CN116847858A - Sars cov-2感染性确定测定 - Google Patents

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Abstract

提供了用于表征来自受试者的生物样品(例如，包括感染源)的方法和组合物。方法可以包含检测在活细胞或有机体中连接但在不可存活细胞或有机体中降解并因此未连接的核酸的键，并且然后基于连接的和未连接的序列的数量表征所述受试者。

Description

SARS COV-2感染性确定测定
相关申请交叉引用
本专利申请要求于2021年2月16日提交的美国临时专利申请第63/150,050号的优先权，所述美国临时专利申请出于所有目的通过引用并入。
背景技术
SARS-CoV-2冠状病毒引起冠状病毒病2019(COVID-19)，并且可以通过呼吸道飞沫和直接人接触传播。SARS-CoV-2的传播可能来自具有重度、中度或轻度症状的个体，以及没有症状的个体。感染率取决于群体中感染的个体的传染性和暴露程度。虽然大多数人只有轻度症状甚至没有症状，但那些出现重度症状的人可能会受到包含肺、心脏和循环系统在内的器官损伤。
有三种主要类型的检测方法可以帮助检测具有活动性病毒感染的个体。核酸扩增测试(NAAT)，如使用聚合酶链式反应(PCR)的那些测试可以在症状前、无症状和有症状感染期间检测病毒本身。康复后，个体可能继续显示出使用PCR的低拷贝数的病毒。直接抗原测试检测病毒蛋白片段并对有症状的感染最有效，并且在提供快速结果方面最有用。相反，血清学(抗体)测试可以鉴定个体对病毒的免疫应答，并且可以表明先前感染。这些测试的分析性能和对其验证用途的遵守有助于提供高质量和可靠的结果。
各种卫生组织已经就如医院、长期护理设施、监狱系统、工厂以及高技术工作场所和职业等聚集环境提出了建议。对于那些处于社交距离有限的高风险环境中的人来说，频繁的测试有助于鉴定活性感染并监测先前感染的数量。然而，重返学校、工作和其它将人们聚集在一起的社会活动的政策，包含体育和娱乐仍然没有明确定义。除了隔离和测试疑似症状个体的一般指南外，在这些情况下的测试频率几乎没有达成共识。
测试的一个警告是，包含核酸测试在内的可用测试的灵敏度各不相同，这是由于大多数技术普遍无法准确定量SARS-CoV-2感染期间的病毒载量。此外，测试通常仅报告定性输出，包含阳性、阴性和无效结果，一些制造商限制了用户审查或报告潜在定量或相对定量值的能力。
发明内容
在一些实施例中，提供了一种表征受试者的感染源的方法。在一些实施例中，所述方法包括：提供来自所述受试者的包括感染源核酸的第一样品；将所述第一样品分割为多个第一分区；在所述第一分区中检测第一感染源核酸和第二感染源核酸的存在或不存在，其中所述第一感染源核酸和所述第二感染源核酸在活感染源核酸中共价连接；确定(a)含有与所述第二感染源核酸连接的所述第一感染源核酸的第一分区的数量，以及(b)含有所述第一感染源核酸，而不含所述第二感染源核酸的第一分区的数量或(c)含有所述第二感染源核酸，而不含所述第一感染源核酸的第一分区的数量(例如确定连接的第一和第二核酸的百分比(显示连接的信号的分区的数量/(显示连接的分区的数量+显示未连接的分区的数量，即第一感染源核酸和第二感染源核酸中的一个但不是两者)；以及基于(a)和(b)或(a)和(c)的确定来表征所述受试者体内的所述感染源。
在一些实施例中，所述确定包括确定(b)和(c)，并且所述表征基于(a)和(b)以及(c)的确定。
在一些实施例中，所述表征包括将(a)、(b)、(c)或其组合与一个或多个阈值进行比较。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：提供来自所述受试者的包括感染源核酸的第二样品，其中所述第二样品在比所述第一样品晚的时间点从所述受试者获得；将所述第二样品分割为多个第二分区；在所述第二分区中检测第一感染源核酸和第二感染源核酸的存在或不存在；确定(a′)含有与所述第二感染源核酸连接的所述第一感染源核酸的第二分区的数量，(b′)含有所述第一感染源核酸，而不含所述第二感染源核酸的第二分区的数量，以及(c′)含有所述第二感染源核酸，而不含所述第一感染源核酸的第二分区的数量；其中所述表征包括将(a)与(a′)、(b)与(b′)、(c)与(c′)或其组合进行比较。在一些实施例中，在获得所述第一样品后至少24小时(例如，1天至10天、1天至5天、1天至3天、1天至2天)从所述受试者获得所述第二样品。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在所述分区中检测对照核酸，并且其中所述确定包括将以下：(a)含有与所述第二感染源核酸连接的所述感染源核酸的第一分区的数量，以及(b)含有所述第一感染源核酸，而不含所述第二感染源核酸的第一分区的数量，和/或(c)含有所述第二感染源核酸，而不含所述第一感染源核酸的第一分区的数量相对于含有所述对照核酸的分区的数量进行归一化。
在一些实施例中，所述表征包括将所述感染源分类为活的或降解的。
在一些实施例中，所述感染源是病毒。在一些实施例中，所述感染源是选自由以下组成的组的病毒：SARS-CoV-2、流感和呼吸道合胞病毒(RSV)。在一些实施例中，所述感染源是SARS-CoV-2。在一些实施例中，所述第一感染源核酸包括核衣壳(N)基因N1的至少可检测部分，并且所述第二感染源核酸包括N基因N2的至少可检测部分。
在一些实施例中，所述感染源是细菌或支原体。
在一些实施例中，所述第一感染源核酸和所述第二感染源核酸在活感染源核酸中彼此相距100个至200,000个(例如100个至10,000个)核苷酸。
在一些实施例中，所述受试者是人。
在一些实施例中，所述分区是乳液中的液滴或微孔或纳米孔。
还提供了一种表征受试者的感染源的方法。在一些实施例中，所述方法包括：提供来自所述受试者的包括感染源核酸的第一样品；确定(a)与第二感染源核酸连接的第一感染源核酸的量，(b)与第二感染源核酸未连接的第一感染源核酸的量以及(c)任选地与第一感染源核酸未连接的第二感染源核酸的量；以及基于(a)、(b)和任选地(c)的确定来表征所述受试者体内的所述感染源。
