CN116837031A - 一种生产慢病毒的低背景稳定生产细胞株的构建及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用基于Csy4改造的低背景Tet‑ON‑3G系统打造一种慢病毒稳转包装细胞系及慢病毒制备方法，用于包括免疫细胞治疗中的应用。本发明中用于生产慢病毒的方法，不再使用质粒，简化了慢病毒生产流程，极大地降低了生产成本。诱导系统对诱导剂的反应灵敏，低背景表达的同时，最大水平的诱导目的基因的表达。该慢病毒包装细胞系生产慢病毒能极大的提高载体的均一性及表达量，批间差异小，工艺易放大，病毒滴度高，杂质含量少，病毒泄露低。克服了目前慢病毒载体生产泄漏率高、工艺难放大、杂质难纯化的局限，在包括免疫治疗领域中广泛应用。

Description

一种生产慢病毒的低背景稳定生产细胞株的构建及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学和分子生物学领域，主要是细胞治疗领域，尤其是涉及一种基于转录后调控的稳定生产慢病毒的生产系统及其在免疫细胞治疗中的应用。
背景技术
慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒科，是具有包膜的双链RNA病毒。其典型特征在于其能够将RNA基因组逆转录为cDNA，cDNA又能稳定整合至宿主细胞基因组中。病毒粒的直径一般为100nm左右，两条正链RNA基因组被包被在蛋白衣壳(CA)中，该衣壳还包含反转录蛋白酶(RT)，整合酶(IN)和蛋白酶(PR)，这些酶是病毒感染所必需的。基质蛋白(MA)被来源于宿主细胞膜插有包膜糖蛋白的腹膜所包围。锚定在该包膜上的是病毒包膜糖蛋白(Env)，其负责识别宿主细胞上的特异性受体并且启动感染过程。
慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env 3个基本基因结构外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。最佳的载体应该是小型化、自身失活的载体，为此，删除病毒基因组中某些基因和病毒蛋白，使用不同的表达盒表达复制酶和包膜糖蛋白，由非慢病毒属提供包膜糖蛋白。水泡性口炎病毒的糖蛋白(vesicularstomatitis virus glycoprotein,VSVG)是最常用的病毒包膜，基于慢病毒的用途不同，许多有独特特性的包膜糖蛋白也可以作为慢病毒的包膜。
与其他逆转录病毒载体相比，慢病毒(Lentivirus)载体具有能同时感染分裂和非分裂的细胞、携带的外源基因在宿主中表达时间长、毒性低、可携带的外源基因片段大、不易诱发宿主免疫反应等优点，在靶细胞的免疫治疗中具有较好的应用前景。慢病毒介导的免疫治疗，不但可以用于治疗肿瘤，还可以用于治疗感染性疾病、自身免疫性疾病及器官移植排斥反应。
目前慢病毒载体的制备方法一般是在哺乳动物宿主细胞内(通常是来源于鼠或人的细胞内)，分别转入gag基因、pol基因、rev基因、包膜糖蛋白基因，以及携带目核酸片段的病毒基因组转录盒，慢病毒基因组包装及转染所需的各种顺式作用序列。通过将含上述基因的构建体比如质粒，瞬时转染到上述宿主细胞中瞬时生产慢病毒载体。但是目前的生产工艺生产的慢病毒滴度低、杂质残留多、工艺难放大、病毒批次间产毒量不稳定、且价格昂贵，纯化难度大。因此，通过在宿主细胞基因组中稳定整合gag基因、pol基因、rev基因、包膜糖蛋白基因等形成稳定生产细胞系(producer cell line)以实现慢病毒的持续生产，并使生产的慢病毒滴度高，杂质含量少是大势所趋。然而，构建慢病毒载体稳定生产细胞系的技术难度较大。已有的方法构建的稳定生产细胞系都有高泄漏表达，而高泄露表达会导致生产细胞系不稳定且在细胞培养扩增时因包装基因泄露表达导致的细胞毒性影响细胞的生长，难以达到工艺放大的要求。
