CN116832171B - 靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统、构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统，其结构为：从骨髓间充质干细胞中提取得到外泌体并与靶向多肽结合，所述靶向多肽可同时靶向外泌体及肾脏组织，所述靶向多肽序列如SEQ IDNo.1所述。本发明提供的外泌体载药系统可以避免在递送药物过程中不必要的损耗，避免损伤靶向器官以外的脏器，更加精准地递送到损伤脏器，因而具有更好的损伤修复能力以及靶向示踪能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种载药系统，具体地说是一种靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统，还涉及该外泌体载药系统的构建方法及其应用。
背景技术
急性肾损伤是一种由多种原因引起的肾功能迅速减退为特征的临床急重综合征，其发病率高、病死率高、预后差，已经成为突出的影响人类健康的疾病之一。近年来，干细胞疗法成为治疗肾缺血再灌注损伤(IRI)-急性肾损伤(AKI)最有前途的治疗方法之一，由于细胞对环境的高度多样性反应，因此比单一药物疗法有更大的潜在价值。特别是骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有在间质纤维化、炎症、血管生成和免疫调节等方面的生物学功能，BMSCs可能通过旁分泌和内分泌因子降低炎症、减少凋亡、促进自噬、改善组织纤维化以及加速肾间质细胞增殖，进而改善IRI后肾脏的结构和功能。BMSCs对肾脏损伤疾病有很高的治疗潜力，但在临床应用中，其移植和治疗效果受到损伤部位病理生理条件的限制，葡萄糖缺乏、氧化应激、缺血和炎症等，均会导致其功能障碍，影响输注的BMSCs的存活，导致到达损伤组织的BMSCs死亡。
发明人在前期研究中发现了骨髓间充质干细胞搭载PINK1激酶的一种新用途，其能够减少急性肾损伤中损伤组织细胞凋亡，降低T细胞浸润，增加巨噬细胞浸润，改善炎症反应，利于修复IRI-AKI时损伤肾组织。但干细胞疗法在临床的应用中仍存在诸多障碍，如副作用、高成本、难以掌握最佳的输注时间以及最佳的输注途径等。发明人在前期研究中还发现BMSCs的输注在修复小鼠肾脏组织损伤的同时，会对肺脏及肝脏造成一定程度的损伤，分析原因可能与细胞栓塞相关。在动物肾脏损伤模型中，静脉注射BMSCs后，由于肺首过效应，大多数细胞被滞留在肺部，并造成肺组织部分损伤。不同方法造成的AKI模型、在不同时间点输注以及输注的不同途径等，均难以避免BMSCs在靶向损伤肾脏的同时被肺屏障并导致肺组织的损伤。发明人同样观察到：PINK1过表达的BMSCs可以减少肺损伤的程度，并可能促进BMSCs进入受损器官，但仍不可避免造成的肺部损伤。
如何解决上述现有技术中的问题，仍然是本领域技术人员的研究重点之一。
发明内容
本发明所要解决的首要技术问题在于提供一种靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统，可以有效靶向损伤肾脏而不损伤其他脏器。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种上述靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统的构建方法。
本发明所要解决的又一技术问题在于提供一种上述靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统的应用。
为实现上述技术目的，本发明采用以下的技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，提供一种靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统，其结构为：从骨髓间充质干细胞中提取得到外泌体并与靶向多肽结合，所述靶向多肽同时靶向外泌体及肾脏组织，所述靶向多肽序列如SEQ ID No.1所述。
其中较优地，所述外泌体载药系统由下述构建方法获得：