附图说明
图1描绘了用于检测SARS-CoV-2N1和N2基因靶标中的键的表示。
图2描绘了轻度和重度Covid-19病例中SARS-CoV-2感染的假设表示，以及患者经历不同感染期时键检测变化的实例。
图3a至l。随着时间的推移，一位供体中连接的和未连接的病毒基因组的连续检测。示出了一个个体在covid-19感染期间的分区图。在分子阳性之前，经过症状前、无症状、有症状、无症状(恢复)和康复(分子阴性)，使用SARS CoV-2ddPCR测试分析鼻拭子样本。将样本记录为阳性(多于或等于20个拷贝的N1和N2)或阴性(少于20个拷贝的N1和N2)。图3b示出了代表连接的N1、N2(圆形)的簇的示例性标记，而N1和N2基因靶标分别是未连接的(矩形和六边形)。连接的和未连接的簇的变化代表了从完整的病毒基因组(圆形)到片段化基因组(矩形和六边形)的增加。不含有N1或N2的簇要么是空分区(菱形阴性)，要么仅含有人对照基因RPP30(梯形RPP30+)。
图4。N1和N2到RPP30的归一化拷贝，代表代表性供体1中的病毒载量。将N1和N2到RPP30的归一化拷贝计算为每微升反应的拷贝，以使用RPP30对照基因作为每天样本收集的归一化器来确定拷贝数的序列评分。病毒载量评分＝[(N1+N2)/2]/RPP30。
图5：查看图6a至e的关键，所述图示出了在三位供体中使用ddPCR在呼吸道样本中连续测量的SARS-CoV-2感染的各个期。
图6a至e。通过COVID-19感染的多位供体的代表性分区图。示出了covid-19感染期间个体的分区图。在分子阳性(第0天症状前)前、症状前(第2天)、有症状(第5天峰值分子计数)、无症状(恢复)和康复(分子阴性)，使用SARS CoV-2ddPCR测试分析鼻拭子样本。图6b(供体1)示出了代表连接的N1、N2(圆形)的簇的示例性标记，而N1和N2基因靶标分别是未连接的(矩形和六边形)。连接的和未连接的簇的变化代表了从完整的病毒基因组(圆形)到片段化基因组(矩形和六边形)的增加。不含有N1或N2的簇要么是空分区(菱形)，要么仅含有人对照基因RPP30(梯形)。
图7a至d。具有不同症状((a)无症状；(b)轻度有症状和(c、d)重度症状(需要住院治疗和/或吸氧))的供体的代表性基因连接的和部分连接的分区图。(a)供体4：感染期间无症状；示出了第3天和第6天。(b)供体2：轻度症状；示出了第5天和第9天。(c)供体5：重度症状；示出了第6天和第11天。(d)供体6：重度症状，示出了第9天和第12天。病毒载量和键的动力学在所有供体中是相似的(还参见表5)。图7a(第6天)示出了代表连接的N1、N2(圆形)的簇的示例性标记，而N1和N2基因靶标分别是未连接的(矩形和六边形)。连接的和未连接的簇的变化代表了从完整的病毒基因组(圆形)到片段化基因组(矩形和六边形)的增加。不含有N1或N2的簇要么是空分区(菱形阴性)，要么仅含有人对照基因RPP30(梯形RPP30+)。
图7a：供体4在covid期间无症状。2D图示出了连接的(左)和未连接的(右)基因组。
图7b：供体2显示出轻度症状。2D图示出了连接的(左)和未连接的(右)病毒基因组。
图7c：具有重度covid症状的两位供体。供体5(上图)和供体6(下图)。2D分区图示出了与病毒基因组相关的连接的(左)和未连接的(右)模式。
图8a、b描绘了在SARS-CoV-2感染后的多个时间点的康复供体的分区图。示出了covid-19感染期间个体的分区图。在分子阳性(第0天症状前)前、症状前(第2天)、有症状(第5天峰值分子计数)、无症状(恢复)和康复(分子阴性)，使用SARS CoV-2ddPCR测试分析鼻拭子样本。图6b(供体1)示出了代表连接的N1、N2(圆形)的簇的示例性标记，而N1和N2基因靶标分别是未连接的(矩形和六边形)。连接的和未连接的簇的变化代表了从完整的病毒基因组(圆形)到片段化基因组(矩形和六边形)的增加。不含有N1或N2的簇要么是空分区(菱形)，要么仅含有人对照基因RPP30(梯形)。
图9描绘了COVID-19临床样本中的键实例。2D图示出了COVID-19无症状或有症状个体的类似平均百分比键评分和聚类。图是示出代表连接的和未连接的N1和N2基因靶标的簇的示例性标记的标记。不含有N1或N2的簇要么是空分区(阴性)，要么仅含有人对照基因RPP30(RPP30+)。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。通常，本文所使用的命名法以及下文所描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学以及核酸化学与杂交中的实验室程序是本领域中众所周知并且通常采用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。技术和程序通常根据本领域的常规方法和各种一般参考文献来执行(通常参见，Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL)》，第2版(1989)纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)，所述文献通过引用并入本文)，所述常规方法和各种一般参考文献在本文档中通篇提供。
术语“扩增反应”是指以线性或指数方式扩增核酸的靶序列拷贝的任何体外方法。此类方法包含但不限于聚合酶链式反应(PCR)。
“扩增”是指如果反应的所有组分都完好无损，将溶液置于足以扩增多核苷酸的条件下的步骤。扩增反应的组分包含例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”通常指靶核酸的“指数”增加。然而，如本文所使用的，“扩增”也可以指核酸的选定靶序列的数量的线性增加，如通过循环测序或线性扩增获得的。