由于基因稳定插入效率低，通常需要引入大量的抗性基因进行同步或分步筛选，筛选过程很多在含血清贴壁培养条件下进行，筛选后细胞系不一定能适应无血清培养基悬浮培养条件，不符合国际上生物制药的技术发展趋势和安全性要求。
因此，本领域中目前迫切需要构建一种高效的低背景的稳定生产慢病毒载体的生产细胞系的方法。本发明提供的一种利用基于Csy4改造的低背景Tet-ON 3G系统打造一种慢病毒稳转包装细胞系及慢病毒制备方法，不仅在传代、产毒及遗传基因拷贝数方面应该都比较稳定，且该慢病毒包装细胞系生产的慢病毒滴度高，杂质含量少，病毒零泄露，工艺易放大，在包括免疫治疗领域中广泛应用。
发明内容
本发明的目的是构建一种慢病毒稳定包装细胞系及其慢病毒的制备方法。通过转染和单克隆筛选获得含慢病毒包装所需的Gag、Pol、Rev、病毒包膜蛋白的编码序列和Tet-On-3G反式激活物rtTA3G基因序列的稳转细胞株。经血清逐量减少法驯化，获得稳转的悬浮细胞株。通过将携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒转染上述细胞，获取能稳定表达慢病毒，在传代、产毒和遗传基因拷贝数方面都比较稳定的细胞株。通过基于Csy4修饰的转录后调控系统的调控，该体系生产的慢病毒滴度高，杂质含量少，泄露率低，基本无泄露现象，工艺易放大，很好的解决了目前慢病毒包装存在的问题。
慢病毒基因组是正链RNA，具体是指在构建慢病毒载体时，能包装进病毒内的所有核糖核酸片段。一般包含慢病毒包装和转导所必要的序列，如ψ包装信号、5’和3’长末端重复序列(LTR)、5’端非翻译区域、中心多嘌呤束(cPPT)片段及其他应答元件。缺少一段或多段以上片段可能会严重影响慢病毒的包装或转导效率。在制备慢病毒载体时，携带目的核酸片段的病毒基因组RNA片段一般是通过构造携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒来实现的。转录盒包含具有启动子功能的核酸序列、病毒RNA基因组对应的DNA序列、调控转录终止的多聚腺苷酸信号序列等。在制备慢病毒载体时，载有携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒的构建体在被递送到宿主细胞后，在细胞质中被自身携带的反转录酶反转录为DNA，再进入细胞核并整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录为mRNA，回到细胞质中，表达目的蛋白。
由于慢病毒载体存在表达泄露现象，在本发明中，通过Tet-On-Csy4诱导表达系统来控制转入宿主细胞的核酸构建体中的相关基因的转录和表达。在本发明中，可用的诱导表达系统是基于第三代Tet-On诱导表达系统中TRE3G序列中多拷贝连续TetO操作子序列。
本发明中慢病毒载体包括的Gag、Pol和Rev基因的序列、Tet-On-3G反式激活物的基因序列、病毒包膜蛋白的编码序列、以及携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列。