(1)由骨髓间充质干细胞(MUBMX-01001；Cyagen，苏州，中国)中提取外泌体，提取得到的外泌体满足在投射电镜下具有外泌体基本特征，符合外泌体粒径要求，检测到表面蛋白CD9、CD63、CD81的表达和Cal nexi n的阴性结果；
(2)将步骤(1)得到的骨髓间充质干细胞外泌体与SEQ ID No.1所述的靶向多肽孵育结合。
其中较优地，所述步骤(2)具体为：将外泌体与SEQ ID No.1所述的靶向多肽在血清液中预孵育6小时以上；用PBS洗涤；过滤去除游离多肽。
其中较优地，所述外泌体载药系统携带有P INK1激酶。
根据本发明实施例的第二方面，提供一种靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统的构建方法，具体步骤如下：
(1)由骨髓间充质干细胞中提取外泌体，提取得到的外泌体满足在投射电镜下具有外泌体基本特征，符合外泌体粒径要求，检测到CD9、CD63、CD81的表达和Calnex in的不表达；
(2)将步骤(1)得到的骨髓间充质干细胞外泌体与SEQ ID No.1所述的靶向多肽孵育结合。
其中较优地，所述步骤(2)具体为：将外泌体与SEQ ID No.1所述的靶向多肽在血清液中预孵育6小时以上；用PBS洗涤；过滤去除游离多肽。
根据本发明实施例的第三方面，提供一种靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统的构建方法，将上述步骤(2)制备的外泌体和P INK1等比例混合在电穿孔缓冲液中制备电穿孔混合物。
上述靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统在制备治疗肾脏组织损伤或疾病的药物中的应用。
需要说明的是，本发明所提供的外泌体载药系统的结构特征可以实现本发明所述的技术效果。本发明所提供的构建方法是发明人推荐方法，但并不唯一，本领域技术人员公知的构建方法也可以应用于本发明所提供的外泌体载药系统的构建。
另外，本发明所提供的外泌体载药系统携带的治疗药物不唯一，PINK 1激酶是发明人实验药物，本发明所提供的外泌体载药系统也可以携带本领域技术人员公知的其他治疗肾脏的药物，如RNA药物或化疗药物等。
与现有技术相比较，本发明具有以下的技术效果：
(1)本发明提供的BMSCs外泌体结合靶向损伤肾脏组织的多肽R1构建的载药系统可携带表达PINK1激酶等肾脏治疗药物，有效地解决了现有技术中过表达PINK1的骨髓间充质干细胞在治疗肾损伤时，由于肺的首过效应造成的其他脏器，如肺和肝脏的损伤，更加精准的靶向损伤肾脏，作为替代细胞移植的方案对急性肾损伤具有显著的治疗潜力、治疗吸引力和临床应用价值。
(2)本发明提供的载药系统携带PINK1激酶具有更强更直接的促进损伤肾组织修复的能力，携带大量细胞因子和生长因子促进免疫抑制、抗炎、抗凋亡和增殖作用，有效促进肾功能的恢复。
(3)本发明提供的载药系统可以避免P INK1在递送过程中不必要的损耗，避免损伤靶向器官以外的脏器，更加精准地递送到损伤脏器，因而具有更好的损伤修复能力以及靶向示踪能力。
附图说明
图1A为靶向多肽的筛选以及R1-EXO的结构示意图；
图1B为靶向多肽的筛选以及R2-EXO的结构示意图；
图1C为靶向多肽的筛选以及R3-EXO的结构示意图；
图2A为细胞上清中的外泌体图，图2B和图2C为外泌体的粒径分析图；
图3为外泌体的WB分析图；
图4A～图4D为外泌体的纳米流式分析图；
图5A为实验验证R1-EXO对组织的损伤情况中R1-EXO结果图；
图5B为R2-EXO对组织的损伤情况实验结果中R2-EXO结果图；
图5C为R3-EXO对组织的损伤情况实验结果中R3-EXO结果图；
图6为小鼠单侧肾损伤模型示意图；
图7A为单纯标记PKH67的EXO流式细胞仪实验结果图；
图7B为标记PKH67的R1-EXO靶向载药系统流式细胞仪实验结果图；
图8A为构建的R1-EXO-PINK1的结构示意一；
图8B为构建的R1-EXO-PINK1的结构示意二；
图9为靶向载药系统对肾、肝、肺组织的修复作用的病理HE染色图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术内容进行详细具体的说明。
实施例1靶向多肽的筛选及构建
