CN116848131A - 工程化细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了具有表面分子的工程化细胞(诸如干细胞或T细胞)，该表面分子包含与T细胞表面抗原(诸如CCR5、CD4或CXCR4)或HIV抗原结合的膜系链结合部分，或抑制HIV的膜融合的膜系链抑制部分(诸如C34)。本申请还提供了制备和使用这些工程化细胞的方法。

Description

工程化细胞及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年2月9日提交的国际专利申请号PCT/CN 2021/076390的优先权，其内容通过援引以其全文并入本文。
序列表以ASCII文本文件提交
以下以ASCII文本文件提交的内容通过援引以其全文并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：761422003240SEQLIST.TXT，记录日期：2022年2月8日，大小：133KB)。
技术领域
本发明涉及包含可用于治疗感染性疾病诸如HIV的表面分子的工程化细胞。
背景技术
趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)用作HIV-1共受体，并且对于CCR5嗜性病毒的细胞感染是必需的。功能性受体的丧失保护免受HIV感染。参见Gupta等人Nature第568卷,第244–248页(2019)。CCR5基因编辑的造血干细胞和祖细胞(HSPC)移植是一种有前景的缓解HIV的策略。然而，在自体移植之前，仅一部分HSPC可离体编辑以提供针对感染的保护。通过数学模型推断，移植物中73％-90％受保护的HSPC的阈值足以克服猴免疫缺陷病毒(SHIV)免疫的移植依赖性损失。参见Cardozo等人bioRxiv 629717。然而，Xu等人显示，使用CRISPR-Cas9编辑的供体来源的分选HSPC仅导致CCR5插入或缺失(indel)效率为17.8％。参见Xu等人N Engl J Med.2019年9月26日；381(13):1240-1247。
本文提到的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的披露内容通过援引以其全文特此并入本文。
发明内容
本申请在一方面提供了一种包含编码表面分子的核酸的工程化细胞，该表面分子包含：a)结合部分，其中该结合部分i)特异性结合T细胞表面抗原并防止该T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合，或ii)与10-1074、10E8或PGT121竞争性地特异性结合HIV抗原，或与10-1074、10E8或PGT121结合相同的表位并防止HIV感染该工程化细胞；以及b)膜结构域，该膜结构域将该分子系链到膜上或促进该表面分子系链到膜上。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，T细胞表面抗原选自由CCR5、CD4和CXCR4组成的组。
在一些实施例中，根据上述工程化细胞中的任一种，T细胞表面抗原是CCR5。
本申请在另一方面提供了一种包含编码表面分子的核酸的工程化细胞，该表面分子包含：a)特异性结合CCR5并防止CCR5与HIV蛋白结合的结合部分，以及b)将该分子系链到膜上或促进该表面分子系链到膜上的膜结构域，并且该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。
在根据上述工程化细胞中的任一种的一些实施例中，该结合部分与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816特异性结合相同的表位。
在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ IDNO:75所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VH，以及b)包含SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VL。
在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含含有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:131所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VH，以及b)包含SEQ ID NO:132所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VL。
在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ IDNO:77或79所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VH，以及b)包含SEQ ID NO:78或80的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VL。
在一些实施例中，该抗体部分包含SEQ ID NO:1-3和133-135中的任一者所示的氨基酸序列，或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该T细胞表面抗原是CD4。在一些实施例中，该结合部分与C2-05、C2-11或C2-13竞争性地特异性结合CD4，或与C2-05、C2-11或C2-13特异性结合相同的表位。
在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VH，以及b)包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VL。
在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ IDNO:81所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VH，以及b)包含SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VL。
在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:4-6中的任一者的氨基酸序列，或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该表面分子包含结合部分，该结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性地特异性结合HIV，与10-1074、10E8或PGT121特异性结合相同的表位。
在一些实施例中，该表面分子包含结合部分，该结合部分与10-1074竞争性地特异性结合HIV，或与10-1074特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ IDNO:43的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VH，以及b)包含SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VL。
在一些实施例中，该表面分子包含结合部分，该结合部分与10E8竞争性地特异性结合HIV，或与10E8特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VH，以及b)包含SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VL。
在一些实施例中，该表面分子包含结合部分，该结合部分与PGT121竞争性地特异性结合HIV，或与PGT121特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ IDNO:73的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VH，以及b)包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VL。
在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:7、61或62的氨基酸序列，或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
在根据上述工程化细胞中的任一种的一些实施例中，VH和VL经由接头融合。在一些实施例中，VH和VL之间的接头是肽接头。在一些实施例中，VH和VL之间的接头包含SEQ IDNO:45的氨基酸序列。
在根据上述工程化细胞中的任一种的一些实施例中，该结合部分是sdAb、scFv、Fab’、(Fab’)2、Fv或肽配体。在一些实施例中，该结合部分是scFv。
在根据上述工程化细胞中的任一种的一些实施例中，该工程化细胞是干细胞。
在根据上述工程化细胞中的任一种的一些实施例中，该工程化细胞是免疫细胞。在一些实施例中，该工程化细胞是T细胞或自然杀伤细胞。在一些实施例中，该T细胞是γδT细胞。
本申请在另一方面提供了一种包含编码表面分子的核酸的工程化细胞，该表面分子包含：a)抑制HIV的膜融合的抑制部分，该抑制部分包含C34的氨基酸序列或其功能部分，以及b)将该分子系链到膜上或促进该表面分子系链到膜上的膜结构域，并且该工程化细胞是干细胞。
在根据上述工程化细胞中的任一种的一些实施例中，该膜结构域包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着信号序列。在一些实施例中，该GPI附着信号序列包含SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列。
在根据上述工程化细胞中的任一种的一些实施例中，该结合部分或抑制部分经由接头与膜结构域的N末端融合。在一些实施例中，a)结合部分或抑制部分和b)膜结构域之间的接头包括肽接头。在一些实施例中，该肽接头选自由SEQ ID NO:45-52、150和152组成的组。
在根据上述工程化细胞中的任一种的一些实施例中，该表面分子包含特异性结合第二抗原的第二结合部分。在一些实施例中，该结合部分和该第二结合部分串联连接。在一些实施例中，该表面分子包含：a)特异性结合CCR5或CD4的抗CCR5抗体部分或抗CD4抗体部分，以及b)特异性结合HIV抗原的抗HIV抗体部分或抑制HIV的膜融合的抑制部分。
在根据上述工程化细胞中的任一种的一些实施例中，工程化细胞包含第二表面分子，该第二表面分子包含特异性结合第二抗原的第二结合部分。在一些实施例中，该工程化细胞包含：a)特异性结合CCR5或CD4的抗CCR5抗体部分或抗CD4抗体部分，以及b)包含特异性结合HIV抗原的抗体部分或抑制HIV的膜融合的抑制部分的抗HIV表面分子。
在根据上述工程化细胞中的任一种的一些实施例中，该表面分子包含SEQ ID NO:136和144-147中的任一者所示的氨基酸序列。
在根据上述工程化细胞中的任一种的一些实施例中，该表面分子还在分子的N末端包含促进该表面分子系链到膜上的信号肽。在一些实施例中，该信号肽是CD8α信号肽。
在根据上述工程化细胞中的任一种的一些实施例中，该工程化细胞表达嵌合抗原受体。在一些实施例中，该嵌合抗原受体包含抗HIV抗体部分。
本申请在另一方面提供了多种工程化细胞，诸如上述工程化细胞中的任一种，其中在a)与多种不表达表面分子且易受HIV感染的细胞混合以及b)使该细胞组合物与HIV接触时，未感染HIV的细胞的百分比高于(诸如高至少约10％)工程化细胞的百分比。在一些实施例中，不包含表达表面分子的核酸的多种细胞的数量在该多种工程化细胞的数量的约80％至约120％之间。在一些实施例中，不包含表达表面分子的核酸的多种细胞表达CCR5、CXCR4和/或CD4并对HIV敏感。
本申请在另一方面提供了一种表面分子，该表面分子包含：a)特异性结合T细胞表面抗原并防止该T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合的结合部分，与抗HIV抗体竞争性地特异性结合HIV抗原或与该抗HIV抗体结合相同的表位并防止HIV感染工程化细胞的结合部分，或抑制HIV的膜融合的抑制部分；以及b)膜结构域，该膜结构域在细胞中表达后能够将该分子系链到细胞膜或促进该表面分子系链到细胞膜，其中当被细胞表达时，该细胞赋予针对HIV的群体免疫。在一些实施例中，该细胞表达CCR5、CD4或CXCR4。在一些实施例中，该细胞是TZM-bl细胞。在一些实施例中，该细胞不表达CCR5、CD4或CXCR4。
本申请在另一方面提供了一种表达上述表面分子的工程化细胞。在一些实施例中，该细胞是干细胞(诸如造血干细胞(HSC))。在一些实施例中，该细胞是免疫细胞。在一些实施例中，该细胞是T细胞。
在另一方面，本申请提供了一种包含上述工程化细胞或多种工程化细胞中的任一种的药物组合物。
本申请在另一方面提供了一种制备上述工程化细胞中的任一种的方法，该方法包括将一种或多种编码表面分子的核酸引入/转导到细胞中，从而获得工程化细胞。在一些实施例中，该方法进一步包括基于工程化细胞的表面分子的表达来选择工程化细胞。
本申请在另一方面提供了一种富集上述工程化细胞或多种工程化细胞中的任一种的方法，该方法包括基于结合部分或抑制部分来选择该一种或多种工程化细胞。在一些实施例中，该一种或多种工程化细胞是干细胞。在一些实施例中，工程化细胞是T细胞(诸如γδT细胞)。在一些实施例中，工程化细胞是NK细胞。
本申请在另一方面提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的上述药物组合物。在一些实施例中，工程化细胞对于个体是自体的。在一些实施例中，工程化细胞对于个体是同种异体的。在一些实施例中，在施用药物组合物后个体中至少约5％的T细胞表达表面分子。在一些实施例中，在施用药物组合物后个体中至少约20％的T细胞对HIV感染具有抗性。在一些实施例中，该方法进一步包括施用第二疗法。
附图说明
图1描绘了表达针对HIV假病毒的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的各种抗体的细胞的阻断作用。
图2A描绘了用GPI-scFv构建体转导的TZM-bl细胞的GFP表达。图2B描绘了用GPI-scFv构建体转导的TZM-bl细胞针对AD8假病毒的阻断作用。
图3描绘了用各种GPI-scFv构建体转导的TZM-bl细胞和未用GPI-scFv构建体转导的TZM-bl细胞的混合物针对HIV假病毒的阻断作用。
图4描绘了用各种GPI-scFv转导的TZM-bl细胞和未用GPI-scFv构建体转导的TZM-bl细胞的混合物针对AD8假病毒的阻断作用。
图5描绘了用GPI-抗CCR5 scFv构建体转导的TZM-bl细胞和未用GPI-scFv构建体转导的TZM-bl细胞的混合物在不同病毒浓度下针对HIV假病毒的阻断作用。
图6A至图6B描绘了用示例性GPI-scFv构建体转导的TZM-bl细胞和未用GPI-scFv构建体转导的TZM-bl细胞的混合物针对HIV假病毒的阻断作用。
图7描绘了在富集之前和之后表达CAR-scFv构建体(CAR-C1-13或CAR-10E8)的CAR阳性原代CD4 T细胞的百分比。
图8描绘了表达CAR-scFv构建体(CAR-CD4-11、CAR-CD4-13或CAR-CCR5-13)的原代CD4 T细胞和不含CAR-scFv构建体的原代CD4 T细胞的混合物针对HIV假病毒的阻断作用。
图9描绘了两种不同类型细胞的混合物(详见表4)针对HIV假病毒的阻断作用。
具体实施方式
本申请提供了包含编码表面分子的核酸的工程化细胞(诸如干细胞，诸如免疫细胞)，该表面分子包含：a)结合部分，该结合部分i)特异性结合T细胞表面抗原并防止该T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合，或ii)特异性结合HIV抗原并防止该HIV抗原与工程化细胞结合，或b)抑制HIV的膜融合的抑制部分，该表面分子进一步包含将结合部分或抑制部分系链到细胞膜或促进该分子系链到膜上的膜结构域(例如，GPI附着序列)。通过表达所述表面分子，工程化细胞实现对HIV感染的抗性。在一些实施例中，该结合部分特异性结合CCR5、CD4或CXCR4。在一些实施例中，该结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性地结合HIV抗原，或与10-1074、10E8或PGT121结合相同的表位。在一些实施例中，该抑制部分包含C34的氨基酸序列或其功能部分。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内结构域。
本文还提供了包含本文所述的多种工程化细胞的细胞组合物、包含工程化细胞的药物组合物、制备工程化细胞的方法、通过施用工程化细胞治疗感染了HIV的个体的方法。
本申请在一方面为感染了HIV的患者在基于基因编辑的干细胞疗法中的长期挑战提供了解决方案。例如，双等位基因CCR5敲除HSC是HIV抗性的并且可能是一种有前途的疗法。然而，由于缺乏选择标记，它们难以筛选或富集。在目前可用的基因组编辑工具(诸如CRISPR-Cas9)下不能将选择标记整合到核糖核蛋白(RNP)中。此外，高浓度的RNP可能导致高脱靶位点切割。通过表达赋予工程化细胞(诸如干细胞，诸如造血干细胞(HSC))HIV抗性的表面分子，可经由基于表面分子的富集而获得高纯度的HIV抗性细胞群(例如，纯度大于90％的HSC群，参见实例2和图2)。该方法为基于基因编辑的干细胞疗法的挑战提供了可行的解决方案，并为治疗HIV患者提供了巨大的治疗益处。
此外，通过工程化本申请中描述的细胞，我们惊讶地发现具有某些表面分子的工程化细胞赋予细胞级群体免疫现象。这些工程化细胞不仅表现出对HIV感染的抗性，而且还向最初易受HIV感染的其他细胞赋予免疫力。具体地，实例2-5显示表达示例性表面分子(具有a)抗CCR5、抗CD4或抗HIV抗体部分、或抑制HIV的膜融合的抑制部分以及b)膜结构域的此类表面分子)的各种工程化细胞赋予针对HIV的群体免疫。
定义
术语“抗体”以其最广泛的含义使用，并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全长抗体和其抗原结合片段，只要它们表现出所希望的抗原结合活性即可。术语抗体包括常规的四链抗体和单域抗体，诸如仅有重链的抗体或其片段，例如VH H。
全长四链抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。可以分别将重链和轻链的可变结构域称为“VH”和“VL”。两种链中的可变区通常含有三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链(LC)CDR，包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链(HC)CDR)。可以通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani的公约来定义或鉴定本文披露的抗体和抗原结合片段的CDR边界(Al-Lazikani,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948；Chothia1985,J.Mol Biol.,186:651-663；Chothia 1987,J.Mol.Biol.,196:901-917；Chothia 1989,Nature,342:877-883；Kabat 1987,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第四版.US Govt.Printing Off.No.165-492；Kabat 1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版.NIH公开号91-3242)。重链或轻链的三个CDR位于称为框架区(FR)的侧翼段之间，该框架区比CDR更高度保守并形成支架以支持高变环。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现各种效应子功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列来对抗体分类。抗体的五个主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征分别是存在α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要的抗体类别被分成亚类，如lgG1(γ1重链)、lgG2(γ2重链)、lgG3(γ3重链)、lgG4(γ4重链)、lgA1(α1重链)或lgA2(α2重链)。
术语“仅有重链的抗体”或“HCAb”是指包含重链，但缺少通常在4链抗体中发现的轻链的功能性抗体。已知骆驼科动物(诸如骆驼、美洲驼或羊驼)会产生HCAb。
术语“单域抗体”或“sdAb”是指具有三个互补决定区(CDR)的单一抗原结合多肽。单独的sdAb能够与抗原结合而不与对应的含CDR的多肽配对。在一些情况下，单域抗体从骆驼科HCAb工程改造，并且它们的重链可变结构域在本文中称为“VH H”(重链抗体的重链可变结构域)。骆驼科sdAb是最小的已知抗原结合抗体片段之一(参见例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-8(1993)；Greenberg等人,Nature 374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。基本VH H从N末端到C末端具有以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3是指互补决定区1至3。
术语“抗体部分”包括全长抗体及其抗原结合片段。全长抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两种链中的可变区通常含有三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链(LC)CDR，包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链(HC)CDR)。可以通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani的公约来定义或鉴定本文披露的抗体和抗原结合片段的CDR边界(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat1987；Kabat 1991)。重链或轻链的三个CDR位于称为框架区(FR)的侧翼段之间，该框架区比CDR更高度保守并形成支架以支持高变环。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现各种效应子功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列来对抗体分类。抗体的五个主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征分别是存在α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要的抗体类别被分成亚类，如lgG1(γ1重链)、lgG2(γ2重链)、lgG3(γ3重链)、lgG4(γ4重链)、lgA1(α1重链)或lgA2(α2重链)。
如本文所用的，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，包括例如双抗体、Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或结合抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(例如，亲本scFv)结合的相同抗原结合。在一些实施例中，抗原结合片段可包含来自特定人抗体的一个或多个CDR，这些CDR接枝到来自一个或多个不同人抗体的框架区。
“Fv”是含有完全的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。这两个结构域的折叠产生六个高变环(重链和轻链中各3个环)，高变环为抗原结合提供氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但是比整个结合位点的亲和力更低。
“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接到单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施例中，scFv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的一种多肽接头，该多肽接头使得scFv形成所希望的用于抗原结合的结构。关于scFv的综述，参见Plückthun于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
如本文所用的，术语“CDR”或“互补决定区”旨在意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区已经描述于：Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences ofproteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植的抗体或其变体的CDR旨在落入如本文定义和使用的术语的范围内。涵盖如上述每篇参考文献定义的CDR的氨基酸残基列于下表1中作为比较。CDR预测算法和接口是本领域已知的，包括例如Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Ehrenmann F.等人,Nucleic Acids Res.,38:D301-D307(2010)；和Adolf-Bryfogle J.等人,Nucleic Acids Res.,43:D432-D438(2015)。在本段中引用的参考文献的内容通过援引以其全文并入本文，以用于本发明中并且可能包含在本文的一项或多项权利要求中。除非另有定义，否则本文提供的CDR序列基于Kabat定义。
表1：CDR定义
1残基编号遵循Kabat等人的命名法(同上)
2残基编号遵循Chothia等人的命名法(同上)
3残基编号遵循MacCallum等人的命名法(同上)
4残基编号遵循Lefranc等人的命名法(同上)
5残基编号遵循Honegger和Plückthun的命名法(同上)
“框架”或“FR”残基是除如本文定义的CDR残基之外的那些可变结构域残基。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，例如包含该群体的各个抗体是相同的，除了可能的突变，例如，可以少量存在的天然存在的突变。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施例中，此类单克隆抗体通常包括包含结合靶点的多肽序列的抗体，其中靶点结合多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶点结合多肽序列的方法获得。例如，选择方法可以是从多个克隆中选择独特的克隆，诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆库。应当理解，可以进一步改变所选择的靶点结合序列，例如，以提高对靶点的亲和力，使靶点结合序列人源化，提高其在细胞培养物中的产量，降低其在体内的免疫原性，产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶点结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体制剂的优势在于它们通常不被其他免疫球蛋白污染。
修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体中获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，这些技术包括例如杂交瘤方法(例如Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma 14(3):253-260(1995),Harlow等人,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988)；Hammerling等人,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))，以及用于在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或人样抗体的技术(参见例如WO1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
本文的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而该链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们表现出所希望的生物活性(参见例如美国专利号4,816,567；以及Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括抗体，其中抗体的抗原结合区源自通过例如用感兴趣的抗原免疫猕猴产生的抗体。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施例中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者HVR的残基被来自非人物种(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的具有所希望的特异性、亲和力和/或容量的HVR(供体抗体)的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含未在受者抗体中或供体抗体中发现的残基。可进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个、并且典型地两个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。关于进一步细节，参见例如，Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见例如，Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；以及美国专利号6,982,321和7,087,409。
