CN116836159A - 一类脂质导向的癌细胞荧光探针、其制备方法及应用 - Google Patents

一类脂质导向的癌细胞荧光探针、其制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116836159A
CN116836159A CN202310758755.7A CN202310758755A CN116836159A CN 116836159 A CN116836159 A CN 116836159A CN 202310758755 A CN202310758755 A CN 202310758755A CN 116836159 A CN116836159 A CN 116836159A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fluorescent probe
alkyl
benzyl
substituted
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310758755.7A
Other languages
English (en)
Inventor
樊江莉
夏卓然
夏天平
杜健军
彭孝军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian University of Technology
Original Assignee
Dalian University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian University of Technology filed Critical Dalian University of Technology
Priority to CN202310758755.7A priority Critical patent/CN116836159A/zh
Publication of CN116836159A publication Critical patent/CN116836159A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1434—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1007—Non-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C09K2211/1037—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom with sulfur

Abstract

本发明公开了一类脂质导向的癌细胞荧光探针，式中X1选自C(CH3)2、O、S或Se；A1选自H、苯基或取代苯基；R1、R2可以相同或不同，R1和R2各自独立选自C1‑C8烷基、C1‑C8羟基、C1‑C8羧基、C1‑ 8NR5R6、C1‑C8酯基、苄基和取代苄基；所述取代苄基由以下基团任意取代：C1‑C8烷基、C1‑C8烷氧基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、卤素或C1‑C8卤代烷基；Y‑选自卤素负离子、ClO4 ‑、PF6 ‑、CH3COO‑或OTs‑。所述荧光探针利用碳碳双键将苯并噻唑和喹啉部分连接形成了Donor‑Accepter结构，具有核酸响应的优点，且该探针分子能够依据细胞膜脂质含量不同对正常细胞/组织和癌细胞/组织进行区分，选择性进入癌细胞并同核酸结合产生荧光。该荧光探针能够用于以核酸检测为基础的肿瘤细胞或组织特异性荧光成像。

Description

一类脂质导向的癌细胞荧光探针、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及精细化工领域，尤其涉及一类脂质导向的癌细胞荧光探针、其制备方法及应用。
背景技术
近年来，癌症的发病率和死亡率逐年增加，给人类的生命安全带来了巨大挑战。据国际癌症研究机构(IAPC)统计，仅2018年全球新增癌症病例超过1800万例，死亡率高达52.85％。对癌症的快速诊断和早期治疗是提高癌症患者存活率的有效手段。传统的诊断方法如核磁共振(MR)、超声诊断(US)、X射线断层摄影术(CT)等存在操作费时，分辨率不高，无法准确区分小于2mm病灶的不足。在手术切除过程中因无法准确区分正常组织和癌细胞边界，导致术后存在复发的可能。因此开发具有高精度的快速诊断方法受到了研究者们的广泛关注。其中，以小分子荧光探针为基础的荧光成像技术因为其高灵敏度、高时空分辨率、毒副作用小等特点，在肿瘤的早期诊断，术中成像以及预后评价领域得到了广泛的应用。
细胞膜作为细胞的保护边界，与细胞的许多生理病理过程密切相关。肿瘤细胞和正常细胞在细胞膜组成成分上存在差异。癌细胞对脂类和胆固醇表现出很强的亲和力。由于癌细胞的脂类和胆固醇主要富集在细胞膜上，因此，如何根据细胞膜脂质含量差异区分正常细胞和癌细胞，在肿瘤细胞或组织特异性荧光成像上具有重要的研究意义。
发明内容
