素可以抑制凝血酶引起的巨噬细胞的损伤。
二、重组水蛭素对凝血酶诱导的巨噬细胞氧化应激和炎症表达的影响
1、细胞培养和处理
(1)将Raw264.7细胞接种至6孔板中，采用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养1天。
(2)完成步骤(1)后，加入凝血酶并使其在体系中的浓度为2U/mL，培养5小时。
(3)完成步骤(2)后，吸弃培养上清，加入含药物的培养基，培养24小时。含药物的培养基是将药物加入高糖DMEM培养基得到的。药物为重组水蛭素时，药物在体系中的浓度分别设置为：25U/mL、50U/mL或100U/mL。药物为辛伐他汀时，药物在体系中的浓度设置为5nM。
设置不加入凝血酶且不加入药物的正常组。设置加入凝血酶不加入药物的模型组。
2、重组水蛭素对凝血酶诱导的巨噬细胞氧化应激的影响
检测细胞内MDA、LDH、GSH、SOD的表达变化情况。丙二醛测定试剂盒(MDA)、乳酸脱氢酶测定试剂盒(LDH)、还原型谷胱甘肽测定试剂盒(GSH)、超氧化物歧化酶测定试剂盒(SOD)均为南京建成有限公司产品。
结果见图13(n＝8；与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01；与正常组相比，##p<0.01)。与正常组相比，模型组细胞内MDA的含量和LDH的释放明显增加，细胞内SOD和GSH的含量明显降低，重组水蛭素作用于细胞后MDA的含量以及LDH的释放明显下降，SOD和GSH的含量明显上升。结果表明，重组水蛭素能够抑制thrombin诱导的巨噬细胞Raw264.7的氧化损伤作用并成剂量依赖性。
3、重组水蛭素对凝血酶诱导的巨噬细胞氧化相关蛋白及炎症因子表达的影响
收集细胞，提取总蛋白。通过western blot检测细胞氧化炎症相关因子以及黏附分子(VCAM-1和ICAM-1)表达的情况。
结果见图13(n＝8；与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01；与正常组相比，##p<0.01)。与正常组相比，模型组细胞中氧化相关蛋白Nox-4及炎症因子IL-6、TF和MCP-1的表达明显增高，给予重组水蛭素后Nox-4、IL-6、TF和MCP-1的表达明显降低。与正常组相比，模型组细胞中的VCAM-1和ICAM-1蛋白表达明显升高，重组水蛭素处理后可以逆转这种现象。结果表明，重组水蛭素可以明显抑制thrombin诱导的巨噬细胞Raw264.7的氧化应激及炎症反应。
三、重组水蛭素对凝血酶诱导的巨噬细胞凋亡的影响
1、将Raw264.7细胞接种至6孔板中，采用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养1天。
2、完成步骤1后，加入凝血酶并使其在体系中的浓度为2U/mL，培养5小时。
3、完成步骤2后，吸弃培养上清，加入含药物的培养基，培养24小时。含药物的培养基是将药物加入高糖DMEM培养基得到的。药物为重组水蛭素时，药物在体系中的浓度分别设置为：25U/mL、50U/mL或100U/mL。药物为辛伐他汀时，药物在体系中的浓度设置为5nM。
4、完成步骤3后，进行DAPI染色，然后用磷酸缓冲盐溶液洗涤，然后在荧光显微镜下观察(波长360-400nM)。
结果见图14。与正常组相比，模型组较多细胞的细胞核出现了非均匀的荧光强度，并且出现了细胞核的染色质凝集现象。与模型组相比，重组水蛭素处理组细胞核荧光强度逐渐减弱。结果表明，重组水蛭素能够改善thrombin诱导的巨噬细胞凋亡且作用呈剂量依赖性。
四、重组水蛭素对凝血酶诱导的巨噬细胞中TAFI、PAI和PAR-4以及斑块稳定性指标蛋白表达的影响
1、将Raw264.7细胞接种至6孔板中，采用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养1天。
2、完成步骤1后，加入凝血酶并使其在体系中的浓度为2U/mL，培养5小时。
3、完成步骤2后，吸弃培养上清，加入含药物的培养基，培养24小时。含药物的培养基是将药物加入高糖DMEM培养基得到的。药物为重组水蛭素时，药物在体系中的浓度分别设置为：25U/mL、50U/mL或100U/mL。药物为辛伐他汀时，药物在体系中的浓度设置为5nM。
4、完成步骤3后，收集细胞，提取总蛋白。通过western blot检测细胞中TAFI、PAI和PAR-4的蛋白表达情况。通过western blot检测细胞中动脉粥样硬化斑块稳定性相关指标MMP-2和MMP-9蛋白表达情况。
结果见图15(n＝8；与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01；与正常组相比，##p<0.01)。与正常组相比，凝血酶可以明显升高TAFI、PAI和PAR-4的蛋白表达水平，重组水蛭素可以剂量依赖性地降低TAFI，PAI和PAR-4的蛋白表达水平。同样的，重组水蛭素可以剂量依赖性地下调凝血酶对MMP-2和MMP-9的蛋白表达的影响，提示重组水蛭素可以增加AS的斑块稳定性。