“人抗体”是具有氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或已经使用如本文披露的任何用于制备人抗体的技术来制备。人抗体的此定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)产生人抗体。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是在Cole等人,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,77(1985)；Boerner等人,J.Immunol.147(1):86-95(1991)中描述的方法。还参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)。人抗体可以通过将抗原施用至已被修饰以响应抗原攻击而产生此类抗体但其内源基因座已失效的转基因动物(例如，已免疫的异种小鼠(xenomice))来制备(参见例如有关XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。有关经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体，还参见例如Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-3562(2006)。
如本文所用的，术语“结合”、“特异性结合”或“对……有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，诸如靶点与抗体之间的结合，其决定了在异质分子(包括生物分子)群体存在时靶点的存在。例如，结合或特异性结合靶点(其可以是表位)的抗体是以比其与其他靶点结合的更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间与该靶点结合的抗体。在一个实施例中，抗体与不相关靶点的结合程度小于例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的抗体与靶点的结合的约10％。在某些实施例中，特异性结合靶点的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施例中，抗体特异性结合在来自不同物种的蛋白质中保守的蛋白质上的表位。在另一个实施例中，特异性结合可以包括但不要求排他结合。
术语“特异性”是指抗原结合蛋白(诸如嵌合受体或抗体构建体)对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。如本文所用的术语“多特异性”指代抗原结合蛋白具有两个或更多个抗原结合位点，其中至少两个结合不同的抗原或表位。如本文所用的“双特异性”指代抗原结合蛋白具有两种不同的抗原结合特异性。如本文使用的术语“单特异性”指代具有一个或多个结合位点的抗原结合蛋白，每个结合位点结合相同的抗原或表位。
如本文所用的术语“价”指代抗原结合蛋白中存在指定数目的结合位点。例如天然抗体或全长抗体具有两个结合位点，是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别指代在抗原结合蛋白中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
如本文所用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指基因工程化受体，其将一种或多种抗原特异性移植到细胞诸如T细胞上。CAR也称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施例中，CAR包含对肿瘤抗原有特异性的抗体的胞外可变结构域和T细胞受体和/或其他受体的胞内信号传导结构域，诸如一个或多个共刺激结构域。“CAR-T”是指表达CAR的T细胞。
如本文所用的“T细胞受体”或“TCR”是指包含胞外抗原结合域的内源或重组T细胞受体，该胞外抗原结合结构域结合MHC分子中结合的特异性抗原肽。在一些实施例中，TCR包含TCRα多肽链和TCRβ多肽链。在一些实施例中，TCR特异性结合肿瘤抗原。“TCR-T”是指表达重组TCR的T细胞。
如本文所用的“嵌合T细胞受体”或“cTCR”是指工程化受体，其包含与特定抗原结合的胞外抗原结合结构域、TCR复合物的第一亚基或其部分的跨膜结构域和TCR复合物的第二亚基或其部分的胞内信号传导结构域，其中该TCR复合物的第一亚基或第二亚基是TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3δ或CD3γ。cTCR的跨膜结构域和胞内信号传导结构域可源自TCR复合物的相同亚基，或源自TCR复合物的不同亚基。胞内结构域可以是全长胞内信号传导结构域或天然存在的TCR亚基的胞内结构域的一部分。在一些实施例中，该cTCR包含TCR亚基的胞外结构域或其部分。在一些实施例中，该cTCR不包含TCR亚基的胞外结构域。“eTCR”是指包含CD3ε的胞外结构域的cTCR。
将关于多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并且在必要时引入空位以达到最大序列同一性百分比后，不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分，候选序列中与特定多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的，可以用本领域技术中的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。例如，考虑了与本文所述的特定多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并且优选地表现出基本上相同的功能的多肽，以及编码此类多肽的多核苷酸。
术语“重组体”是指生物分子，例如基因或蛋白质，其(1)已经从其天然存在的环境中移除，(2)不与该基因在自然界中所处于的多核苷酸的全部或一部分缔合，(3)可操作地连接到其在自然界中不连接的多核苷酸，或(4)在自然界中不存在。术语“重组体”可用于指克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及由此类核酸编码的蛋白质和/或mRNA。
术语“表达”是指将核酸翻译成蛋白质。蛋白质可在胞内表达和保留，成为细胞表面膜的组分，或分泌到胞外基质或培养基中。
术语“宿主细胞”是指能够支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞诸如大肠杆菌，或真核细胞诸如酵母、昆虫细胞、两栖动物细胞或哺乳动物细胞。
如本文所用的术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。
术语“体内”是指从中获得细胞的生物体的体内。“离体”或“体外”是指在从中获得细胞的生物体的体外。
术语“细胞”包括原代受试细胞及其子代。
如本文所用的与表达CD3的细胞相关的“活化”是指已被充分刺激以诱导CD3信号传导途径的下游效应子功能(包括但不限于细胞增殖和细胞因子产生)的可检测增加的细胞状态。
如本文所用的，术语“自体”是指源自同一个体的任何材料，该材料随后将被重新引入该个体。“同种异体”是指源自同一物种的不同个体的移植物。
当涉及蛋白质的一部分时，术语“结构域”意指包括构成蛋白质的一种或多种多肽的结构和/或功能相关部分。例如，免疫细胞受体的跨膜结构域可指受体的每条多肽链跨越膜的部分。结构域也可指单个多肽链的相关部分。例如，单体受体的跨膜结构域可指跨越膜的受体的单个多肽链的部分。结构域也可仅包括多肽的单一部分。
如本文所用的术语“分离的核酸”旨在表示基因组、cDNA或合成来源或它们的某种组合的核酸，由于其来源，“分离的核酸”(1)不与“分离的核酸”在自然界中发现所在的多核苷酸的全部或一部分缔合，(2)可操作地连接到在自然界中不与其连接的多核苷酸，或(3)在自然界中不作为较大序列的一部分出现。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可包括内含子，其程度使得编码该蛋白质的核苷酸序列在某些形式中可含有内含子。
术语“可操作地连接”是指调控序列和核酸序列之间的功能性连接，从而导致核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接到该编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时，在同一读码框中。
术语“诱导型启动子”是指其活性可通过添加或去除一个或多个特定信号来调控的启动子。例如，诱导型启动子可在一组特定的条件下活化可操作地连接的核酸的转录，例如在存在活化启动子和/或解除启动子阻遏的诱导剂或条件的情况下。
如本文所用的，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状、减轻疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的传播(例如，转移)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、增加或改善生活质量、增加体重和/或延长存活。“治疗”还涵盖减轻疾病的病理结果(诸如癌症中的肿瘤体积)。本发明的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。
如本文所用的，“药学上可接受的”或“药理学上可相容的”是指不是生物学上或其他方面不希望的材料，例如，可将该材料掺入施用于患者的药物组合物中而不引起任何显著的不希望的生物效应或以有害方式与包含该材料的组合物的任何其他组分相互作用。药学上可接受的载剂或赋形剂优选地满足毒理学和制造测试的要求标准和/或包含在美国食品和药物管理局制定的非活性成分指南中。
与一种或多种其他药剂“组合”施用包括同时和以任何顺序依次施用。
术语“同时”在本文中用于指施用两种或更多种治疗剂，其中至少部分施用是在时间上重叠的或其中在施用一种治疗剂的短时间段内施用另一种治疗剂。例如，两种或更多种治疗剂以不超过约15分钟(诸如不超过约10、5、或1分钟中的任一数值)的时间间隔施用。
术语“依次”在本文中用于指两种或更多种治疗剂的施用，其中一种或多种治疗剂的施用在停止一种或多种其他药剂的施用后继续。例如，将两种或更多种药剂的施用以超过约15分钟，诸如约20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或60分钟、1天、2天、3天、1周、2周或1个月或更长时间中的任一时间间隔施用。
用于治疗目的的“受试者”或“个体”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，诸如狗、马、猫、牛等。
应当理解，本文所述的发明的实施例包括“由实施例组成”和/或“基本上由实施例组成”。
本文对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用的，对“不是”值或参数的提及通常意指并描述“不同于”该值或参数。例如，方法不是用于治疗X型癌症，意味着该方法用于治疗不同于X型的癌症。
如在本文和附带的权利要求中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。
如本文所用的术语“和/或”诸如短语“A和/或B”旨在包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如本文所用的术语“和/或”诸如短语“A、B和/或C”旨在涵盖以下实施例中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
包含编码表面分子的核酸的工程化细胞
本申请在一方面提供了一种包含编码表面分子的核酸的工程化细胞，该表面分子包含：a)结合部分，该结合部分i)特异性结合T细胞表面抗原并防止该T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合，或ii)特异性结合HIV抗原，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，T细胞表面抗原选自由CCR5、CD4和CXCR4组成的组。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。
在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合T细胞表面抗原并防止该T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合，其中该T细胞表面抗原选自由CCR5、CD4和CXCR4组成的组，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CCR5，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CCR5，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列的VH或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:131所示的氨基酸序列的VH或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VL或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:133或134的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:77或79所示的氨基酸序列的VH或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含SEQ ID NO:78或80的氨基酸序列的VL或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)包含特异性结合CCR5的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:1-3和133-135的氨基酸序列中的任一者，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)包含特异性结合CCR5的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:1-3和133-135的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CD4，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CD4，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分与C2-05、C2-11或C2-13竞争性地特异性结合CD4，或与C2-05、C2-11或C2-13特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列的VH或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQID NO:25的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列的VH或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:4-6中的任一者的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)包含特异性结合CD4的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:4-6中的任一者的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)包含特异性结合CD4的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:4-6中的任一者的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性地特异性结合HIV抗原，或与10-1074、10E8或PGT121结合相同的表位并防止HIV抗原与工程化细胞结合，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与10-1074竞争性地特异性结合HIV，或与10-1074特异性结合相同的表位，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与10-1074竞争性地特异性结合HIV，或与10-1074特异性结合相同的表位，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列的VH或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与10E8竞争性地特异性结合HIV，或与10E8特异性结合相同的表位，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与10E8竞争性地特异性结合HIV，或与10E8特异性结合相同的表位，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列的VH或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)包含scFv的结合部分，该scFv包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)包含scFv的结合部分，该scFv包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与PGT121竞争性地特异性结合HIV，或与PGT121特异性结合相同的表位，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与PGT121竞争性地特异性结合HIV，或与PGT121特异性结合相同的表位，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ IDNO:69的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ IDNO:71的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列的VH或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)包含scFv的结合部分，该scFv包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)包含scFv的结合部分，该scFv包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)抑制HIV的膜融合的抑制部分，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该抑制部分选自由C34、HP32、SC35EK、西夫韦肽(sifuvirtide)、T20和T2634或它们的功能部分组成的组。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)包含C34的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)或其功能部分的抑制部分，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，该工程化干细胞包含：a)包含C34的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)或其功能部分的抑制部分，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合T细胞表面抗原并防止该T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合，其中该T细胞表面抗原选自CCR5，CD4和CXCR4，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CCR5，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CCR5，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含特异性结合CCR5的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含特异性结合CCR5的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含特异性结合CCR5的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含特异性结合CCR5的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含特异性结合CCR5的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含特异性结合CCR5的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CD4，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CD4，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分与C2-05、C2-11或C2-13竞争性地特异性结合CD4，或与C2-05、C2-11或C2-13特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含特异性结合CD4的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含特异性结合CD4的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含特异性结合CD4的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含特异性结合CD6的scFv的结合部分，其中该scFv包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性地特异性结合HIV抗原，或与10-1074、10E8或PGT121结合相同的表位并防止HIV抗原与工程化细胞结合，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与10-1074竞争性地特异性结合HIV，或与10-1074特异性结合相同的表位，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与10-1074竞争性地特异性结合HIV，或与10-1074特异性结合相同的表位，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQID NO:43的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与10E8竞争性地特异性结合HIV，或与10E8特异性结合相同的表位，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与10E8竞争性地特异性结合HIV，或与10E8特异性结合相同的表位，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含scFv的结合部分，该scFv包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含scFv的结合部分，该scFv包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与PGT121竞争性地特异性结合HIV，或与PGT121特异性结合相同的表位，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分与PGT121竞争性地特异性结合HIV，或与PGT121特异性结合相同的表位，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQID NO:73的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含scFv的结合部分，该scFv包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含scFv的结合部分，该scFv包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)抑制HIV的膜融合的抑制部分，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该抑制部分选自由C34、HP32、SC35EK、西夫韦肽、T20和T2634或它们的功能部分组成的组。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含C34的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)或其功能部分的抑制部分，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种工程化免疫细胞(例如，T细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含C34的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)或其功能部分的抑制部分，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，本文所述的VH和VL经由接头融合。在一些实施例中，VH和VL之间的接头是肽接头。在一些实施例中，VH和VL之间的接头包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施例中，该结合部分是sdAb、scFv、Fab’、(Fab’)2、Fv或肽配体。在一些实施例中，该结合部分是scFv。
在一些实施例中，该结合部分或该抑制部分经由接头与膜结构域的N末端融合。在一些实施例中，a)结合部分或抑制部分和b)膜结构域之间的接头包括肽接头。在一些实施例中，该接头选自由SEQ ID NO:45-52、150和152组成的组。
在一些实施例中，该工程化细胞是干细胞。在一些实施例中，该干细胞是胚胎干细胞(ESC)。在一些实施例中，该干细胞是造血干细胞(HSC)。在一些实施例中，该干细胞是间充质干细胞。在一些实施例中，该干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。
在一些实施例中，该工程化细胞是免疫细胞。在一些实施例中，该免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，该免疫细胞是B细胞。在一些实施例中，该免疫细胞是自然杀伤细胞(NK细胞)。
在一些实施例中，该工程化细胞表达嵌合抗原受体。在一些实施例中，该嵌合抗原受体包含抗HIV抗体部分(诸如本文所述的抗HIV抗体部分中的任一种)。
在一些实施例中，该表面分子包含特异性结合第二抗原的第二结合部分。在一些实施例中，该结合部分和该第二结合部分串联连接。在一些实施例中，该表面分子包含：a)特异性结合CCR5或CD4的抗CCR5抗体部分或抗CD4抗体部分，以及b)特异性结合HIV抗原的抗HIV抗体部分或抑制HIV的膜融合的抑制部分。
在一些实施例中，该工程化细胞包含第二表面分子，其中该第二表面分子包含特异性结合第二抗原的第二结合部分。在一些实施例中，该工程化细胞包含：a)特异性结合CCR5或CD4的抗CCR5抗体部分或抗CD4抗体部分，以及b)包含特异性结合HIV抗原的抗体部分或抑制HIV的膜融合的抑制部分的抗HIV表面分子。
本申请在另一方面提供了一种表达表面分子并表现出针对HIV的群体免疫的工程化细胞。本文所述的针对HIV的群体免疫是指表达防止或抑制HIV感染的某种表面分子(诸如本文所述的表面分子中的任一种)的细胞不仅对HIV感染本身具有抗性，而且还赋予对最初易受HIV感染的另一细胞抗HIV免疫的现象。通过将多种表达该表面分子的细胞与多种不表达该表面分子且易受HIV感染的细胞以一定比例(诸如4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4)混合，然后将细胞的混合物与HIV一起孵育，可测试针对HIV的群体免疫。当孵育后对HIV感染有抗性的细胞数量高于表达该表面分子的细胞数量(诸如至少高约5％、10％、15％或20％)时，存在群体免疫。对于可用于测试群体免疫效果的方法的示例性说明，参见例如实例2-5。在一些实施例中，该细胞是干细胞(诸如造血干细胞(HSC))。在一些实施例中，该细胞是免疫细胞。在一些实施例中，该细胞是T细胞。