所述慢病毒的Gag、Pol和Rev基因是HIV-1病毒的Gag、Pol和Rev基因；所述病毒包膜蛋白选自两性逆转录病毒包膜蛋白、狒狒猿白血病病毒包膜蛋白、猫白血病病毒(RD114)包膜蛋白、猫内源反转录病毒包膜蛋白、猫免疫缺陷病毒包膜蛋白、淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒包膜蛋白、嗜性逆转录病毒包膜蛋白、莫科拉病毒包膜蛋白、尼帕病毒包膜蛋白、基孔肯雅病毒包膜蛋白、罗斯河病毒包膜蛋白、塞姆利基森林病毒包膜蛋白、信德比斯病毒包膜蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒包膜2蛋白、流感病毒包膜蛋白、禽瘟病毒包膜蛋白、昌迪普拉病毒和皮里病毒包膜蛋白、西部马脑炎病毒包膜蛋白、猿免疫缺陷病毒包膜蛋白、马传染性贫血病毒包膜蛋白、埃博拉病毒包膜蛋白、狂犬病病毒包膜蛋白、杆状病毒包膜蛋白、丙型肝炎病毒包膜蛋白、麻疹病毒包膜蛋白、鼠白血病病毒的兼嗜性4070A和10A1、长臂猿白血病病毒的包膜蛋白、人免疫缺陷病毒的gp120和水疱性口炎病毒的糖蛋白(VSVG)，优选地，所属病毒包膜蛋白为水疱性口炎病毒的糖蛋白(VSVG)。
本发明中所述的调控系统为基于Csy4转录后调控的Tet-On3G系统。它是将序列特异性的核糖核酸内切酶Csy4作为转录后调控的中介物。将Csy4的识别序列插入到目标基因的5’UTR区域，并使用一个替代启动子来控制Csy4的表达。Csy4切割mRNA可以抑制基因表达，而在Csy4切割后的mRNA的3’端插入Csy4识别序列可以维持mRNA的稳定性。为了避免添加诱导剂后不必要的Csy4的表达对细胞的毒性，在基因中加入了TRE3G启动子驱动的Csy4反向表达盒。在加入诱导剂后，通过TRE3G-反向Csy4盒产生的高水平的反义Csy4mRNA将与Csy4盒产生的正义Csy4mRNA形成dsRNA，从而敲除Csy4的表达。
本发明中Gag、Pol和Rev基因的序列位于Gag/Pol质粒构建体上，病毒包膜蛋白的编码序列位于VSVG质粒构建体上，携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列位于另一个质粒构建体上。
所述Gag/Pol质粒除包含Gag、Pol和Rev基因外，还包含有TRE3G启动子、序列特异性的核糖核酸内切酶Csy4识别位点、hPGK启动子、嘌呤霉素抗性基因、TRE3G启动子驱动的Csy4反向表达盒、hPGK启动子驱动的Csy4表达盒、cPPT/CTS元件、RRE元件和多腺苷酸化信号等。
根据所述的慢病毒稳定生产细胞系，其中VSVG质粒除了包含VSVG基因，还包括有TRE3G启动子、序列特异性的核糖核酸内切酶Csy4识别位点、hPGK启动子、杀稻瘟菌素抗性基因、TRE3G启动子驱动的Csy4反向表达盒、hPGK启动子驱动的Csy4表达盒、cPPT/CTS元件、RRE元件和多腺苷酸化信号等。
所述稳定生产细胞系中，主质粒除了CDS序列片段外，还包含有TRE3G启动子、序列特异性的核糖核酸内切酶Csy4识别位点、hPGK启动子、TRE3G启动子驱动的Csy4反向表达盒、hPGK启动子驱动的Csy4表达盒、cPPT/CTS元件、RRE元件和多腺苷酸化信号等。
病毒包膜蛋白VSVG和Rev基因均具有明显的细胞毒性，尤其是Rev基因，不仅毒性强，而且还调控通常含有Rre序列的Gag/Pol基因的表达，更需要受到诱导表达系统的严格控制，否则所有高表达的细胞株都会死亡难以形成稳定生产细胞系，且产毒滴度低。在本发明中，所述Gag/Pol、Rev和病毒包膜蛋白基因VSVG的编码序列中的一种或多种的转录在Tet-On3G-Csy4诱导表达系统的控制下。优选地，所述Gag/Pol基因、Rev基因、VSVG基因的表达是受控的。
本发明中，反义Csy4的表达是TRE3G启动子驱动。
本发明中，一种利用基于Csy4改造的低背景Tet-ON-3G系统的慢病毒稳转包装细胞系的方法，该方法包括:
(1)分别以Gag/Pol质粒、VSVG质粒为主质粒，包装慢病毒；
(2)将VSVG质粒包装的慢病毒转导宿主细胞。
(3)加入第一抗生素，用有限稀释法进行阳性筛选，得到第一阳性的单克隆细胞。
(4)鉴定第一阳性单克隆细胞。
(5)再将Gag/Pol质粒包装的慢病毒转导步骤(4)筛选鉴定出的第一阳性单克隆细胞。
(6)加入第二抗生素，有限稀释法进行第二次筛选，得到第二阳性单克隆细胞，经半定量PCR鉴定后，即确定为慢病毒稳定包装细胞系。
优选地，其中第一抗生素为嘌呤霉素，其用量分别为0.25～3ug/mL。更优选地，所述嘌呤霉素为2ug/mL；第二抗生素为嘌呤霉素和杀稻瘟菌素的混合物，其用量分别为0.25～3ug/mL和10～100ug/mL；更优选地，所述嘌呤霉素和杀稻瘟菌素的用量分别为2ug/mL和50ug/mL。
本发明中，在Tet-On-3G-Csy4诱导表达调控系统调控的情况下，插入在所述宿主细胞的基因组中的VSVG与Gag/pol的拷贝数之比为1:1至1:5，Gag/pol基因在所述宿主细胞的基因组中的插入拷贝数为3-9个拷贝/细胞。优选地，插入在所述宿主细胞的基因组中的VSVG和Gag/pol的拷贝数之比为1:2至1:3。Gag/pol基因在所述宿主细胞的基因组中的插入拷贝数为4-5个拷贝/细胞。
本发明所述的宿主细胞选自293T、293FT、HEK293、HEK293-T、293SF-3F6、TE671、HT1080或HeLa细胞系中的一种；优选地，所用的宿主细胞为293T来源细胞系。
本发明的另一个方面是将上述筛选出的慢病毒稳定包装细胞系经血清逐量减少法驯化成稳定的悬浮细胞系。
本发明中，将目的质粒转染慢病毒稳定包装细胞系的过程中还需要加入转染试剂lip8000。优选地，所述转染试剂lip8000(ul)与质粒(ug)用量比为1:0.5-1:5，更优选地每一步转染过程中所需的转染试剂(ul)与质粒(ug)用量比为＝1:2.5。
本发明中，一种稳定的慢病毒的生产方法，将目的质粒转染至慢病毒稳定包装细胞系中，应加入诱导剂后才能诱导病毒表达。所述诱导剂为四环素或者四环素衍生物，如多西环素和/或强力霉素。优选地，所述诱导剂为多西环素。
所述的诱导剂的加入时间为转染后18～48h；优选地，所述诱导剂的加入时间为转染后24h；优选地，所述诱导剂的加入浓度为1～15ug/mL，更优选地，所述诱导剂的加入浓度为10ug/mL。
丁酸钠是一种有效的组蛋白去乙酰化抑制剂，使组蛋白高度乙酰化，从而可以引起染色质的解聚，使转染的DNA的转录和表达更高。本发明专利中，我们验证了单一变量变化的情况下，使用不同浓度的丁酸钠包装病毒，经流式细胞术确定慢病毒的功能滴度。结果显示，培养基中丁酸钠浓度为3mmol/L时慢病毒滴度最高，但与未添加丁酸钠的培养基相比未有统计学差异。为减少慢病毒中的杂质，方便后期用于临床生产的病毒的下游纯化操作，未选择丁酸钠作为增加慢病毒滴度的包装条件。
附图说明
图1质粒图谱；
图2慢病毒Rev、VSVG的诱导表达；
图3单克隆产毒能力验证；
图4悬浮慢病毒稳定包装细胞系的生产病毒能力的验证；
图5慢病毒包装细胞系的传代稳定性。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明的技术方案进行说明，不会对本发明的保护范围进行限制。不应被认为是对本发明的范围的限制。实施例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的培养基、试剂、耗材和试剂盒等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1质粒构建方法