“聚合酶链式反应”或“PCR”是指一种以几何级数扩增靶双链DNA的特定区段或子序列的方法。PCR对于本领域技术人员来说是众所周知的；参见例如，美国专利第4,683,195号和第4,683,202号；以及《PCR方案：方法和应用指南》，Innis等人，编辑，1990。示例性PCR反应条件通常包括两步或三步循环。两步循环具有变性步骤，然后是杂交/延伸步骤。三步循环包括变性步骤，然后是杂交步骤，然后是单独的延伸步骤。
“引物”是指与靶核酸上的序列杂交并任选地作为核酸合成起始点的多核苷酸序列。引物可以有各种长度。在一些实施例中，引物的长度小于100个或50个核苷酸，例如，长度为约10个至约900个、约15个至约80个或约30个至85个至约30个核苷酸。用于扩增反应(例如，PCR)的引物的长度和序列可以基于本领域技术人员已知的原理来设计；参见例如，《PCR方案：方法和应用指南(PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications)》，Innis等人，编辑，1990。引物可以包含DNA、RNA或非天然核苷酸或完全由其形成。在一些实施例中，引物包括一个或多个经修饰的和/或非天然核苷酸碱基。在一些实施例中，引物包括标记(例如，可检测标记)。
核酸或其一部分与另一种核酸“杂交”，条件是在生理缓冲液中特定温度下非特异性杂交最小。在一些情况下，核酸或其部分与一组靶核酸之间共享的保守序列杂交。在一些情况下，如果存在至少约6个、8个、10个、12个、14个、16个或18个连续互补核苷酸，包含与多于一个核苷酸配偶体互补的“通用”核苷酸，则引物或其部分可以与引物结合位点杂交。可替代地，如果在至少约12个、14个、16个或18个连续互补核苷酸上存在少于1个或2个互补错配，则引物或其部分可以与引物结合位点杂交。在一些实施例中，发生特异性杂交的定义的温度是室温。在一些实施例中，发生特异性杂交的定义的温度高于室温。在一些实施例中，发生特异性杂交的定义的温度为至少约37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。
如本文所使用的，“核酸”是指DNA、RNA、单链、双链或更多高度聚集的杂交基序以及其任何化学修饰。修饰包含但不限于那些提供化学基团的修饰，所述化学基团合并了另外的电荷、极化率、氢键、静电相互作用、连接点和对核酸配体碱基或对整个核酸配体的功能。此类修饰包含但不限于肽核酸(PNA)、磷酸二酯酶基团修饰(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2′-位置糖修饰、5-位置嘧啶修饰、8-位置嘌呤修饰、外环胺处的修饰、4-硫尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代；主链修饰、甲基化、不寻常的碱基配对组合，如异碱基、异胞苷和异胍等。核酸还可以包含非天然碱基，例如硝基吲哚。修饰也可以包含3′和5′修饰，其包含但不限于用荧光团(例如，量子点)或另一个部分封端。
如本文所使用的，术语“分割”或“分割的”是指将样品分离为多个部分(例如，区室)或“分区”。分区可以是固体的或流体的。在一些实施例中，分区是固体分区，例如微通道、纳米孔或孔(即在多孔微量滴定盘中)。在一些实施例中，分区是流体分区，例如液滴。在一些实施例中，流体分区(例如，液滴)是不混溶流体(例如，水和油)的混合物。在一些实施例中，流体分区(例如，液滴)是被不混溶载体流体(例如，油)包围的水性液滴。
具体实施方式
发明人已经发现，细胞或有机体中不同序列之间的键可以用于评估细胞或有机体的活力。例如，在两个序列在其基因组中连接的细胞或有机体中，两个序列的键的检测和定量可以与细胞或有机体的活力和状态相关，从而允许基于观察到的键来表征(例如，分类)细胞或有机体。
作为一个实例，发明人已经发现，定量病毒SARS CoV-2中连接的序列的键可以是病毒的活力的指标，并且因此是携带病毒的人是否可能具有传染性的指标。例如，在初次感染后，SARS-CoV-2中的连接的序列的数量在感染的最初几天期间大幅增加，但在一些时刻，连接的序列的数量达到峰值，而未连接序列(即在分区中测量一个序列而不是另一个序列)的数量增加。因此，通过评估连接的序列的数量以及未连接的序列的数量，可以对从受试者获得的病毒进行分类并因此进行表征，例如将病毒分类为具有传染性，并且因此使受试者或多或少具有传染性。
如下面更详细地讨论的，数字扩增方法，例如液滴数字PCR(ddPCR)可以用于测量键。例如，通过将样品分割为多个分区，可以在不同的分区中分离单个核酸分子。如果这两个序列是共价连接的，例如在同一核酸上，那么分区应该包含两个连接的序列(或如果检测到多于两个序列，则更多)。相反，如果这两个序列不再连接，例如由于细胞的或有机体的核酸的降解，那么具有一个或另一个但不是两个序列的分区的比例将增加。细胞的或有机体的核酸的降解的检测和定量允许将样品中的细胞或有机体分类为活的或受胁迫的或以其它方式不可存活的。
任何疾病或遗传病状都可以用本文所描述的方法进行评估，其中核酸靶标在一种情况下连接并由于在另一种情况中降解而分离。在一些实施例中，连接的核酸序列出现在感染性有机体(即感染源)中，并且键的测量可以用于评估有机体在宿主中的活力。例如，携带有机体的受试者的相对传染性或治疗效果可以基于键的定量来评估。