在一些实施例中，提供了多种工程化细胞(诸如多种本文所述的工程化细胞中的任一种)，其中在a)与多种不表达表面分子且易受HIV感染的细胞混合以及b)使细胞组合物与HIV接触时，未感染HIV的细胞的百分比高于(例如高至少约10％)工程化细胞的百分比。在一些实施例中，不包含表达表面分子的核酸的多种细胞的数量为多种工程化细胞的数量的约80％至约120％(诸如约80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％或120％)。在一些实施例中，不包含表达表面分子的核酸的多种细胞表达CCR5、CXCR4和/或CD4并对HIV敏感。
在一些实施例中，提供了包含多种工程化干细胞(例如，工程化造血干细胞)的干细胞(例如，造血干细胞)群，诸如上述那些中的任一种，其中该干细胞群中工程化干细胞的纯度为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，工程化干细胞表达包含抗CCR5抗体部分(例如，抗CCR5 scFv)的表面分子。在一些实施例中，工程化干细胞表达包含抗CD4抗体部分(例如，抗CD4 scFv)的表面分子。在一些实施例中，工程化干细胞表达包含抗HIV抗体部分(例如，抗HIV，scFv，例如，SEQ ID NO:7，61或62)的表面分子。在一些实施例中，工程化干细胞表达包含抑制部分(例如，C34肽，例如，SEQID NO:8)的表面分子。
表面分子
本申请还提供了本文所述的各种表面分子。在一些实施例中，该表面分子包含：a)防止HIV抗原与工程化细胞结合的结合部分(诸如本文所述的结合部分中的任一种)以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域(诸如本文所述的膜结构域中的任一种，诸如GPI附着信号序列)。在一些实施例中，该表面分子包含特异性结合T细胞表面抗原(例如，CCR5、CD4或CXCR4)并防止T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合的结合部分。在一些实施例中，该表面分子包含与抗HIV抗体(诸如10-1074、10E8或PGT121)竞争性地特异性结合HIV抗原、或与抗HIV抗体(诸如10-1074、10E8或PGT121)结合相同表位并防止HIV抗原与工程化细胞结合的结合部分。在一些实施例中，该表面分子包含抑制HIV的膜融合的抑制部分和将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域(诸如GPI附着信号序列)。在一些实施例中，该抑制部分包含C34的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:8)或其功能部分。
在一些实施例中，在细胞表达表面分子后，细胞赋予针对HIV的群体免疫。在一些实施例中，该细胞表达CCR5、CD4或CXCR4。在一些实施例中，该细胞是TZM-bl细胞。
在一些实施例中，该结合部分或该抑制部分与膜结构域的N末端融合。在一些实施例中，该结合部分或该抑制部分经由接头(诸如“接头”部分中描述的接头中的任一种)与膜结构域的N末端融合。在一些实施例中，a)结合部分或抑制部分和b)膜结构域之间的接头包括肽接头。在一些实施例中，该接头选自由SEQ ID NO:45-52、150和152组成的组。在一些实施例中，该结合部分或该抑制部分在没有接头的情况下与膜结构域的N末端融合。
在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，该表面分子还在分子的N末端包含促进该表面分子系链到膜上的信号肽。在一些实施例中，该信号肽是CD8α信号肽(例如，SEQ ID NO:148)。
结合部分
本申请中描述的结合部分可以是a)特异性结合T细胞表面抗原并防止T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合的结合部分，或b)特异性结合HIV抗原并防止HIV抗原与工程化细胞结合的结合部分。在一些实施例中，该结合部分特异性结合T细胞表面抗原，其中该T细胞表面抗原选自由CCR5、CD4和CXCR4组成的组。在一些实施例中，该结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性地特异性结合HIV抗原，或与10-1074、10E8或PGT121结合相同的表位。
在一些实施例中，该结合部分是具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中该VH包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且该VL包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施例中，VH和VL经由接头(诸如“接头”部分中描述的接头中的任一种)融合。在一些实施例中，VH和VL之间的接头是肽接头。在一些实施例中，VH和VL之间的接头包含SEQ IDNO:45的氨基酸序列。
在一些实施例中，该结合部分是sdAb、scFv、Fab’、(Fab’)2、Fv或肽配体。
在一些实施例中，该结合部分是包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的scFv。在一些实施例中，VH与VL的N末端融合。在一些实施例中，VH与VL的C末端融合。在一些实施例中，VH和VL经由接头(诸如“接头”部分中描述的接头中的任一种)融合。在一些实施例中，VH和VL之间的接头是肽接头。在一些实施例中，VH和VL之间的接头包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
示例性结合部分描述如下。
CCR5
在一些实施例中，该T细胞表面抗原是CCR5。在一些实施例中，该结合部分包含抗CCR5抗体部分。在一些实施例中，该结合部分与C1-11、C1-12、C1-13、C1-14、C1-814或C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-11、C1-12、C1-13、C1-14、C1-814或C1-816特异性结合相同的表位。
在一些实施例中，该结合部分与C1-13竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-13特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该结合部分与C1-814竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-814特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分与C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-816特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
CD4
在一些实施例中，该T细胞表面抗原是CD4。在一些实施例中，该结合部分包含抗CD4抗体部分。在一些实施例中，该结合部分与C2-05、C2-11或C2-13竞争性地特异性结合CD4，或与C2-05、C2-11或C2-13特异性结合相同的表位。
在一些实施例中，该结合部分与C2-05竞争性地特异性结合CD4，或与C2-05特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:22的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQID NO:4的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该结合部分与C2-11竞争性地特异性结合CD4，或与C2-11特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:28的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQID NO:5的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该结合部分与C2-13竞争性地特异性结合CD4，或与C2-13特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:34的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQID NO:6的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
抗HIV结合部分
在一些实施例中，该结合部分特异性结合HIV抗原(例如，抗HIV抗体)。对于示例性抗HIV抗体，参见例如，Kwong等人,Immunity.2018年5月15日；48(5):855-871；Sok等人,NatImmunol.2018年11月；19(11):1179-1188；West Jr.等人,Cell.2014年2月13日；156(4):633–648。
在一些实施例中，该结合部分特异性结合HIV上的CD4靶向位点。在一些实施例中，该结合部分与B12、IOMA、NIH45、NIH46、12A12、VRC-PG04、VRC-CH31、VRC13.01、VRC16.01、8ANC131、B2530、CH103、N6、N49-P7、VRC01、CH235.12、NC-Cow1、IOMA、CH235、3BNC117或HJ16竞争性地特异性结合HIV，或与B12、IOMA、NIH45、NIH46、12A12、VRC-PG04、VRC-CH31、VRC13.01、VRC16.01、8ANC131、B2530、CH103、N6、N49-P7、VRC01、CH235.12、NC-Cow1、IOMA、CH235、3BNC117或HJ16特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含B12、IOMA、NIH45、NIH46、12A12、VRC-PG04、VRC-CH31、VRC13.01、VRC16.01、8ANC131、B2530、CH103、N6、N49-P7、VRC01、CH235.12、NC-Cow1、IOMA、CH235、3BNC117或HJ16或它们的功能变体的HIV结合部分。
在一些实施例中，该结合部分特异性结合HIV上的聚糖V3(诸如Asn332聚糖-V3)。在一些实施例中，该结合部分与PGT121、BG18、DH270.6、PDGM12、PGDM21、PCDN-33A、DH270.1、VRC41.01、BF520.1、VRC29.03、PGT128、PGT135或2G12竞争性地特异性结合HIV，或与PGT121、BG18、DH270.6、PDGM12、PGDM21、PCDN-33A、DH270.1、VRC41.01、BF520.1、VRC29.03、PGT128、PGT135或2G12特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含PGT121、BG18、DH270.6、PDGM12、PGDM21、PCDN-33A、DH270.1、VRC41.01、BF520.1、VRC29.03、PGT128、PGT135或2G12或它们的功能变体的HIV结合部分。
在一些实施例中，该结合部分特异性结合HIV上的聚糖V1/V2(诸如Asn160聚糖-V1/V2)。在一些实施例中，该结合部分与PGDM1400、VRC26.25、CH01、CH02、CH03、CH-04、PCT64-24E、VRC38.01、PG9、PG16、PGT141、PGT142、PGT143、PGT144或PGT145竞争性地特异性结合HIV，或与PGDM1400、VRC26.25、CH01、CH02、CH03、CH-04、PCT64-24E、VRC38.01、PG9、PG16、PGT141、PGT142、PGT143、PGT144或PGT145特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含PGDM1400、VRC26.25、CH01、CH02、CH03、CH-04、PCT64-24E、VRC38.01、PG9、PG16、PGT141、PGT142、PGT143、PGT144或PGT145或它们的功能变体的HIV结合部分。
在一些实施例中，该结合部分特异性结合HIV上的界面或融合肽。在一些实施例中，该结合部分与PGT151、VRC34.01、35O22或ACS202竞争性地特异性结合HIV，或与PGT151、VRC34.01、35O22或ACS202特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含PGT151、VRC34.01、35O22或ACS202或它们的功能变体的HIV结合部分。
在一些实施例中，该结合部分特异性结合HIV上的沉默面。在一些实施例中，该结合部分与VRC-PG05竞争性地特异性结合HIV，或与VRC-PG05特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含VRC-PG05或它们的功能变体的HIV结合部分。
在一些实施例中，该结合部分特异性结合HIV上的近膜外部区域(MPER)。在一些实施例中，该结合部分与4E10、2F5、Z13、DF511、Z13e1、DH511.11P或M66.6竞争性地特异性结合HIV，或与4E10、2F5、Z13、DF511、Z13e1、DH511.11P或M66.6特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含4E10、2F5、Z13、DF511、Z13e1、DH511.11P或M66.6或它们的功能变体的HIV结合部分。
在一些实施例中，该结合部分与8ANC195、3BC176或X5竞争性地特异性结合HIV，或与8ANC195、3BC176或X5特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含8ANC195、3BC176或X5或它们的功能变体的HIV结合部分。
在一些实施例中，该结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性地特异性结合HIV，与10-1074、10E8或PGT121特异性结合相同的表位。
在一些实施例中，该结合部分与10-1074竞争性地特异性结合HIV，或与10-1074特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该结合部分与10E8竞争性地特异性结合HIV，或与10E8特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:64的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQID NO:61的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该结合部分与PGT121竞争性地特异性结合HIV，或与PGT121特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HC-CDR3，并且该VL包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
抑制HIV的膜融合的抑制部分
本文所述的抑制部分抑制HIV的膜融合。在一些实施例中，该抑制部分靶向gp41。示例性抑制部分包括C34、HP32、SC35EK、西夫韦肽、T20、T2634或它们的功能部分。参见例如，Woodham等人AIDS Patient Care STDS.2016年7月1日；30(7):291–306。
在一些实施例中，该抑制部分包含C34的氨基酸序列或其功能部分。在一些实施例中，该抑制部分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
膜结构域
本申请中所述的膜结构域包括能够a)将本文所述的结合部分或抑制部分系链到细胞膜或b)促进该结合部分或抑制部分系链到细胞膜上的任何分子。
在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该GPI附着信号序列包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列。
在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。
在一些实施例中，该膜结构域不与胞内信号传导结构域融合。
多特异性表面分子
本申请还提供了本文所述的多特异性表面分子。在一些实施例中，本文所述的表面分子包含两个或更多个部分(例如，如本文所述的两个或更多个结合部分、本文所述的两个或更多个抑制部分、或一个或多个结合部分和一个或多个抑制部分)。
在一些实施例中，该表面分子包含与第一抗原特异性结合的第一结合部分和与第二抗原特异性结合的第二结合部分，其中该第一抗原和该第二抗原都是T细胞表面抗原，其中两个结合部分都防止T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体的结合，并且其中该第一结合部分和该第二结合部分都经由膜结构域系链到细胞膜。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，该表面分子包含特异性结合CCR5的第一结合部分和特异性结合CD4的第二结合部分，其中该第一结合部分和该第二结合部分都经由膜结构域系链到细胞膜。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该第一结合部分与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该第一结合部分包含SEQ ID NO:1-3和133-135中的任一者的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％，98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该第二结合部分与C2-05、C2-11或C2-13竞争性地特异性结合CD4，或与C2-05、C2-11或C2-13特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该第二结合部分包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该表面分子包含特异性结合CCR5的第一结合部分和特异性结合CD4的第二结合部分，其中该表面分子进一步包含含有GPI附着信号序列(例如SEQ ID NO:149)的膜结构域。在一些实施例中，该第一结合部分包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该第一结合部分包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该表面分子包含特异性结合CCR5的第一结合部分和特异性结合CXCR4的第二结合部分，其中该表面分子进一步包含将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ IDNO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该第一结合部分与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该第一结合部分包含SEQ ID NO:1-3和133-135中的任一者(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该表面分子包含特异性结合CD4的第一结合部分和特异性结合CXCR4的第二结合部分，其中该表面分子进一步包含将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ IDNO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该第一结合部分与C2-05、C2-11或C2-13竞争性地特异性结合CD4，或与C2-05、C2-11或C2-13特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该第一结合部分包含SEQ ID NO:4-6中的任一者(例如，SEQ ID NO:6)的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该表面分子包含第一结合部分和第二结合部分，该第一结合部分特异性结合T细胞表面抗原(例如CCR5、CD4、CXCR4)并防止该T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合，该第二结合部分特异性结合HIV抗原并防止HIV抗原与工程化细胞结合，并且其中该表面分子进一步包含将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，该表面分子包含与CCR5特异性结合的第一结合部分和与HIV抗原特异性结合并防止HIV抗原与工程化细胞结合的第二结合部分，并且其中该表面分子进一步包含将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该第二结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性地特异性结合HIV抗原，或与10-1074、10E8或PGT121结合相同的表位。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQID NO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该第一结合部分与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该第一结合部分包含SEQ ID NO:1-3和133-135中的任一者(例如，SEQ IDNO:1)的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该表面分子包含与CD4特异性结合的第一结合部分和与HIV抗原特异性结合并防止HIV抗原与工程化细胞结合的第二结合部分，并且其中该表面分子进一步包含将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该第二结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性地特异性结合HIV抗原，或与10-1074、10E8或PGT121结合相同的表位。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ IDNO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该第一结合部分与C2-05、C2-11或C2-13竞争性地特异性结合CD4，或与C2-05、C2-11或C2-13特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该第一结合部分包含SEQ ID NO:4-6中的任一者(例如，SEQ ID NO:6)的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该表面分子包含特异性结合T细胞表面抗原(例如CCR5、CD4、CXCR4)并防止T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合的结合部分，以及抑制HIV的膜融合的抑制部分，其中该表面分子进一步包含将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该抑制部分包含HP32、SC35EK、西夫韦肽、T20或T2634的氨基酸序列或它们的功能部分。在一些实施例中，该抑制部分包含C34的氨基酸序列或其功能部分。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，该表面分子包含特异性结合CCR5的结合部分和抑制HIV的膜融合的抑制部分，该抑制部分包含C34的氨基酸序列或其功能部分(例如，SEQ ID NO:8)，其中该表面分子进一步包含将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ IDNO:1-3和133-135中的任一者(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，或含有具有至少约(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该表面分子包含特异性结合CCR5的结合部分和抑制HIV的膜融合的抑制部分，该结合部分包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该抑制部分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其中该表面分子进一步包含将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域(例如，GPI附着信号序列)，其中该表面分子不具有胞内结构域。
在一些实施例中，该表面分子包含特异性结合HIV抗原并防止HIV抗原与工程化细胞结合的结合部分，以及抑制HIV的膜融合的抑制部分，其中该表面分子进一步包含将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性结合HIV抗原，或与10-1074、10E8或PGT121结合相同的表位并防止HIV抗原与工程化细胞结合。在一些实施例中，该表面分子包含与10-1074竞争性地特异性结合HIV、或与10-1074特异性结合相同的表位的结合部分。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该抑制部分包含HP32、SC35EK、西夫韦肽、T20或T2634的氨基酸序列或它们的功能部分。在一些实施例中，该抑制部分包含C34的氨基酸序列或其功能部分(例如，SEQ ID NO:8)。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，该表面分子包含特异性结合包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HIV抗原的结合部分和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的抑制部分，其中该表面分子进一步包含将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域(例如，GPI附着信号序列)。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，该表面分子包含第一结合部分和第二结合部分，其中该第一结合部分和该第二结合部分结合相同抗原的两个不同表位，其中该抗原是a)选自由CCR5、CD4和CXCR4组成的组的T细胞表面抗原或b)HIV抗原，其中该表面分子进一步包含将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域(例如，GPI信号附着序列)。
包含一种或多种编码两种或更多种不同表面分子的核酸的工程化细胞