本实施例构建的慢病毒稳定包装细胞系，包括Gag/Pol质粒(包含Gag、Pol和Rev基因)、VSVG质粒(包含VSVG基因)，质粒图谱参见图1a和图1b。
实施例中所涉及的各质粒所采用的功能元件序列信息为实现本发明的示例，本领域技术人员可以将实施例中所用质粒上各功能元件序列，包括但不限于质粒的骨架序列、启动子序列、隔离子序列、内含子序列、酶切位点序列、转座子重复序列、诱导系统响应元件序列、聚腺苷酸信号序列等，均可替换成其它生物学功能类似的元件序列，也能达到本发明所述效果，具体的质粒构建方法如下所示：
Gag/Pol质粒除包含Gag、Pol和Rev基因外，还包含有TRE3G启动子、序列特异性的核糖核酸内切酶Csy4识别位点、hPGK启动子、嘌呤霉素抗性基因、TRE3G启动子驱动的Csy4反向表达盒、hPGK启动子驱动的Csy4表达盒、cPPT/CTS元件、RRE元件和多腺苷酸化信号等，质粒序列如SEQ ID NO:11所示。
VSVG质粒除了包含VSVG基因，还包括有TRE3G启动子、序列特异性的核糖核酸内切酶Csy4识别位点、hPGK启动子、杀稻瘟菌素抗性基因、TRE3G启动子驱动的Csy4反向表达盒、hPGK启动子驱动的Csy4表达盒、cPPT/CTS元件、RRE元件和多腺苷酸化信号等，质粒如SEQID NO:12所示。
上述质粒委托安徽通用生物技术有限公司构建。经过感受态转化并鉴定后，用ZymoPURE无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，用于后续稳定细胞系的构建。
上述质粒中所用的序列如下：
Gag Pol基因(SEQ ID NO:1)
Rev基因(SEQ ID NO:2)
VSVG基因(SEQ ID NO:3)
TRE3G启动子(SEQ ID NO:4)
Csy4(SEQ ID NO:5)
Csy4 recognition site(SEQ ID NO:6)
Rcsy4(SEQ ID NO:7)
Tet-On 3G(SEQ ID NO:8)
嘌呤霉素抗性基因(SEQ ID NO:9)
杀稻瘟菌素抗性基因(SEQ ID NO:10)
实施例2慢病毒稳定包装细胞系的制备
将实施例1中构建的质粒Gag/Pol、VSVG分别包装慢病毒，用于后续转导293T细胞。
(1)复苏293T细胞。
(2)待细胞生长良好时，将线性化的VSV-G质粒在转染试剂Lip8000的辅助下转入293T细胞。转染过程中所需的转染试剂(ul)与质粒(ug)用量比为＝1:2.5。
(3)加入第一抗生素进行嘌呤霉素加压筛选，其用量为2ug/mL进行克隆筛选。在加压筛选2周后，即可收获阳性的多克隆细胞。
(4)将上述获得的多克隆细胞进行96孔板有限稀释法单克隆筛选，按照50cells/板，每孔200μL培养基，然后每日显微镜观察，挑出只有单个细胞的孔，并标记。
(5)将在96孔板中存活下来的单克隆细胞继续逐级扩大培养。取扩大培养的单克隆细胞，进行PCR。鉴定其是否含有目的基因VSVG。
(6)将经鉴定的单克隆细胞群冻，用Lip8000转染线性化的Gag/Pol质粒。转染过程中所需的转染试剂(ul)与质粒(ug)用量比为＝1:2.5。
(7)加入第二抗生素为嘌呤霉素和杀稻瘟菌素的混合物进行抗生素加压筛选。其用量分别为2ug/mL和50ug/mL。筛选2周后，得到抗药的阳性稳转细胞群。将多克隆阳性稳转细胞进行96孔板有限稀释法单克隆筛选，按照50cells/板，每孔200μL培养基，然后每日显微镜观察，挑出只有单个细胞的孔，并标记。
(8)培养约30-35天。记录在96孔板中存活下来的单克隆细胞的编号。分别为Clone4、5、11、14、17、20、22、27、35。