示例性感染性有机体包含但不限于病毒、细菌、真菌和支原体。示例性病毒包含但不限于RNA病毒或DNA病毒，例如，单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、水痘-带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、巨细胞病毒、人疱疹病毒6、天花病毒、水疱性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒(包含但不限于SARS-CoV-2)、流感病毒A、流感病毒B、麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒、柯萨奇病毒(Coxsackie virus)、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、劳斯氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、呼肠孤病毒、黄热病病毒、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、寨卡病毒(Zika virus)、拉沙热病毒(Lassa fever virus)、东部马脑炎病毒(Eastern EquineEncephalitis virus)、日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis Encephalitis virus)、默里谷热病毒(Murray Valley fever virus)、西尼罗河病毒(West Nile virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、裂谷热病毒(Rift Valleyfever virus)、A型轮状病毒、B型轮状病毒、C型轮状病毒、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、猿免疫缺陷病毒、人T细胞白血病病毒1型、汉坦病毒(Hantavirus)、风疹病毒、猿免疫缺陷病毒、人类免疫缺陷病毒1型、人类免疫缺陷病毒2型；艾柯病毒(echovirus)；细小病毒；痘苗病毒；软疣病毒；JC病毒；以及虫媒病毒性脑炎病毒。在例如美国专利第9,944,998号中描述了可以分析键的另外的病毒。如本文所描述的，任何连接的序列，即在病毒生命周期的至少一部分期间连接的序列可用于监测键。
在一些实施例中，连接的序列来自SARS-CoV-2基因组。多种SARS-CoV-2核苷酸序列是可用的，包含Wang等人，《临床微生物学与传染病杂志(J Clin Microbiol InfectDis.)》2020年4月24日：1-7和NCBI SARS-CoV-2资源中所描述的那些。如实例所示，可以使用核衣壳(N)编码序列的N1与N2序列之间的键的检测(参见例如，图1)，然而，也可以使用SARS-CoV-2基因组中的其它连接的序列。例如，两个连接的序列可以来自例如另一种SARSCoV-2蛋白的编码序列，例如刺突(S)、膜(M)、开放阅读框(ORF)或包膜(e)蛋白。在一些实施例中，从第一编码序列检测第一序列，并且从第二编码序列检测第二序列，其中两个编码序列在活病毒的基因组的相同核酸上。
在一些实施例中，感染性有机体是细菌。示例性细菌可以包含但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、葡萄球菌(Staphylococcus)和链球菌(Streptococcal)。
两个连接的靶序列之间的距离可以是允许以期望的特异性和灵敏度监测被检测有机体的活力的任何长度。在一些实施例中，当连接时，两个靶核酸序列相距10个至10,000个核苷酸，例如，50个至5,000个核苷酸、100个至1000个核苷酸，例如至少10个、50个、100个、500个或1000个核苷酸，但在一些实施例中，不超过200,000个、100,000个、50,000个、25,000个、10,000个、5,000个、2,000个或1,000个核苷酸。如上所述，在一些实施例中，通过本文所描述的方法检测多于两个(例如，3个、4个或更多)核酸序列的键。上述距离也可以应用于有机体的连接的基因组中的第二与第三、或第三与第四等靶核酸序列之间。
检测到键的样品可以是任何生物样品。在感染性有机体的情况下，样品可以是已知已经(例如，已经接受了指示感染的临床测试)或疑似暴露于感染性有机体或被其感染的受试者。生物样品可以从任何生物有机体中获得，例如，动物、植物、真菌、病原体(例如，细菌或病毒)或任何其它有机体。在一些实施例中，生物样品来自动物，例如哺乳动物(例如，人或非人灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(例如，鸡)或鱼。生物样品可以是从生物有机体获得的任何组织或体液，例如，血液、血液级分或血液产品(例如，血清、血浆、血小板、红细胞等)、痰、唾液或支气管肺泡灌洗液(BAL)、组织(例如，肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如，原代培养物、外植体和转化的细胞、干细胞、粪便、尿液等。在一些实施例中，样品是包括细胞的样品。测试样本也可以在宿主外部存在的容器中，并且在例如废水或其它流出物中，或作为空气交换系统产生的雾化液滴，或在物体、墙壁、地板等的表面上进行检测。
在一些实施例中，样品与一种或多种防腐剂接触，直到其被分区并检测到键。可替代地，样品不需要与防腐剂接触。特别是当获得并比较多个样品时，只要每个样品以基本上相同的方式储存，就可以在样品之间进行核酸键出现频率的比较，而不管存在或不存在防腐剂。通常，样品在分割和检测之前不暴露于核酸酶或切割核酸的其它试剂，并且实际上可以包括整个完整的有机体本身(例如，病毒体)。
已经描述了使用分割和液滴(或其它分割)数字扩增检测核酸键的方法。参见例如，美国专利申请第2012/0322058号(然而应注意，与美国专利申请第2012/0322058号中的方法不同，本方法不包含引入切割样品核酸的试剂的步骤)。液滴数字PCR(ddPCR)将PCR样品分为分区(例如，油包水液滴)。参见例如，Hindson等人，2011，《分析化学(Anal.Chem.)》83：8604-8610；Pinheiro等人，2012，《分析化学》84：1003-1011。液滴支持模板分子(如果存在的话)的PCR扩增，并且使用能够特异性地从靶扩增子(即来自靶序列的扩增子)产生信号的试剂。例如，特异性扩增第一靶序列的引物对和特异性扩增与第一靶序列连接的第二靶序列的单独引物对存在或递送到每个分区。如果要产生更多的靶序列或对照序列，则可以包含另外的引物。示例性试剂还可以包含在结合相关靶序列时产生荧光信号的探针。示例性探针包含但不限于Taqman探针、Scorpion探针和分子信标。在一些实施例中，用于每个不同靶标的探针产生不同波长的信号，允许单独检测每一个。在PCR之后，读取来自每个液滴的信号，以确定原始样品中扩增的每个靶标的阳性液滴的数量(包含具有多个不同靶标的分区以及仅具有单个或没有靶标信号的部分)。