本申请还提供了包含一种或多种编码两种或更多种不同表面分子的核酸的工程化细胞。在“多特异性表面分子”部分中讨论的各种实施例也在包含一种或多种核酸的工程化细胞的上下文中构思，该一种或多种核酸编码两种或更多种不同的表面分子以获得相同的所希望的效果。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码：a)包含与第一膜结构域融合的第一结合部分的第一表面分子，该第一结合部分特异性结合第一抗原，以及b)包含与第二膜结构域融合的第二结合部分的第二表面分子，该第二结合部分特异性结合第二抗原，其中该第一膜结构域和该第二膜结构域分别将第一结合部分和第二结合部分系链到膜上或促进两个部分系链到膜上，其中该第一抗原和该第二抗原都是T细胞表面抗原，其中两个结合部分都防止T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ IDNO:149)。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该第一表面分子和/或该第二表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码：a)包含与第一膜结构域融合的第一结合部分的第一表面分子，该第一结合部分特异性结合CCR5，以及b)包含与第二膜结构域融合的第二结合部分的第二表面分子，该第二结合部分特异性结合CD4，其中该第一膜结构域和该第二膜结构域分别将第一结合部分和第二结合部分系链到膜上或促进两个部分系链到膜上。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该第一表面分子和/或该第二表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该第一结合部分与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该第一结合部分包含SEQ ID NO:1-3和133-135中的任一者的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％，98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该第二结合部分与C2-05、C2-11或C2-13竞争性地特异性结合CD4，或与C2-05、C2-11或C2-13特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该第二结合部分包含SEQ ID NO:4-6中的任一者的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中至少约任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码：a)包含与第一膜结构域融合的第一结合部分的第一表面分子，该第一结合部分特异性结合CCR5，以及包含与第二膜结构域融合的第二结合部分的第二表面分子，该第二结合部分特异性结合CD4，其中该第一膜结构域和该第二膜结构域分别将第一结合部分和第二结合部分系链到膜上或促进两个部分系链到膜上。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该第一结合部分包含SEQ ID NO:1或6的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码：a)包含与第一膜结构域融合的第一结合部分的第一表面分子，该第一结合部分特异性结合CCR5，以及b)包含与第二膜结构域融合的第二结合部分的第二表面分子，该第二结合部分特异性结合CXCR4，其中该第一膜结构域和该第二膜结构域分别将第一结合部分和第二结合部分系链到膜上或促进两个部分系链到膜上。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该第一表面分子和/或该第二表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该第一结合部分与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该第一结合部分包含SEQ ID NO:1-3和133-135中的任一者(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码：a)包含与第一膜结构域融合的第一结合部分的第一表面分子，该第一结合部分特异性结合CD4，以及b)包含与第二膜结构域融合的第二结合部分的第二表面分子，该第二结合部分特异性结合CXCR4，其中该第一膜结构域和该第二膜结构域分别将第一结合部分和第二结合部分系链到膜上或促进两个部分系链到膜上。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该第一表面分子和/或该第二表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该第一结合部分与C2-05、C2-11或C2-13竞争性地特异性结合CD4，或与C2-05、C2-11或C2-13特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该第一结合部分包含SEQID NO:4-6中的任一者(例如，SEQ ID NO:6)的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码a)包含第一结合部分的第一表面分子，该第一结合部分特异性结合T细胞表面抗原(例如CCR5、CD4、CXCR4)并防止T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合，其中该第一结合部分与第一膜结构域融合，以及b)包含第二结合部分的第二表面分子，该第二结合部分与HIV抗原特异性结合并防止HIV抗原与工程化细胞结合，其中该第二结合结构域与第二膜结构域融合，并且其中该第一膜结构域和该第二膜结构域分别将第一结合部分和第二结合部分系链到膜上或促进两个部分系链到膜上。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该第一表面分子和/或该第二表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码：a)包含与第一膜结构域融合的第一结合部分的第一表面分子，该第一结合部分特异性结合CCR5，以及b)包含第二结合部分的第二表面分子，该第二结合部分特异性结合HIV抗原并防止HIV抗原与工程化细胞结合，其中该第二结合部分与第二膜结构域融合，并且其中该第一膜结构域和该第二膜结构域分别将第一结合部分和第二结合部分系链到膜上或促进两个部分系链到膜上。在一些实施例中，该第二结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性地特异性结合HIV抗原，或与10-1074、10E8或PGT121结合相同的表位。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该第一表面分子和/或该第二表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该第一结合部分与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该第一结合部分包含SEQ ID NO:1-3和133-135中的任一者(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码：a)包含与第一膜结构域融合的第一结合部分的第一表面分子，该第一结合部分特异性结合CD4，以及b)包含第二结合部分的第二表面分子，该第二结合部分特异性结合HIV抗原并防止HIV抗原与工程化细胞结合，其中该第二结合部分与第二膜结构域融合，并且其中该第一膜结构域和该第二膜结构域分别将第一结合部分和第二结合部分系链到膜上或促进两个部分系链到膜上。在一些实施例中，该第二结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性地特异性结合HIV抗原，或与10-1074、10E8或PGT121结合相同的表位。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该第一表面分子和/或该第二表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该第一结合部分与C2-05、C2-11或C2-13竞争性地特异性结合CD4，或与C2-05、C2-11或C2-13特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该第一结合部分包含SEQ ID NO:4-6中的任一者(例如，SEQ ID NO:6)的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码a)包含结合部分的第一表面分子，该结合部分特异性结合T细胞表面抗原(例如CCR5、CD4、CXCR4)并防止T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合，其中该结合部分与第一膜结构域融合，以及b)包含抑制部分的第二表面分子，该抑制部分抑制HIV的膜融合，其中该抑制部分与第二膜结构域融合，其中该第一膜结构域和该第二膜结构域分别将第一结合部分和第二结合部分系链到膜上或促进两个部分系链到膜上。在一些实施例中，该抑制部分包含HP32、SC35EK、西夫韦肽、T20或T2634的氨基酸序列或它们的功能部分。在一些实施例中，该抑制部分包含C34的氨基酸序列或其功能部分。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码：a)包含与第一膜结构域融合的结合部分的第一表面分子，该第一表面分子特异性结合CCR5，以及b)包含与第二膜结构域融合的抑制部分的第二表面分子，该抑制部分抑制HIV的膜融合，该抑制部分包含C34的氨基酸序列或其功能部分(例如，SEQ ID NO:8)，其中该第一膜结构域和该第二膜结构域分别将第一结合部分和第二结合部分系链到膜上或促进两个部分系链到膜上。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该第一表面分子和/或该第二表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816特异性结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:1-3和133-135中的任一者(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，或含有具有至少约(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码：a)包含与第一膜结构域融合的结合部分的第一表面分子，该结合部分特异性结合CCR5，该结合部分包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，以及b)包含与第二膜结构域融合的抑制部分的第二表面分子，该抑制部分抑制HIV的膜融合，该抑制部分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其中该第一膜结构域和该第二膜结构域分别将第一结合部分和第二结合部分系链到膜上或促进两个部分系链到膜上。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域是GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，其中该第一表面分子和/或该第二表面分子不具有胞内结构域。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码：a)包含结合部分的第一表面分子，该结合部分特异性结合HIV抗原并防止HIV抗原与工程化细胞结合，其中该结合部分与第一膜结构域融合，以及b)包含与第二膜结构域融合的抑制部分的第二表面分子，该抑制部分抑制HIV的膜融合，其中该第一膜结构域和该第二膜结构域分别将第一结合部分和第二结合部分系链到膜上或促进两个部分系链到膜上。在一些实施例中，该结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性结合HIV抗原，或与10-1074、10E8或PGT121结合相同的表位并防止HIV抗原与工程化细胞结合。在一些实施例中，该第一表面分子包含与10-1074竞争性地特异性结合HIV、或与10-1074特异性结合相同的表位的结合部分。在一些实施例中，该结合部分包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或含有具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一数值)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施例中，该抑制部分包含HP32、SC35EK、西夫韦肽、T20或T2634的氨基酸序列或它们的功能部分。在一些实施例中，该抑制部分包含C34的氨基酸序列或其功能部分(例如，SEQ ID NO:8)。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该第一表面分子和/或该第二表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码：a)包含与第一膜结构域融合的结合部分的第一表面分子，该结合部分特异性结合HIV抗原，该结合部分包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及b)包含与第二膜结构域融合的抑制部分的第二表面分子，该抑制部分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其中该结合部分和该抑制部分都经由该第一膜结构域和该第二膜结构域(例如，GPI锚)系链到细胞膜。在一些实施例中，该第一表面分子和/或该第二表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，该工程化细胞包含一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码：a)包含与第一膜结构域融合的第一结合部分的第一表面分子，以及b)包含与第二膜结构域融合的第二结合部分的第二表面分子，并且其中该第一结合部分和该第二结合部分结合相同抗原的两个不同表位，其中该抗原是a)选自由CCR5、CD4和CXCR4组成的组的T细胞表面抗原或b)HIV抗原，其中该第一膜结构域和该第二膜结构域将第一结合部分和第二结合部分系链到膜上或促进两个部分系链到膜上。在一些实施例中，该第一膜结构域和/或该第二膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。
接头
表面分子中使用的接头(例如，结合部分的VH和VL之间的接头，例如，结合/抑制部分和膜结构域之间的接头，例如，连接双特异性表面分子中的两个部分(例如，两个结合部分)的接头)的长度、柔性程度和/或其他特性可对包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力的特性具有一些影响。例如，可以选择更长的接头以确保两个相邻的结构域在空间上不会彼此干扰。在一些实施例中，接头(诸如肽接头)包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻的结构域相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。在一些实施例中，接头是非肽接头。在一些实施例中，接头是肽接头。
其他接头考虑因素包括对所得化合物的物理或药代动力学特性的影响，例如溶解度、亲脂性、亲水性、疏水性，稳定性(更稳定或更不稳定以及计划的降解)、刚性、柔性、免疫原性，抗体结合的调节、掺入胶束或脂质体的能力等。
在一些实施例中，接头是如下所述的肽接头。在一些实施例中，肽接头的长度为约一至约五十、约二至约第四、约三至约三十、或约四至约二十个氨基酸。
在一些实施例中，接头是GS接头。
在一些实施例中，接头包含SEQ ID NO:45-60中的任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，接头包含SEQ ID NO:45-52和59-60中的任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，接头包含SEQ ID NO:53-58中的任一者的氨基酸序列。
肽接头
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，源自仅有重链的抗体的铰链区的序列可以用作接头。参见例如WO 1996/34103。
肽接头可以具有任何合适的长度。在一些实施例中，肽接头的长度为至少约以下中的任何一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100个或更多个氨基酸。在一些实施例中，肽接头的长度为不超过约以下中的任何一者：100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少个氨基酸。在一些实施例中，肽接头的长度为以下中的任何一者：约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、或约1个氨基酸至约100个氨基酸。
这种肽接头的基本技术特征是所述肽接头不包含任何聚合活性。肽接头的特征(其包含二级结构促进作用的缺失)在本领域中已知，并且在例如Dall’Acqua等人(Biochem.(1998)37,9266-9273)、Cheadle等人(Mol Immunol(1992)29,21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB(1995)9(1),73-80)中有描述。就“肽接头”而言，特别优选的氨基酸是Gly。此外，也不促进任何二级结构的肽接头是优选的。结构域彼此之间的联接可以通过例如基因工程来提供。用于制备融合的且可操作地连接的双特异性单链构建体并将其在哺乳动物细胞或细菌中表达的方法是本领域众所周知的(例如，WO 99/54440,Ausubel,CurrentProtocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y.1989和1994或Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001)。
肽接头可以是稳定的接头，其不能被蛋白酶尤其是被基质金属蛋白酶(MMP)切割。
接头也可以是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n(SEQ ID NO:49)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n(SEQ ID NO:50)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:51)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:46)、和(GGGS)n(SEQ ID NO:52)，其中n是至少是一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、和本领域已知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化，并且因此可能能够作为组分之间的中性系链。甘氨酸比丙氨酸可到达显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基所受限制小得多(Scheraga,Rev.Computational Chem.11:173-142(1992))。本领域普通技术人员将认识到，抗体融合蛋白的设计可以包括全部或部分为柔性的接头，使得该接头可以包括柔性接头部分以及赋予较小的柔性结构以提供所希望的抗体融合蛋白结构的一个或多个部分。在一些实施例中，接头是GS接头。在一些实施例中，接头具有选自由SEQ ID NO:45-52和59-60组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，肽接头包含IgG的铰链区，如人IgG1的铰链区。在一些实施例中，接头具有选自由SEQ ID NO:53-58组成的组的氨基酸序列的序列。
非肽接头
两个部分的偶联可以通过将两个分子结合的任何化学反应来完成，只要这两种组分都保持它们各自的活性。该联接可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和力结合、插入、配位结合和络合。在一些实施例中，结合是共价结合。共价结合可以通过现有侧链的直接缩合或通过外部桥接分子的并入来实现。在这种情况下，许多二价或多价连接剂可用于偶联蛋白质分子。例如，代表性的偶联剂可包括有机化合物，例如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。该清单并非旨在穷尽本领域中已知的各种偶联剂，而是更常见的偶联剂的示例(参见Killen和Lindstrom,Jour.Immun.133:1335-2549(1984)；Jansen等人,Immunological Reviews 62:185-216(1982)；和Vitetta等人,Science 238:1098(1987))。
可以在本申请中应用的接头在文献中有所描述(参见例如Ramakrishnan,S.等人,Cancer Res.44:201-208(1984)，其描述MBS(M-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的用途。在一些实施例中，本文使用的非肽接头包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(Pierce Chem.Co.,目录号(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.,目录号21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺]己酸酯(Pierce Chem.Co.目录号2165-G；以及(v)缀合至EDC的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酰亚胺:Pierce Chem.Co.,目录号24510)。
上述接头含有具有不同属性的组分，因此可能导致具有不同理化特性的双特异性抗体。例如，烷基羧酸盐的磺基-NHS酯比芳香族羧酸盐的磺基-NHS酯更稳定。含NHS酯的接头的可溶性不如磺基-NHS酯。此外，接头SMPT含有空间受阻的二硫键，并且可以形成具有增强的稳定性的抗体融合蛋白。二硫键通常比其他键不稳定，因为二硫键在体外被切割，导致可用的抗体融合蛋白更少。特别地，磺基-NHS可以增强碳二亚胺偶联的稳定性。当与磺基-NHS配合使用时，碳二亚胺偶联(例如EDC)形成比单独的碳二亚胺偶联反应对水解的抵抗力更大的酯。
制备方法
还提供了用于制备本文所述的工程化细胞的组合物和方法。
抗体部分
在一些实施例中，本文所述的结合部分包含抗体部分(例如抗CCR5抗体部分、抗CD4抗体部分、抗CXCR4抗体部分、抗HIV抗体部分)。在一些实施例中，该抗体部分包含来自单克隆抗体的VH和VL结构域或它们的变体。在一些实施例中，该抗体部分进一步包含来自单克隆抗体的CH1和CL结构域或它们的变体。单克隆抗体可例如使用杂交瘤方法制备，诸如Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)以及Sergeeva等人,Blood,117(16):4262-4272中所述的那些。
在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫仓鼠、小鼠或其他合适的宿主动物以激发淋巴细胞，该淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合该免疫剂的抗体。替代性地，可在体外免疫淋巴细胞。免疫剂可包括多肽或感兴趣的蛋白的融合蛋白，或包含至少两个分子的复合物，诸如包含肽和MHC蛋白的复合物。通常，如果需要人类来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要非人哺乳动物来源的细胞，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合，形成杂交瘤细胞。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可将杂交瘤细胞在合适的培养基中培养，该培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基典型地将包含次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
在一些实施例中，永生化细胞系有效融合，支持所选择的产生抗体的细胞稳定高水平表达抗体，并且对培养基诸如HAT培养基敏感。在一些实施例中，永生化细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，其可从例如Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California和American Type Culture Collection,Manassas,Virginia获得。还描述了人骨髓瘤和小鼠人异源骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体。Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications(Marcel Dekker,Inc.:New York,1987)第51-63页。
然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对该多肽的单克隆抗体。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。此类技术和测定是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Munson和Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来确定。
在鉴定所希望的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆，并使其通过标准方法生长。Goding，同上。用于此目的的培养基包括例如杜尔贝克改良伊格尔培养基和RPMI-1640培养基。替代性地，杂交瘤细胞可作为腹水在哺乳动物体内生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规免疫球蛋白纯化程序(诸如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法)从培养基或腹水中分离或纯化。
在一些实施例中，抗体部分包含来自选自抗体部分文库(诸如呈递scFv或Fab片段的噬菌体文库)的克隆的序列。可通过从组合文库中筛选具有所希望活性的抗体片段来鉴定克隆。例如，本领域已知用于生成噬菌体展示文库和筛选具有所希望的结合特征的抗体的此类文库的多种方法。此类方法综述于例如Hoogenboom等人,Methods in MolecularBiology 178:1-37(O'Brien等人编,Human Press,Totowa,N.J.,2001)中，并进一步描述于例如以下文献中：McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods inMolecular Biology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,N.J.,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因库通过聚合酶链反应(PCR)来分别克隆并在噬菌体文库中随机重组，然后可以将其针对抗原结合噬菌体进行筛选，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体典型地以单链Fv(scFv)片段或Fab片段的形式展示抗体片段。来自免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。替代性地，可以(例如，从人)克隆原始库，以提供针对多种非自身抗原以及自身抗原的单一抗体来源，而无需任何免疫，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，还可以通过从干细胞中克隆未重排的V基因片段，并使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区域并完成体外重排来合成原始文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括，例如：美国专利号5,750,373以及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
抗体部分可使用噬菌体展示以从文库中筛选对靶抗原(诸如CCR5、CXCR4和CD4多肽)具有特异性的抗体来制备。文库可以是具有至少1×109个(诸如至少约1×109、2.5×109、5×109、7.5×109、1×1010、2.5×1010、5×1010、7.5×1010或1×1011中的任一数值)独特人抗体片段多样性的人scFv噬菌体展示文库。在一些实施例中，文库是由从健康供体的人PBMC和脾脏中提取的DNA构建的原初人文库，包含所有人重链和轻链亚家族。在一些实施例中，文库是由从PBMC提取的DNA构建的原初人文库，该PBMC分离自患有各种疾病的患者，诸如患有自身免疫性疾病的患者、癌症患者和患有感染性疾病的患者。在一些实施例中，文库是半合成人文库，其中重链CDR3是完全随机化的，所有氨基酸(半胱氨酸除外)同样可能存在于任何给定位置(参见例如Hoet,R.M.等人,Nat.Biotechnol.23(3):344-348,2005)。在一些实施例中，半合成人文库的重链CDR3具有约5至约24个(诸如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24中的任一数值)氨基酸的长度。在一些实施例中，文库是全合成噬菌体展示文库。在一些实施例中，文库是非人噬菌体展示文库。
以高亲和力与靶抗原结合的噬菌体克隆可通过噬菌体与靶抗原的反复结合来选择，该靶抗原与固体支持物(诸如用于溶液淘选的珠或用于细胞淘选的哺乳动物细胞)结合，然后去除未结合的噬菌体并洗脱特异性结合的噬菌体。在溶液淘选的实例中，靶抗原可被生物素化用于固定到固体支持物上。将生物素化的靶抗原与噬菌体文库和固体支持物诸如链霉亲和素缀合的Dynabeads M-280混合，然后分离靶抗原-噬菌体-珠复合物。然后洗脱结合的噬菌体克隆并用于感染合适的宿主细胞，诸如大肠杆菌XL1-Blue，用于表达和纯化。在细胞淘选的实例中，将表达靶抗原(例如CD4、CCR5)的细胞与噬菌体文库混合，之后收集细胞，并且洗脱结合的克隆并用于感染合适的宿主细胞用于表达和纯化。可用溶液淘选、细胞淘选或这两者的组合进行多轮(例如约2、3、4、5、6或更多轮中的任一轮数)淘选，以富集特异性结合靶抗原的噬菌体克隆。可通过本领域已知的任何方法，包括例如ELISA和FACS，测试富集的噬菌体克隆与靶抗原的特异性结合。