(9)将96孔板存活下来的克隆继续扩大培养，分别用48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、摇瓶T125逐级放大。分别取Clone4、5、11、14、17、20、22、27、35的单克隆细胞进行流式表型分析。经鉴定，所有克隆均。将克隆4、17、20、22、27、35含有VSVG和Gag Pol基因。将克隆4、17、20、22、27、35单克隆细胞冻存。
实施例3慢病毒基因Rev、VSVG和Gag/Pol的诱导表达优化
本实施例针对表达Rev、VSVG和Gag/Pol基因的诱导表达进行优化。因Gag/Pol编码序列的表达同时受Rev蛋白的调控，所以Gag/pol编码序列的调控是非必须。通过本发明中设计的基于Csy4转录后调控的Tet-On3G系统来调控慢病毒包装基因Rev和VSVG的表达。采用单质粒替换方法筛选优化Rev和VSVG的基因表达调控方式，将无诱导调控体系的Rev、VSVG质粒分别替换为诱导表达的Rev的质粒和VSVG质粒。以CARCD19质粒为携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒转移载体质粒，通过Lip8000瞬时转染的方式分别在有无诱导剂(盐酸多西环素)的情况下制备病毒，并且通过感染293T细胞，QPCR检测病毒滴度(产毒滴度和泄露滴度)。在慢病毒产毒滴度和泄露滴度这两个方面进行优化。具体实施步骤如下：
(1)分别构建包含和不包含诱导调控体系的Rev、VSVG质粒。
(2)用上述质粒分别包装慢病毒，并转导293T细胞，构建慢病毒稳定包装细胞系。
(3)接种293T细胞至24孔板。培养24h后，在包含和不包含诱导调控体系的Rev、VSVG稳转细胞株中，包装CAR-CD19慢病毒。
(4)阳性对照为无诱导表达调控的Gag/pol、Rev、VSVG。在Rev优化实验组中仅替换表达调控Rev质粒；在VSVG实验组中仅替换表达VSVG的质粒；
(5)将质粒和转染试剂混合均匀后，轻轻的均匀加入24孔板中，每个样品设置两个孔。转染24h后，在每个样品的其中一个孔中加入终浓度为10ug/ml的盐酸多西环素作为诱导组，另一孔加入等量培养基作为非诱导组。继续培养48h后，收集病毒上清液，超高速离心纯化后，检测病毒滴度(如图4)。
实施例4慢病毒稳定包装细胞系的悬浮驯化
具体包括以下步骤：
将实施例2中筛选得到的单克隆细胞按5*105细胞/ml，每瓶30ml接种至T125ml摇瓶中。培养基初始为TransproCD01和DMEM+4mM Glutamax，初始培养基的体积比为TransproCD01：DMEM＝1:9，培养条件为相对湿度≥80％、温度为37℃、CO2浓度为8％，转速118rpm/min。细胞培养3-4天，达到1×106cells/mL以上传代；后期逐渐增加TransproCD01：DMEM培养基的比例到1:3，1:1，3:1，1:0；进行悬浮适应；细胞生长至(3-6)*106细胞/ml时进行传代，连续培养至无明显细胞结团并且倍增时间小于24小时后，细胞活率为95％以上，细胞分散性较好、无明显聚集，此即为悬浮驯化成功的悬浮293T细胞。将这些驯化成功的悬浮细胞扩大培养后，一部分继续传代培养，一部分进行冻存建库保藏。
实施例5悬浮慢病毒稳定包装细胞系的生产病毒能力的验证
本实施例使用的CAR-CD19序列为目的核酸片段，目的是开发及验证本发明所述构建慢病毒稳定生产细胞系的方法，此方法在原理上不受特定目的核酸片段的影响。可以为任意的目的核酸片段。