1.首先确定靶向锚定肾小管上皮细胞的序列(KKEEE)3K，使目标载体向巨蛋白肾皮质内近端小管细胞的顶端聚集，并确定了三条靶向骨髓间充质干细胞外泌体的多肽，分别如SEQ ID No.1-3所示。
2.为了更好地在流式细胞仪上示踪靶向多肽的靶向性，分别将上述三条序列与罗丹明B染料及序列(KKEEE)3K结合，得到荧光靶向多肽链R1、R2和R3。本发明提供的载药系统的多肽在实际临床应用中可不连接染料。
R1(SEQ ID No.1)：KKEEEKKEEEKKEEEKCRHSQMTVTSRL
R2(SEQ ID No.2)：KKEEEKKEEEKKEEEKAHLHNRS
R3：(SEQ ID No.3)：NVFTVSPCRHSQMTVTSRL
3.通过流式细胞术进行靶向载药系统对小鼠原代肾小管上皮细胞(CP-M062；Procel l，Wuhan，China)靶向性的验证，我们将外泌体标记了PKH67(FITC)，靶向多肽带有罗丹明B(PE)，经过多次实验并进行统计后，携带R1的外泌体系统最多可锚定26.8％左右的小鼠肾小管上皮细胞，较R2、R3明显锚定更多靶细胞。因此多肽R1在外泌体靶向肾小管上皮细胞中最具优势，如图1A、图1B和图1C所示。
实施例2骨髓间充质干细胞外泌体(Exos)与多肽构建肾脏组织靶向载药系统
1.外泌体的提取：
骨髓间充质外泌体的提取方法有多种，只要可以提取得到符合本发明要求的外泌体均可用于本发明，条件为：透射电镜显示外泌体的基本特征，外泌体的粒径分布为30-150nm，纳米流式细胞术和WB对外泌体进行鉴定，检测到外泌体中CD9、CD63、CD81和Calnexin的表达。
本实施例使用的提取方法为两步超离法，通过两步超离法提取得到的外泌体更纯净，具体方法如下：
两步超离法：将无外泌体血清培养的骨髓间充质干细胞样本，样本为骨髓间充质干细胞(MUBMX-01001；Cyagen，苏州，中国)的细胞上清。取出，25℃水浴解冻，冰上放置；4℃，2000×g，离心10min，取上清；4℃，10000×g，离心30min，取上清；样本转移至超高速离心管中，4℃，110000×g，离心75min，弃上清；用1mL 1×PBS重悬沉淀，重悬后各用1×PBS稀释，0.22um膜过滤；样本转移至超高速离心管，4℃，110000×g，离心75min，弃上清；沉淀用相应的1×PBS重悬，分装，-80℃保存。
现有技术中使用的试剂盒法同样可以用于本发明。试剂盒法的优点是简便，具体方法为：样本与试剂的比例→2:1；10ml细胞上清，3000×g，离心15min，去除细胞碎片；将上清移至新的离心管中，加入5ml试剂，颠倒混匀；4℃，孵育过夜，并保持直立；混合液1500xg，离心30min(室温或者4℃)；离心后的底部沉淀为外泌体，吸除上清，将残留的混合液1500g，离心5min，弃上清；沉淀用100-150μl无菌1xPBS重悬，(立即使用，不建议分装)。
2.外泌体的鉴定
图2A为细胞上清中的外泌体图，图中电镜视野下均可见清晰的囊泡结构，而且囊泡粒径大小符合外泌体的检测标准，为大小100nm左右的双层膜结构囊性小泡；图2B和图2C为外泌体的粒径分析图，图中粒径分析显示，目标外泌体的直径约在118nm，样本粒径大小整体符合标准。
图3为外泌体的WB分析图：全部样本检测到外泌体表面标志物CD9、CD63表达，无Calnexin表达。
图4A～图4D为外泌体的纳米流式分析图：纳米流式结果提示，外泌体表面蛋白CD9、CD63、CD81表达均有阳性率，其中CD9表达约6.1％、CD63表达约3.4％、CD81表达约2.0％。
3.靶向多肽R1与外泌体EXO结合构建R1-EXO
将上述方法得到的外泌体(30μg)与罗丹明b标记的靶向多肽R1(30μg)在4℃ 4％牛血清液中预孵育一夜。用PBS在2ml超速离心管中洗涤5次。用100kDa透析管(透析袋)(微孔)过滤去除游离小分子多肽，以测定候选多肽与外泌体的亲和力。将肽外泌体复合物(30μg)与HK2在室温下旋转孵育15min，并用PBS洗涤3次。回收的HK2用常规荧光显微镜和流式细胞仪观察。
R1-EXO外泌体的PKH67标记与追踪：
100μlPBS重悬R1-EXO，取50μl PBS-EXO+0.5ml Di luent C混匀，4μlPKH67+0.5mlDi luent C混匀，步骤3的试剂加入步骤2液体中，4min，1ml0.5％BSA终止染色，外泌体提取试剂盒试剂重提EXO，最终PKH67母液稀释比为2:500。