在一些实施例中，结合部分与参考抗体结合相同的表位。在一些实施例中，结合部分与参考抗体竞争结合。竞争测定可用于确定两个抗体部分是否通过识别相同或空间上重叠的表位而结合相同表位(或彼此竞争)，或一种抗体是否竞争性抑制另一抗体与抗原的结合。示例性竞争测定包括但不限于常规测定，诸如Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)中提供的那些。在Morris(1996)"Epitope Mapping Protocols,"Methods inMolecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,N.J.)中提供了绘制抗体所结合的表位的详细示例性方法。在一些实施例中，如果两种抗体各自阻断另一种抗体50％或更多的结合，则称这两种抗体结合相同的表位。
人和人源化抗体部分
本文所述的抗体部分可以是人的或人源化的。非人(例如，鼠)抗体部分的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或它们的通常含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的片段(诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体部分包括人免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(受者抗体)，其中来自受者CDR的残基被来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的具有所希望的特异性、亲和力和容量的CDR的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基替换。人源化抗体部分还可包含既不存在于受者抗体部分中也不存在于输入的CDR或框架序列中的残基。通常，人源化抗体部分可包含至少一个、并且典型地两个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。参见例如Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。
通常，人源化抗体部分具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。根据一些实施例，人源化可基本上按照Winter及其同事的方法(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体部分的对应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体部分是这样的抗体部分(美国专利号4,816,567)：其中基本上少于完整的人可变结构域被来自非人物种的对应序列取代。在实践中，人源化抗体部分通常是人抗体部分，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
作为人源化的替代方案，可生成人抗体部分。例如，现在有可能产生转基因动物(例如小鼠)，其在免疫后能够在没有内源免疫球蛋白产生的情况下产生完整的人抗体库。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到此类种系突变小鼠中将导致在抗原攻击时产生人抗体。参见例如，Jakobovits等人,PNAS USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.,7:33(1993)；美国专利号5,545,806、5,569,825、5,591,669、5,545,807；和WO 97/17852。替代性地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如，其中内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠)中来制备人抗体。在攻击后，观察到人抗体产生，其在所有方面都与在人中发现的非常相似，包括基因重排、组装和抗体库。该方法描述于例如以下文献中：美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016，以及Marks等人,Bio/Technology,10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature,368:856-859(1994)；Morrison,Nature,368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology,14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology,14:826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)。
人抗体也可通过体外活化的B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)或通过使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)来生成。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体。Cole等人,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)以及Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。
抗体变体
在一些实施例中，考虑了本文提供的抗原结合结构域(例如，抗CCR5抗体部分、抗CD4抗体部分和抗HIV抗体部分)的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗原结合结构域的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗原结合结构域的氨基酸序列变体可通过向编码抗原结合结构域的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括，例如，抗原结合结构域的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终的构建体具有所希望的特征，例如抗原结合性。
在一些实施例中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗原结合结构域变体。取代诱变的目标位点包括抗体部分的HVR和FR。可将氨基酸取代引入感兴趣的抗原结合结构域中，并针对所希望的活性(例如，保留/改善的抗原结合或降低的免疫原性)筛选产物。
保守取代显示于下表2中。本文讨论的变体CORS也可含有此类保守取代。
表2：保守取代
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氨基酸可以根据共同的侧链特性分组成不同的类别：
a.疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
b.中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
c.酸性：Asp、Glu；
d.碱性：His、Lys、Arg；
e.影响链取向的残基：Gly、Pro；
f.芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。
示例性取代变体是亲和力成熟的抗体部分，其可以方便地生成，例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术。简而言之，将一个或多个CDR残基突变并将变体抗体部分在噬菌体上展示，并针对特定的生物活性(例如，结合亲和力)来筛选。可以在HVR中进行改变(例如取代)，例如以提高抗体部分的亲和力。可在HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或特异性决定残基(SDR)中进行此类改变，其中测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过从二级文库中构建和重新选择的亲和力成熟描述于例如：Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等人编,Human Press,Totowa,NJ,(2001)。)
在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有所希望的亲和力的任何抗体部分变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR导向的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以特异性鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。HC-CDR3和LC-CDR3尤其经常被靶向。
在一些实施例中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个HVR内，只要此类改变基本上不降低抗体部分结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行不显著降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。此类改变可以在HVR“热点”或SDR之外。在以上提供的变体VH和VL序列的一些实施例中，每个HVR是未改变的或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述，用于鉴定可以靶向诱变的抗原结合结构域的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此方法中，鉴定靶残基的残基或残基组(例如，带电荷的残基，例如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以确定抗原结合结构域与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入另外的取代，证明对初始取代的功能敏感性。替代性地或另外地，可测定抗原-抗原结合结构域复合物的晶体结构以鉴定抗原结合结构域和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可以作为取代的候选者被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所希望的特性。
氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗原结合结构域。抗原结合结构域的其他插入变体包括将抗原结合结构域的N末端或C末端与延长该抗原结合结构域的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽融合。
核酸
本文还提供了编码本文所述的表面分子、结合部分、抑制部分、膜结构域的核酸(或一组核酸)，以及包含核酸的载体。
表面分子、结合部分、抑制部分、膜结构域的表达可通过将核酸插入适当的表达载体中实现，使得核酸可操作地连接到5'和/或3'调控元件，包括例如启动子(例如淋巴细胞特异性启动子)和3'非翻译区(UTR)。载体可适于在宿主细胞中复制和整合。典型的克隆和表达载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调控所希望的核酸序列表达的启动子。
可将核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，可以将表达载体以病毒载体的形式提供至细胞。病毒载体技术是本领域熟知的。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择性标记。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可使用本领域已知的技术将所选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可在体内或离体分离重组病毒并将其递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。源自逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体比源自肿瘤逆转录病毒诸如鼠白血病病毒的载体具有额外的优势，因为它们可转导非增殖细胞，诸如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。
附加的启动子元件，例如增强子，调控转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可增加到相隔50bp。
合适启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV病毒启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸酐激酶启动子。
为了评估多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体还可含有选择性标记基因或报告基因或这两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择性标记可携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序。选择性标记和报告基因都可侧接有合适的调控序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。
报告基因用于鉴定潜在的转染细胞和评价调控序列的功能。通常，报告基因是不存在于受者生物体或组织中或不由受者生物体或组织表达并且编码其表达由一些容易检测的特性(例如酶活性)来显现的多肽的基因。在将DNA引入受者细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因。合适的表达系统是熟知的并且可使用已知技术制备或商购获得。通常，具有显示报告基因最高表达水平的最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区域可与报告基因连接并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
确认哺乳动物细胞中核酸存在的示例性方法包括例如本领域技术人员熟知的分子生物学测定，诸如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；生物化学测定，诸如通过免疫学方法(诸如ELISA和蛋白质印迹)检测特定肽的存在或不存在。
在一些实施例中，该一种或多种核酸序列包含在单独的载体中。在一些实施例中，这些核酸序列中的至少一些核酸序列包含在同一载体中。在一些实施例中，所有核酸序列都包含在同一载体中。载体可选自例如由哺乳动物表达载体和病毒载体(诸如源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒的那些)组成的组。
例如，在一些实施例中，核酸包含编码包含：特异性结合T细胞表面抗原(例如CCR5、CD4、CXCR4)的结合部分的第一表面分子的第一核酸序列，任选地编码包含抑制HIV的膜融合的抑制结构域(诸如C34)的第二表面分子的第二核酸，任选地编码包含特异性结合HIV抗原的结合部分的第三表面分子的第三核酸。在一些实施例中，第一核酸序列包含在第一载体中，任选的第二核酸序列包含在第二载体中，并且任选的第三核酸序列包含在第三载体中。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列包含在第一载体中，并且第三核酸序列包含在第二载体中。在一些实施例中，第一核酸序列和第三核酸序列包含在第一载体中，并且第二核酸序列包含在第二载体中。在一些实施例中，第二核酸序列和第三核酸序列包含在第一载体中，并且第一核酸序列包含在第二载体中。在一些实施例中，第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列包含在同一载体中。在一些实施例中，第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸可经由选自由内部核糖体进入位点(IRES)和编码自切割2A肽(诸如P2A、T2A、E2A或F2A)的核酸组成的组的接头彼此连接。
在一些实施例中，第一核酸序列在第一启动子的控制下，任选的第二核酸序列在第二启动子的控制下，并且任选的第三核酸序列在第三启动子的控制下。在一些实施例中，第一启动子、第二启动子和第三启动子中的一些或全部启动子具有相同的序列。在一些实施例中，第一启动子、第二启动子和第三启动子中的一些或全部启动子具有不同的序列。在一些实施例中，第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的一些或全部在多顺反子载体中在单个启动子的控制下表达为单个转录物。在一些实施例中，这些启动子中的一者或多者是诱导型的。
在一些实施例中，第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列中的一些或全部核酸序列在细胞(诸如干细胞，诸如免疫细胞，诸如T细胞)中具有相似(诸如基本上或大约相同)的表达水平。在一些实施例中，第一核酸序列，第二核酸序列和第三核酸序列中的一些核酸序列在细胞(诸如干细胞，诸如免疫细胞，诸如T细胞)中的表达水平相差不超过2倍。可在mRNA或蛋白质水平上测定表达。mRNA表达的水平可通过使用各种熟知的方法，包括RNA印迹、定量RT-PCR、微阵列分析等，测量从核酸转录的mRNA的量来确定。蛋白质表达水平可通过已知方法测量，包括免疫细胞化学染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、发光测定、质谱法、高效液相色谱、高压液相色谱-串联质谱法等。
在细胞(诸如干细胞，诸如免疫细胞，诸如T细胞)中引入和表达基因的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，可通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可通过物理、化学或生物手段将表达载体转移到宿主细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。在一些实施例中，通过磷酸钙转染将多核苷酸引入宿主细胞。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物(例如人)细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒1、腺病毒和腺相关病毒等。
用于将多核苷酸引入宿主细胞(诸如免疫细胞)的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可包封在脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂质双层中，经由同时与脂质体和寡核苷酸缔合的连接分子连接到脂质体上，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以双层结构、作为胶束或“折叠”结构存在。它们也可简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的一类化合物。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞或将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法如何，为了确认重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定来鉴定落入本发明范围内的药剂。
本文所述的核酸可瞬时或稳定掺入细胞(诸如干细胞，诸如免疫细胞，诸如T细胞)中。在一些实施例中，核酸在工程化细胞中瞬时表达。例如，核酸可存在于含有异源基因表达盒的染色体外阵列中的工程化细胞的细胞核中。可使用本领域已知的任何转染或转导方法，包括病毒或非病毒方法，将核酸引入工程化哺乳动物。示例性非病毒转染方法包括但不限于基于化学的转染，诸如使用磷酸钙、树枝状聚合物、脂质体或阳离子聚合物(例如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)；非化学方法，诸如电穿孔、细胞挤压、声致穿孔、光学转染、刺穿转染、原生质体融合、流体动力学递送或转座子；基于粒子的方法，诸如使用基因枪、磁转染或磁辅助转染、粒子轰击；以及杂交方法，诸如核转染。在一些实施例中，核酸是DNA。在一些实施例中，核酸是RNA。在一些实施例中，核酸是线性的。在一些实施例中，核酸是环状的。
在一些实施例中，核酸存在于工程化细胞的基因组中。例如，可通过本领域已知的任何方法将核酸整合到基因组中，包括但不限于病毒介导的整合、随机整合、同源重组方法和定点整合方法，诸如使用位点特异性重组酶或整合酶、转座酶、类转录激活因子效应物核酸酶CRISPR/Cas9和锌指核酸酶。在一些实施例中，核酸被整合到工程化细胞的基因组的特定设计基因座中。在一些实施例中，核酸被整合到工程化细胞的基因组的整合热点中。在一些实施例中，核酸被整合到工程化细胞的基因组的随机基因座中。在单个工程化细胞中存在多拷贝核酸的情况下，核酸可被整合到工程化细胞的基因组的多个基因座中。
编码表面分子的核酸可操作地连接到启动子。在一些实施例中，启动子是内源启动子。例如，可使用本领域已知的任何方法，诸如CRISPR/Cas9方法，将编码表面分子的核酸敲入内源启动子下游的工程化细胞的基因组中。在一些实施例中，内源启动子是丰富蛋白质诸如β-肌动蛋白、CMV或EF1α的启动子。在一些实施例中，内源启动子是诱导型启动子，例如，可由工程化细胞的内源活化信号诱导。在其中工程化细胞是T细胞的一些实施例中，启动子是T细胞活化依赖性启动子(诸如IL-2启动子、NFAT启动子或NFκB启动子)。
在一些实施例中，启动子是自体启动子。
在一些实施例中，启动子是异源启动子。
在一些实施例中，编码表面分子的核酸可操作地连接到组成型启动子。在一些实施例中，编码表面分子的核酸可操作地连接到诱导型启动子。在一些实施例中，第一启动子(例如，诱导型启动子)可操作地连接到编码包含抗HIV抗体部分或抑制HIV的膜融合的抑制部分的第一表面分子的核酸，并且第二连续启动子(例如，连续启动子)可操作地连接到编码包含特异性结合T细胞表面抗原(例如，CD4、CCR5、CXCR4)的抗体部分的第二表面分子的核酸，或反之亦然。
组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成型表达。本文考虑的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)、猴病毒40早期启动子(SV40)和与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。在大量研究中已经广泛比较了此类组成型启动子驱动转基因表达的效率。例如，Michael C.Milone等人比较了CMV、hEF1α、UbiC和PGK在原代人T细胞中驱动嵌合抗原受体表达的效率，并且推断hEF1α启动子不仅诱导最高水平的转基因表达，而且还在CD4和CD8人T细胞中最佳地维持(Molecular Therapy,17(8):1453-1464(2009))。在一些实施例中，核酸中的启动子是hEF1α启动子。
诱导型启动子可由一种或多种条件诸如物理条件、工程化细胞的微环境、或工程化细胞的生理状态、诱导物(即诱导剂)或它们的组合诱导。在一些实施例中，诱导条件不诱导工程化细胞和/或接受药物组合物的受试者中内源基因的表达。在一些实施例中，诱导条件选自由以下项组成的组：诱导物、辐射(诸如电离辐射、光)、温度(诸如热)、氧化还原状态、肿瘤环境和工程化细胞的活化状态。
在一些实施例中，启动子可被诱导物诱导。在一些实施例中，诱导物是小分子，诸如化学化合物。在一些实施例中，小分子选自由多西环素、四环素、醇、金属或类固醇组成的组。化学诱导的启动子已被最广泛地研究。此类启动子包括转录活性受小分子化学物质诸如多西环素、四环素、醇、类固醇、金属和其他化合物存在与否调控的启动子。具有反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)和四环素响应元件启动子(TRE)的多西环素诱导系统是目前最成熟的系统。WO 9429442描述了通过四环素响应启动子对真核细胞中基因表达的严格控制。WO 9601313披露了四环素调控的转录调节剂。此外，Tet技术(诸如Tet-on系统)已经在例如TetSystems.com的网站上进行了描述。在本申请中，任何已知的化学调控启动子可用于驱动治疗性蛋白质的表达。
在一些实施例中，诱导物是多肽，诸如生长因子、激素或细胞表面受体的配体，例如特异性结合HIV抗原的多肽。在一些实施例中，多肽由工程化细胞表达。在一些实施例中，多肽由核酸中的核酸编码。许多多肽诱导物也是本领域已知的，并且它们可能适用于本发明。例如，基于蜕皮激素受体的基因开关、基于孕酮受体的基因开关和基于雌激素受体的基因开关属于使用类固醇受体衍生的反式激活因子的基因开关(WO 9637609和WO 9738117等)。
在一些实施例中，诱导物同时包含小分子组分和一种或多种多肽。例如，依赖于多肽二聚化的诱导型启动子是本领域已知的，并且可能适用于本发明。1993年开发的第一个小分子CID系统使用FK1012(药物FK506的衍生物)诱导FKBP的同型二聚化。通过使用类似的策略，Wu等人通过使用Rapalog/FKPB-FRB*和赤霉素/GID1-GAI二聚化依赖性基因开关，成功地使CAR-T细胞能够通过ON开关方式滴定(C.-Y.Wu等人,Science 350,aab4077(2015))。其他二聚化依赖性开关系统包括香豆霉素/GyrB-GyrB(Nature 383(6596):178-81)和HaXS/Snap-tag-HaloTag(Chemistry and Biology 20(4):549-57)。
在一些实施例中，启动子是光诱导型启动子，并且诱导条件是光。用于调控哺乳动物细胞中基因表达的光诱导型启动子也是本领域熟知的(参见例如Science 332,1565-1568(2011)；Nat.Methods 9,266-269(2012)；Nature 500:472-476(2013)；NatureNeuroscience 18:1202-1212(2015))。此类基因调控系统可根据它们对(1)DNA结合或(2)转录活化结构域到DNA结合蛋白的募集的调控大致分为两类。例如，开发并在哺乳动物细胞中测试了基于黑视蛋白的合成哺乳动物蓝光控制转录系统，该系统响应于蓝光(480nm)而触发导致钙调磷酸酶介导的NFAT动员的胞内钙增加。最近，Motta-Mena等描述了从天然存在的EL222转录因子开发的新的诱导型基因表达系统，该转录因子在人细胞系和斑马鱼胚胎中赋予对转录起始的高水平的蓝光敏感性控制(Nat.Chem.Biol.10(3):196-202(2014))。此外，红光诱导的拟南芥(Arabidopsis thaliana)光受体光敏色素B(PhyB)和光敏色素相互作用因子6(PIF6)的相互作用被用于红光触发的基因表达调控。此外，还开发了紫外线B(UVB)诱导型基因表达系统并证明其在哺乳动物细胞中的靶基因转录中是有效的(Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies第25章,第四版,CRCPress,2015年1月20日)。本文所述的任何光诱导型启动子可用于驱动本发明中治疗性蛋白质的表达。
在一些实施例中，启动子是由光诱导型分子和光的组合诱导的光诱导型启动子。例如，化学诱导物上的光可切割的光老化基团使诱导物保持无活性，除非光老化基团通过辐射或通过其他手段被去除。此类光诱导型分子包括小分子化合物、寡核苷酸和蛋白质。例如，已经开发了笼状蜕皮激素、与lac操纵子一起使用的笼状IPTG、用于核酶介导的基因表达的笼状丰加霉素、与Tet-on系统一起使用的笼状多西环素和用于光介导的FKBP/FRB二聚化的笼状Rapalog(参见例如，Curr Opin Chem Biol.16(3-4):292-299(2012))。
在一些实施例中，启动子是辐射诱导型启动子，并且诱导条件是辐射，诸如电离辐射。辐射诱导型启动子也是本领域已知的控制转基因表达的启动子。细胞受到辐射后，基因表达发生改变。例如，一组被称为“立即早期基因”的基因可在电离辐射下迅速反应。示例性立即早期基因包括但不限于Erg-1、p21/WAF-1、GADD45α、t-PA、c-Fos、c-Jun、NF-κB和AP1。立即早期基因在其启动子区域包含辐射响应序列。共有序列CC(A/T)6GG(SEQ ID NO:165)已在Erg-1启动子中发现并且被称为血清响应元件或CArG元件。已经对辐射诱导的启动子和转基因的组合进行了深入的研究，并证明其具有有效的治疗益处。参见例如，CancerBiol Ther.6(7):1005-12(2007)以及Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanismsand Strategies第25章,第四版,CRC Press,2015年1月20日。任何立即早期基因启动子或任何包含血清响应元件或SEQ ID NO:65的启动子可用作辐射诱导型启动子以驱动本发明治疗性蛋白质的表达。
在一些实施例中，启动子是热诱导型启动子，并且诱导条件是热。驱动转基因表达的热诱导型启动子也在本领域中被广泛研究。包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp10等的热休克或应激蛋白(HSP)在热或其他物理和化学应激下保护细胞中起重要作用。已经在临床前研究中尝试了几种热诱导型启动子，包括热休克蛋白(HSP)启动子和生长停滞和DNA损伤(GADD)153启动子。1985年首次描述的人hsp70B基因的启动子似乎是最高效的热诱导型启动子之一。本领域已知的附加的热诱导型启动子可见于例如Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies第25章,第四版,CRC Press,2015年1月20日。本文讨论的任何热诱导型启动子可用于驱动本发明治疗性蛋白质的表达。