例如，在已公布的专利申请WO 2010/036,352、US 2010/0173,394、US 201I/0092,373和US2011/0092,376中描述了用于分割的方法和组合物。多个分区可以在多个乳液液滴或多个纳米孔、微孔等中。
在一些实施例中，一种或多种试剂在液滴形成期间或在液滴被形成之后被添加到液滴。用于将试剂递送到一个或多个分区的方法和组合物包含本领域已知的微流体方法；液滴或微胶囊组合、聚结、融合、破裂或降解(例如，如U.S.2015/0027,892；US 2014/0227,684；WO 2012/149,042和WO 2014/028,537中所描述的)；液滴注射方法(例如，如WO 2010/151,776中所描述的)；以及其组合。
如本文所描述的，分区可以是皮可孔、纳米孔或微孔。分区可以是皮可室、纳米室或微反应室，如皮可胶囊、纳米胶囊或微胶囊。分区可以是皮可通道、纳米通道或微通道。分区可以是液滴，例如乳液液滴。
在一些实施例中，分区是液滴。在一些实施例中，液滴包括乳液组合物，即不混溶流体(例如，水和油)的混合物。在一些实施例中，液滴是被不混溶载体流体(例如，油)包围的水性液滴。在一些实施例中，液滴是被不混溶载体流体(例如，水溶液)包围的油液滴。在一些实施例中，本文所描述的液滴是相对稳定的，并且在两个或更多个液滴之间具有最小的聚结。在一些实施例中，由样品产生的小于0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的液滴与其它液滴聚结。乳液也可能具有有限的絮凝，即分散相以薄片形式从悬浮液中出来的过程。在一些情况下，此类稳定性或最小聚结维持至多4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、24小时或48小时或更长时间(例如，在室温下，或在约0℃、2℃、4℃、6℃、8℃、10℃或12℃下)。在一些实施例中，液滴是通过使油相流过水性样品或试剂而形成的。
油相可以包括氟化基础油，所述氟化基础油可以通过与氟化表面活性剂(如全氟化聚醚)组合而另外稳定。在一些实施例中，基础油包括HFE 7500、FC-40、FC-43、FC-70或另一种常见的氟化油中的一种或多种。在一些实施例中，油相包括阴离子含氟表面活性剂。在一些实施例中，阴离子含氟表面活性剂是Krytox铵(Krytox AS)、Krytox FSH的铵盐或Krytox FSH的吗啉代衍生物。Krytox-AS可以以约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)的浓度存在。在一些实施例中，Krytox-AS的浓度为约1.8％。在一些实施例中，Krytox-AS的浓度为约1.62％。KrytoxFSH的吗啉代衍生物可以以约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)的浓度存在。在一些实施例中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度为约1.8％。在一些实施例中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度为约1.62％。
在一些实施例中，油相进一步包括用于调节油特性(如蒸汽压力、粘度或表面张力)的添加剂。非限制性实例包含全氟辛醇和1H，1H，2H，2H-全氟癸醇。在一些实施例中，将1H，1H，2H，2H-全氟癸醇添加到约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)的浓度。在一些实施例中，将1H，1H，2H，2H-全氟癸醇添加到约0.18％(w/w)的浓度。
在一些实施例中，样品被分区成或至少分区成500个分区、1000个分区、2000个分区、3000个分区、4000个分区、5000个分区、6000个分区、7000个分区、8000个分区、10,000个分区、15,000个分区、20,000个分区、30,000个分区、40,000个分区、50,000个分区、60,000个分区、70,000个分区、80,000个分区、90,000个分区、100,000个分区、200,000个分区、300,000个分区、400,000个分区、500,000个分区、600,000个分区、700,000个分区、800,000个分区、900,000个分区、1,000,000个分区、2,000,000个分区、3,000,000个分区、4,000,000个分区、5,000,000个分区、10,000,000个分区、20,000,000个分区、30,000,000个分区、40,000,000个分区、50,000,000个分区、60,000,000个分区、70,000,000个分区、80,000,000个分区、90,000,000个分区、100,000,000个分区、150,000,000个分区或200,000,000个分区。
在一些实施例中，所产生的液滴在形状和/或尺寸上基本上是均匀的。例如，在一些实施例中，液滴的平均直径基本上是均匀的。在一些实施例中，所产生的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施例中，所产生的液滴的平均直径小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米或小于约25微米。在一些实施例中，所产生的液滴在形状和/或尺寸上是不均匀的。