实施例3通过细胞实验将R1-EXO、R2-EXO与R3-EXO靶向载药系统进行对比,进一步
研究各载药系统对组织的损伤情况
(1)实验方法：分别将上述方法制备得到的R1-EXO、R2-EXO与R3-EXO锚定小鼠的肾小管上皮细胞，通过流式细胞术对R1-EXO载、R2-EXO与R3-EXO载药系统进行对比。
(2)实验结果：如图5A、图5B及图5C所示，图5A为R1-EXO结果，图5B为R2-EXO实验结果，图5C为R3-EXO实验结果。由图中可以看出R3-EXO在靶向组织的同事造成大量组织细胞损伤，R1-EXO、R2-EXO在靶向损伤肾脏组织的同时，并不会对组织细胞造成损伤。由于携带R1的外泌体系统最多可锚定26.8％左右的小鼠肾小管上皮细胞，较R2、R3明显锚定更多靶细胞，而且不会对组织细胞造成损伤，因此优选R1-EXO载药系统。
实施例4构建小鼠单侧肾损伤模型进一步验证R1-EXO在肝、肺、损伤肾组织以及未
损伤肾组织中的分布情况
(1)实验方法：图6为小鼠单侧肾损伤模型示意图。通过构建小鼠单侧肾损伤模型，尾静脉分别注射标记了PKH67的R1-EXO靶向载药系统，以及单纯PKH67标记的EXO，24H后取小鼠双侧肾、肝、肺组织，冰冻切片后荧光显微镜观察EXO的分布情况；
(2))实验结果：如图7A和图7B所示，图7A为单纯PKH67标记的EXO实验结果，图7B为标记了PKH67的R1-EXO靶向载药系统实验结果。由图中可以看出，注射R1-EXO靶向载药系统的损伤肾组织中有更多的EXO绿色示踪荧光浸润，且多分布在肾小管，而肝、肺以及未损伤侧肾组织中绿色荧光较少；而单纯注射EXO的情况，除损伤侧肾组织，肝、肺以及未损伤肾组织中也均可见EXO绿色荧光，且肾组织中的绿色荧光多位于肾组织表面，并未向组织中浸润。
以上说明本发明所提供的R1-EXO靶向载药系统可以精准靶向损伤肾组织，而对其他组织无损伤，有效避免了现有技术中在修复肾脏组织损伤的同时对肺脏、肝脏等其他组织造成的伤害。
实施例5构建R1-EXO-PINK1
(1)构建方法：R1-EXO载入PINK1：将R1-EXO和PINK1以1：1(wt/wt)的比例混合在电穿孔缓冲液中制备电穿孔混合物，混合物中外泌体的最终浓度不超过0.5μg/μl。装载大数量的外泌体时，一次电穿孔400μl，然后将批次合并。电穿孔混合物中外泌体的最终浓度不应超过0.5μg/μl，大约25％的PINK1质粒被装载到外泌体中。
具体推荐方法为：
a.在0.4mm的试管中，400mV和125μF电容(脉冲时间10-15ms)下，对400μl R1-EXO和PINK1混合物进行电穿孔；
b.电穿孔后洗涤外泌体：将所有R1-EXO-PINK1外泌体重新悬浮在含有1％(wt/vol)BSA的20ml PBS中。超速离心，120,000g，4℃保温70分钟；通过无菌针头将外泌体颗粒重新悬浮在含有1％(wt/vol)BSA的PBS中三到五次，防止外泌体聚集在一起；
需要说明的是，在后续动物实验中，给小鼠注射外泌体时，应将外泌体重新悬浮在5％(wt/vol.)葡萄糖中。
构建的R1-EXO-PINK1的结构示意图如图8A和图8B所示。
本发明实施例构建的R1-EXO-PINK1靶向载药系统可以精准地锚定肾损伤组织，并且不会对其他组织造成损伤。本发明提供的载药系统可精准给药，并且可充分发挥携带的肾损伤治疗药物PINK1的治疗功效。
实施例6构建小鼠单侧肾损伤模型进一步验证R1-EXO-PINK1对肝、肺、损伤肾组织
以及未损伤肾组织的修复功能情况
(1)实验方法：通过构建小鼠单侧肾损伤模型，尾静脉分别注射R1-EXO-PINK1靶向载药系统、单纯搭载PINK1的外泌体EXO-PINK1，以及过表达PINK1的骨髓间充质干细胞BMSC-PINK1。24H后收集小鼠双侧肾、肝以及肺组织，样本用福尔马林固定。石蜡包被固定样本组织，4μm厚连续切片，常规做苏木素-伊红(hematoxyl in-eos in，HE)染色，光学显微镜下观察；