在一些实施例中，启动子可由氧化还原状态诱导。可由氧化还原状态诱导的示例性启动子包括诱导型启动子和缺氧诱导型启动子。例如，已显示HIF-2α经由直接结合病毒启动子来限制HIV转录。缺氧减少了肿瘤坏死因子或组蛋白脱乙酰酶抑制剂罗米地辛(Romidepsin)介导的HIV再活化，并且抑制HIF信号传导途径逆转了这种表型。(参见Zhuang等人,Commun Biol 3,376(2020))。
在一些实施例中，启动子可由工程化细胞的生理状态(诸如内源活化信号)诱导。在其中工程化细胞是干细胞(例如造血干细胞)的一些实施例中，启动子是干细胞(例如造血干细胞)活化依赖性启动子。在其中工程化细胞是T细胞的一些实施例中，启动子是T细胞活化依赖性启动子，其可由工程化T细胞的内源活化信号诱导。在一些实施例中，工程化T细胞被诱导物诸如PMA、离子霉素或植物血凝素活化。在一些实施例中，工程化T细胞经由内源T细胞受体或工程化受体(诸如重组TCR或CAR)识别HIV抗原而活化。在一些实施例中，工程化T细胞通过阻断免疫检查点而活化，诸如通过由工程化T细胞或由第二工程化细胞表达的免疫调节剂。在一些实施例中，T细胞活化依赖性启动子是IL-2启动子。在一些实施例中，T细胞活化依赖性启动子是NFAT启动子。在一些实施例中，T细胞活化依赖性启动子是NFκB启动子。
不受任何理论或假说的束缚，由IL-2启动子的基因转录启动的IL-2表达是T细胞活化的主要活性。佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)、或离子霉素、或植物血凝素对人T细胞的非特异性刺激导致受刺激的T细胞分泌IL-2。研究了IL-2启动子在基因工程化T细胞中活化诱导的转基因表达(Virology Journal 3:97(2006))。我们发现IL-2启动子在人T细胞系中在PMA/PHA-P活化存在下有效启动报告基因表达。T细胞受体刺激引发胞内反应级联，从而引起胞质钙浓度增加并导致NFAT和NFκB的核翻译。活化T细胞核因子(NFAT)的成员是介导T淋巴细胞免疫应答的Ca2+依赖性转录因子。已显示NFAT对于活化T细胞中诱导型白介素-2(IL-2)表达是至关重要的(Mol Cell Biol.15(11):6299-310(1995)；NatureReviews Immunology5:472-484(2005))。我们发现NFAT启动子在人T细胞系中在PMA/PHA-P活化存在下有效启动报告基因表达。包括核因子κB(NFκB)的其他途径也可用于通过T细胞活化来控制转基因表达。
工程化细胞的制备
在一些实施例中，工程化细胞是干细胞。在一些实施例中，干细胞是造血干细胞(例如，CD34+和/或CD33-细胞)。干细胞可源自胎盘细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞或造血干细胞。造血干细胞可从骨髓细胞或外周血单个核细胞(PBMC)获得。
在一些实施例中，工程化细胞是免疫细胞。
工程化免疫细胞可从外周血、脐带血、骨髓、肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴结组织或胸腺组织获得。宿主细胞可包括胎盘细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞或造血干细胞。细胞可从人、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠以及它们的转基因物种获得。细胞可从已建立的细胞系获得。
在一些实施例中，该工程化免疫细胞源自干细胞。在一些实施例中，该干细胞是胚胎干细胞(ESC)。在一些实施例中，该干细胞是造血干细胞(HSC)。在一些实施例中，该干细胞是间充质干细胞。在一些实施例中，该干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。
表达表面分子的工程化细胞可通过将一种或多种编码表面分子的核酸(包括例如慢病毒载体)引入细胞而生成。在一些实施例中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体以及它们的衍生物。病毒载体技术是本领域熟知的并且描述于例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)，以及其他病毒学和分子生物学手册中。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可使用本领域已知的技术将核酸插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可在体外或离体分离重组病毒并将其递送至工程化细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。在一些实施例中，使用自灭活慢病毒载体。例如，携带编码表面分子的核酸序列的自灭活慢病毒载体可用本领域已知的方法包装。使用本领域已知的方法，所得的慢病毒载体可用于转导哺乳动物细胞(诸如原代人T细胞)。
在一些实施例中，转导或转染的哺乳动物细胞在引入核酸后离体繁殖。在一些实施例中，将转导或转染的哺乳动物细胞培养以繁殖至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一时间。在一些实施例中，将转导或转染的哺乳动物细胞培养不超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一时间。在一些实施例中，进一步评价或筛选转导或转染的哺乳动物细胞以选择工程化细胞。
可以使用本领域已知的技术将一种或多种核酸引入细胞(例如干细胞或免疫细胞)。在一些实施例中，工程化细胞(诸如工程化干细胞或T细胞)能够在体内自我更新、扩增和/或分化，导致可导致疾病的持续控制的长期持续性。
在一些实施例中，在细胞的遗传修饰和/或扩增之前，从受试者获得细胞来源。细胞(例如干细胞或免疫细胞)可从多种来源获得，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的一些实施例中，可使用本领域可获得的任何数量的细胞系。在本发明的一些实施例中，可使用本领域技术人员已知的许多技术，诸如FICOLLTM分离，从收集自受试者的血液或骨髓单位获得细胞。在一些实施例中，来自个体循环血液或骨髓的细胞通过单采术获得。
干细胞可以从成人或新生儿脐带全白细胞样品或全骨髓细胞样品获得。造血干细胞可源自选自骨髓、外周血和新生儿脐带血的来源。在一些实施例中，干细胞是基于下列标记中的一种或多种选择的人造血干细胞：CD34+、CD59+、CD90/Thy1+、CD38低/-、c-Kit-/低和Lin-。在一些实施例中，干细胞是基于下列标记中的一种或多种的小鼠造血干细胞：CD34低/-、SCA-1+、CD90/Thy1+/低、CD38+、c-Kit+和Lin-。
培养、富集和扩增干细胞的方法在本领域是公知的，例如，如Bernstein等人,StemCell Res Ther.2012；3(3):17,等人,Stem Cells,17:19-24和WO 2003062369A2中所述，这些文献以其全文并入本文。
免疫细胞(例如，T细胞)可源自单采产物。在一些实施例中，通过单采术收集的细胞可被洗涤以去除血浆部分，并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁或可能缺少许多(如果不是全部的话)二价阳离子。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法来完成，诸如通过根据制造商的说明书使用半自动化“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，诸如不含Ca2+、不含Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其他含或不含缓冲剂的盐溶液。替代性地，可去除单采样品中不需要的成分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施例中，通过裂解红细胞并消耗单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析从外周血淋巴细胞中分离免疫细胞(诸如T细胞)。T细胞的特定亚群，诸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞，可通过正或负选择技术进一步分离。例如，在一些实施例中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3×28)缀合的珠诸如M-450CD3/CD28T一起孵育足以正选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一些实施例中，该时间段约为30分钟。在一些实施例中，该时间段在30分钟至36小时或更长的范围内(包括这些值之间的所有范围)。在一些实施例中，该时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施例中，该时间段为10至24小时。在一些实施例中，孵育时间段为24小时。在与其他细胞类型相比存在很少T细胞的任何情况下，可使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可增加CD8+T细胞的捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率，可在培养开始时或在该过程中的其他时间点优先选择T细胞亚群或针对其进行选择。此外，通过增加或减小珠或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可在培养开始时或在其他所希望的时间点优先选择T细胞亚群或针对其进行选择。本领域技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可使用多轮选择。在一些实施例中，可能期望进行选择程序并在活化和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可经受更多轮的选择。
通过负选择富集T细胞群可通过针对负选择细胞所特有的表面标记的抗体的组合来实现。一种方法是经由负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该方法使用针对负选择细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体混合物。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD 14、CD20、CD11b、CD 16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施例中，可能期望富集或正选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。替代性地，在一些实施例中，通过抗CD25缀合珠或其他类似的选择方法来消耗T调节性细胞。
为了通过正或负选择分离所希望的细胞群，可改变细胞和表面(例如，颗粒诸如珠)的浓度。在一些实施例中，可能期望显著减小珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一些实施例中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用约10亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用大于约1亿个细胞/ml。在一些实施例中，使用约0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5亿个细胞/ml中的任一数值的细胞浓度。在一些实施例中，使用约0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1亿个细胞/ml中的任一数值的细胞浓度。在一些实施例中，使用约1.25或约1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能微弱表达感兴趣的靶抗原或来自存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)的细胞，诸如CD28阴性T细胞。此类细胞群可具有治疗价值并且是期望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，本文所述的免疫细胞(诸如T细胞)通过与表面接触而扩增，该表面附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可刺激T细胞群，诸如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)连同钙离子载体接触。对于辅助分子在T细胞表面上的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。可使用抗CD28抗体的实例，包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,France)，如本领域公知的其他方法可用的(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol.Meth.227(1-2):53-63,1999)。
无论是在遗传修饰细胞(例如干细胞，例如免疫细胞)以表达表面分子之前还是之后，都可活化和扩增细胞。
遗传修饰
在一些实施例中，工程化细胞被修饰以阻断或降低CCR5的表达。破坏基因表达的细胞修饰包括本领域已知的任何此类技术，包括例如RNA干扰(例如，siRNA、shRNA、miRNA)、基因编辑(例如，基于CRISPR或TALEN的基因敲除)等。
在一些实施例中，使用CRISPR/Cas系统生成CCR5表达降低的工程化细胞。关于基因编辑的CRISPR/Cas系统的综述，参见例如Jian W&Marraffini LA,Annu.Rev.Microbiol.69,2015；Hsu PD等人,Cell,157(6):1262-1278,2014；以及O’Connell MR等人,Nature 516:263–266,2014。在一些实施例中，例如使用基于TALEN的基因组编辑生成T细胞的内源TCR链之一或两者的表达降低的工程化T细胞。在一些实施例中，工程化细胞，特别是从供体获得的同种异体免疫细胞，可被修饰以使参与MHC识别的TCR组分失活。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞不引起移植物抗宿主病。
在一些实施例中，使用CRISPR/Cas9基因编辑使CCR5基因(或TCR基因)失活。CRISPR/Cas9涉及两个主要特征：短导向RNA(gRNA)和CRISPR相关核酸内切酶或Cas蛋白。Cas蛋白能够与gRNA结合，gRNA含有允许定向靶向并随后敲除感兴趣的基因的工程化的间隔区。一旦被靶向，Cas蛋白切割DNA靶序列，从而导致基因的敲除。
在一些实施例中，使用基于类转录激活因子效应物核酸酶的基因组编辑来使CCR5基因(或TCR基因)失活。基于/>的基因组编辑涉及使用可被工程化以靶向DNA的特定区域的限制酶。类转录激活因子效应物(TALE)DNA结合结构域与DNA切割结构域融合。TALE负责将核酸酶靶向感兴趣的序列，并且切割结构域(核酸酶)负责切割DNA，从而导致DNA的该片段的去除和随后基因的敲除。
在一些实施例中，使用锌指核酸酶(ZFN)基因组编辑方法使CCR5基因(或TCR基因)失活。锌指核酸酶是由锌指DNA结合结构域和DNA切割结构域组成的人工限制酶。ZFN DNA结合结构域可被工程化以靶向DNA的特定区域。DNA切割结构域负责切割感兴趣的DNA序列，从而导致DNA的该片段的去除和随后基因的敲除。
在一些实施例中，通过使用RNA干扰(RNAi)诸如小干扰RNA(siRNA)、微RNA和短发夹RNA(shRNA)来降低CCR5基因的表达。siRNA分子是20-25个核苷酸长的寡核苷酸双链体，其与来自感兴趣的基因的信使RNA(mRNA)转录物互补。siRNA靶向这些mRNA进行破坏。通过靶向，siRNA防止mRNA转录物的翻译，从而防止细胞产生蛋白质。
在一些实施例中，通过使用反义寡核苷酸降低CCR5基因(或TCR基因)的表达。靶向mRNA的反义寡核苷酸在本领域通常是已知的，并且通常用于下调基因表达。参见Watts,J.和Corey,D(2012)J.Pathol.226(2):365-379。
工程化细胞的富集
提供了一种富集工程化细胞的异质细胞群的方法，这些工程化细胞表达根据本文所述的工程化细胞中的任一种的表面分子。
在一些实施例中，提供了一种富集包含编码表面分子的核酸的工程化细胞群的方法，该表面分子包含a)结合部分(诸如本文所述的结合部分中的任一种)或抑制部分(诸如本文所述的抑制部分中的任一种)和b)膜结构域，其中该方法包括基于结合部分或抑制部分的富集。在一些实施例中，该结合部分特异性结合CCR5、CD4或CXCR4。在一些实施例中，该结合部分特异性结合HIV抗原。在一些实施例中，该抑制部分包含C34肽。在一些实施例中，该方法包括将特异性结合该结合部分或抑制性部分的药剂与工程化细胞群一起孵育。在一些实施例中，该方法包括孵育特异性结合膜结构域的药剂。在一些实施例中，该药剂是抗体。在一些实施例中，经由本文所述的富集方法实现至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞纯度。
根据本文所述的方法产生的工程化细胞群可通过基于例如表面分子表达的正选择技术来富集。例如，在一些实施例中，工程化细胞(诸如工程化干细胞或T细胞)通过与靶抗原缀合的珠和/或靶配体缀合的珠一起孵育足以正选择所希望的工程化细胞的时间段来富集，其中珠靶向表面分子上的结合结构域或抑制结构域。在一些实施例中，该时间段约为30分钟。在一些实施例中，该时间段在30分钟至36小时或更长的范围内(包括这些值之间的所有范围)。在一些实施例中，该时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施例中，该时间段为10至24小时。在一些实施例中，孵育时间段为24小时。为了分离在异质细胞群中以低水平存在的工程化细胞，使用更长的孵育时间，诸如24小时，可增加细胞产量。在与其他细胞类型相比存在很少工程化细胞的任何情况下，可使用更长的孵育时间来分离工程化细胞。本领域技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可使用多轮选择。
为了通过正选择分离所希望的工程化细胞群，可改变细胞和珠的浓度。在一些实施例中，可能期望显著减小珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一些实施例中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用约10亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用大于约1亿个细胞/ml。在一些实施例中，使用约0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5亿个细胞/ml中的任一数值的细胞浓度。在一些实施例中，使用约0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1亿个细胞/ml中的任一数值的细胞浓度。在一些实施例中，使用约1.25或约1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能微弱表达表面分子的工程化细胞。
在一些实施例中，富集导致工程化细胞(例如免疫细胞)的耗竭最小或基本上不耗竭。例如，在一些实施例中，富集导致少于约50％(诸如少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％中的任一数值)的工程化细胞变得耗竭。免疫细胞耗竭可通过本领域已知的任何手段(包括本文所述的任何手段)来确定。
在一些实施例中，富集导致工程化细胞(例如干细胞，例如免疫细胞)的分化最小或基本上不分化。例如，在一些实施例中，富集导致少于约50％(诸如少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％中的任一数值)的工程化细胞变得分化。细胞(例如干细胞，例如免疫细胞)分化可通过本领域已知的任何方法(包括本文所述的任何方法)来确定。
在一些实施例中，富集导致工程化细胞上表面分子的内化最小或基本上不内化。例如，在一些实施例中，富集导致工程化细胞上少于约50％(诸如少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％中的任一数值)的表面分子变得内化。工程化细胞上表面分子的内化可通过本领域已知的任何方法(包括本文所述的任何方法)来确定。
在一些实施例中，富集导致工程化细胞的增殖增加。例如，在一些实施例中，富集导致富集后工程化细胞的数量增加至少约10％(诸如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多中的任一数值)。
因此，在一些实施例中，提供了一种富集表达表面分子的工程化细胞的异质细胞群的方法，该方法包括：a)使该异质细胞群与包含靶分子(诸如CCR5、CD4、HIV抗原)或其中所含的一个或多个表位的分子接触以形成包含与该分子结合的工程化细胞的复合物；以及b)从该异质细胞群中分离复合物，从而生成富集工程化细胞的细胞群。在一些实施例中，分子被单独固定在固体支持物上。在一些实施例中，固体支持物是微粒(诸如珠)。在一些实施例中，固体支持物是表面(诸如孔的底部)。在一些实施例中，用标签单独标记分子。在一些实施例中，标签是荧光分子、亲和标签或磁性标签。在一些实施例中，该方法进一步包括从第一分子和/或第二分子中洗脱工程化细胞并回收洗脱液。
在一些实施例中，例如通过使用负富集来富集工程化免疫细胞中的CD4+和/或CD8+细胞，由此使用涉及物理(柱)和磁性(MACS磁珠)纯化步骤的两步纯化方法来纯化细胞混合物(Gunzer,M.等人(2001)J.Immunol.Methods258(1-2):55-63)。在其他实施例中，可通过使用专门设计用于富集CD4+或CD8+细胞的T细胞富集柱来富集细胞群中的CD4+和/或CD8+细胞。在其他实施例中，可通过使用可商购获得的套件(试剂盒)来富集细胞群中的CD4+细胞。在一些实施例中，可商购获得的试剂盒是EASYSEPTM人CD4+T细胞富集试剂盒(StemcellTechnologies)。在其他实施例中，可商购获得的试剂盒是MAGNISORTTM小鼠CD4+T细胞富集试剂盒(Thermo Fisher Scientific)。
药物组合物
本文还提供了包含本文所述的工程化细胞(诸如干细胞，诸如T细胞)的工程化细胞组合物(诸如药物组合物，本文也称为制剂)。
在一些实施例中，提供了一种工程化细胞组合物，该工程化细胞组合物包含相同细胞类型的工程化细胞(诸如干细胞，诸如T细胞)的均质细胞群，包含一种或多种编码相同表面分子的核酸，并且任选地表达相同表面分子。在一些实施例中，工程化细胞是干细胞(例如，造血干细胞)。在一些实施例中，工程化细胞是T细胞。在一些实施例中，工程化细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞组成的组。在一些实施例中，工程化细胞组合物是药物组合物。
在一些实施例中，提供了一种包含异质细胞群的工程化细胞组合物，该异质细胞群包含含有不同细胞类型的工程化细胞的多个工程化细胞群，这些工程化细胞包含编码不同表面分子并且任选地表达不同表面分子的不同核酸。
在一些实施例中，药物组合物适合施用于个体，诸如人个体。在一些实施例中，药物组合物适于注射。在一些实施例中，药物组合物适于输注。在一些实施例中，药物组合物基本上不含细胞培养基。在一些实施例中，药物组合物基本上不含内毒素或过敏蛋白。在一些实施例中，“基本上不含”小于药物组合物总体积或重量的约10％、5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、1ppm或更少中的任一数值。在一些实施例中，药物组合物不含支原体、微生物病原体(microbial agent)和/或传染病病原体(communicable disease agent)。
本申请人的药物组合物可包含任何数量的工程化细胞。在一些实施例中，药物组合物包含单拷贝的工程化细胞。在一些实施例中，药物组合物包含至少约1、10、100、1000、104、105、106、107、108个或更多个拷贝中的任一数值的工程化细胞。在一些实施例中，药物组合物包含单一类型的工程化细胞。在一些实施例中，药物组合物包含至少两种类型的工程化细胞，其中不同类型的工程化细胞在它们的细胞来源、细胞类型、表达的治疗性蛋白质(例如，表面分子)和/或启动子等方面不同。
在制备组合物期间的不同时间点，冷冻保存细胞可能是必要的或有益的。术语“冷冻”和“冷冻保存”可互换使用。冷冻包括冷冻干燥。
在一些实施例中，可从培养基中收获细胞，洗涤并以治疗有效量浓缩到载剂中。示例性载剂包括盐水、缓冲盐水、生理盐水、水、汉克斯溶液、林格氏溶液、Nonnosol-R(AbbottLabs)、Plasma-Lyte A(R)(Baxter Laboratories,Inc.,Morton Grove,IL)、甘油、乙醇以及它们的组合。
在一些实施例中，载剂可补充有人血清白蛋白(HSA)或其他人血清组分或胎牛血清。在特定的实施例中，用于输注的载剂包括具有5％ HAS或葡萄糖的缓冲盐水。其他等渗剂包括多羟基糖醇，包括三元或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。
载剂可包括缓冲剂，诸如柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、富马酸盐缓冲液、葡萄糖酸盐缓冲液、草酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和/或三甲胺盐。
稳定剂是指有助于防止细胞粘附到容器壁上的一大类赋形剂，其功能范围可从填充剂到添加剂。典型的稳定剂可包括多羟基糖醇；氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌肉肌醇、半乳糖醇、甘油和环醇，诸如肌醇；PEG；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即<10个残基)；蛋白质，诸如HSA、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖，诸如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖，诸如棉子糖；以及多糖，诸如葡聚糖。
在必要或有益的情况下，组合物可包含局部麻醉剂诸如利多卡因以减轻注射部位的疼痛。
示例性防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵、氯化六甲双铵、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
组合物中细胞的治疗有效量可大于102个细胞，大于103个细胞，大于104个细胞，大于105个细胞，大于106个细胞，大于107个细胞，大于108个细胞，大于109个细胞，大于1010个细胞或大于1011个细胞，包括这些值之间的任何值和范围。
在本文披露的组合物和制剂中，细胞通常为一升或更少、500ml或更少、250ml或更少或100ml或更少的体积。因此，所施用细胞的密度通常大于104个细胞/ml、107个细胞/ml或108个细胞/ml。
本文还提供了包含编码本文所述的一种或多种表面分子的核酸中的任一种的核酸组合物(诸如药物组合物，本文也称为制剂)。在一些实施例中，核酸组合物是药物组合物。在一些实施例中，核酸组合物进一步包含等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂和/或防腐剂中的任一种；和/或水性媒介物，诸如纯化水、糖水溶液、缓冲溶液、生理盐水、聚合物水溶液或无RNA酶的水。可根据核酸组合物的使用形式适当地选择此类添加剂和水性媒介物的添加量。
本文披露的组合物和制剂可制备用于通过例如注射、输注、灌注或灌洗而施用。组合物和制剂可进一步配制用于骨髓、静脉内、皮内、动脉内、结节内、淋巴内、腹膜内、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、瘤内、肌内、膀胱内和/或皮下注射。
用于体内施用的配制品必须是无菌的。这可以通过例如穿过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
赋形剂
本申请的药物组合物可用于治疗目的。因此，与包含工程化细胞(诸如表达表面分子的生产细胞)的其他组合物不同，本申请的药物组合物包含适于向个体施用的药学上可接受的赋形剂。
合适的药学上可接受的赋形剂可包括缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括自体血清。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括人血清。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂是无毒的、生物相容的、非免疫原性的、可生物降解的，并且可避免被宿主的防御机制识别。赋形剂还可含有佐剂，诸如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂等。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂增强工程化细胞或抗体或其分泌的其他治疗性蛋白质的稳定性。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂减少由工程化细胞分泌的抗体或其他治疗性蛋白质的聚集。最终形式可以是无菌的，并且也能够容易地通过注射装置诸如空心针。通过适当选择赋形剂可实现并保持适当的粘度。