(1)将上述驯化成功的悬浮细胞培养扩增至(3-6)*106细胞/ml密度，活率≥95％，用新鲜的TransproCD01+4mM Glutamax培养基调整细胞密度至4*106细胞/ml，过夜生长。再次用新鲜培养基将细胞稀释至4.5×106细胞/ml。将细胞悬液按每孔2ml接种至6孔孔细胞培养板中。
(2)将目的质粒CAR-CD19在转染试剂Lip8000的辅助下转入293T细胞中。转染过程中所需的转染试剂(ul)与质粒(ug)用量比为＝1:2.5。转染24h后，加终浓度为10μg/mL诱导剂盐酸多西环素。在转染后48h收集病毒上清，4000rpm，4℃离心10min，弃沉淀留上清，并将上清用0.45um的滤膜过滤。
(4)按照20％的蔗糖溶液与慢病毒上清液的体积比＝1：8的体积比加入到超高速离心管中，4℃，25，000rpm(82，700g)离心2小时。
(5)弃上清，吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。
(6)加入不含钙和镁的PBS洗下沉淀，并在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
(7)弃上清，吸掉剩余的液滴，并加入培养基轻柔吹打使沉淀重悬，即获得病毒悬液。将病毒悬液分装后储存在-80℃待用。
(8)将293T单克隆细胞铺于96孔板中，每孔5000个细胞。24小时后，将上述包装的病毒感染293T细胞，48h后QPCR检测，并计算病毒滴度(TU/mL)。实验结果表明，克隆4、17、20、22、27、35均能适应无血清悬浮培养条件，不同单克隆细胞在悬浮培养条件下瞬时转染CD19CAR质粒，均能产毒。除克隆35所生产的病毒滴度稍低(3.4*106TU/mL)，其余克隆所产病毒的滴度均在10的7次方的数量级，且克隆20的病毒滴度最高为9.6*107TU/mL。选择克隆20做后续的实验。
实施例6在悬浮培养条件下检测CAR-CD19细胞的产毒滴度和泄露病毒滴度
复苏培养筛选的悬浮单克隆稳定慢病毒生产细胞系。按照实施例4所述的方法，将目的质粒CAR-CD19(含GFP)转染上述悬浮细胞。设置诱导剂组、无诱导剂组和阳性对照组。诱导剂组于转染后24h加入10μg/mL盐酸多西环素，无诱导剂组加入等量的培养基，然后置于细胞培养摇床上继续培养48小时后，收集病毒。阳性对照组为稳转的质粒系统包装CAR-CD19慢病毒。总质粒质量45ug，其中质粒CARCD19:Gal/Pol:VSVG的质量比为：3:1:1。转染后48小时后，收集病毒。
将上述收集到的病毒4000rpm，4℃离心10min，弃沉淀留上清，并将上清用0.45um的滤膜过滤。经蔗糖密度梯度超高速离心(4℃，25，000rpm离心2小时后，弃上清，吸掉剩余的液滴，加入不含钙和镁的PBS洗下沉淀，并在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。加入培养基轻柔吹打使沉淀重悬，即获得病毒悬液。将病毒悬液感染293T细胞，通过QPCR检测病毒滴度。结果显示在诱导后的病毒滴度为6.1*108，是稳转悬浮293T细胞包装所获得的病毒的72倍。在无诱导条件下泄露产毒滴度的RLU荧光值和293T细胞的背景RLU值基本一致。
实施例7稳定包装细胞系传代稳定性和产毒稳定性验证
为了验证慢病毒稳定包装细胞系克隆20的传代稳定性和产毒稳定性，将单克隆20细胞株分别在加抗生素和不加抗生素的条件下进行悬浮传代培养，并分别检测细胞数和细胞活率。
具体操作步骤为：
将克隆20分别接种于2个T125摇瓶中，每瓶各接种5×105个/mL，用30mLTransproCD01+4mM Glutamax培养基(不加抗生素)，TransproCD01+4mM Glutamax+抗生素培养。每隔一天传代一次，并检测细胞数和细胞活率，观察其传代稳定性。