本发明提供一类脂质导向的癌细胞荧光探针，所述荧光探针利用碳碳双键将苯并噻唑和喹啉部分连接，形成了Donor-Accepter的结构，具有核酸响应的优点，且该探针分子能够依据细胞膜脂质含量不同对正常细胞/组织和癌细胞/组织进行区分，选择性进入癌细胞并同核酸结合，产生荧光。该荧光探针，能够用于以核酸检测为基础的肿瘤细胞或组织特异性荧光成像的应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一类脂质导向的癌细胞荧光探针，具有如下结构通式Ⅰ
其中，
X1选自C(CH3)2、O、S或Se；
A1选自H、苯基或取代苯基；
R1、R2可以相同或不同，R1和R2各自独立选自C1-C8烷基、C1-C8羟基、C1-C8羧基、C1- 8NR5R6、C1-C8酯基、苄基和取代苄基；所述取代苄基由以下基团任意取代：C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、卤素或C1-C8卤代烷基；
Y-选自卤素负离子、ClO4 -、PF6 -、CH3COO-或OTs-中的一种。
进一步地，所述A1选自H；
R1、R2不同，R1选自苄基或C1-C8烷基；
R2选自C1-C8烷基或C1-C8羧基；
X1为S；
更进一步地，A1选为自由H；R1优选为甲基；R2选为5-羧基戊基；X1优选为S。
更进一步地，所述癌细胞荧光探针为：
一类脂质导向的癌细胞荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
S1：分别制备第一中间体和第二中间体，所述第一中间体具有如下通式Ⅱ的结构，所述第二中间体具有如下通式Ⅲ的结构；
在式Ⅱ中，X1选自C(CH3)2、O、S或Se；
在通式Ⅲ中，X2选自F、Cl、Br或I，R2选自C1-C8烷基、C1-C8羟基、C1-C8羧基、C1- 8NR5R6、C1-C8酯基、苄基和取代苄基；所述取代苄基由以下基团任意取代：C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、卤素或C1-C8卤代烷基；
S2：按照1:2-5的摩尔比将第一中间体和第一化学试剂混合均匀，然后加入第二中间体和催化剂，在惰性气氛保护下，在80-100℃反应4-6h，得到目标荧光探针。
更进一步地，在步骤S2中，反应温度为80℃。
进一步地，在步骤S1中，所述第一中间体采用如下方法制备：
在惰性气氛保护下，将具有结构通式Ⅳ的化合物和第一卤代试剂在第二有机溶剂中反应制得；
反应时间为6-24h，反应温度为80-110℃，所述化合物Ⅳ与第一卤代试剂的摩尔比为1：2-5。更进一步地，反应时间为8-20h。
进一步地，在步骤S1中，所述第二中间体采用如下方法制备：
在惰性气氛保护下，将具有结构通式Ⅴ的化合物和第二卤代试剂在第三有机溶剂中反应制得；
反应时间为6-24h，反应温度为80-110℃，所述化合物Ⅴ与第二卤代试剂的摩尔比为1：2-5。更进一步地，反应时间为8-20h。
进一步地，在步骤S2中，所述第一中间体和第二中间体的摩尔比为1:1.2-1.5；所述催化剂选自无机碱或有机碱；所述第一化学试剂选自无水乙醇、无水甲醇或无水乙腈。更进一步地，所述催化剂选自NaHCO3。
进一步地，所述第一卤代试剂选自Cl、Br或I取代的C1-C8烷基、C1-C8羟基、C1-C8羧基、C1-8NR5R6、C1-C8酯基、苄基和取代苄基；所述取代苄基由以下基团任意取代：C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、卤素或C1-C8卤代烷基；；
所述第二有机溶剂选自乙醇、甲醇、乙腈、DMF或乙二醇单甲醚中的任意一种。
进一步地，所述第二卤代试剂选自Cl、Br或I取代的C1-C8烷基、C1-C8羟基、C1-C8羧基、C1-8NR5R6、C1-C8酯基、苄基和取代苄基；所述取代苄基由以下基团任意取代：C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、卤素或C1-C8卤代烷基；；
所述第三有机溶剂选自乙醇、甲醇、乙腈、DMF或乙二醇单甲醚中的任意一种。
一类脂质导向的癌细胞荧光探针的应用，所述荧光探针在以核酸检测为基础的肿瘤细胞或组织特异性荧光成像的应用。
更进一步，一类脂质导向的癌细胞荧光探针在检测肿瘤细胞方面的应用。
更进一步地，所述的癌症包括宫颈癌、肺癌或乳腺癌。
更进一步地，应用脂质导向的癌细胞荧光探针判断癌细胞的方法为：
S1、采集患者手术标本，切片；或取正常癌细胞/组织；
S2、将切片或者活细胞与所述的荧光探针共孵育，并对切片或者活细胞进行荧光共聚焦成像，当切片组织或活细胞表现出明显明亮的荧光信号，则证明是癌细胞或者癌组织。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、噻唑橙类化合物由于存在Donor-Accepter结构，能够引起分子内电荷转移效应(ICT)，探针分子自体荧光极弱，同时探针分子存在正电性，与带负电的核酸分子具有良好的亲和性，能够增强同核酸的结合能力。探针分子同核酸沟槽结合后，分子转动受到限制，产生荧光，在同核酸结合前后荧光增强46(DNA)、30.75(RNA)倍，因此本发明对核酸具有良好的响应性。