在一些实施例中，药物组合物被配制成具有约4.5至约9.0范围内的pH，包括例如约5.0至约8.0、约6.5至约7.5或约6.5至约7.0中的任一数值的pH范围。在一些实施例中，还可通过加入合适的张力调节剂诸如甘油使药物组合物与血液等渗。
在一些实施例中，药物组合物适合施用于人。在一些实施例中，药物组合物适于通过肠胃外施用向人施用。适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期受者的血液相容的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，诸如安瓿和小瓶，并且可储存在仅需要在使用前即刻添加在本文所述的治疗方法、施用方法和剂量方案中用于注射的无菌液体赋形剂(即水)的条件下。在一些实施例中，药物组合物容纳在一次性小瓶，诸如一次性密封小瓶中。在一些实施例中，药物组合物容纳在多次用小瓶中。在一些实施例中，药物组合物散装容纳在容器中。在一些实施例中，药物组合物是冷冻保存的。
在一些实施例中，药物组合物被配制用于静脉内施用。在一些实施例中，药物组合物被配制用于皮下施用。在一些实施例中，药物组合物被配制用于局部施用至肿瘤部位。在一些实施例中，药物组合物被配制用于瘤内注射。
在一些实施例中，药物组合物必须满足用于向个体施用的某些标准。例如，美国食品和药物管理局已经发布了为基于细胞的免疫治疗产品设定标准的管理指南，包括21CFR610和21CFR 610.13。本领域已知评估药物组合物的外观、特性、纯度、安全性和/或效力的方法。在一些实施例中，除了工程化的哺乳动物免疫细胞之外，药物组合物基本上不含能够产生过敏作用的外来蛋白质，诸如细胞培养中使用的动物来源的蛋白质。在一些实施例中，“基本上不含”小于药物组合物总体积或重量的约10％、5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、1ppm或更少中的任一数值。在一些实施例中，药物组合物在GMP级工作间中制备。在一些实施例中，对于肠胃外施用，药物组合物包含小于约5EU/kg体重/小时的内毒素。在一些实施例中，对于静脉内施用，药物组合物中至少约70％的工程化细胞是活的。在一些实施例中，当使用美国药典(USP)中所述的14天直接接种测试方法评估时，药物组合物具有“不生长”结果。在一些实施例中，在施用药物组合物之前，应在最终收获前约48-72小时(或与培养物的最后一次再进料同时)采集同时包含工程化细胞和药学上可接受的赋形剂的样品用于无菌测试。在一些实施例中，药物组合物不含支原体污染。在一些实施例中，药物组合物不含可检测的微生物病原体。在一些实施例中，药物组合物不含传染病病原体，诸如I型HIV、II型HIV、HBV、HCV、I型人嗜T淋巴细胞病毒和II型人嗜T淋巴细胞病毒。
使用工程化细胞治疗疾病的方法
本申请还提供了施用工程化细胞以治疗感染性疾病例如HIV的方法。因此，本申请在一些实施例中提供了一种用于治疗个体中的感染性疾病的方法，该方法包括向该个体施用有效量的组合物(诸如药物组合物)，该组合物包含根据本文所述的实施例中的任一种的工程化细胞。在一些实施例中，病毒感染由选自例如人T细胞白血病病毒(HTLV)和HIV(人免疫缺陷病毒)的病毒引起。
在一些实施例中，提供了治疗HIV的方法，该方法包括施用本文所述的工程化细胞中的任一种。HIV有两种亚型：HIV-1和HIV-2。HIV-1是全球大流行的原因，是一种同时具有高毒力和高感染性的病毒。然而，HIV-2仅在西非流行，其毒性和感染性都不如HIV-1。HIV-1和HIV-2感染之间毒力和感染性的差异可归根于针对HIV-2感染中的病毒蛋白的更强的免疫应答，从而导致在受影响的个体中更有效的控制(Leligdowicz,A.等人(2007)J.Clin.Invest.117(10):3067-3074)。这也可能是HIV-1在全球传播而HIV-2在地理上流行有限的一个控制原因。
尽管HIV-2病毒感染比HIV-1病毒感染得到了更好的控制，但HIV-2感染个体仍能从治疗中受益。在一些实施例中，工程化细胞用于治疗HIV-1感染。在其他实施例中，工程化细胞用于治疗HIV-2感染。在一些实施例中，工程化细胞用于治疗HIV-1和HIV-2感染。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法向该个体施用有效量的工程化干细胞(例如，造血干细胞)，这些工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合T细胞表面抗原并防止该T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合，其中该T细胞表面抗原选自由CCR5、CD4和CXCR4组成的组，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化干细胞(例如，造血干细胞)，这些工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CCR5，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化干细胞(例如，造血干细胞)，这些工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CCR5，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分是包含SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列或包含至少约80％序列同一性的变体的scFv。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化干细胞(例如，造血干细胞)，这些工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CD4，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化干细胞(例如，造血干细胞)，这些工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CD4，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分是包含SEQ ID NO:4、5或6的氨基酸序列或包含至少约80％序列同一性的变体的scFv。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化干细胞(例如，造血干细胞)，这些工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CXCR4，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化干细胞(例如，造血干细胞)，这些工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CXCR4，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化干细胞(例如，造血干细胞)，这些工程化干细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合HIV抗原并防止该HIV抗原与工程化细胞结合，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性结合，或与10-1074、10E8或PGT121结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分是包含SEQ ID NO:7、61或62的氨基酸序列或包含至少约80％序列同一性的变体的scFv。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化干细胞(例如，造血干细胞)，这些工程化干细胞包含：a)抑制HIV的膜融合的抑制部分，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该抑制部分选自由C34、HP32、SC35EK、西夫韦肽、T20和T2634或它们的功能部分组成的组。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化干细胞(例如，造血干细胞)，这些工程化干细胞包含：a)包含C34的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)或其功能部分的抑制部分，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合T细胞表面抗原并防止该T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合，其中该T细胞表面抗原选自由CCR5、CD4和CXCR4组成的组，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CCR5，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CCR5，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分是包含SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列或包含至少约80％序列同一性的变体的scFv。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CD4，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CD4，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分是包含SEQ ID NO:4、5或6的氨基酸序列或包含至少约80％序列同一性的变体的scFv。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CXCR4，以及b)将该分子系链到膜上的膜结构域，其中该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合CXCR4，以及b)包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)的膜结构域，其中该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)结合部分，其中该结合部分特异性结合HIV抗原并防止该HIV抗原与工程化细胞结合，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，该结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性结合，或与10-1074、10E8或PGT121结合相同的表位。在一些实施例中，该结合部分是包含SEQID NO:7、61或62的氨基酸序列或包含至少约80％序列同一性的变体的scFv。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)抑制HIV的膜融合的抑制部分，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该抑制部分选自由C34、HP32、SC35EK、西夫韦肽、T20和T2634或它们的功能部分组成的组。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，提供了一种治疗感染了HIV的个体的方法，该方法包括向该个体施用有效量的工程化免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞)，该工程化免疫细胞包含：a)包含C34的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)或其功能部分的抑制部分，以及b)将该分子系链到膜上或促进该分子系链到膜上的膜结构域。在一些实施例中，该膜结构域包含GPI附着信号序列(例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，该膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。在一些实施例中，该表面分子不包含胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，工程化细胞对于个体是自体的。
在一些实施例中，工程化细胞对于个体是同种异体的。
在一些实施例中，在施用工程化细胞后个体中至少约5％(诸如至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％或20％)的T细胞表达表面分子。在一些实施例中，在施用工程化细胞后约1、2、3、4、5、6或7天测量T细胞。在一些实施例中，在施用工程化细胞后约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周测量T细胞。在一些实施例中，在施用工程化细胞后约1、2、3、4、5或6个月测量T细胞。
在一些实施例中，在施用工程化细胞后个体中至少约20％(诸如至少约22％、24％、26％、28％、30％、32％、34％、36％、38％或40％)的T细胞对HIV感染具有抗性。在一些实施例中，在施用工程化细胞后约1、2、3、4、5、6或7天测量T细胞的HIV抗性。在一些实施例中，在施用工程化细胞后约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周测量T细胞的HIV抗性。在一些实施例中，在施用工程化细胞后约1、2、3、4、5或6个月测量T细胞的HIV抗性。
在一些实施例中，个体是哺乳动物(例如，人、非人灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、猪、羊、山羊、狗、猫等)。在一些实施例中，个体是人。在一些实施例中，个体是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在一些实施例中，个体年龄小于约60岁(包括例如小于约50、40、30、25、20、15或10岁中的任一数值)。在一些实施例中，个体年龄大于约60岁(包括例如大于70、80、90或100岁中的任一数值)。在一些实施例中，个体被诊断患有或在环境上或遗传上易患本文所述的一种或多种疾病或障碍(诸如癌症或病毒感染)。在一些实施例中，个体具有与本文所述的一种或多种疾病或障碍相关的一种或多种危险因素。
在一些实施例中，本发明的工程化细胞组合物与第二药剂、第三药剂或第四药剂(包括例如抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂)组合施用以治疗涉及靶抗原表达的疾病或障碍。
病毒感染治疗可通过例如病毒载量、存活持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评价。
在一些实施例中，药物组合物以至少约104、105、106、107、108或109个细胞/kg体重中的任一数值的剂量施用。在一些实施例中，药物组合物以约104至约105、约105至约106、约106至约107、约107至约108、约108至约109、约104至约109、约104至约106、约106至约108或约105至约107个细胞/kg体重中的任一数值的剂量施用。
在一些实施例中，施用多于一种类型的工程化细胞，可将不同类型的工程化细胞同时施用于个体，诸如在单一组合物中，或以任何合适的顺序依次施用。
在一些实施例中，药物组合物单次施用。在一些实施例中，药物组合物施用多次(诸如2、3、4、5、6次或更多次中的任一数值)。在一些实施例中，药物组合物每周一次、2周一次、3周一次、4周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次或每年一次施用。在一些实施例中，施用之间的间隔为约1周至2周、2周至1个月、2周至2个月、1个月至2个月、1个月至3个月、3个月至6个月或6个月至一年中的任一数值。对于特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗而容易地确定。
在一些实施例中，本文所述的治疗感染性疾病的方法进一步包括向个体施用第二抗感染性疾病剂。合适的抗感染性疾病剂包括但不限于抗逆转录病毒药物、广泛中和抗体、toll样受体激动剂、潜伏再活化剂、CCR5拮抗剂、免疫刺激剂(例如TLR配体)、疫苗、核苷逆转录酶抑制剂、核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂和融合抑制剂。在一些实施例中，第二抗感染剂与工程化细胞同时施用。在一些实施例中，第二抗感染剂与工程化细胞的施用依次(例如，之前或之后)施用。
制品和套件
在本发明的一些实施例中，提供了一种含有用于治疗感染性疾病诸如病毒感染(例如HIV感染)的材料的制品。该制品可以包括容器和该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多种材料诸如玻璃或塑料形成。通常，容器容纳有效治疗本文所述的疾病或障碍的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的工程化细胞。标签或包装插页指示该组合物用于治疗特定病症。标签或包装插页将进一步包括用于将工程化细胞组合物施用于患者的说明书。还考虑了包含本文所述的组合疗法的制品和套件。
包装插页是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，这些说明书含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。在其他实施例中，包装插页指示该组合物用于治疗靶抗原阳性病毒感染(例如HIV感染)。
此外，该制品可进一步包括第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可进一步包括从商业和用户角度来看所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
还提供了用于各种目的的套件，例如，用于治疗本文所述的靶抗原阳性疾病或障碍，任选地与制品组合。本发明的套件包括一个或多个包含工程化细胞组合物(或单位剂型和/或制品)的容器，并且在一些实施例中，进一步包括另一种药剂(诸如本文所述的药剂)和/或根据本文所述的方法中的任一种使用的说明书。该套件可进一步包括选择适于治疗的个体的详细描述。在本发明的套件中提供的说明书通常是标签或包装插页(例如，包含在套件中的纸片)上的书面说明书，但机器可读说明书(例如，在磁或光存储盘上携带的说明书)也是可接受的。
本领域技术人员将会认识到，在本发明的范围和精神内，多个实施例是可能的。现在将参考以下非限制性示例性实施例和实例更详细地描述本发明。以下示例性实施例和实例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
实例
实例1.表面锚定的scFv阻断细胞池中的假病毒
使用TZM-bl细胞测定GPI-scFv构建体阻断假病毒的能力。在细胞上表达的GPI锚定的抗体构建体列于下表3中。这些构建体还包括用于检测的编码GFP的核酸。
表3用于实验的scFv和bnAb构建体
scFv/bnAb构建体 靶点
X5 HIV gp120
C1-13 CCR5
C1-814 CCR5
C1-816 CCR5
C2-05 CD4
C2-11 CD4
C2-13 CD4
C3-05 CXCR4
VRC01 CD4
3BNC117 CD4
10E8 MPER
PGT121 V3
GPI TZM-bl细胞的制备
如下所述产生GPI TZM-bl细胞。将TZM-bl细胞消化并以800rpm离心5分钟。重悬细胞沉淀并计数。将2×105个细胞转移到24孔板中并将细胞生长培养基重新填充至1mL。24小时后，弃去上清液，并将1ml含有具有表3所列的GPI-scFv构建体的慢病毒的完全培养基添加到细胞中进行培养。然后将细胞消化，转移到6孔板中并孵育。在荧光显微镜下测量绿色荧光。
假病毒感染
将用于每种GPI锚定抗体的200ul GPI TZM-bl细胞重悬液铺在96孔板中，以测试对HIV假病毒感染的抗性。通过用200μl含有假病毒的新鲜完全培养基替换每个孔中的上清液，将假病毒添加到每个实验组中。病毒的添加量与假病毒的滴度有关。用具有假病毒感染的空白TZM-bl细胞设立阳性对照(PC)组。设立无假病毒感染的阴性对照(NC)组。然后将细胞孵育24小时，之后用200μl新鲜完全培养基替换上清液，接着再孵育24小时。
发光检测
吸出100μl培养上清液。将100μl的One-GloTM荧光素酶试剂添加到孔中并使其在室温下反应15分钟。使用酶标仪检测平均相对发光单位(RLU)。RLU结果显示于图1中。
图1显示了表达GPI锚定的各种抗体的细胞的阻断作用。如图所示，三种GPI锚定的抗CCR5抗体，即GPI-C1-13、GPI-C1-814和GPI-C1-816提供针对假病毒感染的保护。其中，GPI-C1-13提供最高水平的针对病毒感染的保护。GPI锚定的抗CD4抗体，例如GPI-C2-05和GPI-C2-13也提供针对假病毒的保护。各种GPI锚定的HIV bnAb(例如GPI-10E8、GPI-PGT121、GPI-X5)提供不同水平的保护。
实例2.对HIV感染的细胞级群体免疫
表达表面GPI-scFV的单克隆GPI-TZM-bl细胞系的生成
如实例1中所述产生GPI-TZM-bl细胞。然后将细胞消化并使用在200μl培养基中铺板的连续稀释法在96孔板中重新铺板。将细胞在培养箱中连续培养10天。使用倒置显微镜观察孔中是否存在单细胞簇。在荧光显微镜下检查单细胞簇以确认该簇是否具有绿色荧光。选择并扩增具有绿色荧光的单细胞簇，并进行流式细胞术以检测单克隆细胞的纯度。结果显示于图2A中，其中表达表面GPI-scFVs或HIV bnAb的单克隆TZM-bl细胞系具有高纯度，范围从96.9％到99.0％。这些结果表明，通过细胞分选可获得高度同质的抗HIV细胞。
假病毒感染
将用于每种GPI锚定抗体的200ul GPI TZM-bl细胞重悬液铺在96孔板中，以测试对AD8假病毒感染的抗性(Giese等人,Viruses.2020年4月；12(4):459)。通过用200μl含有假病毒的新鲜完全培养基替换每个孔中的上清液，将假病毒添加到每个实验组中。病毒的添加量与假病毒的滴度有关。用具有假病毒感染的空白TZM-bl细胞设立阳性对照(PC)组。然后将细胞孵育24小时，之后用200μl新鲜完全培养基替换上清液，接着再孵育24小时。
如图2B所示，所有测试的GPI锚定抗体都防止了AD8假病毒感染。
细胞级群体免疫
群体免疫通常是指当足够高比例的个体尤其是通过接种疫苗对传染性疾病免疫时对该疾病在人群中传播的抗性。我们测试了细胞级群体免疫是否可通过混合HIV抗性细胞和HIV非抗性细胞来实现。
将空白TZM-bl细胞和GPI TZM-bl细胞以100％、75％、60％、45％、35％、15％的GPITZM-bl细胞混合。所用的GPI TZM-bl细胞包括单GPI-X5(即，表达抗X5 scFv的单克隆GPITZM-bl细胞，也称为单X5，类似于下文所述细胞的缩写)、单GPI-CCR5(C1-13)、单GPI-CD4(C2-13)、单GPI-C34、单GPI-10E8、单GPI-PGT121、单GPI-1-18、单GPI-10-1074、单GPI-N6、单GPI-VRC07-523、单GPI-VRC07和单GPI-PGT128。将培养基重新填充至200ul。然后将细胞与假病毒一起孵育24小时。将阳性组(PC)设定为具有假病毒感染的空白TZM-bl细胞，将无病毒感染的100％ GPI TZM-bl细胞设定为阴性对照(NC)组。还测试了另一个无假病毒感染的空白TZM-bl细胞的阴性对照组。
如实例1中所述检测每个组的RLU。无病毒感染的GPI TZM-bl细胞的每个组的RLU与无假病毒感染的空白TZM-bl细胞的RLU基本相当。因此，NC组的RLU用作所有孔的背景用于计算阻断作用。阻断作用(％)计算为1-(RLUGPI-TZM-bl-RLUNC)/(RLUPC-RLUNC)*100％。
如图3和图4所示，表达GPI锚定的HIV抗性蛋白(例如，特异性结合CCR5、CD4、HIV抗原的抗体部分，或抑制部分诸如C34)的细胞的百分比表示为X轴，并且受保护免受感染的细胞百分比表示为Y轴。单GPI-X5具有接近线性的阻断作用曲线(图3)，表明最小的群体免疫。另一方面，单GPI-N6以高群体百分比显示感染的增强(图4)。引人注目的是，表达GPI锚定的抗CCR5(GPI-CCR5-13，即GPI-C1-13)scFv的细胞表现出细胞级群体免疫，在仅15％的细胞群中赋予超过50％的阻断，并且在50％群体中赋予约90％的保护。GPI-C2-13(即GPI-CD4-13)、GPI-10E8和GPI-PGT121也表现出对不同水平的群体免疫。图4证实单GPI-CCR5表现出惊人的群体免疫现象。图4还显示单GPI-C34、单GPI-CD4(C2-13)、单GPI-10-1074、单GPI-10E8和单GPI-PGT121也表现出群体免疫。
为了测试群体免疫是否在高剂量病毒下持续存在，将单GPI-CCR5(即GPI-C1-13)与不同剂量的假病毒一起孵育。如图5所示，较高剂量的病毒(60μl、80μl或90μl病毒)不影响单GPI-CCR5的群体免疫现象。另一方面，较高剂量的病毒影响单GPI-10E8和单GPI-10-1074的抗性(数据未显示)。
据我们所知，我们的发现首次发现了细胞级群体免疫现象。通过利用这种作用，我们可设计出可在很大程度上有益于与病原体(例如病毒)感染相关的疾病的治疗方法。具体地，我们提供了生成表达GPI锚定的表面分子的高纯度单克隆细胞的方法，以及这些细胞(诸如表达GPI锚定的抗CCR5 scFv、GPI锚定的C34、GPI锚定的抗CD4 scFv或各种GPI锚定的抗HIV scFv的细胞)赋予群体免疫的令人信服的证据。
实例3.表达各种GPI锚定的抗CCR5构建体的细胞的阻断作用
靶向CCR5的GPI-scFv的构建
图6A中展示的各种GPI-scFv从N末端到C末端具有：CD8α信号肽(SEQ ID NO:148)-[scFv-接头序列-GPI附着序列](SEQ ID NO:137-147中的任一者)-GFP(SEQ ID NO:153)。
GPI TZM-bl细胞的制备
如下所述产生GPI TZM-bl细胞。将TZM-bl细胞消化并以800rpm离心5分钟。重悬细胞沉淀并计数。将2×105个细胞转移到24孔板中并将细胞生长培养基重新填充至1mL。24小时后，弃去上清液，并将1ml含有具有GPI-scFv(上述构建体)的慢病毒的完全培养基添加到细胞中进行培养。然后将细胞消化，转移到6孔板中并孵育。在荧光显微镜下测量绿色荧光。
细胞级群体免疫
如实例2中所述测量这些GPI TZM-bl细胞的细胞级群体免疫。如图6A至图6B所示，用GPI锚定的C1-11、C1-12、C1-13或C1-14转导的细胞对假病毒表现出优异的阻断作用。其中，用GPI锚定的C1-11、C1-12或C1-13转导的细胞表现出细胞级群体免疫。
实例4.
CAR-scFv构建体的构建
示例性CAR-scFv构建体(CAR-CD4-11(即，CAR-C2-11)、CAR-CD4-13(即，CAR-C2-13)、CAR-CCR5-13(即，CAR-598)(C1-13)、CAR-600(10E8))从N末端到C末端具有：CD8α信号肽(SEQ ID NO:148)-scFv-CD8跨膜结构域序列(SEQ ID NO:166)。示例性CAR-scFv构建体具有SEQ ID NO:167-171所示的氨基酸序列。
CAR-scFv构建体不具有胞内信号传导结构域。还构建了具有CAR但不具有scFv的对照构建体。
表达CAR-scFv构建体的原代T细胞的制备
CD4+T细胞分离自获自健康供体的PBMC。然后用如上所述制备的CAR-scFv构建体或对照CAR构建体转导这些CD4+T细胞。表达CAR-scFv构建体的CD4+T细胞被富集，与抗scFv抗体一起孵育细胞，并分选抗scFv抗体阳性的细胞。
如图7所示，富集后CAR+细胞的纯度达到约90％。
细胞级群体免疫
评价表达CAR-scFv构建体的这些原代CD4+T细胞的细胞级群体免疫。具体地，将空白PBMC和表达CAR-scFv的PBMC以0:4、1:3、2:2、3:1和4:0的比率混合。然后将细胞与假病毒一起孵育24小时。将阳性组(PC)设定为具有假病毒感染的空白CD4+原代T细胞。将无病毒感染的表达CAR-scFv构建体的100％ CD4+原代T细胞设定为阴性对照(NC)组。还测试了另一个无假病毒感染的空白CD4+原代T细胞的阴性对照组。
如实例1中所述检测每个组的RLU。无病毒感染的表达CAR-scFv构建体的CD4+原代T细胞的每个组的RLU与无假病毒感染的空白CD4+原代T细胞的RLU基本相当。因此，NC组的RLU用作所有孔的背景用于计算阻断作用。阻断作用(％)计算为1-(RLUCAR-CD4T-RLUNC)/(RLUPC-RLUNC)*100％。
如图8所示，表达CAR-CD4-11、CAR-CD4-13或CAR-CCR5-13的原代CD4+T细胞均表现出优异的阻断作用和针对HIV假病毒的细胞级群体免疫。
实例5.表达抗CCR5抗体的细胞表现出针对HIV的细胞级群体免疫。
为了进一步评价由表达抗CCR5抗体的细胞表现出的针对HIV的细胞级群体免疫作用，如实例3中所述制备表达GPI-C1-13(即，如图9所示的C1-13)的Tzm-bl细胞。还通过向Tzm-bl细胞中引入靶向CCR5的单一导向RNA来制备CCR5KO Tzm-bl细胞(如图9所示的KO)。
如下表4所示，将两种类型的细胞(A型和B型细胞)以0％、25％、40％、55％、65％、85％或100％的B型细胞混合。如上所述计算阻断作用(％)。
表4.