在一些实施例中，所产生的液滴在体积上基本上是均匀的。例如，液滴体积的标准偏差可以小于约1皮升、5皮升、10皮升、100皮升、1nL或小于约10nL。在一些情况下，液滴体积的标准偏差可以小于平均液滴体积约10％至25％。在一些实施例中，所产生的液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL或约50nL。
所述方法涉及确定(a)含有与第二核酸连接的第一核酸的第一分区的数量，(b)含有第一核酸，而不含第二核酸的第一分区的数量，以及(c)含有第二核酸，而不含第一核酸的第一分区的数量。(a)的数量可以例如确定为显示来自两个核酸序列的探针的信号的分区的数量。任选地，与从两个探针的信号的随机分散所预期的相比，在一个分区中具有两个探针信号的分区过多可以表明样品含有具有至少两个连接的靶核酸序列的多核苷酸。换言之，与如果靶标随机分布在分区中的预期相比，可以评估具有特定靶标组合的分区的数量是否以及在多大程度上统计过量。此类分区过多的程度可以用于估计连接的靶标的数量。
在一些实施例中，所述方法进一步包括列举包括参考核酸序列的分区的数量，所述参考核酸序列可以用于将所测定的第一核酸、第二核酸和任何其它核酸序列的数量归一化。在一些实施例中，将第一核酸和第二核酸的拷贝数量相对于参考序列的出现次数归一化。在一些实施例中，样品来自人，并且参考核酸序列是RPP30基因的至少一部分。例如，可以将第一核酸和第二核酸相对于RPP30归一化，例如，按反应的体积(例如，20微升)计算，以使用RPP30对照基因作为每天样本收集的归一化器来确定拷贝数的序列评分(例如，评分＝[(N1+N2)/2]/RPP30，其中N1和N2表示SARS-CoV-2的N1和N2，但可以是如本文所描述的任何第一和第二靶核酸)。
本文所描述的方法可以在一个样品或多个样品上进行(例如，随着时间的推移，来自同一受试者，例如，每天一次或每隔一天一次)，从而允许通过评估感染源的相对活力或降解来表征受试者体内的感染源。在一些实施例中，从受试者获得单个样品，并且如上所详述的对两个或更多个靶核酸序列的键进行定量，例如确定含有连接的序列的分区的数量和未连接的序列的数量。在这种情况下，可以将连接的或未连接的序列或两者的分区的结果数量、或连接的与未连接的比率、或连接的或未连接的与总体(连接的加未连接的)的比率(其中每一个可以如本文所描述的进行归一化)与一个或多个阈值进行比较以对结果进行分类。因此例如，可以基于与未连接的序列连接的绝对量或与未连接的序列连接的比率或连接的或未连接的与总体(连接的加未连接的)的比率来确定用于将传染性个体与非传染性个体分离的阈值，然后可以将此阈值与来自感染的个体的数据进行比较以表征感染源，并且从而预测个体是否处于疾病的传染期。作为实例，相对较高数量的连接的靶序列可以表明感染源是活的，并且例如携带其的个体具有传染性，或者至少比数量较低时更具传染性。在一些实施例中，未连接的靶序列(例如，其中分区含有一个但不含有第二个，通常是连接的靶序列)的出现增加可以表明感染源在受试者体内已经降解，并且因此受试者的传染性可能较低。精确阈值可以基于用户期望的灵敏度和特异性来选择，并且可以例如基于在一系列感染的个体经历感染性疾病的不同期时对其结果的测量和平均来确定。
在一些实施例中，随着时间的推移，可以从受试者获得两个或更多个(例如，2个、3个、4个、5个或更多个)样品。在这些实施例中，可以将连接的或未连接的或两者的数量或连接的与未连接的比率或连接的或未连接的与总阳性(连接的加未连接的)[键百分比]靶序列的比率与如上文所讨论的一个或多个阈值进行比较，或者来自一个样品的连接或未连接或两者的数量、连接与未连接的靶序列的比率或连接或未连接的与总阳性(连接加未连接的)的比率中的一个或多个可以与第二(或更多个)样品进行比较。后一种选择可能是有用的，例如，随着时间的推移，用于表征受试者体内的感染源，例如，由此监测感染过程，何时受试者可能具有传染性或不具有传染性，或者例如，受试者对治疗的应答有多好。
在一些实施例中，向受试者提供由如何通过本文所描述的方法对感染源进行分类所确定的治疗或护理过程。例如，如果确定受试者携带活感染源(例如，高于阈值)，则可以用抗生素、抗病毒或其它药剂治疗受试者，所述药剂将改善感染或由感染引起的症状。
还提供了一种用于执行本文所公开的方法的系统。所述系统可以包括液滴发生器，所述液滴发生器被配置成形成包含核酸的水相的液滴。所述系统还可以包括热循环器和检测器，所述检测器被配置成从单个液滴收集扩增数据(例如，不同波长处的信号以检测不同的扩增的核酸序列)。所述系统可以进一步包括处理器。处理器可以被配置成确定各种靶核酸的阳性分区的数量，以及用于对数据进行归一化，并且任选地用于将数据与阈值或来自不同样品的数据进行比较，所述数据可以存储在存储器中。在一些实施例中，所述系统包括Bio-Rad QX200(或QXDx AutoDG或QX ONE)液滴数字PCR系统(加利福尼亚州的赫克力士公司(Hercules，Calif.))。
一方面，提供了一种计算机程序产品，其包括存储程序代码的非暂时性机器可读介质，所述程序代码在由计算机系统的一个或多个处理器执行时使计算机系统实现如本文所描述的方法的至少一个步骤，例如将来自第一样品的包括连接的或未连接的靶核酸序列的分区的数量与阈值进行比较，或者将数量与来自第二样品的此类数量进行比较。
实例
已经研究了液滴数字PCR(ddPCR)在定量病毒载量以及检测症状前、有症状、无症状和康复个体的病毒核酸质量方面确定绝对病毒拷贝的效用。示出了在SARS-CoV-2基因组N1和N2的核衣壳(N)基因内存在两个近端扩增区的系列测试的多个实例。本文所提供的数据表明，使用ddPCR的绝对定量允许精确测量病毒拷贝数量，并且此外，扩增子键水平随着感染的进展而跟踪。