2、噻唑橙类化合物由于存在多个官能团修饰位点，所以通过在喹啉处引入疏水性烷基链和亲水性羧酸基团，构建类脂型荧光探针，并通过细胞膜脂质导向选择性进入癌细胞，因此本发明对于正常细胞和肿瘤细胞具有良好的区分效果。
3、由于本发明能够选择性进入癌细胞，产生荧光，且不存在时间依赖性，短时间内(0.5h)即可区分正常细胞与癌细胞，因此本发明能够同流式细胞仪适配，应用于单细胞层面区分正常细胞和肿瘤细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1-6公开荧光探针的对正常细胞(COS-7细胞)和肿瘤细胞(MCF-7细胞)的激光共聚焦成像图；
图2是本发明实施例6公开荧光探针TO-Ac在不同浓度下的吸收和发射光谱图；
图3是本发明实施例6公开荧光探针TO-Ac的核酸滴定光谱图；
图4是本发明实施例6公开荧光探针TO-Ac对正常组织细胞3T3细胞和COS-7细胞染色的激光共聚焦成像图；
图5是本发明实施例6公开荧光探针TO-Ac对肿瘤组织细胞HepG2细胞和MCF-7细胞染色的激光共聚焦成像图；
图6是本发明实施例6公开荧光探针TO-Ac对四种固定细胞(HepG2细胞、MCF-7细胞、3T3细胞和COS-7细胞)染色的激光共聚焦成像图；
图7是本发明实施例6公开荧光探针TO-Ac对混合组织细胞HepG2细胞和COS-7细胞染色的激光共聚焦成像图；
图8是本发明实施例6公开荧光探针TO-Ac在流式细胞分析仪中对正常细胞和肿瘤细胞的分类测试图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图1-8，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请中，除非另有其他明确说明，否则百分比、百分含量均以质量计。如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
以下结合实施例对通式I所示荧光探针进行详细说明。
式I中，
X1选自C(CH3)2、O、S或Se；
A1选自H、苯基或取代苯基；
R1、R2可以相同或不同，R1和R2各自独立选自C1-C8烷基、C1-C8羟基、C1-C8羧基、C1- 8NR5R6、苄基和取代苄基；所述取代苄基由以下基团任意取代：C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、卤素或C1-C8卤代烷基；
Y-选自卤素负离子、ClO4 -、PF6 -、CH3COO-或OTs-中的一种。
以下，举出由通式I所表示的荧光探针的具体例，但本发明并不限于这些具体例。
本发明由通式I所示的化合物的反应机理为：
本发明由通式I所示的化合物可通过下述记载的方法合成。
原料及中间体的制备例
制备例1
中间体1的合成：
将二甲基苯并噻唑(4.00mmol)加入到装有5mL无水乙腈的双口圆底烧瓶中，然后加入溴化苄(20.00mmol)。整个反应体系充氮气保护，磁力搅拌，转速为200-300R/min，并控制反应温度在120℃左右，反应时间持续20h。反应结束后，真空旋蒸反应溶剂，然后加入过量乙酸乙酯结晶，过滤得到白色中间体1，收率为66.70％。
制备例2
中间体3的合成：
和制备例1的区别仅在于：采用碘甲烷(20.00mmol)替换溴化苄(20.00mmol)，过滤得到苍白色中间体3，收率为82.10％。
制备例3
中间体7的合成：
和制备例1的区别仅在于：采用碘乙烷(20.00mmol)替换溴化苄(20.00mmol)，过滤得到苍白色中间体7，收率为88.00％。
实施例
实施例1
合成以R1为苄基，R2为甲基，A1为氢原子，X1为硫原子，Y-为I-的荧光探针TO-ph，具有如下结构式：
荧光探针TO-ph的合成包括如下步骤：
S1：将4-碘喹啉(2.00mmol)加入到装有5mL无水乙腈的双口圆底烧瓶中，然后将碘甲烷(10.00mmol)加入到圆底烧瓶中，整个反应体系充氮气保护，磁力搅拌，并控制反应温度在120℃左右，反应时间持续20h。反应结束后，真空旋蒸反应溶剂，然后加入过量乙酸乙酯结晶，过滤得到淡黄色中间体2，收率为20.55％；
S2：将中间体1(1.25mmol)加入到装有5mL无水甲醇的双口圆底烧瓶中，然后将步骤S1制得的中间体2(1.5mmol)加入到圆底烧瓶中，最后加入碳酸氢钠(0.09mmol)，整个反应体系充氮气保护，磁力搅拌，并控制反应温度80℃左右，反应时间持续4-6h，反应完成后，真空旋蒸反应溶剂，选择二氯甲烷和甲醇(100:5)的混合溶液作为洗脱剂，经色谱柱分离得到粉橙色固体荧光染料TO-ph，收率为15.00％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.67(d,J＝7.1Hz,1H),8.54(d,J＝8.5Hz,1H),8.07(dd,J＝8.2,4.5Hz,2H),8.00(dd,J＝9.3,6.3Hz,1H),7.77(t,J＝7.8Hz,2H),7.58(t,J＝7.8Hz,1H),7.43–7.35(m,5H),7.30(t,J＝6.8Hz,1H),6.98(s,1H),5.95(s,2H),4.19(s,3H).