(2)实验结果：图9为靶向载药系统对肾、肝、肺组织的修复作用的病理HE染色图。由此可以看出，骨髓间充质干细胞BMSC搭载PINK1，虽然可以修复损伤的肾脏组织，但是造成了肝脏以及肺脏的损伤；较BMSC-PINK1，R1-EXO-PINK1不仅有同样修复损伤肾脏组织的作用，而且对肝脏、肺脏的损伤明显减轻，特别是肺脏；单纯EXO-PINK1对损伤肾脏的修复作用较BMSC-PINK1、R1-EXO-PINK1差，可能是由于EXO-PINK1不能精准到达损伤部位且到达损伤部位的PINK1载量较少，并且仍能看到肺组织的损伤；R1-EXO-PINK1较单纯EXO-PINK1则具有更精准的靶向损伤肾脏的功能，对损伤的肾脏有更好的修复作用。因此，本发明所提供的R1-EXO-PINK1靶向载药系统可以避免P INK1在递送过程中不必要的损耗，避免损伤靶向器官以外的脏器，更加精准地递送到损伤脏器，因而具有更好的损伤修复能力以及靶向示踪能力。
上面对本发明所提供的靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统、构建方法及其应用进行了详细的说明。对本领域的一般技术人员而言，在不背离本发明实质内容的前提下对它所做的任何显而易见的改动，都将构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。
Claims (9)
1.一种靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统，其特征在于结构为：
骨髓间充质干细胞来源外泌体与靶向多肽结合，所述靶向多肽可同时靶向外泌体及肾脏组织，所述靶向多肽序列如SEQ ID No.1所述。
2.如权利要求1所述的靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统，其特征在于由下述构建方法获得：
（1）由骨髓间充质干细胞中提取外泌体，提取得到的外泌体满足在投射电镜下具有外泌体基本特征，符合外泌体粒径要求，检测到CD9、CD63、CD81表达和Calnexin的不表达；
（2）将步骤（1）得到的骨髓间充质干细胞外泌体与SEQ ID No.1所述的靶向多肽孵育结合。
3.如权利要求2所述的靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统，其特征在于所述步骤（2）具体为：
将外泌体与SEQ ID No.1所述的靶向多肽在血清液中预孵育6小时以上；用PBS洗涤；过滤去除游离多肽。
4.如权利要求1所述的靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统，其特征在于还携带有PINK1激酶。
5.权利要求1至4中任意一项所述的靶向肾脏组织的外泌体载药系统在制备治疗肾脏组织损伤的药物中的应用。
6.一种权利要求1所述的靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）由骨髓间充质干细胞中提取外泌体，提取得到的外泌体满足在投射电镜下具有外泌体基本特征，符合外泌体粒径要求，检测到CD9、CD63、CD81的表达 和Calnexin的不表达；
（2）将步骤（1）得到的骨髓间充质干细胞外泌体与SEQ ID No.1所述的靶向多肽孵育结合。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于所述步骤（2）具体为：
将外泌体与SEQ ID No.1所述的靶向多肽在血清液中预孵育6小时以上；用PBS洗涤；过滤去除游离多肽。
8.一种权利要求4所述的靶向损伤肾脏组织的外泌体载药系统的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）由骨髓间充质干细胞中提取外泌体，提取得到的外泌体满足在投射电镜下具有外泌体基本特征，符合外泌体粒径要求，检测到CD9、CD63、CD81的表达 和Calnexin的不表达；
（2）将步骤（1）得到的骨髓间充质干细胞外泌体与SEQ ID No.1所述的靶向多肽孵育结合；
（3）将步骤（2）制备的外泌体和PINK1激酶等比例混合在电穿孔缓冲液中制备电穿孔混合物。
9.权利要求6至8中任意一项所述构建方法构建得到的靶向肾脏组织的外泌体载药系统在制备治疗肾脏组织损伤的药物中的应用。
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