在症状前个体中，观察到高度连接的N1和N2 PCR基因产物，随着病毒拷贝伴随症状的出现而增加，所述基因产物维持这种状态。在具有轻度症状或未报告症状的个体中，类似地观察到键和病毒载量上升。随着个体的恢复，键的程度迅速下降。病毒基因组可能会随着个体进入康复期而降解并被清除。研究结果表明，尽管在感染的所有期都有一些转变，但SARS-CoV-2病毒在感染早期是完整的并积极复制，并且大幅超过了峰值病毒载量时的降解速率。这种复制率在感染的前2天至7天很快，并且反映在高度完整的病毒(高键)中。按照合同，病毒载量和N1与N2之间的键迅速减少，表明随着感染的减弱和个体进入康复期，基因组降解。
这是第一份详细观察SARS-CoV-2感染的个体在可定量病毒拷贝数的背景下基因键的系列变化的报告。希望这些方法在其它疾病中有广泛的应用，特别是由人病原体引起的那些疾病。
材料和方法：
用于SARS-CoV-2ddPCR测试的FDA EUA方法由伯乐公司(Bio-Rad)开发，并且由佰欧迪塞克斯公司(Biodesix)商业化，用于佰欧迪塞克斯公司的集中式CAP/CLIA/CLEP认证实验室。简而言之，将鼻拭子样本收集到运输介质中，并且通过快递运输到实验室通过ddPCR进行测试。将病毒样本灭活，提取RNA，并且然后在分区(液滴)荧光读取器(例如QX-200；伯乐公司)上进行液滴产生、热循环和分析。
SARS-CoV-2测定包含基于当前经验证的CDC测定的单管三重测定。具体而言，所述测定能够检测病毒靶标(N1——核衣壳1以及N2——核衣壳2)以及对照靶标(RPP30——编码RNase P的人基因)。主要样本类型为鼻拭子样本，并且佰欧迪塞克斯公司使用的样本已被验证可以与多种运输介质一起使用，包含但不限于分子运输介质、Amies介质、Norgen总核酸保存管、盐水，以及各种通用运输介质(UTM)/病毒运输介质(VTM)类型，包含Hardy DiagnosticsTM VTM、/>VTM、MicroTestTM M4RTTM、/>VTM、MedSchenkerTM智能运输介质和AccuViral UTM。
对每批临床样品进行三次对照。人细胞系(A549；ATCC)用于RNA提取监测；将商业来源的由基因组DNA背景中的合成核衣壳RNA转录物组成的标准品(Exact，伯乐公司SKUCOVID19)用于阳性RT-ddPCR对照；并且使用无模板阴性对照(无核酸酶的水)来监测RT-PCR反应的潜在污染。
使用来自齐莫研究公司(Zymo Research)的快速RNA病毒96试剂盒(目录号R1040、R1041)提取RNA。每批都对提取对照样品进行处理。将300μL的运输介质与300μL灭活溶液(DNA/RNA屏蔽，齐莫研究公司)混合。将200μL的样品/屏蔽混合物与400μL病毒RNA缓冲液合并，并且应用于96孔旋转柱板上。将板以2200x g离心5分钟。将柱用500μL病毒洗涤缓冲液洗涤两次，并且用100％乙醇洗涤一次；在每次洗涤后，将板以2200x g离心5分钟，并且将流过液丢弃。然后将板以2200x g旋转另外2分钟以将柱干燥。将75μL不含核酸酶的水应用于每个柱，并且将板以2200x g离心5分钟以洗脱RNA。将RNA保持在冰上，直到用于ddPCR，然后储存在超低温冷冻室中。
对于单柱提取(来自齐莫研究公司的柱，D4014)，所有体积都相同，但离心速度和时间不同。对于所有步骤，柱均以10,000x g旋转：2分钟用于结合、30秒用于每次洗涤，并且2分钟用于干燥旋转。将纯化的RNA洗脱到1.5mL管中并保持在冰上，直到用于ddPCR，然后储存在超低温冷冻室中。
反应混合物为5.5μL RNA和16μL PCR主混合物(表1)；其中20μL用于在QX200液滴发生器(伯乐公司)上产生液滴。每批处理一个阳性和阴性对照。将液滴转移到96孔PCR板上，并且在组合的RT-ddPCR热循环程序上运行(表2)。热循环后，将板转移到QX200液滴读取器(伯乐公司)中。分析来自读取器的结果，以确定在每个20μL PCR中检测到的N1、N2和RPP30的拷贝数量。基于每个靶标的阈值产生2D液滴簇的标签。
N1和N2的平均键百分比计算如下：
平均值((100×(N1键值)/(N1拷贝/μL))、(100×(N2键值)/(N2拷贝/μL)))；“键值”＝连接的分子/μl。
表1.用于检测COVID-19和RPP30的PCR主混合物。
表2.COVID-19RT-ddPCR反应的PCR程序。
表3.在一位代表性供体中对SARS-CoV-2N1和N2拷贝以及人对照基因RNase P(RPP30)的连续检测。在分子阳性(第0天)之前，经过感染的症状前、无症状、有症状、无症状(恢复)和康复(分子阴性)期，使用SARS CoV-2ddPCR测试分析鼻拭子样本。A.示出了病毒N基因和人对照基因RPP30的总拷贝数；B示出了在感染过程期间N1和N2基因的键％。
这些数据显示，从感染前到无症状和有症状期，病毒拷贝数都在增加。与此同时，观察到N1和N2的键百分比增加，在100％处达到峰值，并且然后随着病毒在此代表性供体序列中被清除而迅速下降。这些数据在QuantaSoft的2D图(图3a至c)和计算的病毒载量(图4)中直观示出。病毒载量(表4)和基因组质量(图3b至e)的增加可能代表病毒传播性和感染性的可能性增加。
已知有症状个体具有高度传播性，并且临床病例的实例在图11中示出。无论这些临床病例是被诊断为有症状还是无症状，都观察到类似的分子键簇，这表明任一病例都可能具有感染性。此报告另外示出了一种分子机制，所述分子机制清楚地表明诊断的其它期在分子上与有症状个体相似，并且在症状前(图3b；第2天)和无症状(图6b、c)的个体中检测到复制的完整基因组。由于具有相似的病毒载量和大量完整基因组，特别是在感染早期，这些个体同样有可能传播病毒。示出了使用连续ddPCR结果的连接的(感染)和未连接的(降解的基因组)的其它实例。供体2和3的结果(图6和表4)示出了与在供体1的完整连续系列中观察到的相似的结果(图3、图6、表3、4)。可以看到病毒载量在活跃感染阶段增加，并且然后迅速减少。所有供体的键曲线在活跃感染期间是高的，而在峰值病毒载量之后是低的(图3、6和表3、4)。这些数据共同证明了一种常见且可测量的表型，所述表型可以通过绝对拷贝数、病毒载量、簇分布和使用ddPCR产生的键值的组合区分非常早期、早期、峰值和晚期感染。