实施例2
合成以R1为甲基，R2为5-乙氧羰基戊基，A1为氢原子，X1为硫原子，Y-为I-的荧光探针TO-AcOEt，具有如下结构式：
荧光探针TO-AcOEt的合成方法如下：
S1：将4-碘喹啉(2.00mmol)加入到装有5mL无水乙腈的双口圆底烧瓶中，然后将5-溴戊酸乙酯(10.00mmol)加入到圆底烧瓶中，整个反应体系充氮气保护，磁力搅拌，并控制反应温度在120℃左右，反应时间持续20h。反应结束后，真空旋蒸反应溶剂，然后加入过量乙酸乙酯结晶，过滤得到淡黄白色中间体4，收率为65.20％；
S2：将中间体3(1.25mmol)加入到装有5mL无水甲醇的双口圆底烧瓶中，然后将步骤S1制得的中间体4(1.5mmol)加入到圆底烧瓶中，最后加入碳酸氢钠(0.09mmol)，整个反应体系充氮气保护，磁力搅拌，并控制反应温度80℃左右，反应时间持续4-6h，反应完成后，真空旋蒸反应溶剂，选择二氯甲烷和甲醇(100:5)的混合溶液作为洗脱剂，经色谱柱分离得到粉橙色固体荧光染料TO-AcOEt，收率为23.00％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.81(d,J＝8.5Hz,1H),8.66(d,J＝7.2Hz,1H),8.14(d,J＝8.8Hz,1H),8.06(d,J＝7.9Hz,1H),8.00(t,J＝7.8Hz,1H),7.82–7.73(m,2H),7.62(t,J＝7.8Hz,1H),7.43(t,J＝7.6Hz,1H),7.36(d,J＝7.1Hz,1H),6.93(s,1H),4.60(t,J＝7.4Hz,2H),3.11(q,J＝7.3Hz,6H),2.88(s,2H),2.30(t,J＝7.3Hz,2H),1.86(p,J＝7.1Hz,2H),1.58(p,J＝7.4Hz,2H),1.38(p,J＝7.8Hz,2H).
实施例3
合成以R1为甲基，R2为6-羧基己基，A1为氢原子，X1为硫原子，Y-为I-的荧光探针TO-6C-Ac，具有如下结构式：
荧光探针TO-6C-Ac的合成方法如下：
S1：将4-碘喹啉(2.00mmol)加入到装有5mL无水乙腈的双口圆底烧瓶中，然后将7-溴庚酸(10.00mmol)加入到圆底烧瓶中，整个反应体系充氮气保护，磁力搅拌，并控制反应温度在120℃左右，反应时间持续20h。反应结束后，真空旋蒸反应溶剂，然后加入过量乙酸乙酯结晶，过滤得到黄白色中间体5，收率为20.55％；
S2：将中间体3(1.25mmol)加入到装有5mL无水甲醇的双口圆底烧瓶中，然后将步骤S1制得的中间体5(1.5mmol)加入到圆底烧瓶中，最后加入碳酸氢钠(0.09mmol)，整个反应体系充氮气保护，磁力搅拌，并控制反应温度80℃左右，反应时间持续4-6h，反应完成后，真空旋蒸反应溶剂，选择二氯甲烷和甲醇(100:5)的混合溶液作为洗脱剂，经色谱柱分离得到粉橙色固体荧光染料TO-6C-Ac，收率为14.70％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.80(d,J＝8.6Hz,1H),8.64(d,J＝7.2Hz,1H),8.15(d,J＝8.8Hz,1H),8.06(d,J＝7.9Hz,1H),8.00(t,J＝7.8Hz,1H),7.82–7.74(m,2H),7.62(t,J＝7.8Hz,1H),7.43(t,J＝7.6Hz,1H),7.38(d,J＝7.1Hz,1H),6.94(s,1H),4.59(t,J＝7.4Hz,2H),4.03(s,3H),2.19(t,J＝7.3Hz,2H),1.85(t,J＝7.3Hz,2H),1.50(p,J＝7.2Hz,2H),1.34(d,J＝10.5Hz,4H).
