CN116832025A - 维拉帕米在制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品中的用途 - Google Patents

维拉帕米在制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药领域，公开了维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物在制备预防或治疗椎间盘退变产品中的用途。本发明通过应用TBHP诱导氧化应激构建椎间盘退变模型，观察维拉帕米对椎间盘退变的治疗作用，通过观察氧化应激和椎间盘退变表型的相关指标以评估维拉帕米对于椎间盘退变的治疗作用。并且通过蛋白印迹试验以证明维拉帕米抑制氧化应激缓解椎间盘退变的机制。椎间盘内氧化应激参与加速退变，维拉帕米通过降低TXNIP蛋白的异常上调，减轻氧化应激引起细胞外基质降解、凋亡及炎症延缓椎间盘退变，为退变治疗指出了新方向。

Description

维拉帕米在制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品中的用途
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及维拉帕米制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品中的用途。
背景技术
下腰痛作为骨科门诊最常见主诉之一，是影响伤残调整生命年(disability-adjusted life-years,DALYs)的十大疾病原因之一。椎间盘退变(intervertebral discdegeneration,IVDD)作为公认引起下腰痛的重要风险因素，现阶段针对退变后所引起疼痛的保守治疗效果并不理想，多数患者最终仍需手术治疗，因此带来的经济、潜在医源性损伤和心理问题不可避免。因此如何针对IVDD防治下腰痛是目前脊柱外科领域的重难点研究。在患者椎间盘退变临床病理标本及基础研究中发现髓核组织的异常改变显著，因此关于髓核细胞代谢、命运及细胞外基质分泌的研究是防止IVDD的关键。基于这些，研究干预椎间盘退变、保护髓核细胞的药物应用具有极其重要的临床意义及科研价值。
维拉帕米(Verapamil)是一种钙通道阻滞剂，临床应用已有五十余年历史。其广泛应用于高血压，心绞痛、肥厚型心肌病和快速性心律失常等心内科疾病。此外，近年来还有将维拉帕米应用于治疗神经内科疾病如脑血管病、偏头痛，血管外科疾病如血管痉挛，普外科疾病如腹痛、食道失驰缓症，心内科疾病如肺动脉高压和产科如早产情况等。然而，维拉帕米是否可以延缓椎间盘退变，目前尚无有关报道，本发明由此而来。
发明内容
本发明的目的在于提供一种维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物在制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品的用途。本发明公开了维拉帕米作为药物的新用途，说明维拉帕米对治疗椎间盘退行性病变有良好效果。
发明人经过研究发现GEO数据库中椎间盘退变相关人类髓核样本和叔丁基过氧化氢(TBHP)刺激的大鼠髓核细胞中硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)表达异常增加，且病灶粘附、细胞外基质受体相互作用和凋亡通路在髓核退变时表达变化显著。并且进行了RNA和蛋白质水平的实验，结果显示在氧化应激失衡条件下，髓核细胞中TXNIP显著上调。
基于此，本发明技术方案首先采取叔丁基过氧化氢(TBHP)诱导大鼠髓核细胞产生氧化应激，应用维拉帕米干预来观察是否其能延缓髓核细胞的退变，应用RT-qPCR、Westernblotting、细胞免疫荧光、流式细胞技术等手段测定：活性氧簇(ROS)、基质金属蛋白酶3(MMP-3)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶13(MMP-13)、ADAMTS5、SOX9和TXNIP等的水平，评估维拉帕米对椎间盘退变的影响及其作用机制。经过实验证明维拉帕米抑制TBHP诱导下的细胞凋亡(通过BAX和cleaved caspase-3测量)、氧化应激介质(ROS)和与ECM降解相关的分解代谢因子(MMP3、MMP9、MMP13、ADAMTS5)。此外，验证了维拉帕米对细胞存活促进因子(Bcl-2)和ECM合成代谢因子(SOX9)上调的髓核细胞保护作用。还发现验证了维拉帕米可上调Nrf2和相应的下游途径，如TBHP刺激的NP中的HO-1和NQO1，从而抑制TXNIP/NLRP3轴的激活，以此进一步抑制炎性细胞因子如IL-1β的产生。
本发明第一方面提供维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物在制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品的用途。
在一些实施方式中，所述用途制备下列产品中的一项或多项：
1)用于挽救髓核细胞外基质异常降解的产品；2)用于保护髓核细胞、抑制髓核细胞凋亡和/或焦亡的产品；3)用于降低氧化应激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态的产品；4)用于减少细胞内TXNIP表达水平的产品；5)用于调节TXNIP的上游和/或下游信号通路的产品；6)用于降低炎症刺激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态的产品；7)用于维持椎间隙高度，延缓椎间盘退变的发展的产品；8)用于提高椎间盘的应激与修复能力的产品；9)用于预防、减轻或延缓由氧化应激引起的椎间盘退变产品。