进一步描述了无症状、轻度症状和严重症状(需要住院治疗和/或吸氧)的聚类表型(图7，以及病毒载量和键计算(表5)。对于有症状或没有症状的患者，病毒载量和键的动力学是相似的(也参见图7)，并且强调需要进行如本研究中所描述的分子分析，以通过具有连接的、有复制能力的基因组来鉴定可能感染的患者。还进行了对康复供体的研究，试图在感染后期和康复期间鉴定潜在的感染性基因组(图8)。在此示出了最近SARS-CoV-2感染后多个时间点的三个个体病例的实例。即使在恢复后的这些早期时间点，尚未观察到病毒载量，也没有明显的键。病毒复制和键的影响仅限于病毒传播性最强的感染周期，并且进一步表明恢复的个体较少或不太可能感染之前所感染的同一病毒株。
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提供上述实例是为了说明本发明，但不是为了限制其范围。本发明的其它变体对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的，并且被所附权利要求所涵盖。本文引用的所有出版物、数据库、互联网资源、专利、专利申请和登录号均出于所有目的通过引用整体并入本文。

Claims (16)

1.一种表征受试者体内的感染源的方法，所述方法包括：
提供来自所述受试者的包括感染源核酸的第一样品；
将所述第一样品分割为多个第一分区；
在所述第一分区中检测第一感染源核酸和第二感染源核酸的存在或不存在，其中所述第一感染源核酸和所述第二感染源核酸在活感染源核酸中共价连接；
确定(a)含有与所述第二感染源核酸连接的所述第一感染源核酸的第一分区的数量，以及(b)含有所述第一感染源核酸，而不含所述第二感染源核酸的第一分区的数量或(c)含有所述第二感染源核酸，而不含所述第一感染源核酸的第一分区的数量；以及
基于(a)和(b)或(a)和(c)的确定来表征所述受试者体内的所述感染源。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述确定包括确定(b)和(c)，并且所述表征基于(a)和(b)以及(c)的确定。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述表征包括将(a)、(b)、(c)或其组合与一个或多个阈值进行比较。
4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
提供来自所述受试者的包括感染源核酸的第二样品，其中所述第二样品在比所述第一样品晚的时间点从所述受试者获得；
将所述第二样品分割为多个第二分区；
在所述第二分区中检测第一感染源核酸和第二感染源核酸的存在或不存在；
确定(a′)含有与所述第二感染源核酸连接的所述第一感染源核酸的第二分区的数量，(b′)含有所述第一感染源核酸，而不含所述第二感染源核酸的第二分区的数量，以及(c′)含有所述第二感染源核酸，而不含所述第一感染源核酸的第二分区的数量；
其中所述表征包括将(a)与(a′)、(b)与(b′)、(c)与(c′)或其组合进行比较。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在获得所述第一样品后至少24小时(例如，1天至10天、1天至5天、1天至3天、1天至2天)从所述受试者获得所述第二样品。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其进一步包括在所述分区中检测对照核酸，并且其中所述确定包括将以下：
(a)含有与所述第二感染源核酸连接的所述感染源核酸的第一分区的数量，以及
(b)含有所述第一感染源核酸，而不含所述第二感染源核酸的第一分区的数量，和/或
(c)含有所述第二感染源核酸，而不含所述第一感染源核酸的第一分区的数量
相对于含有所述对照核酸的分区的数量进行归一化。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述表征包括将所述感染源分类为活的或降解的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述感染源是病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述感染源是选自由以下组成的组的病毒：SARS-CoV-2、流感和呼吸道合胞病毒(RSV)。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述感染源是SARS-CoV-2。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一感染源核酸包括核衣壳(N)基因N1的至少可检测部分，并且所述第二感染源核酸包括N基因N2的至少可检测部分。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述感染源是细菌或支原体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一感染源核酸与所述第二感染源核酸在所述活感染源核酸中彼此相距100个至10,000个核苷酸。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述分区是乳液中的液滴或微孔或纳米孔。
16.一种表征受试者体内的感染源的方法，所述方法包括：
提供来自所述受试者的包括感染源核酸的第一样品；
确定(a)与第二感染源核酸连接的第一感染源核酸的量，(b)与第二感染源核酸未连接的第一感染源核酸的量以及(c)任选地与第一感染源核酸未连接的第二感染源核酸的量；以及
基于(a)、(b)和任选地(c)的确定来表征所述受试者体内的所述感染源。
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