实施例4
合成以R1为甲基，R2为4-羧基丁基，A1为氢原子，X1为硫原子，Y-为I-的荧光探针TO-4C-Ac，具有如下结构式：
荧光探针TO-4C-Ac的合成方法如下：
S1：将4-碘喹啉(2.00mmol)加入到装有5mL无水乙腈的双口圆底烧瓶中，然后将5-溴戊酸(10.00mmol)加入到圆底烧瓶中，整个反应体系充氮气保护，磁力搅拌，并控制反应温度在120℃左右，反应时间持续20h。反应结束后，真空旋蒸反应溶剂，然后加入过量乙酸乙酯结晶，过滤得到灰白色中间体6，收率为23.10％；
S2：将中间体3(1.25mmol)加入到装有5mL无水甲醇的双口圆底烧瓶中，然后将步骤S1制得的中间体6(1.5mmol)加入到圆底烧瓶中，最后加入碳酸氢钠(0.09mmol)，整个反应体系充氮气保护，磁力搅拌，并控制反应温度80℃左右，反应时间持续4-6h，反应完成后，真空旋蒸反应溶剂，选择二氯甲烷和甲醇(100:5)的混合溶液作为洗脱剂，经色谱柱分离得到橙色固体荧光染料TO-4C-Ac，收率为14.70％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.67(d,J＝7.1Hz,1H),8.54(d,J＝8.5Hz,1H),8.07(dd,J＝8.2,4.5Hz,2H),8.00(dd,J＝9.3,6.3Hz,1H),7.77(t,J＝7.8Hz,2H),7.58(t,J＝7.8Hz,1H),7.43–7.35(m,5H),7.30(t,J＝6.8Hz,1H),6.98(s,1H),5.95(s,2H),4.19(s,3H).
实施例5
合成以R1为乙基，R2为5-羧基戊基，A1为氢原子，X1为硫原子，Y-为I-的荧光探针EtTO-Ac，具有如下结构式：
荧光探针EtTO-Ac的合成方法如下：
S1：将4-碘喹啉(2.05mmol)加入到装有5mL无水乙腈的双口圆底烧瓶中，然后将6-溴己酸(10.25mmol)加入到圆底烧瓶中，整个反应体系充氮气保护，磁力搅拌，并控制反应温度在80℃左右，反应时间持续20h。反应结束后，真空旋蒸反应溶剂，然后加入过量乙酸乙酯结晶，过滤得到黄白色中间体8，收率为20.55％；
S2：将中间体7(1.25mmol)加入到装有5mL无水甲醇的双口圆底烧瓶中，然后将中间体8(1.5mmol)加入到圆底烧瓶中，最后加入碳酸氢钠(0.09mmol),整个反应体系充氮气保护，磁力搅拌，并控制反应温度80℃左右，反应时间持续4-6h，反应完成后，真空旋蒸反应溶剂，选择二氯甲烷和甲醇(100:5)的混合溶液作为洗脱剂，经色谱柱分离得到橙色固体荧光染料EtTO-Ac，收率为15.73％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.80(d,J＝8.5Hz,1H),8.65(d,J＝7.2Hz,1H),8.15(d,J＝8.8Hz,1H),8.06(dd,J＝8.0,3.5Hz,1H),8.00(t,J＝7.9Hz,1H),7.83–7.74(m,2H),7.63(t,J＝7.7Hz,1H),7.47–7.36(m,2H),6.95(d,J＝6.6Hz,1H),4.68(t,J＝7.2Hz,1H),4.61(t,J＝7.5Hz,2H),4.03(s,1H),2.22(t,J＝7.2Hz,2H),1.87(p,J＝7.7Hz,2H),1.56(p,J＝7.4Hz,2H),1.39(q,J＝6.9Hz,4H).
实施例6
合成以R1为甲基，R2为5-羧基戊基，A1为氢原子，X1为硫原子，Y-为I-的荧光探针TO-Ac，具有如下结构式：
荧光探针TO-Ac的合成方法如下：
S1：同实施例5；
S2：和实施例5的区别仅在于，采用中间体3(1.25mmol)替换中间体7(1.25mmol)，经色谱柱分离得到橙色固体荧光染料TO-Ac，收率为21.96％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.74(dd,J＝7.4,2.8Hz,2H),8.08(d,J＝8.7Hz,1H),7.98(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.93(ddd,J＝8.5,6.9,1.3Hz,1H),7.70(td,J＝8.0,5.7Hz,2H),7.56(ddd,J＝8.4,7.2,1.3Hz,1H),7.40–7.34(m,1H),7.27(d,J＝7.1Hz,1H),6.84(s,1H),4.57(t,J＝7.2Hz,2H),3.97(s,3H),1.82(q,J＝7.8,7.3Hz,4H),1.49(p,J＝7.0Hz,2H),1.32(qd,J＝8.4,6.1Hz,2H).
