CN116814579A - PpUGT2重组蛋白、表达基因、表达盒、重组载体、宿主菌以及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PpUGT2重组蛋白、上述PpUGT2重组蛋白的表达基因、表达盒、重组载体、宿主菌以及应用。PpUGT2重组蛋白包括由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽。结合具体实施例，本发明的这种PpUGT2重组蛋白能够催化薯蓣皂苷元的葡萄糖基化反应，将薯蓣皂苷元转化为延龄草苷，其具有糖基转移酶功能，为重楼皂苷合成提供了作用元件，可以用于重楼皂苷的合成。本发明首次克隆并验证了与重楼皂苷生物合成相关、具有糖基转移酶功能的PpUGT2重组蛋白，在体外，PpUGT2重组蛋白可以将薯蓣皂苷元转化合成延龄草苷。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及一种PpUGT2重组蛋白、表达基因、表达盒、重组载体、宿主菌以及应用。
背景技术
重楼作为中国传统名贵中药，具有清热解毒、消肿止痛及止血定惊等作用，而且临床上常用于抗肿瘤治疗[1]，其主要药效成分为重楼皂苷，依据苷元的结构不同主要分为两大类，一类薯蓣皂苷元类，包括重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ和V等；另一类是偏诺皂苷元类，包括重楼皂苷Ⅵ、Ⅶ和H等[2]。临床上内服具有显著的抗肿瘤、止血、促进子宫收缩及消炎等作用，外用具有抗炎镇痛作用，而且最近研究还发现重楼皂苷具有抑制新型冠状病毒与ACE2受体结合能力的潜力[3]，对各类癌症及病毒等的治疗潜力使得人们对其活性和应用研究越来越关注。2020年《中国药典》规定重楼皂苷I、II及VI是评判重楼药材质量的标准，其含量不低于0.6％[4]。重楼皂苷作为中药重楼的药效物质基础，不仅直接反映了中药重楼的传统药效，其含量也是重楼药材品质的关键评价标准。
重楼生长周期长、种植条件要求严格、人工栽培技术不规范及缺乏优质种源等问题影响了重楼栽培品种的药材品质及重楼皂苷含量。中药材种植培育的目标就是保证药效，如果栽培品种的有效药效成分含量难以达到《中国药典》标准，制药企业就不会收购，药农的经济收益会受到直接影响，而且以差充好也会使中药材难以发挥最佳效用。另一方面，为了缓解重楼药材资源压力，国内外研究人员在化学提取工艺优化、化学合成及微生物转化制备重楼皂苷及其关键中间体上做出了大量探索[5,6]，但仍存在诸多问题，如化学提取效率低、化学合成反应步骤冗长及转化甾体皂苷合成的微生物较少等[7-9]。因此，重楼皂苷生物合成途径的解析为缓解中药重楼资源匮乏压力提供重要途径。
重楼皂苷的生物合成途径可以分为3个部分：(1)胆固醇的合成：环阿屯醇经过多步酶促反应，碳链延长与环化，产生重楼皂苷元合成前体——胆固醇[10]；(2)重楼皂苷苷元的合成：胆固醇经CYP450酶作用，分别在C22、C16和C26位进行氧化修饰产生薯蓣皂苷元，在此基础上，薯蓣皂苷元经CYP450酶的催化，在C17位进行氧化修饰合成偏诺皂苷元[11,12]；(3)重楼皂苷的合成：薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元在糖基转移酶(UGTs)催化下，分别结合葡萄糖、鼠李糖及阿拉伯糖，形成各种各样的重楼皂苷类化合物[13,14]。目前，研究人员仍主要集中于重楼皂苷上游合成途径中关键酶的解析及其中间体的合成生物学研究[15]。
目前，重楼皂苷的上游合成网络已经基本确定，因此，下游途径中糖基转移酶的挖掘及功能分析成为了重楼皂苷生物合成途径的解析的关键。
参考文献
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[2]王婧，徐志超，刘颖琳，段宝忠.滇重楼化学成分、药理作用和临床应用研究进展[J].中草药.2022,53(23):7633-7648.
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发明内容
基于此，有必要提供一种具有糖基转移酶功能的、可以用于重楼皂苷合成的PpUGT2重组蛋白。
此外，还有必要提供上述PpUGT2重组蛋白的表达基因、表达盒、重组载体、宿主菌以及应用。
一种PpUGT2重组蛋白，包括由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽。
一种表达基因，包括编码由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链。
在一个实施例中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示。
一种表达盒，包括上述的表达基因。
一种重组载体，包括上述的表达基因。
在一个实施例中，所述重组载体为克隆载体，所述克隆载体为pEASY-BluntSimple Cloning Vector。
在一个实施例中，所述重组载体为表达载体，所述表达载体为pGEX-4T-1载体。
一种宿主菌，包括上述的重组载体。
在一个实施例中，所述宿主菌为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)pLysS。
上述的PpUGT2重组蛋白、上述的表达基因、上述的表达盒、上述的重组载体以及上述的宿主菌在重楼皂苷合成领域的应用。
结合具体实施例，本发明的这种PpUGT2重组蛋白能够催化薯蓣皂苷元的葡萄糖基化反应，将薯蓣皂苷元转化为延龄草苷，其具有糖基转移酶功能，为重楼皂苷合成提供了作用元件，可以用于重楼皂苷的合成。
本发明首次克隆并验证了与重楼皂苷生物合成相关、具有糖基转移酶功能的PpUGT2重组蛋白，在体外，PpUGT2重组蛋白可以将薯蓣皂苷元转化合成延龄草苷。
此外，本发明还提供了上述PpUGT2重组蛋白的表达基因、表达盒、重组载体和宿主菌，并指出其在重楼皂苷合成领域的应用，为通过生物工程方法生产重楼皂苷奠定基础。
本发明的这种PpUGT2重组蛋白的底物专一性好，为进一步对其进行定向改造提供了理论支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
其中：
图1为实施例1中PpUGT2重组蛋白编码基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为DNA分子量标准DL 2000，1为PpUGT2重组蛋白编码基因的扩增产物(1389bp)。
图2为pGEX-4T-1载体图及多克隆位点，其中高亮的内切酶为本方案中连接目的基因所用的酶切位点。
图3为实施例3中含有PpUGT2重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；泳道M为Page-ruler预染蛋白Ladder，1为诱导的pGEX-4T-1-Rosetta-gami(DE3)pLysS蛋白，2为未经诱导的pGEX-PpUGT2-Rosetta-gami(DE3)pLysS蛋白，3为IPTG诱导后的pGEX-PpUGT2-Rosetta-gami(DE3)pLysS菌体上清蛋白，4为IPTG诱导后的pGEX-PpUGT2-Rosetta-gami(DE3)pLysS菌体沉淀，5为纯化的带GST标签的PpUGT2蛋白，其分子量为78kDa。
图4a为实施例4中PpUGT2重组蛋白催化薯蓣皂苷元的酶活反应后新产物的液相色谱分析对比图，横坐标为采集时间(min)，纵坐标为电信号(mAU)。
图4b为实施例4中PpUGT2重组蛋白催化薯蓣皂苷元的酶活反应后新产物的质谱分析对比图，横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度。
图5为实施例4中PpUGT2重组蛋白与薯蓣皂苷元反应后薯蓣皂苷元底物的液相色谱分析对比图，UDP-葡萄糖为糖供体，横坐标为采集时间(min)，纵坐标为电信号(mAU)；B为质谱图，横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度。
图6为PpUGT2重组蛋白催化薯蓣皂苷元糖基化的原理图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开了一实施方式的PpUGT2重组蛋白，包括由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽。
结合具体实施例，本发明的这种PpUGT2重组蛋白能够催化薯蓣皂苷元的葡萄糖基化反应，将薯蓣皂苷元转化为延龄草苷，其具有糖基转移酶功能，为重楼皂苷合成提供了作用元件，可以用于重楼皂苷的合成。
本发明首次克隆并验证了与重楼皂苷生物合成相关、具有糖基转移酶功能的PpUGT2重组蛋白，在体外，PpUGT2重组蛋白可以将薯蓣皂苷元转化合成延龄草苷。
本发明的这种PpUGT2重组蛋白的底物专一性好，为进一步对其进行定向改造提供了理论支持。
本实施方式中，PpUGT2重组蛋白的全称可以为薯蓣皂苷元-3-O-葡萄糖基转移酶PpUGT2。
本发明还公开了一实施方式的表达基因，包括编码由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者多核苷酸的互补链。
具体来说，本实施方式中，多核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示。
本实施方式中，表达基因的全称可以为薯蓣皂苷元-3-O-葡萄糖基转移酶PpUGT2基因。
具体来说，表达基因是从重楼植株根茎中分离获得，表达基因表达得到的PpUGT2重组蛋白为一种尿苷二磷酸葡糖基转移酶。
本发明中，PpUGT2重组蛋白的制备方法如下：将表达基因导入原核表达载体，并将其转入宿主菌中，培养并诱导蛋白表达，获得PpUGT2重组蛋白。
PpUGT2重组蛋白可以将薯蓣皂苷元转化合成延龄草苷。
本发明还公开了一实施方式的包括上述表达基因的表达盒。
本发明还公开了一实施方式的包括上述表达基因的重组载体。
在一个实施方式中，重组载体为克隆载体，克隆载体为pEASY-Blunt SimpleCloning Vector。
在另一个实施方式中，重组载体为表达载体，表达载体为pGEX-4T-1载体。
本发明还公开了一实施方式的包括上述重组载体的宿主菌。
在一个实施方式中，宿主菌可以为适用于候选基因克隆的宿主菌，例如大肠杆菌DH5α。
在另一个实施方式中，宿主菌还可以为用于重组蛋白表达的宿主菌，例如大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)pLysS。
本发明公开的PpUGT2重组蛋白、表达基因、表达盒、重组载体以及宿主菌可以应用于重楼皂苷合成领域。
本发明还提供了上述PpUGT2重组蛋白的表达基因、表达盒、重组载体和宿主菌，并指出其在重楼皂苷合成领域的应用，为通过生物工程方法生产重楼皂苷奠定基础。
以下为具体实施例。
实施例1PpUGT2重组蛋白编码基因的克隆
1.实验材料
云南滇重楼(Paris polyphylla SMITH var.yunnanensis(FRANCH.)Hand.Mazz.)采摘于云南昆明植物园，植物状态良好且生长一致。将滇重楼的不同组织，包括根、茎、叶和果实，每组三次重复，液氮速冻。
2.载体和菌株
大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞Trans5αChemically Competent Cell(CD201)购于北京全式金生物技术股份有限公司。
大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)pLysS感受态细胞(ZC1212)购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司。
克隆载体pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(CB111)购于北京全式金生物技术股份有限公司。
原核表达载体pGEX-4T-1购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司。
3.溶液配制
(1)LB培养基(500mL)：准确称取5g胰蛋白胨，2.5g酵母提取物和5g氯化钠，用超纯水定容到500mL，固体培养基需加入7.5g琼脂粉，121℃高压灭菌15min，冷却至常温后保存于4℃冰箱备用。Amp溶液(100mg/mL)：精确称取2g Amp粉末溶解于20mL灭菌水中，0.22μm无菌滤膜除菌，-20℃冰箱保存备用(工作浓度：100μg/mL)。
(2)异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(500mM)：称取5.95g IPTG，溶于灭菌超纯水，定容至50mL，过滤除菌，分装小管，-20℃保存。
(3)Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，100mM)：称取1.1214g Tris加水至90mL搅拌溶解均匀，加HCl调pH至7.5，补水定容至100mL。
4.PpUGT2重组蛋白编码基因的克隆
基于云南滇重楼转录组数据分析发现在根茎中表达的PpUGT2重组蛋白编码基因，为了确定其在重楼皂苷生物合成途径中的作用，进行基因克隆与体外蛋白表达。
(1)总RNA的提取
使用QIAGEN RNeasy Plant Mini Kit试剂盒(74903)操作说明书提取重楼叶片RNA，提取过程应注意始终保持在冰上进行操作，避免RNA降解。
(2)反转录反应
利用北京全式金生物技术股份有限公司的反转录试剂盒TransScript One-StepgDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(AU311)合成罗汉果全长cDNA，具体操作如表1。
表1cDNA第一条链合成的反应体系
将反应液用微量移液器轻轻吹打混匀，50℃，15min；85℃，5s。
(3)PpUGT2重组蛋白编码基因的PCR扩增
利用CE Design软件分别设计PpUGT2重组蛋白编码基因全长扩增引物，其引物序列为SEQ：NO.3和SEQ：NO.4。以cDNA作为模板，通过PCR扩增获候选序列，PCR体系见表2所示。
表2PCR反应体系
PCR反应温度程序：
取5μL PCR产物进行凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。
结合图1，可以看出，我们获得了一个大小约为1389bp的目的条带，与预测的PpUGT2的CDS序列长度一致。
(4)PCR产物纯化
将PCR产物进行DNA片段纯化，根据北京全式金生物技术股份有限公司的DNA片段纯化试剂盒(EasyPure PCR Purification Kit，EP101)说明书进行操作。
(5)克隆载体连接反应
将纯化后的PCR产物进行克隆载体连接反应，具体反应体系如表3所示。
表3基因克隆的反应体系
上表中的反应液进行充分混匀后室温反应5min，直接转化大肠杆菌感受态Trans5αChemically Competent Cell。
(6)转化大肠杆菌Trans5αChemically Competent Cell及阳性克隆的筛选
将含有目的基因的克隆载体转化到Trans5αChemically Competent Cell中，37℃培养12h后挑取单克隆，并加入到卡那抗性的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养6-8h后，PCR鉴定并筛选含有目的片段的阳性克隆，电泳结果符合预期的菌液测序鉴定由上海生工生物技术公司完成。
测序后确定，PpUGT2重组蛋白编码基因的序列如SEQ ID No.2所示，PpUGT2重组蛋白编码基因编码的PpUGT2重组蛋白的序列如SEQ ID No.1所示。
(7)克隆载体质粒DNA的提取
将测序结果正确的菌液加入到LB液体培养基(Amp抗性)中，37℃振荡培养12h，离心收菌并提取重组质粒，具体参照天根超纯质粒提取试剂盒说明书进行操作(TIANpureMini Plasmid Kit,DP104)。
实施例2PpUGT2重组蛋白编码基因的表达载体构建
(1)表达载体构建引物设计
结合图2，设计带有原核表达载体pGEX-4T-1双酶切位点附近的同源序列的特异引物，其引物序列如SEQ：NO.5和SEQ：NO.6所示。
(2)PCR扩增及纯化
以测序正确的克隆质粒作为模板，用SEQ：NO.5和SEQ：NO.6进行PCR扩增，具体操作步骤如实施例1中4.PpUGT2重组蛋白编码基因的克隆中(3)表2及PCR反应温度程序所示，获得的PCR产物使用北京全式金生物技术股份有限公司的DNA片段纯化试剂盒说明书进行操作。
(3)pGEX-4T-1载体质粒的双酶切反应
利用XmaI和SalI限制性内切酶对pGEX-4T-1载体质粒进行酶切反应，获得线性化载体，其具体操作如表4。
表4双酶切反应体系
反应液37℃孵育2.5h。
(4)酶切产物胶回收
利用北京全式金快速胶回收试剂盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit,EG101)纯化线性化载体，根据说明书进行操作。
(5)无缝克隆重组反应
利用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix试剂盒(NEB#e2621x)构建pGEX-PpUGT2重组载体，具体反应体系参照表5。
表5连接反应体系
轻轻混合均匀，50℃孵育15min。降至4℃或立即置于冰上冷却。
(6)重组载体的转化
利用冻融法将5μL反应液转化到Trans5αChemically Competent Cell中大肠杆菌感受态细胞中，具体操作见实施例1中4.PpUGT2重组蛋白编码基因的克隆(6)，菌液测序鉴定由上海生工生物技术公司完成。
(7)重组质粒DNA的提取
将测序结果正确的菌液加入到LB液体培养基(Amp抗性)中，37℃振荡培养12h后，离心收集菌体并提取重组质粒pGEX-PpUGT2，质粒提取方法参照说明书进行操作(天根超纯质粒提取试剂盒)。
实施例3PpUGT2重组蛋白的原核表达
(1)重组质粒转化表达载体Rosetta-gami(DE3)pLysS
利用冻融法将pGEX-PpUGT2重组质粒和pGEX-4T-1空载转化到大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)pLysS感受态细胞中，菌落PCR验证阳性克隆，将阳性克隆菌液1：1加入50％甘油置于-80℃保存。
(2)蛋白诱导表达
取50μL菌液加入10mL的LB培养基(Amp)中，37℃震荡培养过夜；取过夜培养的菌液2mL加到300mL的LB培养基(Amp)中，37℃震荡培养到OD600＝0.6，加入终浓度为0.25mM的IPTG，低温17℃诱导培养24h(过夜)，4℃离心收集菌体，加入20mL 4℃预冷的PBS磷酸缓冲液(PH6.8，1M)悬浮菌体，超声破碎20min，工作6s停止2s，超声15min，直到菌液变得透亮，12000rpm离心30min，收集上清液即为粗酶蛋白。
(3)蛋白纯化
将Glutathione Beads(常州天地人和生物科技有限公司，货号：SA008010)装入层析柱中，用5倍柱体积的平衡液(40mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.4，1mM DDT，总体积为1L)进行柱平衡，再与上清孵育2h，收集流出液，用洗脱液(50mMTris-HCl，150mM NaCl，10mM还原型谷胱甘肽，1mM DDT，pH 8.0，总体积1L)洗脱，分次收集流出液，每管2mL，利用SDS-PAGE方法检测蛋白表达和纯化，结果如图3所示。
结合图3，可以看出，pGEX-PpUGT2重组质粒转化到表达菌株Rosetta-gami(DE3)pLysS中，经IPTG诱导后表达，纯化后得到较纯的重组蛋白，且重组蛋白条带大小与预测的一致，加上重组标签后在78kDa左右有明显的重组蛋白条带。纯化的蛋白可用于进一步的酶学分析。
将条带特异性强，浓度高的那管蛋白用超滤管浓缩，利用10％(v/v)的甘油保存纯化蛋白(-80℃)。
实施例4PpUGT2重组蛋白的功能分析
(1)体外酶活反应
反应液中加入1mM薯蓣皂苷元，5mM UDP-Glucose(UDP-Glc)，50mM Tris(pH 8.0)，1mM MgCl2，用纯化后的蛋白补齐到100μL，37℃反应12h后，加入等体积甲醇终止酶活反应，反应液旋干后，溶于100μL色谱甲醇，12,000rpm离心10min，上清用于后续测定。
(2)HPLC-ESI-QTOF MS/MS测定
本实验使用Agilent 1290Infinity II与Agilent 6546LC/Q-TOF对产物及底物进行检测，得到图4a、图4b和图5。具体测定参数条件如表6所示。
表6LC-MS测定参数表
根据HPLC-ESI-QTOF MS/MS测定，结合图4a和图4b可以看出，PpUGT2重组蛋白能够以UDP-葡萄糖为糖供体，特异性催化薯蓣皂苷元3-OH上的糖基化，生成延龄草苷。
具体来说，对比图4a、图4b和图5，以薯蓣皂苷元为底物，葡萄糖作为供体，pGEX-4T-1空载作为对照，HPLC-ESI-QTOF MS/MS检测发现其产物在8.845min出现了新峰，该化合物的采集时间与延龄草苷(trillin)标准品出峰时间一致，同时该产物的母离子荷质比(m/z)为577.3760(M+H+)，MS/MS结果发现其质谱碎裂规律与延龄草苷的标准品相同，表明薯蓣皂苷元经过PpUGT2重组蛋白催化后生成了延龄草苷，并且PpUGT2重组蛋白和偏诺皂苷元、鲁斯可皂苷元、菝葜皂苷元反应未发现产物生成。
结合上述分析，PpUGT2重组蛋白以UDP-葡萄糖为糖供体，特异性催化薯蓣皂苷元3-OH上的糖基化，生成延龄草苷，具体催化流程如图6所示。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种PpUGT2重组蛋白，其特征在于，包括由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽。
2.一种表达基因，其特征在于，包括编码由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链。
3.根据权利要求2所述的表达基因，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示。
4.一种表达盒，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的表达基因。
5.一种重组载体，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的表达基因。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为克隆载体，所述克隆载体为pEASY-Blunt Simple Cloning Vector。
7.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为表达载体，所述表达载体为pGEX-4T-1载体。
8.一种宿主菌，其特征在于，包括如权利要求5～7中任意一项所述的重组载体。
9.根据权利要求8所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)pLysS。
10.根据权利要求1所述的PpUGT2重组蛋白、根据权利要求2或3所述的表达基因、根据权利要求1所述的表达盒、根据权利要求5、6或7所述的重组载体以及根据权利要求8或9所述的宿主菌在重楼皂苷合成领域的应用。
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