A型细胞 B型细胞 在图9中表示
测试#1 Tzm-bl CCR5 KO TZM-bl细胞 三角形连线
测试#2 CCR5 KO TZM-bl细胞 表达GPI-C1-13的Tzm-bl细胞 方形连线
测试#3 Tzm-bl 表达GPI-C1-13的Tzm-bl细胞 点连线
如图9所示，当表达GPI-C1-13的Tzm-bl细胞与CCR5KO TZM-bl细胞混合时，不管两种细胞的比率如何，阻断作用总是接近100％，表明TZM-bl细胞上的抗CCR5 scFv和TZM-bl细胞上的CCR5 KO都能保护细胞免受病毒感染。当TZM-bl细胞与CCR5 KO TZM-bl细胞混合时，在CCR5 KO TZM-bl细胞的比例增加时，阻断作用以线性方式增加。当将表达GPI-C1-13的Tzm-bl细胞与Tzm-bl细胞混合，并且当表达GPI-C1-13的Tzm-bl细胞的比例增加时，阻断作用以非线性方式增加，再次证明了针对HIV假病毒的细胞级群体免疫。
序列表
根据本发明的实施例的示例性构建体的序列：
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/>
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/>
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/>
/>
/>
/>
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/>
/>
序列表
<110> 南京传奇生物科技有限公司（NANJING LEGEND BIOTECH CO., LTD.）
南京金斯瑞生物科技有限公司（NANJING GENSCRIPT BIOTECH CO.,LTD.）
<120> 工程化细胞及其用途
<130> GS-W22331WO
<140> 尚未指定
<141> 一并同时提交
<150> PCT/CN2021/076390
<151> 2021-02-09
<160> 171
<170> FastSEQ for Windows 4.0版
<210> 1
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Gly Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Asn Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Thr Ala Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser
180 185 190
Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Phe Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 2
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Asn Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Ser Leu Gly Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala
130 135 140
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser
145 150 155 160
Ile Asn Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
180 185 190
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
195 200 205
Gly Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
210 215 220
Ser Thr Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 3
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Asn Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Ser Leu Gly Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala
130 135 140
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser
145 150 155 160
Ile Asn Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
180 185 190
Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
195 200 205
Gly Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
210 215 220
Ser Thr Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 4
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Ser His Asp Leu Met Gln Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Phe Asn
180 185 190
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Asp Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 5
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Asn
145 150 155 160
Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr
165 170 175
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
210 215 220
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245 250
<210> 6
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Ile Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp
130 135 140
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp Leu
145 150 155 160
Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
195 200 205
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr Thr
210 215 220
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230
<210> 7
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Val Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Met Asn Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Asp Arg Glu Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Asn
50 55 60
Ser Arg Val Val Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Val Thr Pro Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Ala Arg Arg Gly Gln Arg Ile Tyr Gly Val Val Ser Phe Gly Glu
100 105 110
Phe Phe Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Ser Tyr Val Arg Pro Leu Ser Val Ala Leu Gly Glu Thr
145 150 155 160
Ala Arg Ile Ser Cys Gly Arg Gln Ala Leu Gly Ser Arg Ala Val Gln
165 170 175
Trp Tyr Gln His Arg Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Leu Ile Tyr Asn
180 185 190
Asn Gln Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Thr Pro
195 200 205
Asp Ile Asn Phe Gly Thr Arg Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu
210 215 220
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Met Trp Asp Ser Arg Ser
225 230 235 240
Gly Phe Ser Trp Ser Phe Gly Gly Ala Thr Arg Leu Thr Val Leu
245 250 255
<210> 8
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Thr Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg
1 5 10 15
Trp Val Leu Ser Ser Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu
35 40 45
Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu
50 55
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gly Tyr Gly Met His
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Gly Arg Asn Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Thr Ala Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Gln Ala Ser Gln Gly Ile Arg Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Gln Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Arg Ile Arg Asn Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Leu Gly Glu Phe Ala Tyr
1 5
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Ser Ala Thr Ser Ser Ile Asn Ser Asn Tyr Leu His
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Asn Tyr Gly Met Ala
1 5
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Ser His Asp Leu Met Gln
1 5 10 15
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Asp Ala Phe Asn Leu Ala Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Gln Gln Ser Lys Asp Asp Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Ser Tyr Val Ile His
1 5
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Gly Tyr Tyr Trp Ser
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Val Ile Asn Trp Phe Asp Pro
1 5
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Asn Tyr Tyr Trp Thr
1 5
<210> 40
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Tyr Ile Ser Asp Arg Glu Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Asn Ser
1 5 10 15
<210> 41
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Ala Arg Arg Gly Gln Arg Ile Tyr Gly Val Val Ser Phe Gly Glu Phe
1 5 10 15
Phe Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val
20
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Gly Arg Gln Ala Leu Gly Ser Arg Ala Val Gln
1 5 10
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
His Met Trp Asp Ser Arg Ser Gly Phe Ser Trp Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(5)
<223> 可以至多并包括8的任何整数重复出现
<400> 46
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 47
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(15)
<223> 可以至多并包括3的任何整数重复出现
<400> 48
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
1 5 10 15
<210> 49
<211> 1
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 可以任何整数重复出现
<400> 49
Gly
1
<210> 50
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(2)
<223> 可以任何整数重复出现
<400> 50
Gly Ser
1
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(5)
<223> 可以至多并包括8的任何整数重复出现
<400> 51
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 52
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(4)
<223> 可以至多并包括10的任何整数重复出现
<400> 52
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Gly His Gly Gly Pro Pro Gly Pro
1 5 10 15
<210> 55
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Glu Arg Lys Ser Ser Val Glu Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Glu Arg Lys Ser Gly Val Glu Gly Pro Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 61
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Asp Asn Ala
20 25 30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Thr Gly Pro Gly Glu Gly Trp Ser Val Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Leu Asn Ser Ile Asn Phe
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Glu Met Asn Asn Leu Arg Met Glu Asp Ser Gly Leu Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Arg Thr Gly Lys Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Pro
100 105 110
Pro Gly Glu Glu Tyr Phe Gln Asp Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Glu Thr Gly Val Ser Val Ala Leu
145 150 155 160
Gly Arg Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Gly Asp Ser Leu Arg Ser His
165 170 175
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Leu
180 185 190
Phe Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ala Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala
210 215 220
Glu Asp Asp Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp Lys Ser Gly Ser
225 230 235 240
Arg Leu Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 62
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Gln Met Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Asp Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val His Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Asn Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Ser Leu Val Ala Ala Thr Ala Ala Asp Ser Gly Lys Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Leu His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Ile Val Ala Phe Asn Glu
100 105 110
Trp Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp Val Trp Gly Asn Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Ser Asp Ile Ser Val Ala Pro Gly Glu Thr Ala Arg Ile
145 150 155 160
Ser Cys Gly Glu Lys Ser Leu Gly Ser Arg Ala Val Gln Trp Tyr Gln
165 170 175
His Arg Ala Gly Gln Ala Pro Ser Leu Ile Ile Tyr Asn Asn Gln Asp
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Pro Asp Ser Pro
195 200 205
Phe Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Val Glu Ala Gly Asp
210 215 220
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ile Trp Asp Ser Arg Val Pro Thr Lys
225 230 235 240
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Asn Ala Trp Met Thr
1 5
<210> 64
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Arg Ile Thr Gly Pro Gly Glu Gly Trp Ser Val Asp Tyr Ala Ala Pro
1 5 10 15
Val Glu Gly
<210> 65
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Thr Gly Lys Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Pro Pro Gly Glu Glu
1 5 10 15
Tyr Phe Gln Asp
20
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Arg Gly Asp Ser Leu Arg Ser His Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 68
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Ser Ser Arg Asp Lys Ser Gly Ser Arg Leu Ser Val
1 5 10
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Asp Ser Tyr Trp Ser
1 5
<210> 70
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Tyr Val His Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 71
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Thr Leu His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Ile Val Ala Phe Asn Glu Trp
1 5 10 15
Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp Val
20
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Gly Glu Lys Ser Leu Gly Ser Arg Ala Val Gln
1 5 10
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 74
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
His Ile Trp Asp Ser Arg Val Pro Thr Lys Trp Val
1 5 10
<210> 75
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Gly Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Asn Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Thr Ala Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
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20 25 30
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35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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<220>
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
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35 40 45
Ala Arg Ile Arg Asn Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala
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Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
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Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Phe Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
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<400> 86
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<400> 89
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<220>
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<400> 91
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<400> 96
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 99
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<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
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<211> 16
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 110
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<210> 111
<211> 8
<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 111
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<211> 11
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<220>
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<400> 112
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<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
Lys Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Lys Val Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Arg Asp Val Asp Asp Asp
20 25 30
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Ile Phe Ile Ile
35 40 45
Glu Asp Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly Ile Ser Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Asp Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asp Asn Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 7
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<220>
<223> 合成构建体
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Thr
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65 70 75 80
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<400> 124
Asn Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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Asp
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1 5
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<400> 131
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
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Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asn Tyr Ile Arg Asn Asn Glu Lys Phe
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<223> 合成构建体
<400> 132
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Leu Ser Ser
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<400> 133
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Arg Ser Ser Gln Arg Leu Leu Ser Ser Tyr Gly His Thr Tyr Leu His
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 134
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195 200 205
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245
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 135
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Arg Lys Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Gly Tyr Gly Met His Trp Val
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Asn
210 215 220
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225 230 235 240
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245
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<211> 313
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 136
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Val Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Met Asn Asn Tyr
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Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Asp Arg Glu Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Asn
50 55 60
Ser Arg Val Val Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Val Thr Pro Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Thr Ala Arg Arg Gly Gln Arg Ile Tyr Gly Val Val Ser Phe Gly Glu
100 105 110
Phe Phe Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Ser Tyr Val Arg Pro Leu Ser Val Ala Leu Gly Glu Thr
145 150 155 160
Ala Arg Ile Ser Cys Gly Arg Gln Ala Leu Gly Ser Arg Ala Val Gln
165 170 175
Trp Tyr Gln His Arg Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Leu Ile Tyr Asn
180 185 190
Asn Gln Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Thr Pro
195 200 205
Asp Ile Asn Phe Gly Thr Arg Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu
210 215 220
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Met Trp Asp Ser Arg Ser
225 230 235 240
Gly Phe Ser Trp Ser Phe Gly Gly Ala Thr Arg Leu Thr Val Leu Pro
245 250 255
Gly Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Leu Glu Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr
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<211> 306
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 137
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1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
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Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
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Gly Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
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100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr
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Leu Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Val Ser Val Gly Trp Ile
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Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Ser Ile Asn Trp
165 170 175
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Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His Thr
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Leu Thr
305
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<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 138
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Gly His Asp
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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Phe Ile Phe Phe Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Asn
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Gly Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu
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Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
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Arg Leu Lys Gly Ala Trp Leu Leu Ser Glu Pro Pro Tyr Phe Ser Ser
100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn
130 135 140
Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg
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Val Ser Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ser Asn Thr
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Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Phe Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln Ser
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Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu Asn
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Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Pro Arg Pro Gly Thr Pro Leu Gly Asp
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Glu Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His
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Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly
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Leu Leu Thr
305
<210> 139
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 139
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1 5 10 15
Arg Val Ser Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ser Asn
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Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Phe Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln
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Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu
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Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Pro Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser
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Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr
130 135 140
Val Ser Gly Gly Ser Ile Gly His Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln
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Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Phe Phe Asp Gly
165 170 175
Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Asn Gly Arg Val Thr Ile Ser Leu
180 185 190
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala
195 200 205
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Lys Gly Ala Trp Leu
210 215 220
Leu Ser Glu Pro Pro Tyr Phe Ser Ser Asp Gly Met Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Pro Ser Pro Gly Thr Pro Leu Gly Asp
245 250 255
Thr Thr His Thr Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Leu
260 265 270
Glu Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His
275 280 285
Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly
290 295 300
Leu Leu Thr
305
<210> 140
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 140
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Ser Trp Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Ala Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Asp
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Thr Asn Gln Ile Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Met Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Ala Gly Thr Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Thr Thr Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly Asp Lys Val Ser Ile Ser
145 150 155 160
Cys Lys Ala Ser Arg Asp Val Asp Asp Asp Val Asn Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Arg Pro Gly Glu Ala Pro Ile Phe Ile Ile Glu Asp Ala Thr Thr Leu
180 185 190
Val Pro Gly Ile Ser Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Asp Ser Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr
210 215 220
Phe Cys Leu Gln His Asp Asn Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Glu Ile Lys Pro Gly Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
245 250 255
Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Leu Glu Gly Ser Gly
260 265 270
Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His Thr Cys Phe Thr
275 280 285
Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly Leu Leu Thr Gly
290 295 300
Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu
305 310 315 320
Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
325 330 335
Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys
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Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu
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Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro
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<211> 303
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 141
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Val Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Ile Phe Ile Ile
35 40 45
Glu Asp Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly Ile Ser Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Asp Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asp Asn Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Ser Trp Gly Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Ala Val Ser Gly Ala Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg
165 170 175
Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Asp Gly Arg Val Thr Ile Ser
180 185 190
Leu Asp Thr Ser Thr Asn Gln Ile Ser Leu Lys Leu Thr Ser Met Thr
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Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Ala Gly Thr
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Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser
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Ala Ser Ala Pro Thr Pro Gly Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ile Gln
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Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Asp Ala
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Ser Asp Leu Glu Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile
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Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly
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Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Pro Gly Thr Pro Leu Gly Asp Thr
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Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His Thr
275 280 285
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Leu Thr
305
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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305
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<223> 合成构建体
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Leu Leu Thr
305
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 146
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
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Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245 250 255
<210> 163
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 163
Thr Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg
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Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His Thr Cys Phe Thr Leu
305 310 315 320
Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly Leu Leu Thr
325 330
<210> 164
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 164
Thr Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg
1 5 10 15
Trp Val Leu Ser Ser
20
<210> 165
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 3, 4, 5, 6, 7, 8
<223> n=A或T
<400> 165
ccnnnnnngg 10
<210> 166
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 166
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 167
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 167
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Ser Tyr Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Asp Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp
65 70 75 80
Tyr Asp Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser
85 90 95
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala
115 120 125
Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu
165 170 175
Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr
180 185 190
Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
195 200 205
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
210 215 220
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
225 230 235 240
Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
245 250 255
Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
260 265 270
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
275 280 285
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
290 295 300
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
305 310 315 320
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
325 330 335
Ile Thr Leu Tyr Cys
340
<210> 168
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 168
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
20 25 30
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Leu Ser Gly Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Asn Asp Phe Trp Ser Gly Tyr
115 120 125
Tyr Thr Ala Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
165 170 175
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Arg Lys
180 185 190
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ala Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Phe Pro
245 250 255
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
Tyr Cys
<210> 169
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 169
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu
20 25 30
Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly
35 40 45
Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Ile Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser
145 150 155 160
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
165 170 175
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro
180 185 190
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
195 200 205
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
210 215 220
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn
225 230 235 240
Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr
245 250 255
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
260 265 270
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
275 280 285
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
290 295 300
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
305 310 315 320
Thr Leu Tyr Cys
<210> 170
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 170
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Asp Phe Asp Asn Ala Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Thr Gly Pro Gly Glu Gly Trp Ser
65 70 75 80
Val Asp Tyr Ala Ala Pro Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Leu
85 90 95
Asn Ser Ile Asn Phe Leu Tyr Leu Glu Met Asn Asn Leu Arg Met Glu
100 105 110
Asp Ser Gly Leu Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Gly Lys Tyr Tyr Asp Phe
115 120 125
Trp Ser Gly Tyr Pro Pro Gly Glu Glu Tyr Phe Gln Asp Trp Gly Arg
130 135 140
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Glu Thr Gly
165 170 175
Val Ser Val Ala Leu Gly Arg Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Gly Asp
180 185 190
Ser Leu Arg Ser His Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln
195 200 205
Ala Pro Ile Leu Leu Phe Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val
210 215 220
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ala Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Thr Ile
225 230 235 240
Ser Gly Ala Gln Ala Glu Asp Asp Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg
245 250 255
Asp Lys Ser Gly Ser Arg Leu Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
260 265 270
Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
290 295 300
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
305 310 315 320
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
325 330 335
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
340
<210> 171
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 171
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Thr Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu
20 25 30
Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Ser Trp Met Glu Trp Asp Arg
35 40 45
Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser
50 55 60
Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Thr Thr Thr Pro
65 70 75 80
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
85 90 95
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
100 105 110
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
115 120 125
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
130 135 140
Cys
145

Claims (69)

1.一种工程化细胞，所述工程化细胞包含编码表面分子的核酸，所述表面分子包含：
a)结合部分，其中所述结合部分
i)与T细胞表面抗原特异性结合并防止所述T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合，或
ii)与抗HIV抗体竞争性地特异性结合HIV抗原，或与所述抗HIV抗体结合相同的表位并防止HIV感染所述工程化细胞；以及
b)膜结构域，所述膜结构域将所述分子系链到膜上或促进所述表面分子系链到所述膜上。
2.如权利要求1所述的工程化细胞，其中所述表面分子不包含胞内信号传导结构域。
3.如权利要求1或权利要求2所述的工程化细胞，其中所述T细胞表面抗原选自由CCR5、CD4和CXCR4组成的组。
4.如权利要求3所述的工程化细胞，其中所述T细胞表面抗原是CCR5。
5.一种工程化细胞，所述工程化细胞包含编码表面分子的核酸，所述表面分子包含：
a)结合部分，所述结合部分特异性结合CCR5并防止CCR5与HIV蛋白结合，和
b)膜结构域，所述膜结构域将所述分子系链到膜上或促进所述表面分子系链到所述膜上，
并且其中所述表面分子不包含胞内信号传导结构域。
6.如权利要求5所述的工程化细胞，其中所述膜结构域源自以下项，或为来自以下项的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、4-1BB或PD-1。
7.如权利要求4-6中任一项所述的工程化细胞，其中所述结合部分与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816竞争性地特异性结合CCR5，或与C1-13、C1-14、C1-11、C1-12、C1-814或C1-816特异性结合相同的表位。
8.如权利要求7所述的工程化细胞，其中所述结合部分包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
(1)所述VH包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ IDNO:12的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的LC-CDR3，
(2)VH包含含有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQID NO:128的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的LC-CDR3，或者
(3)所述VH包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR3。
9.如权利要求8所述的工程化细胞，其中：
(1)所述VH包含SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，并且所述VL包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，
(2)所述VH包含SEQ ID NO:131所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，并且所述VL包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，或者
(3)所述VH包含SEQ ID NO:77或79所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，并且所述VL包含SEQ ID NO:78或80的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
10.如权利要求8或权利要求9所述的工程化细胞，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:1-3和133-135中的任一者所示的氨基酸序列，或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
11.如权利要求3所述的工程化细胞，其中所述T细胞表面抗原是CD4。
12.如权利要求11所述的工程化细胞，其中所述结合部分与C2-05、C2-11或C2-13竞争性地特异性结合CD4，或与C2-05、C2-11或C2-13特异性结合相同的表位。
13.如权利要求12所述的工程化细胞，其中所述结合部分包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中
(1)所述VH包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQID NO:36的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQID NO:38的氨基酸序列的LC-CDR3，
(2)所述VH包含含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQID NO:24的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQID NO:26的氨基酸序列的LC-CDR3，或者
(3)所述VH包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQID NO:30的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQID NO:32的氨基酸序列的LC-CDR3。
14.如权利要求13所述的工程化细胞，其中：
(1)所述VH包含SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，并且所述VL包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，
(2)所述VH包含SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，并且所述VL包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，或者
(3)所述VH包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，并且所述VL包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
15.如权利要求13或权利要求14所述的工程化细胞，其中所述结合部分包含SEQ IDNO:4-6中的任一者的氨基酸序列，或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
16.如权利要求1或权利要求2所述的工程化细胞，其中所述表面分子包含结合部分，所述结合部分与10-1074、10E8或PGT121竞争性地特异性结合HIV，或与10-1074、10E8或PGT121特异性结合相同的表位。
17.如权利要求16所述的工程化细胞，其中所述表面分子包含结合部分，所述结合部分与10-1074竞争性地特异性结合HIV，或与10-1074特异性结合相同的表位。
18.如权利要求17所述的工程化细胞，其中所述结合部分包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR3。
19.如权利要求18所述的工程化细胞，其中所述抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VH，以及b)包含SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VL。
20.如权利要求16所述的工程化细胞，其中所述表面分子包含结合部分，所述结合部分与10E8竞争性地特异性结合HIV，或与10E8特异性结合相同的表位。
21.如权利要求20所述的工程化细胞，其中所述结合部分包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的LC-CDR3。
22.如权利要求21所述的工程化细胞，其中所述抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VH，以及b)包含SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VL。
23.如权利要求16所述的工程化细胞，其中所述表面分子包含结合部分，所述结合部分与PGT121竞争性地特异性结合HIV，或与PGT121特异性结合相同的表位。
24.如权利要求23所述的工程化细胞，其中所述结合部分包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的HC-CDR2和含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的LC-CDR2和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的LC-CDR3。
25.如权利要求24所述的工程化细胞，其中所述抗体部分包含：a)包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VH，以及b)包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体的VL。
26.如权利要求16-25中任一项所述的工程化细胞，其中所述结合部分包含SEQ ID NO:7、61或62的氨基酸序列，或含有具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
27.如权利要求8-10、13-15、18-19、21-22和24-26中任一项所述的工程化细胞，其中所述VH和所述VL经由接头融合。
28.如权利要求27所述的工程化细胞，其中所述VH和所述VL之间的接头是肽接头。
29.如权利要求28所述的工程化细胞，其中所述VH和所述VL之间的接头包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
30.如权利要求1-29中任一项所述的工程化细胞，其中所述结合部分是sdAb、scFv、Fab’、(Fab’)2、Fv或肽配体。
31.如权利要求30所述的工程化细胞，其中所述结合部分是scFv。
32.如权利要求1-31中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是干细胞。
33.如权利要求1-31中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是免疫细胞。
34.如权利要求33所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是T细胞或自然杀伤细胞。
35.一种工程化细胞，所述工程化细胞包含编码表面分子的核酸，所述表面分子包含：
a)抑制HIV的膜融合的抑制部分，其中所述抑制部分包含C34的氨基酸序列或其功能部分，和
b)膜结构域，所述膜结构域将所述分子系链到膜上或促进所述表面分子系链到所述膜上，
并且其中所述工程化细胞是干细胞。
36.如权利要求1-5和7-35中任一项所述的工程化细胞，其中所述膜结构域包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着信号序列。
37.如权利要求36所述的工程化细胞，其中所述GPI附着信号序列包含SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列。
38.如权利要求1-37中任一项所述的工程化细胞，其中所述结合部分或所述抑制部分经由接头与所述膜结构域的N末端融合。
39.如权利要求38所述的工程化细胞，其中a)所述结合部分或抑制部分和b)所述膜结构域之间的接头是肽接头。
40.如权利要求39所述的工程化细胞，其中所述肽接头选自由SEQ ID NO:45-52、150和152组成的组。
41.如权利要求1-34和36-40中任一项所述的工程化细胞，其中所述表面分子进一步包含特异性结合第二抗原的第二结合部分。
42.如权利要求41所述的工程化细胞，其中所述结合部分和所述第二结合部分串联连接。
43.如权利要求35-40中任一项所述的工程化细胞，其中所述表面分子进一步包含特异性结合抗原的结合部分。
44.如权利要求43所述的工程化细胞，其中所述抑制部分和所述结合部分串联连接。
45.如权利要求41-44中任一项所述的工程化细胞，其中所述表面分子包含：a)特异性结合CCR5或CD4的抗CCR5抗体部分或抗CD4抗体部分，以及b)特异性结合HIV抗原的抗HIV抗体部分或抑制HIV的膜融合的抑制部分。
46.如权利要求1-40中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含第二表面分子，其中所述第二表面分子包含特异性结合第二抗原的第二结合部分。
47.如权利要求46所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含：a)特异性结合CCR5或CD4的抗CCR5抗体部分或抗CD4抗体部分，以及b)包含特异性结合HIV抗原的抗体部分或抑制HIV的膜融合的抑制部分的抗HIV表面分子。
48.如权利要求1-47中任一项所述的工程化细胞，其中所述表面分子包含SEQ ID NO:136和144-147中的任一者所示的氨基酸序列。
49.如权利要求1-48中任一项所述的工程化细胞，其中所述表面分子还在所述分子的N末端包含促进所述表面分子系链到所述膜上的信号肽。
50.如权利要求49所述的工程化细胞，其中所述信号肽是CD8α信号肽。
51.如权利要求1-50中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞表达嵌合抗原受体。
52.如权利要求51所述的工程化细胞，其中所述嵌合抗原受体包含抗HIV抗体部分。
53.多种如权利要求1-52中任一项所述的工程化细胞，其中在a)与多种不表达所述表面分子并易受HIV感染的细胞混合；以及b)使所述混合物与HIV接触，则不被HIV感染的细胞的百分比比所述工程化细胞的百分比高至少约10％。
54.一种表面分子，所述表面分子包含：
a)特异性结合T细胞表面抗原并防止所述T细胞表面抗原与HIV上的其认知配体结合的结合部分，与抗HIV抗体竞争性地特异性结合HIV抗原或与所述抗HIV抗体结合相同的表位并防止HIV感染所述工程化细胞的结合部分，或者抑制HIV的膜融合的抑制部分；以及
b)膜结构域，所述膜结构域在细胞中表达后能够将所述分子系链到细胞膜上或促进所述表面分子系链到所述细胞膜上，
其中在被细胞表达时，所述细胞赋予群体免疫HIV的能力。
55.如权利要求54所述的表面分子，其中所述细胞表达CCR5、CD4或CXCR4。
56.如权利要求55所述的表面分子，其中所述细胞是TZM-bl细胞。
57.一种工程化细胞，所述工程化细胞表达如权利要求54-56中任一项所述的表面分子。
58.如权利要求57所述的工程化细胞，其中所述细胞是干细胞。
59.如权利要求57所述的工程化细胞，其中所述细胞是免疫细胞。
60.一种药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种如权利要求1-53和57-59中任一项所述的工程化细胞。
61.一种制备如权利要求1-53和57-59中任一项所述的工程化细胞的方法，所述方法包括将一种或多种编码所述表面分子的核酸引入细胞中，从而获得所述工程化细胞。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述方法进一步包括基于所述工程化细胞上所述表面分子的表达来选择所述工程化细胞。
63.一种富集一种或多种如权利要求1-53和57-59中任一项所述的工程化细胞的方法，所述方法包括基于所述结合部分或所述抑制部分来选择所述一种或多种工程化细胞。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述一种或多种工程化细胞是干细胞。
65.一种治疗感染了HIV的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求60所述的药物组合物。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述工程化细胞对于所述个体是自体的或同种异体的。
67.如权利要求65或权利要求66所述的方法，其中在施用所述药物组合物后，所述个体中至少约5％的所述T细胞表达所述表面分子。
68.如权利要求65-67中任一项所述的方法，其中在施用所述药物组合物后，所述个体中至少约20％的所述T细胞对HIV感染具有抗性。
69.如权利要求65-68中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用第二疗法。
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