性能检测试验
使用上述实施例1-6制备的荧光探针分别对正常细胞和肿瘤细胞进行染色，并使用共聚焦激光扫描显微镜观察，结果参见图1。
荧光探针浓度均为10μM，选择代表性区域使用OLYMPUS FV1000激光共聚焦显微镜成像，激发波长为488nm，接收波段为520-550nm。
图1为实施例1-6制备的荧光探针对正常细胞(COS-7细胞)和肿瘤细胞(MCF-7细胞)染色(上为COS-7细胞，下为MCF-7细胞)。
由图1可以看出，由于荧光探针存在正电荷，能够特异性细胞内核酸结合产生荧光，且分子量较小，能够通过被动扩散方式进入细胞，实施例1-6对正常细胞和肿瘤细胞均有一定的染色能力，其中，通过细胞摄取实验和共聚焦成像结果显示，实施例5和实施例6表现出良好的细胞区分能力，能够选择性染色癌细胞而不染色正常细胞。
为了综合评判以上分子的性能，以实施例6制备的荧光探针TO-Ac为例，说明以上分子在区分正常细胞和肿瘤细胞方面的性能。
1、荧光物理性质实验
将实施例6制备的荧光探针TO-Ac逐渐加入到PBS缓冲液(pH＝7.4)，使TO-Ac浓度分别为2、4、6、8、10、12和14μM，记录吸收和荧光发射光谱。测试结果如图2所示。所用仪器分别是FP 6500紫外分光光度计，Agilent Technologies Cary 60荧光分光光度计。
图2(a)为不同浓度TO-Ac的吸收光谱图；
图2(b)为不同浓度TO-Ac的发射光谱图，激发波长为502nm。
从图2中可以看出，由于分子自身存在ICT效应，TO-Ac的最大吸收波长为502nm，且几乎无荧光现象。
2、核酸滴定实验
将实施例6制备的荧光探针TO-Ac配制为浓度为4μM，分别逐渐加入0-140μg/mlDNA和RNA溶液，测试体系为PBS缓冲溶液(pH＝7.4)，测试结果显示于图3。
图3(a)为TO-Ac对DNA的荧光滴定光谱图；
图3(b)为TO-Ac对RNA的荧光滴定光谱图；
图3(c)为TO-Ac对DNA和RNA的荧光滴定光谱对比图；
从图3中可以看出，荧光探针TO-Ac能够同核酸特异性结合，探针分子同核酸沟槽结合后限制双键转动，产生荧光。核酸滴定实验结果表明，荧光探针TO-Ac对DNA和RNA均有良好的响应结果，且对DNA响应性更好，在同核酸结合前后荧光增强46(DNA)、30.75(RNA)倍，同时荧光探针TO-Ac结合核酸前后荧光差别较大，能够有效特异性识别核酸。
3、正常细胞摄取实验
将实施例6制备的荧光探针TO-Ac配制为浓度10μM，分别加入到已经孵育好的3T3细胞和COS-7细胞(细胞培养密度105cells/ml，皿底覆盖70-80％)的6个培养皿中，在37℃，5％CO2条件下染色6h，并分别在0.5h、1h、2h、3h、4h、5h和6h时间点，选择代表性区域使用OLYMPUS FV1000激光共聚焦显微镜成像，TO-Ac的激发波长为502nm，接收波段为520-550nm，重复实验3次，测试结果显示于图4。
图4(a)为荧光探针化合物TO-Ac对3T3细胞的染色图；
图4(b)为荧光探针化合物TO-Ac对COS-7细胞的染色图。
从图4中可以看出，荧光探针TO-Ac难以进入3T3细胞和COS-7细胞，仅停留在细胞膜上。由于荧光探针未进入正常细胞，因此无法同细胞内核酸结合产生荧光信号，因此从单光子共聚焦成像结果显示，在成像6h内，正常细胞内均无荧光信号产生。
4、肿瘤细胞摄取实验
将实施例6制备的荧光探针TO-Ac配制为浓度10μM，分别加入到已经孵育好的HepG2细胞和MCF-7细胞(细胞培养密度105cells/ml，皿底覆盖70-80％)的6个培养皿中，在37℃，5％CO2条件下染色6h，并分别在0.5h、1h、2h、3h、4h、5h和6h时间点，选择代表性区域使用OLYMPUS FV1000激光共聚焦显微镜成像，TO-Ac的激发波长为502nm，接收波段为520-550nm，重复实验3次，测试结果显示于图5。
图5(a)为荧光探针化合物TO-Ac对HepG2细胞的染色图；
图5(b)为荧光探针化合物TO-Ac对MCF-7细胞的染色图。
从5中可以看出，荧光探针TO-Ac能够快速进入肿瘤细胞，并且和细胞内核酸特异性结合，产生荧光信号，通过单光子共聚焦成像显示，在0.5h时，肿瘤细胞内部产生荧光信号，并且在6h内间隔成像，荧光信号稳定存在。
5、固定细胞染色实验
将实施例6制备的荧光探针TO-Ac配制为浓度10μM，
将四种固定细胞(HepG2细胞、MCF-7细胞、3T3细胞和COS-7细胞)分为四组，每组三个培养皿，用冰乙醇进行固定，0.5h后加入TO-Ac(10μM)，孵育2h。选择代表性区域使用OLYMPUS FV1000激光共聚焦显微镜成像，TO-Ac的激发波长为502nm，接收波段为520-550nm，重复实验3次，测试结果显示于图6。
图6(a)为HepG2细胞的固定细胞染色图；
图6(b)为MCF-7细胞的固定细胞染色图；
图6(c)为3T3细胞的固定细胞染色图；
图6(d)为COS-7细胞的固定细胞染色图。
从图6中可以看出，由于细胞被固定，细胞膜通透性增强，荧光探针TO-Ac能够进入固定细胞，并同细胞内核酸结合后产生荧光，固定细胞后，无论正常细胞还是肿瘤细胞，均出现荧光染色现象，进一步证明，该荧光探针TO-Ac能够对正常细胞和癌细胞进行区分。