具体的，1a)所述挽救髓核细胞外基质异常降解的产品为下调MMP3基因表达、和/或下调MMP9基因表达、和/或下调MMP13基因表达、和/或下调ADAMTS5基因表达、和/或上调ECM合成代谢因子SOX9的产品；2a)所述保护髓核细胞的产品为上调Bcl-2基因表达、和/或下调Bax基因表达、和/或下调cleaved caspase-3基因表达的产品；3a)所述降低氧化应激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态的产品为抑制ROS氧化应激介质表达的产品；4a)所述减少细胞内TXNIP表达水平的产品为激活Nrf2并抑制TXNIP降低NLRP3炎症小体的形成产品；5a)所述调节TXNIP的上游信号通路的产品为调节Nrf2基因表达的产品，所述调节TXNIP的下游信号通路的产品为调节NLPR3基因表达的产品；6a)所述降低炎症刺激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态的产品为上调Nrf2和相应的下游途径，从而抑制TXNIP/NLRP3轴的激活，从而抑制炎性细胞因子如IL-1β基因表达的产品。
在一些实施方式中，所述产品的活性成分选自维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。
在一些实施方式中，所述产品中活性成分的含量为0.001-99wt％，根据活性成分的含量根据具体需求进行选择，例如0.001-1wt％，1-10wt％，10-20wt％，20-30wt％，30-40wt％，40-50wt％，50-60wt％，60-70wt％，70-80wt％，80-90wt％或90-99wt％。对于预防性保护椎间盘退变，促进椎间盘的干细胞龛内细胞有效向髓核细胞分化中的用途中，只要添加0.001wt％；对于有临床症状的椎间盘退变，为改善椎间盘内髓核的增殖代谢以及细胞外基质表达的用途中，需要添加99wt％，该用途中一般予以局部椎间盘内单药注射，无需联合其它药物。
在一些实施方式中，所述产品选自组合物或制剂；优选的，所述组合物自药物组合物、化妆品组合物、膳食补充剂、食品组合物或保健品组合物；再优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料；更优选的，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂、或注射剂。临床工作中对于严重椎间盘退变一般选用脊柱微创手术、脊柱内固定融合术，手术中通过内固定、融合邻近节段椎体以保护神经免遭压迫。含有维拉帕米的产品可以通过各种方式向需要的对象施用，使用方便。
本发明第二方面提供一种组合物，包括维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。所述组合物为药物组合物。优选的，所述药物组合物的主要活性成分为维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。更优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
本发明第三方面提供上述组合物在制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品中的用途。
本发明第四方面提供一种体外筛选预防或减轻椎间盘退变药物的方法，所述方法包括：1)以TXNIP为药物靶点，寻找能够抑制或阻断TXNIP的表达或功能的物质作为候选药物；2)向体外细胞培养体系中施加待选药物，共培养检测细胞中的TXNIP含量；3)与对照组相比，TXNIP含量降低，判定为目标药物。
本发明第五方面提供一种体外抑制TXNIP表达量的方法，所述方法包括：将维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物与细胞培养体系混合培养。
具体的，体外减少TXNIP蛋白表达量中的方法中所述培养体系中至少包括如下技术特征中的至少一项；维拉帕米的浓度为0.01-100μM；所述细胞来源于哺乳动物；优选的，所述细胞选自人细胞；所述细胞为体细胞；所述细胞选自骨髓间充质干细胞、骨祖细胞、成骨前体细胞、成骨细胞、软骨祖细胞、软骨细胞或其组合。
本发明的有益效果在于：
1)本发明发现椎间盘退变中，TXNIP表达异常增加，因此将维拉帕米应用到制备预防、减轻或延缓椎间盘退变的产品中。并证实了维拉帕米可以减轻和延缓椎间盘退变。具体的，维拉帕米可以有效地降低髓核细胞内TXNIP水平，挽救退变下细胞外基质降解，维持椎间盘细胞外基质稳定，从而减轻椎间盘退变。
2)维拉帕米作为一种已上市的老药，具有较高的使用安全性，临床工作中维拉帕米一般是作为治疗高血压、心绞痛或抗心律失常等心血管疾病用药，本发明首次发现活性成分维拉帕米(或含维拉帕米的组合物和产品)可应用于保护髓核细胞，延缓椎间盘退变疾病。
3)根据椎间盘退变的严重程度，控制组合物或制剂中的维拉帕米的含量为0.001～99wt％，对于预防性保护椎间盘退变，促进椎间盘的干细胞龛内细胞有效向髓核细胞分化中，只要添加0.001wt％即可，对于有临床症状的椎间盘退变，为改善椎间盘内髓核的增殖代谢以及细胞外基质表达需要添加99wt％，一般予以局部椎间盘内单药注射，无需联合其它药物。
4)通过椎间盘内局部给药的方式，维拉帕米展现出保护髓核细胞减轻椎间盘退变作用，避免全身给药造成的系统性影响。
附图说明
图1为GEO数据库中生物信息学分析结果。A为所使用GSE70362数据集数据清洗校正后表达情况的箱线图，横坐标表示数据集内样本名称，纵坐标表示归一化后的表达水平；B为数据集主成成分分析，横、纵坐标表示样本在前两个主成成分方向上的变异性；C为以P＜0.05和|Fold Change|＞0.5时数据集内基因表达火山图，横坐标表示基因表达的变化水平，纵坐标表示基因变化的p值情况；D为GSE70362中TXNIP在对照组(Pfirrmann分级I-II级)与退变组(Pfirrmann分级III-V级)表达的比较情况，横坐标表示数据集内样本分组，纵坐标表示基因表达水平；E为该数据集内KEGG通路富集情况，横坐标表示富集到该KEGG条目中的基因数目；F-H分别为大鼠原代髓核细胞氧化应激环境下分别在RNA和蛋白表达水平的改变，其中F、H图横坐标表示TBHP作用浓度，纵坐标表示TXNIP相对于内参β-actin的表达水平。
图2为维拉帕米对髓核细胞活力的影响。A为维拉帕米的化学结构；B为不同浓度维拉帕米对细胞毒性试验结果统计分析图；C-E为不同浓度维拉帕米分别对细胞作用12、24、48小时的细胞增殖试验结果统计分析图；F为不同浓度TBHP对细胞毒性试验结果统计分析图；G为不同浓度维拉帕米对TBHP刺激的细胞死亡的影响试验结果统计分析图，其中B-G图横坐标表示维拉帕米和/或TBHP浓度，纵坐标表示细胞增殖、存活水平。
图3为维拉帕米在体外减轻TBHP体外诱导的ECM降解。A为RT-qPCR试验结果统计分析图，横坐标表示维拉帕米及TBHP浓度，纵坐标表示各目的基因在RNA层面表达水平；B为蛋白印迹试验，试验结果显示TBHP刺激后MMP家族上调，SOX9降低；C为蛋白印迹试验结果的统计分析图，横坐标表示维拉帕米及TBHP浓度，纵坐标表示目的基因在蛋白层面表达水平；D为MMP9和MMP13的免疫荧光染色结果示意图和对应的统计图，统计图中横坐标表示维拉帕米及TBHP浓度，纵坐标表示荧光强度相对水平。
图4为维拉帕米在体外减轻TBHP体外诱导的髓核细胞凋亡增加。A为流式细胞术检测Annexin V-FITC、PI印染后不同组凋亡细胞情况；B为流式细胞术结果的定量分析，横坐标表示维拉帕米及TBHP浓度，纵坐标表示凋亡细胞数量。C为蛋白印迹试验，试验结果显示TBHP刺激后Bax、cleaved caspase-3上调，Bcl-2降低；D-F为蛋白印迹试验结果的统计分析图，横坐标表示维拉帕米及TBHP浓度，纵坐标表示目的基因在蛋白层面表达水平。
图5为维拉帕米在体外减轻TBHP体外诱导的髓核细胞焦亡增加并缓解胞内ROS的产生。A为RT-qPCR试验结果统计分析图，横坐标表示维拉帕米及TBHP浓度，纵坐标分别表示ASC、CASPASE1、IL-1β、NLRP3在RNA层面表达水平；B为蛋白印迹试验，TBHP刺激后焦亡显著增加，予以维拉帕米处理后相应减轻；C为蛋白印迹试验结果的统计分析图，横坐标表示维拉帕米及TBHP浓度，纵坐标表示目的基因在蛋白层面表达水平；D为流式细胞术检测DCFH-DA印染后不同组细胞内ROS产生情况及定量，横坐标表示维拉帕米及TBHP浓度，纵坐标为ROS阳性细胞数。
图6为维拉帕米在体外通过抑制TXNIP上调Nrf2及其下游相关基因的激活。A为蛋白印迹试验，TBHP刺激后TXNIP表达随时间呈波动性改变；B为蛋白印迹试验结果的统计分析图，横坐标表示维拉帕米及TBHP浓度，纵坐标表示目的基因在蛋白层面表达水平；C为RT-qPCR试验结果统计分析图，横坐标表示维拉帕米及TBHP浓度，纵坐标表示TXNIP在RNA层面表达水平；D为蛋白印迹试验，TBHP刺激后Nrf2在核内表达上调，维拉帕米处理后其表达进一步增加，Nrf2下游基因包括HO-1、NQO1变化趋势在细胞内与Nrf2相同；TXNIP表达在TBHP刺激后上调，维拉帕米处理后下降；E为蛋白印迹试验结果的统计分析图，横坐标表示维拉帕米及TBHP浓度，纵坐标分别表示目的基因Nrf2、TXNIP、HO-1、NQO1在蛋白层面分别相较于Lamin B和β-actin的表达水平；F为为HO-1和NQO1的免疫荧光染色结果示意图和对应的统计分析图，统计分析图的横坐标表示维拉帕米及TBHP浓度，纵坐标表示荧光强度相对水平。
图7为维拉帕米在体内可减轻针刺诱导的大鼠尾椎IVDD模型。A为HE、SO&FG组织切片，退变后椎间隙高度降低、髓核与纤维环、软骨终板分界模糊，予以维拉帕米处理后上述情况改善；B为组织分析的统计分析图，横坐标为实验动物分组，纵坐标为组织评分；D为影像学MRI、X线结果，退变后对应椎间隙含水量下降、椎间隙缩窄；E为针对影像学的评分，横坐标为实验动物分组，纵坐标为椎间隙高度、Pfirrmann分级评分；F为Tunel印染下评估体内退变模型的凋亡细胞情况，退变组凋亡细胞数量增加，予以维拉帕米处理后凋亡缓解；C为Tunel实验统计分析图，横坐标为实验分组，纵坐标为阳性细胞数；H为免疫组化，退变后MMP9、MMP13、NLRP3及Nrf2表达增加，予以维拉帕米后MMP9、MMP13及NLRP3下调，Nrf2表达显著增加；G为免疫组化的统计分析图，横坐标为实验分组，纵坐标为MMP9、MMP13、NLRP3及Nrf2的累积光密度IOD相对值。
具体实施方式
IVDD是一种与年龄相关的退行性疾病，其特征是细胞死亡和炎症微环境的持续存在。IVDD的病因，如遗传学、机械负荷、衰老、吸烟和其他因素，其中氧化应激的作用不容忽视。本发明人首次研究证实了维拉帕米可以通过调节Nrf2/TXNIP/NLRP3轴来抑制TBHP刺激的氧化应激失衡和大鼠NP细胞的焦亡。并还验证了维拉帕米可以在体内延缓IVDD的发展。这些结果揭示了维拉帕米作为IVDD的一种全新的治疗方式，为开发预防或治疗IVDD相关产品提供借鉴。
本发明提供了TXNIP抑制剂(维拉帕米)或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物在制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品的用途。
所述用途包括如下中的至少一项：
1)挽救髓核细胞外基质异常降解，具体的，抑制ECM降解相关的分解代谢因子异常增加(MMP3、MMP9、MMP13、ADAMTS5)。维拉帕米对ECM合成代谢因子(SOX9)上调的髓核细胞保护作用。
2)保护髓核细胞、抑制髓核细胞凋亡，维拉帕米可以增加Bcl-2、抑制Bax和cleaved caspase-3的表达。
3)降低氧化应激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态，具体的，通过抑制氧化应激介质(ROS)表达。
4)减少细胞内TXNIP表达水平；具体的，通过激活Nrf2并抑制TXNIP进一步降低炎症小体(NLRP3)的形成。
5)调节TXNIP的信号通路，具体的，调节上游信号通路中的Nrf2，调节下游信号通路中的NLPR3。
6)降低炎症刺激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态；维拉帕米可上调Nrf2和相应的下游途径，如TBHP刺激的NP中的HO-1和NQO1，从而抑制TXNIP/NLRP3轴的激活，以此进一步抑制炎性细胞因子如IL-1β的产生。
7)维持椎间隙高度，延缓椎间盘退变的发展；
8)提高椎间盘的应激与修复能力；
9)用于预防、减轻或延缓由氧化应激引起的椎间盘退变产品。
本发明应用中，所述TXNIP抑制剂对于TXNIP的抑制效果包括但不限于：抑制TXNIP的活性或者抑制TXNIP的基因转录或者表达。TXNIP抑制剂是指针对抑制剂具有抑制效果的化合物，该化合物能够降低细胞内抑制剂的含量和/或功能。具体的，所述TXNIP抑制剂为单一活性成分(有效成分维拉帕米)或几种成分的组合。再具体的，维拉帕米在制备预防或减轻椎间盘退变产品中的用途具体是指：将维拉帕米作为退变产品的活性成分。更具体的，产品中活性成分的含量为0.001-99wt％。
在一具体实施例中，所述产品选自组合物或制剂，根据椎间盘退变的严重程度，控制组合物或制剂中的维拉帕米的含量为0.001～99wt％，对于预防性保护椎间盘退变，促进椎间盘的干细胞龛内细胞有效向髓核细胞分化中，只要添加0.001w％即可，对于有临床症状的椎间盘退变，为改善椎间盘内髓核的增殖代谢以及细胞外基质表达需要添加99w％，一般予以局部椎间盘内单药注射，无需联合其它药物。
在一具体实施例中，所述组合物自药物组合物、化妆品组合物、膳食补充剂、食品组合物或保健品组合物。
在一具体实施例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料，具体为药学上可接受的载体或介质，例如无菌水或生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸)、缓冲剂(磷酸和其它的有机酸)、防腐剂、表面活性剂、螯合剂、粘合剂或者其它低分子量的多肽。
本发明还提供了一种组合物，及该组合物在制备预防或减轻椎间盘退变产品中的用途。具体的，组合物包括维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物，其中，组合物为药物组合物，药物组合物中采用两种活性成分构成组合。所述药物组合物的主要活性成分为维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物；更优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。辅料与上述所述药学上可接受选择相似。
本发明所提供的活性成分或含所述活性成分的药物组合物可以适应于任何形式的给药方式，可以是口服、外敷或注射给药。
如本文所用，所述药物组合物的剂型选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂、或注射剂。具体的，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂或糖浆等；适合注射给药的可以是注射剂、注射用无菌粉末等。
本发明还提供了一种体外筛选预防或减轻椎间盘退变产品的药物的方法，1)以TXNIP为药物靶点，寻找能够抑制或阻断TXNIP的表达或功能的物质作为候选药物；2)向体外细胞培养体系中施加待选药物，共培养检测细胞中的TXNIP含量；3)与对照组相比，TXNIP含量降低，判定为目标药物。通常来说，与对照组相比，可以使得TXNIP的含量分别降低了50～100％，可以判定为目标药物。
本发明还提供了一种体外抑制TXNIP表达的方法，所述方法包括：将维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物与细胞培养体系混合培养。
优选的，所述培养体系中至少包括如下技术特征中的至少一项；维拉帕米的浓度为0.01-100μM；所述细胞来源于哺乳动物；优选的，所述细胞选自人细胞；所述细胞为体细胞；所述细胞选自骨髓间充质干细胞、骨祖细胞、成骨前体细胞、成骨细胞、软骨祖细胞、软骨细胞或其组合。
术语解释
本发明中，所述维拉帕米的盐、酯可以以药学或生理学上可接受的盐或酯的形式使用。述及“药学上可接受的盐，通常指当以适当的方式用于治疗时(特别是在人类和/或哺乳动物中应用或使用时)在生理学上可耐受的任何盐(通常来说，这意味着它是无毒的，特别是作为抗衡离子的结果是无毒的)。这些生理上可接受的盐可以是与阳离子或碱形成的，并且在本发明的上下文中，尤其是在人类和/或哺乳动物中施用时，它们应该被理解为由按照本发明所提供的至少一种化合物，通常为酸(去质子化的)，如阴离子和至少一种生理学上耐受的阳离子(优选无机阳离子)形成的盐。在本发明的上下文中，具体地可以包括与碱金属和碱土金属形成的盐、以及与铵阳离子(NH4 +)形成的盐，具体可以是包括但不限于与(单)或(二)钠、(单)或(二)钾、镁或钙形成的盐。这些生理上可接受的盐也可以是与阴离子或酸形成的，并且在本发明的上下文中，特别是在人类和/或哺乳动物中施用时，它们应该被理解为由按照本发明所提供的至少一种化合物，通常质子化的，如阳离子和至少一种生理上可耐受的阴离子形成的盐。所述TXNIP抑制剂的盐、酯包括但不限于与如下酸形成的盐或酯：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。卤化物的盐同样适用。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐。
本发明中，所述“前药”指当用适当的方法服用后，该“前药”在人体内进行代谢或化学反应而转变成所述具有活性的TXNIP抑制剂或药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本文述及“包含”、“含有”等应理解为是包括性的意思，而没有排他性或穷尽的意思；即“包括但不限于”的意思。
术语“预防”可理解为降低具体病症发作的严重程度。治疗也可降低已有病症的严重程度或急性发作的频率。
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
试剂和方法
本申请中维拉帕米和叔丁基过氧化氢(TBHP)从Selleck Chemicals和SigmaAldrich购得。DMSO用于溶解维拉帕米。PBS用于稀释TBHP。TBHP用以诱导ROS的过量产生来刺激氧化应激失衡和应激相关的异常表型。
本申请中的试剂、试剂盒、检测方法等无特殊说明时，均可采用先用技术中的常规。例如原代NP细胞的培养方法、生物安全性的测定方法、RNA提取和实时定量PCR分析的方法、蛋白质提取和蛋白质印迹(Western Blotting)分析方法、免疫荧光方法、细胞内ROS的测量方法、流式细胞术测定方法、X射线分析方法、磁共振成像(MRI)分析方法、组织学分析方法、免疫组织化学方法、Tunel荧光试验方法等。
本申请中Western Blotting实验中涉及的蛋白或抗体来源：MMP3(ab52915)、MMP9(ab228402)、MMP13(ab39012)、ADAMTS5(ab3773)、Bax(ab32503)、Bcl-2(ab196495)、NLRP3(ab263899)、ASC(ab180799)、caspase-1(ab179515)和IL-1β(ab254360)以及NQO1(ab80588)从Abcam(英国剑桥)获得。其他一级抗体，包括β-actin(D6A8)、cleavedcaspase-3(ASP175)、TXNIP(D5F3E)、Nrf2(E3J1V)和HO-1(E3F4S)，均来自Cell SignalingTechnology(美国马萨诸塞州丹弗斯)。
本申请实施例中所涉及实验均进行了三次，数据以均数±标准差形式的呈现。基于不同分组设置，分别采用t检验或ANOVA法评估差异。p＜0.05为具有统计学意义。GraphPad Prism 8.3用于数据分析和创建对应统计学图片。
原代NP细胞的培养
在六周龄的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠中进行颈椎脱位。然后用75％乙醇冲洗大鼠30分钟。我们从其椎间盘(Co1-Co6)中获得NP组织，并将其浸泡在1％胶原酶II中2小时。处理完毕后收集组织悬浮液并以300g，5分钟离心，离心完成后吸弃上清并加入细胞培养基，使其重悬于T25培养瓶中放还培养箱培养(37℃，5％CO2)。细胞培养基由含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)组成。
实施例1
1)发明人通过研究GEO数据库中的椎间盘退变数据集，具体的检测数据集GSE70372的表达情况。按照P＜0.05和|Fold Change|＞0.5的标准，共测定了517个差异表达mRNA，其中295个mRNA上调，222个mRNA下调(图1A-C)。结果表明退变髓核中TXNIP表达显著增加(图1D)。
进一步根据退变组(Pfirrmann分级III-V级)与非退变组(Pfirrmann分级I-II级)间的差异表达基因mRNA分析了功能变化，基于先前阈值标准|logFC|>0.5和P<0.05，差异表达mRNA的基因和基因组京都百科全书(KEGG)功能分析结果显示，病灶粘附、细胞外基质受体相互作用和凋亡通路在退变时表达变化显著(图1E)。
2)发明人进行了RNA和蛋白质水平的实验验证，体外予以50μM TBHP刺激髓核细胞12小时，结果显示在体外氧化应激失衡条件下，髓核细胞中TXNIP显著上调(图1F-H)。
实施例2
2.1实验对象和分组
实验对象为大鼠髓核原代细胞。
实验分组包括维拉帕米作用浓度梯度(0，2.5，5，10，20，40μM)；TBHP作用浓度梯度(0，6.25，12.5，25，50，100μM)；维拉帕米与TBHP联合应用的刺激浓度(TBHP 50μM，维拉帕米0，1.25，2.5，5，10μM)。
2.2生物安全性测定
通过Infinite M200 Pro检测仪(Tecan Life Sciences，Switzerland)测量上述各组中450nm的吸光度大小(光密度值，OD)。
CCK-8试剂盒用于测定细胞毒性和增殖。为了确保维拉帕米作用时的生物安全性，进行了CCK-8试验，以检测维拉帕米对髓核细胞的生物安全性，具体实验如下：
1)为了检测细胞的毒性，对96孔板的每个孔接种1.5×104髓核细胞(nucleuspulposus cells，NP细胞)，细胞贴壁后，分别用不同浓度维拉帕米(0、2.5、5、10、20和40μM)处理，培养12小时。将0μM浓度维拉帕米的细胞毒性作为对照组分析，结果发现维拉帕米对0-40μM的细胞无细胞毒性(图2B)。
2)为了确定细胞增殖，对96孔板的每个孔接种3×103NP细胞，并用0-40μM(0、2.5、5、10、20和40μM)的维拉帕米孵育。为了确保维拉帕米的增殖效果，在12至48小时的时间内进行了CCK-8实验。40μM维拉帕米在作用48小时后显示出对髓核细胞增殖的抑制作用。此外，与12、24和48小时时的其他浓度相比，10μM维拉帕米使NP细胞增殖增加(图2C-E)。基于上述结果，10μM维拉帕米用于后续实验。
3)为了确定TBHP的合适工作浓度，用不同浓度TBHP(6.25、12.5、25、50和100μM)处理12h。结果证明TBHP以浓度依赖性方式降低细胞活力，50μM TBHP最终被选为后续实验中的作用浓度(图2F)。
4)实验中还进一步评估了维拉帕米对TBHP刺激的细胞死亡的影响。用不同浓度0-10μM(0、1.25、2.5、5和10μM)的维拉帕米预处理2h后，予以NP细胞50μM TBHP刺激12h，使用10％CCK-8将细胞在37℃的黑暗中孵育2小时。结果证明维拉帕米的预处理减轻了TBHP刺激后引起的细胞死亡(图2G)。
实施例3
维拉帕米在体外减轻TBHP体外诱导的细胞外基质(ECM)降解
3.1实验对象和分组
实验对象为大鼠髓核原代细胞。
实验分组包括对照组(不予处理)；TBHP组(对细胞予以50μM TBHP处理12小时)；维拉帕米+TBHP组(对细胞给予10μM维拉帕米预处理2小时后续以50μM TBHP处理12小时)。
3.2RNA提取和实时定量PCR(RT-qPCR)分析
使用维拉帕米(10μM)预处理NP细胞2小时，然后在37℃、5％CO2条件下用TBHP(50μM)和维拉帕米(10μM)处理NP细胞12小时。然后，使用TRIzol、核酸提取液、异丙醇、75％乙醇进行提取。随后使用cDNA合成试剂盒从RNA获得互补DNA(cDNA)。
在实时PCR系统中使用TB Green Premix Ex Taq试剂盒(Takara Bio)进行实时定量PCR(RT-qPCR)。引物由NCBI BLAST设计，相关信息见表1。对于不同基因的表达情况，将其与β-actin标准化矫正。使用相对2-ΔΔCT方式量化相对表达水平。
RT-qPCR显示MMP家族(MMP3、MMP9、MMP13)上调，ADAMTS5上调，这与TBHP刺激后ROS过度蓄积，导致细胞内氧化-抗氧化系统失衡进一步引起ECM分解代谢水平的增加有关。此外，TBHP刺激后同样导致SOX9降低。维拉帕米部分逆转了TBHP诱导的上述异常分解代谢加剧(图3A)。
β-actin、MMP3、MMP9、MMP13、ADAMTS5和SOX9的序列号及引物序列如下表1所示。
表1
3.3Western Blotting
使用核质分离蛋白质提取试剂盒(P0028，Beyotime，上海，中国)和RIPA裂解缓冲液收集细胞核和全细胞的蛋白质。在12000×g离心15分钟后，收集上清液中的蛋白质(BCA蛋白质定量试剂盒(23227，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国))用于进一步定量分析，使用。将其溶解在SDS样品加载缓冲液中后，将蛋白质在4–20％的SDS-PAGE凝胶上分离，并转移至0.22μmPVDF膜(Merck Millipore，CA，美国)。将膜置于5％脱脂牛奶中封闭2小时，然后用稀释比为1:1000的一抗孵育。使用荧光二抗在室温下孵育2小时，并通过荧光成像系统(LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，美国)分析蛋白质免疫反应性。
Western Blotting表明，维拉帕米不仅在RNA层面可以减轻ECM降解，还在蛋白水平进一步发挥挽救作用，包括TBHP诱导的蛋白水平上MMP家族(MMP3、MMP9、MMP13)的增加(图3B，C)。蛋白水平上ADAMTS5增加，此外，TBHP刺激后SOX9蛋白降低。
3.4为了进行免疫荧光检测，将无菌玻片放置于六孔板培养板内，将4×105个NP细胞/孔接种于玻片上并等待8小时至细胞贴壁及增殖。使用维拉帕米(10μM)预处理细胞2小时，然后用TBHP(50μM)处理12小时。使用甲醛(4％)固定细胞20分钟后使用PBS洗涤三次，每次10分钟。接着使用0.25％Triton X-100破膜15分钟后，使用PBS洗涤三次，每次10分钟。随后用5％BSA封闭2h后，使用PBS洗涤三次，每次10分钟。洗涤结束后在4℃下将细胞与包括MMP9、MMP13(稀释比例按1:200)的一抗过夜孵育。孵育结束PBS洗涤三次后，将六孔板内玻片与荧光二抗共孵育2小时。孵育结束后，PBS清洗三次。随后细胞核用DAPI染色15分钟并再次PBS清洗。最终，使用荧光显微镜(日本东京股份有限公司)测定数字荧光图像，并由ImageJ进行评估。结果显示，MMP9和MMP13的免疫荧光染色结果也与上述研究结果一致(图3D)。
实施例4
维拉帕米体外水平减轻TBHP引发的细胞凋亡
4.1实验对象和分组
实验对象为大鼠髓核原代细胞。
实验分组包括对照组(不予处理)；TBHP组(对细胞予以50μM TBHP处理12小时)；维拉帕米+TBHP组(对细胞给予10μM维拉帕米预处理2小时后续以50μM TBHP处理12小时)。
4.2流式细胞术测定
根据制造商说明使用Annexin V FITC凋亡检测试剂盒(C1062M，Beyotime，上海，中国)测定凋亡NP细胞。使用流式细胞仪(BD FACS ARIA II，SORP，USA)检测各组的凋亡率(％)。流式细胞术结果显示，TBHP刺激组的凋亡NP细胞明显多于TBHP+维拉帕米组(图4A，B)。
4.3Western Blotting用于检测凋亡相关蛋白，实验可参照实施例2。结果表明维拉帕米可以增加Bcl-2、抑制Bax和cleaved caspase-3的表达(图4C-F)。
综上，TBHP后NP的细胞活力显著受到抑制，凋亡相关蛋白的表达增加,在维拉帕米预处理后，TBHP刺激引起的细胞凋亡显著减少。
实施例5
维拉帕米在体外减轻TBHP引发的焦亡和ROS的过度产生
5.1实验对象和分组
实验对象为大鼠髓核原代细胞。
实验分组包括对照组(不予处理)；TBHP组(对细胞予以50μM TBHP处理12小时)；维拉帕米+TBHP组(对细胞给予10μM维拉帕米预处理2小时后续以50μM TBHP处理12小时)。
5.2RNA提取和实时定量PCR(RT-qPCR)分析
参照实施例1，引物由NCBI BLAST设计，相关信息见表1。对于不同基因的包括ASC，CASPASE1，NLRP3和IL1β，RNA水平的表达情况将其与β-actin标准化矫正并使用相对2-ΔΔCT方式量化其相对表达水平。
RT-qPCR显示维拉帕米预处理组的焦亡情况相比TBHP刺激组出现了显著改善(图5A)。
5.3Western Blotting
参照实施例1，Western Blotting结果与RNA水平趋势相符，这表明在蛋白水平，维拉帕米预处理组的焦亡相关基因表达水平相比TBHP刺激组同样得到了了显著改善(图5B-C)。
5.4细胞内ROS的测量
细胞中的总ROS水平通过2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA，S0033；中国上海Beyotime)按照制造商的方案进行测量。使用流式细胞仪(BD FACS ARIAII，SORP，USA)检测ROS阳性细胞，并通过FlowJo软件(Tree Star，OR，USA)评估定量。
结果表明与TBHP刺激组相比，维拉帕米预处理可以显著抑制ROS的过度产生(图5D)。
综上结果说明维拉帕米预处理可显著抑制TBHP引起的氧化应激相关的焦亡加剧和ROS过度产生。
ASC，CASPASE1，IL-1β，NLRP3和TXNIP的序列号及引物序列下表2所示。
表2
实施例6
维拉帕米上调Nrf2及其下游相关基因表达抑制TXNIP
6.1实验对象和分组
实验对象为大鼠髓核原代细胞。
实验分组包括对照组(不予处理)；TBHP组(对细胞予以50μM TBHP处理12小时)；维拉帕米+TBHP组(对细胞给予10μM维拉帕米预处理2小时后续以50μM TBHP处理12小时)。
6.2Western Blotting
参照实施例1，Western Blotting表明维拉帕米对氧化应激失衡和焦亡加剧的保护作用与Nrf2/TXNIP信号通路的激活有关。在TBHP诱导下，TXNIP在细胞内具有穿梭的效应，呈现出表达水平随作用时间发生变化的现象，同时证明了TXNIP在髓核细胞内前6小时减少，后6小时增加，最后12小时减少(图6A-B)。
6.3RT-qPCR和Western Blotting实验结果表明维拉帕米预处理显著降低了TXNIP基因在RNA及蛋白的表达水平，并分别增加了所提取的细胞核内Nrf2及全细胞HO-1和NQO1的蛋白表达(图6C-E)。
6.4免疫荧光染色参照实施例2，HO-1和NQO1的免疫荧光染色结果也支持上述结论(图6F)。
上述结果表明，维拉帕米给药有助于抑制TXNIP表达并通过激活Nrf2信号通路发挥对异常表型如ECM分解代谢失调、凋亡增加、焦亡加剧的调控作用。
实施例7
体内实验以确定维拉帕米是否可以作为体内退变的治疗药物，维拉帕米在体内实验中可挽救大鼠尾椎穿刺诱导椎间盘退变
7.1实验对象和分组
试验对象：对20只12周龄的雄性SD大鼠使用尾椎针刺退变法构造椎间盘退变模型，术前、术后在适当环境下饲养。通过腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg体重)对大鼠进行麻醉，并使用75％乙醇对尾部进行消毒。使用20G无菌针头从Co7/8和Co8/9椎间盘背侧皮肤穿入髓核中心，旋转360°并保持30秒针刺到位完成造模。造模后为避免感染进行再次灭菌。
试验分组：退变治疗组：每周通过Co8/9椎间盘内注射5μl 10μM维拉帕米作为退变治疗组；IVDD组：每周向Co7/8椎间盘注射相同体积的盐水，即IVDD对照组：Co6/7椎间盘未经任何治疗作为对照组。
7.2放射学检查
X射线分析：在造模及造模给药的4周后进行了放射学检查，以评估造模后椎间隙变化情况。使用21lp/mm探测器，以5倍几何放大率(FaxitronVersaVision；FaxitronBiotics LLC，Tucson，AZ，USA)在俯卧位进行X线摄片。椎间盘高度指数(DHI)的计算公式参考A simpledisc degeneration model induced by percutaneous needle puncture inthe rat tail.Spine(Phila Pa 1976),2008.33(18):p.1925-34。
磁共振成像(MRI)分析：通过MRI评估造模后IVDD进展情况。术后四周，麻醉后固定大鼠，并使用1.5T磁共振扫描仪(Philips Eclipse，Cleveland，OH，USA)在矢状面T2加权图像(T2WI)中检测指定IVD切片的信号。随后，基于MRI结果使用Pfirmann分级确定椎间盘退变水平。
IVDD组椎间盘MRI信号降低，椎间隙高度降低。然而，维拉帕米可部分挽救椎间盘间隙和MRI信号的降低(图7D，E)
7.3组织学分析
通过收集了尾椎造模区域的椎间盘组织，并将其固定在4％多聚甲醛中至少48小时。下一步通过将其植入石蜡中以获得矢状位5μm连续切片。随后，为了评估IVD内结构变化，使用苏木精和伊红(HE)和番红O-快绿(SO-FG)作为染色剂，并使用改良的组织学分级系统计算不同分组椎间盘的组织学评分。根据组织学分析，IVDD组NP组织所出现收缩、减少和蛋白聚糖丢失的水平显著高于对照组。而给药维拉帕米后减轻了NP组织的异常改变，这表明维拉帕米对NP和蛋白聚糖轻微萎缩和丢失的挽救。通过HE和SO-FG染色的组织学评分评估，证实了维拉帕米对延缓IVDD的效果(图7A，B)。
7.4免疫组织化学
首先对切片进行去石蜡化和再水合，并使用3％过氧化氢(H2O2)30分钟以阻断内源性过氧化物酶。一抗4℃下孵育过夜，然后在室温下用10％山羊血清封闭2小时，PBS中冲洗三次后，第二天在室温下使用HRP二抗孵育2小时。用Leica DM4000 B(LeicaMicrosystems)显微镜拍摄免疫组化化学切片图像，使用Image Pro Plus(6.0版；MediaCybernetics，Silver Spring，MD，USA)对积分光学密度(IOD)进行半定量分析。
免疫组化结果表明，维拉帕米可以减轻IVDD时ECM降解、焦亡并上调抗氧化性能，这也与体外实验结果一致(图7G，H)。
7.5Tunel荧光试验
使用TUNEL检测试剂盒，借助末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)检测细胞凋亡。在每个样品中，使用Image Pro Plus 6.0(Media Cybernetics，SilverSpring，MD，USA)挑选三个随机场定量计数阳性细胞。通过荧光显微镜下DAPI染色，评估细胞总数。
TUNEL法以确定维拉帕米是否能减轻体内水平的细胞凋亡。体内结果表明维拉帕米可在IVDD时显著抑制细胞凋亡(图7C，F)。
综上实施例所述，本申请研究证明1)给予TBHP后NP的细胞活力显著受到抑制，凋亡相关蛋白的表达增加，而维拉帕米预处理则使其恢复；2)维拉帕米对TBHP刺激后氧化应激失衡和ECM降解的影响。结果表明，维拉帕米可以抑制ROS水平(氧化应激的重要标志)的过度产生和ECM的降解(MMP家族的上调以及SOX9的下调)。3)构建了大鼠尾椎针刺退变模型，体内实验结果同样表明维拉帕米延缓了大鼠IVDD的进展。4)维拉帕米能减轻TBHP引起的焦亡。焦亡的关键是pro caspase-1的激活，它介导下游分子(包括GSDMD、IL-18和IL-1β)的成熟，并在细胞膜上钻孔，使细胞发生泄漏引起炎症因子的加剧。经实验验证氧化应激下TXNIP和NLRP3炎症小体的激活，维拉帕米可以有效地抑制它们，这一现象进一步阻止了焦亡的激活，从而最终减轻退变。5)实验发现维拉帕米在体外通过激活Nrf2并抑制TXNIP进一步降低炎症小体的形成。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (10)

1.维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物在制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途包括制备下列产品中的一项或多项：
1)用于挽救髓核细胞外基质异常降解的产品；
2)用于保护髓核细胞、抑制髓核细胞凋亡和/或焦亡的产品；
3)用于降低氧化应激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态的产品；
4)用于减少细胞内TXNIP表达水平的产品；
5)用于调节TXNIP的上游和/或下游信号通路的产品；
6)用于降低炎症刺激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态的产品；
7)用于维持椎间隙高度，延缓椎间盘退变的发展的产品；
8)用于提高椎间盘的应激与修复能力的产品；
9)用于预防、减轻或延缓由氧化应激引起的椎间盘退变产品。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，包括如下技术特征中的一项或多项：
1a)所述挽救髓核细胞外基质异常降解的产品为下调MMP3基因表达、和/或下调MMP9基因表达、和/或下调MMP13基因表达、和/或下调ADAMTS5基因表达、和/或上调ECM合成代谢因子SOX9的产品；
2a)所述保护髓核细胞的产品为上调Bcl-2基因表达、和/或下调Bax基因表达、和/或下调cleaved caspase-3基因表达的产品；
3a)所述降低氧化应激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态的产品为抑制ROS氧化应激介质表达的产品；
4a)所述减少细胞内TXNIP表达水平的产品为激活Nrf2并抑制TXNIP降低NLRP3炎症小体的形成的产品；
5a)所述调节TXNIP的上游信号通路的产品为调节Nrf2基因表达的产品，所述调节TXNIP的下游信号通路的产品为调节NLPR3基因表达的产品；
6a)所述降低炎症刺激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态的产品为上调Nrf2和相应的下游途径，从而抑制TXNIP/NLRP3轴的激活，从而抑制炎性细胞因子如IL-1β基因表达的产品。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述产品的活性成分选自维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物；
所述产品中活性成分的质量含量为0.001-99wt％。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述产品选自组合物或制剂；
优选的，所述组合物选自药物组合物、化妆品组合物、膳食补充剂、食品组合物或保健品组合物；
更优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料；所述药物组合物选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂。
6.一种组合物，所述组合物的活性成分包括维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。
7.如权利要求5所述组合物，其特征在于，所述组合物为药物组合物；
优选的，所述药物组合物的活性成分为维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物；
更优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
8.如权利要求6或7所述的组合物在制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品中的用途。
9.一种体外抑制TXNIP表达量的方法，所述方法包括：将维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物与细胞培养体系混合培养。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养体系中至少包括如下技术特征中的至少一项；
1)维拉帕米的浓度为0.01-100μM；
2)所述细胞来源于哺乳动物；优选的，所述细胞选自人细胞；
3)所述细胞为体细胞；
4)所述细胞选自骨髓间充质干细胞、骨祖细胞、成骨前体细胞、成骨细胞、软骨祖细胞、软骨细胞或其组合。
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