实验结果表明，有无抗生素(是否存在筛选压力)对细胞传代过程中的细胞数目影响较小。在不加抗生素(无筛选压力)时，单克隆细胞株20能稳定传代，并且活率可达98％以上，在无筛选压力时能稳定传代30代次以上(图5)。
为了探索单克隆细胞株在有无抗生素时的产毒稳定性，在有无抗生素存在的条件下传代，每隔4代，将目的质粒按照上述方法分别转染Clone20细胞株，并检测病毒滴度。
实验结果表明，在不加抗生素时，其Clone20细胞株具有生产病毒的能力，说明不加抗生素时Clone20细胞株能正常遗传(图5)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种基于转录后调控的慢病毒稳定生产细胞系的制备方法，其特征在于，（1）分别以Gag/Pol质粒、VSVG质粒为主质粒，包装慢病毒；
（2）将VSVG质粒包装的慢病毒转导宿主细胞；
（3）加入第一抗生素嘌呤霉素抗性基因，用有限稀释法进行阳性筛选，得到第一阳性的单克隆细胞；
（4）鉴定第一阳性单克隆细胞；
（5）再将Gag/Pol质粒包装的慢病毒转导步骤（4）筛选鉴定出的第一阳性单克隆细胞；
（6）加入第二抗生素杀稻瘟菌素抗性基因，有限稀释法进行第二次筛选，得到第二阳性单克隆细胞，经半定量PCR鉴定后，即确定为慢病毒稳定包装细胞系；
其中，所述Gag/Pol质粒除包括Gag、Pol和Rev基因外，还包含有TRE3G启动子、序列特异性的核糖核酸内切酶Csy4识别位点、嘌呤霉素抗性基因、TRE3G启动子驱动的Csy4反向表达盒、hPGK启动子驱动的Csy4表达盒；
所述VSVG质粒除了包含VSVG基因，还包括TRE3G启动子、序列特异性的核糖核酸内切酶Csy4识别位点、hPGK启动子、杀稻瘟菌素抗性基因、TRE3G启动子驱动的Csy4反向表达盒、hPGK启动子驱动的Csy4表达盒。
2.根据权利要求1所述的慢病毒稳定生产细胞系的制备方法，其特征在于，所述慢病毒的Gag、Pol和Rev基因是HIV-1病毒的Gag、Pol和Rev基因。
3.根据权利要求1-2任一项所述的慢病毒稳定生产细胞系的制备方法，其特征在于，所述Gag Pol基因如SEQ ID NO:1所示，Rev基因如SEQ ID NO:2所示，VSVG基因如SEQ ID NO:3所示，嘌呤霉素抗性基因如SEQ ID NO:9所示，杀稻瘟菌素抗性基因如SEQ ID NO:10所示。
4.根据权利要求1-2任一项所述的慢病毒稳定生产细胞系的制备方法，其特征在于，Gag/Pol质粒如SEQ ID NO:11所示，VSVG质粒如SEQ ID NO:12所示。
5.一种基于转录后调控的慢病毒稳定生产细胞系，其特征在于，通过权利要求1-4任一项所述制备方法制备获得细胞系。
6.一种慢病毒的生产方法，其特征在于，将目的质粒转染权利要求5所述的稳定生产细胞系，然后加入诱导剂，诱导慢病毒稳定包装细胞系生产慢病毒。
7.权利要求6所述生产方法，其特征在于，所述诱导剂为四环素或者四环素衍生物。
8.权利要求7所述生产方法，其特征在于，所述诱导剂的加入浓度为1～15 ug /mL。
9.权利要求7-8任一项所述生产方法，其特征在于，所述诱导剂为多西环素或强力霉素。
10.权利要求5所述基于转录后调控的慢病毒稳定生产细胞系在生产病毒方面的应用。
11.用于制备基于转录后调控的慢病毒稳定生产细胞系的Gag/Pol质粒，其特征在于，如SEQ ID NO:11所示。
12.用于制备基于转录后调控的慢病毒稳定生产细胞系的VSVG质粒，其特征在于，如SEQ ID NO:12所示。
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