6、混合细胞染色实验
将实施例6制备的荧光探针TO-Ac配制为浓度10μM，分别加入到已经孵育好的混有HepG2细胞和COS-7细胞(细胞培养密度105cells/ml，皿底覆盖70-80％)的3个培养皿中，在37℃，5％CO2条件下染色0.5h，选择代表性区域使用OLYMPUS FV1000激光共聚焦显微镜成像，TO-Ac的激发波长为502nm，接收波段为520-550nm，重复实验3次，测试结果显示于图7。
从图7中可以看出，混养正常细胞和肿瘤细胞后，荧光探针TO-Ac能够选择性对HepG2细胞进行荧光成像，选择性良好(红色圈内为正常细胞COS-7细胞)。
7、流式细胞术染色实验
将实施例6制备的荧光探针TO-Ac配制为浓度10μM，加入到已经孵育好的混有HepG2细胞和COS-7细胞(细胞培养密度105cells/ml，皿底覆盖70-80％)的六孔板中，在37℃，5％CO2条件下染色0.5h，然后使用1.5ml胰蛋白酶在37℃，5％CO2条件下消化细胞2min，刮下细胞后离心，吸取细胞沉淀，加入0.5ml去离子水，混合均匀后，使用Thermo Fisher流式细胞仪进行细胞计数，TO-Ac的激发波长为488nm，接收波段为520-530nm，测试结果显示于图8。
从图8中可以看出，荧光探针TO-Ac对癌细胞(肿瘤细胞)和正常细胞具有良好的区分性，从细胞流式图结果分析，癌细胞荧光强度更强。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一类脂质导向的癌细胞荧光探针，其特征在于，具有如下结构通式Ⅰ
其中，
X1选自C(CH3)2、O、S或Se；
A1选自H、苯基或取代苯基；
R1、R2可以相同或不同，R1和R2各自独立选自C1-C8烷基、C1-C8羟基、C1-C8羧基、C1-8NR5R6、C1-C8酯基、苄基和取代苄基；所述取代苄基由以下基团任意取代：C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、卤素或C1-C8卤代烷基；
Y-选自卤素负离子、ClO4 -、PF6 -、CH3COO-或OTs-中的一种。
2.根据权利要求1所述的一类脂质导向的癌细胞荧光探针，其特征在于，所述A1选自H；
R1、R2不同，R1选自苄基或C1-C8烷基；
R2选自C1-C8烷基或C1-C8羧基；
X1为S。
3.根据权利要求1所述的一类脂质导向的癌细胞荧光探针，其特征在于，所述癌细胞荧光探针为：
4.根据权利要求1-3任意一项所述的一类脂质导向的癌细胞荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：分别制备第一中间体和第二中间体，所述第一中间体具有如下通式Ⅱ的结构，所述第二中间体具有如下通式Ⅲ的结构；
在式Ⅱ中，X1选自C(CH3)2、O、S或Se；
在通式Ⅲ中，X2选自Cl、Br或I，R2选自C1-C8烷基、C1-C8羟基、C1-C8羧基、C1-8NR5R6、C1-C8酯基、苄基和取代苄基；所述取代苄基由以下基团任意取代：C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、卤素或C1-C8卤代烷基；
S2：按照1：2-5的摩尔比将第一中间体和第一化学试剂混合均匀，然后加入第二中间体和催化剂，在惰性气氛保护下，在80-100℃反应4-6h，得到目标荧光探针。
5.根据权利要求4所述的一类脂质导向的癌细胞荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述第一中间体采用如下方法制备：
在惰性气氛保护下，将具有结构通式Ⅳ的化合物和第一卤代试剂在第二有机溶剂中反应制得；
反应时间为6-24h，反应温度为80-110℃，所述化合物Ⅳ与第一卤代试剂的摩尔比为1：2-5。
6.根据权利要求4所述的一类脂质导向的癌细胞荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述第二中间体采用如下方法制备：
在惰性气氛保护下，将具有结构通式Ⅴ的化合物和第二卤代试剂在第三有机溶剂中反应制得；
反应时间为6-24h，反应温度为80-110℃，所述化合物Ⅴ与第二卤代试剂的摩尔比为1：2-5。
7.根据权利要求4所述的一类脂质导向的癌细胞荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述第一中间体和第二中间体的摩尔比为1:1.2-1.5；
所述催化剂选自无机碱或有机碱；所述第一化学试剂选自无水乙醇、无水甲醇或无水乙腈。
8.根据权利要求6所述的一类脂质导向的癌细胞荧光探针的制备方法，其特征在于，所述第一卤代试剂选自Cl、Br或I取代的C1-C8烷基、C1-C8羟基、C1-C8羧基、C1-8NR5R6、C1-C8酯基、苄基和取代苄基；所述取代苄基由以下基团任意取代：C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、卤素或C1-C8卤代烷基；
所述第二有机溶剂选自乙醇、甲醇、乙腈、DMF或乙二醇单甲醚中的任意一种。