五、重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路下调凝血酶诱导的巨噬细胞中AS斑块稳定性相关指标蛋白的表达
为了进一步探究重组水蛭素防治动脉粥样硬化及增强斑块稳定性的作用机制，首先对凝血酶诱导的Raw264.7细胞中PAR-1蛋白表达水平及NF-κB通路的p65磷酸化进行检测。细胞处理方法参见步骤四的1至3。通过Western blot方法检测。结果见图16的A和B。与正常组相比，模型组细胞的PAR-1和p-p65的表达明显增高，而给予重组水蛭素后PAR-1和p-p65的表达水平呈剂量依赖性的降低。
为了进一步确证PAR-1和p65在重组水蛭素增加AS斑块稳定性中的作用，用基因沉默技术对PAR-1基因进行敲低，用NF-κB信号通路阻断剂PDTC阻断NF-κB信号通路。采用Raw264.7细胞。si-RNA序列如下：PAR-1siRNA(sense：5'-AAGGCUACUAUGCCUACUACU-3'；antisense：5'-AGUAGUAGGCAUAGUAGCCUU-3')；Negative control(sense：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；antisense：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’)。PAR-1被敲低的细胞与正常组细胞相比，PAR-1蛋白表达量只有40％，这说明细胞中PAR-1基因敲低成功(图16的C)。细胞处理方法参见步骤四的1至3。通过Western blot方法对下游炎症、凋亡及斑块稳定性相关蛋白的表达进行检测。结果见图16的D、E、F、G和H。对于未进行PAR-1敲低的正常细胞来说，凝血酶诱导组MMP-9、Caspase-3、ICAM-1、VCAM-1和p-p65蛋白的表达显著高于不加入凝血酶的对照组，而重组水蛭素作用后上述蛋白表达明显降低，各蛋白表达分别降低4.69倍、2.12倍、2.37倍、2.04倍和7.98倍。然而，在PAR-1敲低的细胞中，重组水蛭素则只能使MMP-9、Caspase-3、ICAM-1、VCAM-1和p-p65的蛋白表达分别降低1.26倍、1.11倍、1.30倍、1.28倍和2.91倍。由此可以说明，重组水蛭素抑制MMP-9、Caspase-3、ICAM-1、VCAM-1和p-p65的蛋白表达作用在敲低PAR-1之后明显减弱。同样，在使用NF-κB信号通路阻断剂PDTC后，在正常细胞中，模型组中MMP-9和Caspase-3的蛋白表达显著高于对照组，重组水蛭素处理后MMP-9和Caspase-3的蛋白表达分别降低2.89倍和1.74倍(图16的I和J)。然而，在PDTC阻断NF-κB信号通路后，重组水蛭素处理后仅能使MMP-9和Caspase-3的蛋白表达分别降低1.26倍和1.33倍(图16的I和J)。结果表明，重组水蛭素抑制MMP-9和Caspase-3蛋白表达的作用在阻断NF-κB信号通路后明显减弱。以上结果表明重组水蛭素通过抑制PAR-1/NF-κB信号通路抑制AS并增强斑块稳定性。图16中，n＝8；与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01；与正常组相比，##p<0.01。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 天津和睦健民生物科技有限公司
<120> 重组水蛭素在制备用于增强AS斑块稳定性的药物中的应用
<130> GNCYX213692
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaggcuacua ugccuacuac u 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aguaguaggc auaguagccu u 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (8)

1.重组水蛭素在制备增强动脉粥样硬化斑块稳定性的药物中的应用。
2.重组水蛭素在制备减小动脉粥样硬化斑块面积的药物中的应用。
3.重组水蛭素在制备治疗动脉粥样硬化斑块的药物中的应用。
4.重组水蛭素在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
5.一种增强动脉粥样硬化斑块稳定性的药物，其含有重组水蛭素。
6.一种减小动脉粥样硬化斑块面积的药物，其含有重组水蛭素。
7.一种治疗动脉粥样硬化斑块的药物，其含有重组水蛭素。
8.一种治疗动脉粥样硬化的药物，其含有重组水蛭素。
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