9.根据权利要求6所述的一类脂质导向的癌细胞荧光探针的制备方法，其特征在于，所述第二卤代试剂选自Cl、Br或I取代的C1-C8烷基、C1-C8羟基、C1-C8羧基、C1-8NR5R6、C1-C8酯基、苄基和取代苄基；所述取代苄基由以下基团任意取代：C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、卤素或C1-C8卤代烷基；
所述第三有机溶剂选自乙醇、甲醇、乙腈、DMF或乙二醇单甲醚中的任意一种。
10.权利要求1-3任意一项所述的一类脂质导向的癌细胞荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针在以核酸检测为基础的癌细胞或组织特异性荧光成像的应用。
CN202310758755.7A 2023-06-26 2023-06-26 一类脂质导向的癌细胞荧光探针、其制备方法及应用 Pending CN116836159A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310758755.7A CN116836159A (zh) 2023-06-26 2023-06-26 一类脂质导向的癌细胞荧光探针、其制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310758755.7A CN116836159A (zh) 2023-06-26 2023-06-26 一类脂质导向的癌细胞荧光探针、其制备方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116836159A true CN116836159A (zh) 2023-10-03

Family

ID=88171909

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310758755.7A Pending CN116836159A (zh) 2023-06-26 2023-06-26 一类脂质导向的癌细胞荧光探针、其制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116836159A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5313249B2 (ja) ナノ粒子を用いた蛍光共鳴エネルギ移動検出
CN107235946A (zh) 一种谷胱甘肽荧光探针及其制备方法和应用
WO2010126077A1 (ja) 近赤外蛍光化合物
CN110862819B (zh) 基于近红外荧光染料的pH荧光探针及其制备方法和应用
CN112159522B (zh) 一种水溶性罗丹明基荧光/比色双模式探针及其制备方法与应用
CN108982447A (zh) 一种用于检测肼的比率式荧光探针的制备方法及应用
Hao et al. Distinguishing cancer cells from normal cells with an organelle-targeted fluorescent marker
KR102513508B1 (ko) pH 검출용 염료 화합물, 이를 이용한 필름 및 키트
CN114181204A (zh) 一种检测粘度的近红外荧光探针及其制备和应用
CN110357896B (zh) 一类化合物及制备与其在检测二价铜离子和强酸pH中的应用
CN116836159A (zh) 一类脂质导向的癌细胞荧光探针、其制备方法及应用
CN110372681A (zh) 一种用于选择性检测人血清白蛋白的自组装纳米荧光探针的应用
CN112694469B (zh) 基于吡罗红肼的HOCl荧光探针、制备方法及应用
CN111808607B (zh) 一种检测过氧亚硝酰阴离子的荧光探针、制备方法和应用
CN109400616B (zh) 一种二氧化硫衍生物荧光探针及其制备方法和应用
CN110669350B (zh) 一种哌啶基bodipy类红光荧光染料及其制备方法和应用
CN113563298A (zh) 一类含水溶性取代基罗丹明荧光染料其制备方法和应用
CN108250125B (zh) 一种肿瘤靶向探针化合物及其合成和应用
CN110818739B (zh) 一种对肿瘤微环境pH/乏氧协同响应的金属铱配合物及其应用
CN114524809B (zh) 一种香豆素衍生物及其制备方法和应用
CN114574194B (zh) 一种pH荧光探针、其合成方法及其应用
CN114853743B (zh) 一种基于胞嘧啶的花菁探针及其制备方法和应用
CN108676002B (zh) 9-氮(6’-氨基)己基杂双环[3.3.1]壬烷偶联罗丹明b类化合物及用途
CN116284147B (zh) 选择性检测肿瘤细胞内高表达的hNQO1的荧光探针及其应用
CN114456079B (zh) 一种荧光探针化合物、制备方法及作为超氧阴离子指示剂的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination