CN116814448A - 一种干扰红曲菌基因表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种干扰红曲菌基因表达的方法，包括以下步骤：克隆PtrpC(启动子)片段及EGFP(绿色荧光蛋白)片段，将PtrpC片段及EGFP片段融合，获得PtrpC‑EGFP；克隆hph基因片段，将hph基因片段酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒环化成完整的质粒pCAMBIA3300‑hph；将PtrpC‑EGFP与质粒pCAMBIA3300‑hph连接，得到连接产物，将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞后从中挑取克隆子，对克隆子进行PCR和酶切验证，验证结果正确的质粒即为绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300‑hph‑PtrpC‑EGFP；将绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300‑hph‑PtrpC‑EGFP转入红色红曲菌M7中，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到表达EGFP的红曲菌株。本发明利用反向双启动子体系实现对丝状真菌的RNA干扰，大大减少了实现RNA干扰的时间和成本。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种干扰红曲菌基因表达的方法。
背景技术
在丝状真菌中，RNA干扰技术不受丝状真菌中的多核现象，异核现象和非同源重组的高频率影响。然而，真菌细胞是多倍体，并且细胞壁包含更多的多糖和糖蛋白，使得RNA干扰不如动物细胞有效，具有干扰效率低和脱靶效应的缺点。
利用双链RNA表达载体能有效地诱导RNA沉默现象使真菌自主产生双链RNA的方法之一是转入具有发夹结构RNA表达载体，但筛选得到有效的转化子需要耗费大量的时间和资源。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种干扰红曲菌基因表达的方法，旨在解决现有的真菌基因干扰效率低，且不易筛选的问题。
为实现上述目的，本发明提出一种干扰红曲菌基因表达的方法，包括以下步骤：
克隆PtrpC(启动子)片段及EGFP(绿色荧光蛋白)片段，将PtrpC片段及EGFP片段融合，获得PtrpC-EGFP，即绿色荧光蛋白基因的表达片段；
克隆hph(潮霉素抗性标记基因，hygromycin)基因片段，将所述hph基因片段酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒环化成完整的质粒pCAMBIA3300-hph；
将所述PtrpC-EGFP与所述质粒pCAMBIA3300-hph连接，得到连接产物，将所述连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞后从中挑取克隆子，对所述克隆子进行PCR和酶切验证，验证结果正确的质粒即为绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP；
将所述绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP转入红色红曲菌M7中，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到表达EGFP的红曲菌株；
构建带有新霉素抗性基因标记的通用载体pCAMBIA3300-neo(新霉素抗性基因)，再通过酶切酶连插入干扰EGFP表达的RNAi片段，构建pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体；
将目的基因片段RNAi双酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP–PgpdA表达载体环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-RNAi-PgpdA；
将质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-RNAi-PgpdA转入所述表达EGFP的红曲菌株中，经由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到共同干扰EGFP和目的基因表达的红曲菌株。
可选地，在步骤克隆PtrpC(启动子)片段及EGFP(绿色荧光蛋白)片段，将PtrpC片段及EGFP片段融合，获得PtrpC-EGFP，即绿色荧光蛋白基因的表达片段中：从质粒pSKH中克隆PtrpC；和/或，从质粒pEGFP-N1中克隆EGFP；和/或，采用Double-joint PCR将PtrpC片段及EGFP片段融合。
可选地，在步骤克隆hph(潮霉素抗性标记基因，hygromycin)基因片段，将所述hph基因片段酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒环化成完整的质粒pCAMBIA3300-hph中：从质粒pSKH中克隆hph；和/或，
所述hph基因片段与pCAMBIA3300质粒酶切的酶均为Xba I和Hind III。
可选地，在步骤将所述PtrpC-EGFP与所述质粒pCAMBIA3300-hph连接，得到连接产物，将所述连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞后从中挑取克隆子，对所述克隆子进行PCR和酶切验证，验证结果正确的质粒即为绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP之前：将所述PtrpC-EGFP与所述质粒pCAMBIA3300-hph分别均采用Kpn I和XhoI进行双酶切。
可选地，在步骤将所述PtrpC-EGFP与所述质粒pCAMBIA3300-hph连接，得到连接产物，将所述连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞后从中挑取克隆子，对所述克隆子进行PCR和酶切验证，验证结果正确的质粒即为绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP中：采用T4连接酶将所述PtrpC-EGFP与所述质粒pCAMBIA3300-hph进行T4连接。
可选地，步骤将所述绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP转入红色红曲菌M7中，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到表达EGFP的红曲菌株包括：将所述绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP通过根癌农杆菌介导的红曲转化转入红色红曲菌M7中，通过潮霉素筛选出阳性转化子，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到表达EGFP的红曲菌株。
可选地，步骤构建带有新霉素抗性基因标记的通用载体pCAMBIA3300-neo，再通过酶切酶连插入干扰EGFP表达的RNAi片段，构建pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体具体包括：
从质粒pKN1中克隆neo，克隆得到的neo基因片段经Xho I和EcoR I酶切后，与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo；
从质粒pEGFP-N1中克隆EGFP，克隆得到的EGFP基因片段经BamH I和Sma I酶切后与同样酶切过的pSilent-Dual1质粒(氨苄青霉素(Ampicillin)抗性、PgpdA和TrpC启动子)在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pSilent-Dual1-EGFP；
从质粒pSilent-Dual1-EGFP中克隆出PtrpC-EGFP-PgpdA基因片段，经Kpn I和XbaI酶切后与同样双酶切过的pCAMBIA3300-neo质粒在T4连接酶的作用下环化成pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体。
可选地，在步骤构建带有新霉素抗性基因标记的通用载体pCAMBIA3300-neo，再通过酶切酶连插入干扰EGFP表达的RNAi片段，构建pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体之后，还包括：
将所述pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体通过根癌农杆菌介导的红曲转化法转化进入所述表达EGFP的红曲菌株中，通过潮霉素和新霉素两种抗性共同筛选出阳性转化子，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到干扰EGFP表达的红曲菌株。
可选地，在步骤将目的基因片段RNAi双酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP–PgpdA表达载体环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-RNAi-PgpdA中：将目的基因片段RNAi和pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP–PgpdA表达载体双酶切的酶均为Not I与Spe I；和/或，
采用T4连接酶将目的基因片段RNAi与pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP–PgpdA表达载体环化。
可选地，步骤将质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-RNAi-PgpdA转入所述表达EGFP的红曲菌株中，经由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到共同干扰EGFP和目的基因表达的红曲菌株包括：将质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-RNAi-PgpdA通过根癌农杆菌介导的转化法转化进入所述表达EGFP的红曲菌株中，通过潮霉素和新霉素两种抗性共同筛选出阳性转化子，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到共同干扰EGFP和目的基因表达的红曲菌株。
本发明提供的技术方案中，通过引入反向双启动子系统的RNA干扰表达载体，在反向双启动子系统中，目标基因被设计为转录为具有荧光蛋白(如GFP、mCherry等)RNA的嵌合RNA，其中GFP或mCherry荧光可作为基因沉默的指标，根据荧光表达强弱判断RNA干扰效率高低，可以快速有效筛选出RNA干扰表达的红曲菌株，大大提高实验效率，由本发明提供的方法筛选得到的转化子数量多，总体RNA干扰效率较高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1的绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP的PCR产物验证及菌落验证图；
图2为本发明实施例2中的PtrpC-EGFP基因进行菌落验证图；
图3为本发明实施例1中的pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Intron2-PgpdA及PtrpC-EGFP-Intron2-PgpdA基因进行菌落验证图；
图4为本发明实施例2中的pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Exon3-PgpdA及PtrpC-EGFP-Exon3-PgpdA基因进行菌落验证图；
图5为本发明实施例2中获得的转化子的激光共聚焦显微镜图；
图6为本发明干扰红曲菌基因表达的方法一实施例的质粒结构示意图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在丝状真菌中，RNA干扰技术不受丝状真菌中的多核现象，异核现象和非同源重组的高频率影响。然而，真菌细胞是多倍体，并且细胞壁包含更多的多糖和糖蛋白，使得RNA干扰不如动物细胞有效，具有干扰效率低和脱靶效应的缺点。
鉴于此，本发明提出一种干扰红曲菌基因表达的方法，旨在提供一种可以高效干扰真菌基因的表达方法，并且可以高通量筛选红曲菌干扰菌株。参照图6，图6为本发明干扰红曲菌基因表达的方法一实施例的质粒结构示意图。
本发明提出一种干扰红曲菌基因表达的方法，包括以下步骤：
S10、克隆PtrpC(启动子)片段及EGFP(绿色荧光蛋白)片段，将PtrpC片段及EGFP片段融合，获得PtrpC-EGFP，即绿色荧光蛋白基因的表达片段；
在该步骤中，从质粒pSKH中克隆PtrpC，从质粒pEGFP-N1中克隆EGFP；采用Double-joint PCR将PtrpC片段及EGFP片段融合、富集和纯化，获得绿色荧光蛋白基因的表达片段。
所述Double-joint PCR融合、富集和纯化过程如下：融合体系是2个基因片段的PCR纯化产物各5μL，12.5μL2×Utaq PCR Master Mix，补水至25μL。融合PCR程序为94℃3min；(94℃30s，55℃5min，72℃1min30s)×15cycles；72℃5min。然后以融合PCR产物为模板，合成表达绿色荧光蛋白基因片段两端的引物(KpnI-PtrpC-F/XhoI-EGFP-R)进行融合产物富集。PCR程序为94℃3min；(94℃30s，55℃30s，72℃1min30s)×30cycles；72℃5min。使用小量DNA产物纯化试剂盒纯化PCR产物PtrpC-EGFP。
S20、克隆hph(潮霉素抗性标记基因，hygromycin)基因片段，将所述hph基因片段酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒环化成完整的质粒pCAMBIA3300-hph；
于本步骤中，从质粒pSKH中克隆hph(潮霉素抗性标记基因，hygromycin)，克隆得到的hph基因片段经Xba I和Hind III酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pCAMBIA3300-hph。
S30、将所述PtrpC-EGFP与所述质粒pCAMBIA3300-hph连接，得到连接产物，将所述连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞后从中挑取克隆子，对所述克隆子进行PCR和酶切验证，验证结果正确的质粒即为绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP；
进一步地，在该步骤之前，先将所述PtrpC-EGFP与所述质粒pCAMBIA3300-hph均采用Kpn I和Xho I进行双酶切，然后使用小量DNA产物纯化试剂盒纯化酶切产物，纯化的酶切产物在T4连接酶作用下进行T4连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞后从中随机挑取克隆子。采用引物KpnI-PtrpC-F/XhoI-EGFP-R和限制酶Kpn I和Xho I分别对克隆子进行PCR和酶切验证，验证结果正确的质粒即为绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP。
S40、将所述绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP转入红色红曲菌M7中，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到表达EGFP的红曲菌株；
具体地，本步骤包括：将所述绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP通过根癌农杆菌介导的红曲转化转入红色红曲菌M7中，通过潮霉素筛选出阳性转化子，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到表达EGFP的红曲菌株。
S50、构建带有新霉素抗性基因标记的通用载体pCAMBIA3300-neo(新霉素抗性基因)，再通过酶切酶连插入干扰EGFP表达的RNAi片段，构建pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体；
其中，所述pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体的序列SEQ ID NO:1具体如下所示：
CATGCCAACCACAGGGTTCCCCTCGGGATCAAAGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCACCGGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTGACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATCCAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGCCGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCAC
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于本实施例中，首先构建带有新霉素抗性基因标记的通用载体pCAMBIA3300-neo，再构建pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体，具体地，S50包括：
S51、从质粒pKN1中克隆neo，克隆得到的neo基因片段经Xho I和EcoR I酶切后，与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo；
S52、从质粒pEGFP-N1中克隆EGFP，克隆得到的EGFP基因片段经BamH I和Sma I酶切后与同样酶切过的pSilent-Dual1质粒(氨苄青霉素(Ampicillin)抗性、PgpdA和TrpC启动子)在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pSilent-Dual1-EGFP；
S53、从质粒pSilent-Dual1-EGFP中克隆出PtrpC-EGFP-PgpdA基因片段，经Kpn I和Xba I酶切后与同样双酶切过的pCAMBIA3300-neo质粒在T4连接酶的作用下环化成pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体。
步骤S50之后还包括以下步骤：
S6、将所述pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体通过根癌农杆菌介导的红曲转化法转化进入所述表达EGFP的红曲菌株中，通过潮霉素和新霉素两种抗性共同筛选出阳性转化子，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到干扰EGFP表达的红曲菌株。
S60、将目的基因片段RNAi双酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP–PgpdA表达载体环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-RNAi-PgpdA；
在本步骤中，将目的基因片段RNA干扰(RNAi)片段通过PCR扩增出后，经Not I与Spe I双酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP–PgpdA表达载体在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo(新霉素)-PtrpC(启动子)-EGFP(荧光标记)-RNAi(目的基因片段)-PgpdA(启动子)。
S70、将质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-RNAi-PgpdA转入所述表达EGFP的红曲菌株中，经由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到共同干扰EGFP和目的基因表达的红曲菌株。
本发明提供的技术方案中，通过引入反向双启动子系统的RNA干扰表达载体，在反向双启动子系统中，目标基因被设计为转录为具有荧光蛋白(如GFP、mCherry等)RNA的嵌合RNA，其中GFP或mCherry荧光可作为基因沉默的指标，根据荧光表达强弱判断RNA干扰效率高低，可以快速有效筛选出RNA干扰表达的红曲菌株，大大提高实验效率，由本发明提供的方法筛选得到的转化子数量多，总体RNA干扰效率较高。
上述步骤S70具体包括：将质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-RNAi-PgpdA通过根癌农杆菌介导的转化法转化进入所述表达EGFP的红曲菌株中，通过潮霉素和新霉素两种抗性共同筛选出阳性转化子，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到共同干扰EGFP和目的基因表达的红曲菌株。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1反向双启动子干扰表达EGFP-Intron2红曲菌株及其筛选
(1)采用引物KpnI-PtrpC-F/EGFP-PtrpC-R从质粒pSKH中克隆PtrpC。同时采用引物EGFP-F/XhoI-EGFP-R从质粒pEGFP-N1中克隆EGFP。采用Double-joint PCR融合、富集和纯化2个片段，获得绿色荧光蛋白基因的表达片段PtrpC-EGFP。
其中，Double-joint PCR融合、富集和纯化过程具体操作如下：融合体系是2个基因片段的PCR纯化产物各5μL，12.5μL2×Utaq PCR Master Mix，补水至25μL。融合PCR程序为94℃3min；(94℃30s，55℃5min，72℃1min30s)×15cycles；72℃5min。然后以融合PCR产物为模板，合成表达绿色荧光蛋白基因片段两端的引物(KpnI-PtrpC-F/XhoI-EGFP-R)进行融合产物富集。PCR程序为94℃3min；(94℃30s，55℃30s，72℃1min30s)×30cycles；72℃5min。使用小量DNA产物纯化试剂盒纯化PCR产物PtrpC-EGFP。
(2)采用引物XbaI-hphF/HindIII-hphR从质粒pSKH中克隆hph，克隆得到的hph基因片段经Xba I和Hind III酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pCAMBIA3300-hph。
(3)采用Kpn I和Xho I分别酶切PtrpC-EGFP与环化质粒pCAMBIA3300-hph，使用小量DNA产物纯化试剂盒纯化酶切产物，纯化的酶切产物在T4连接酶作用下16℃连接4h，取20μL连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，在含有50μg/mL Kan的LB固体培养基上37℃过夜培养大肠杆菌，随机挑取克隆子，采用KpnI-PtrpC-F/XhoI-EGFP-R进行PCR验证。提取质粒进行酶切验证，采用Kpn I和Xho I双酶切质粒，酶切结果正确的质粒即为绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP。
(4)将绿色荧光表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP经根癌农杆菌介导的红曲转化法转入红色红曲菌M7中，经由基因组验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到表达EGFP的红曲菌株。
(5)从质粒pKN1中克隆neo，克隆得到的neo基因片段经Xho I和EcoR I酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo；从质粒pEGFP-N1中克隆EGFP，克隆得到的EGFP基因片段经BamH I和Sma I酶切后与同样酶切过的pSilent-Dual1质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pSilent-Dual1-EGFP；从质粒pSilent-Dual1-EGFP中克隆PtrpC-EGFP-PgpdA，克隆得到的PtrpC-EGFP-PgpdA基因片段经Kpn I和Xba I酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300-neo质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA。
(6)将目的基因片段Intron2经Not I与Spe I双酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP–PgpdA质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Intron2-PgpdA。
(7)将质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Intron2-PgpdA经根癌农杆菌介导的红曲转化法转入表达EGFP的红曲菌株中，经由基因组验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到反向双启动子干扰表达EGFP-Intron2红曲菌株。
上述步骤(4)中表达EGFP的红曲菌株的转化筛选方法是：将红曲菌M7接种到PDA斜面上，28℃培养10-20d，无菌水洗下孢子经过滤、浓缩的得到孢子液，使用血球计数板计数。将含有构建表达EGFP载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP的农杆菌接种到5mL含有50μg/mLKan的LB液体培养基中，28℃220r/min过夜培养，5000r/min离心5min收集菌体。用IM培养基将菌体重悬，并将菌体浓度稀释至OD600nm＝0.4-0.5，同样条件下继续培养6h。红曲菌孢子和转入表达EGFP载体的农杆菌共培养用根瘤农杆菌菌液稀释红曲菌孢子液至104-105个孢子/mL，取200μL稀释液涂布在铺有玻璃纸的Co-IM培养基上，28℃培养2-3d。转移Co-IM培养基上的玻璃纸至灭菌的空平皿中，倒入约40℃含有30mg/L潮霉素和0.5g/L CS的PDA培养基，待培养基凝固后28℃倒置培养。将长出的菌落挑出，接种到含有15mg/L G418的PDA培养基上，继续培养，如果能生长，可断定为转化子，提取基因组，进行PCR验证是否为目的基因突变菌株。
上述步骤(7)中干扰表达EGFP-Intron2的红曲菌株的转化筛选步骤如下：筛选出的表达EGFP红曲菌株接种到PDA斜面上，28℃培养10-20d，无菌水洗下孢子经过滤、浓缩的得到孢子液，使用血球计数板计数。将含有构建干扰EGFP-Intron2表达载体pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Intron2-PgpdA的农杆菌接种到5mL含有50μg/mL Kan的LB液体培养基中，28℃220r/min过夜培养，5000r/min离心5min收集菌体。用IM培养基将菌体重悬，并将菌体浓度稀释至OD600nm＝0.4-0.5，同样条件下继续培养6h。将孢子液用根瘤农杆菌菌液稀释红曲菌孢子至104-105个孢子/mL，取200μL稀释液涂布在铺有玻璃纸的Co-IM培养基上，28℃培养2-3d。转移Co-IM培养基上的玻璃纸至灭菌的空平皿中，倒入约40℃含有15mg/L G418，30mg/L潮霉素和0.5g/L CS的PDA培养基中，待培养基凝固后28℃倒置培养。将长出的菌落挑出，接种到含有15mg/L G418和30mg/L潮霉素的PDA培养基上，继续培养，如果能生长，可断定为转化子，提取基因组，进行PCR验证是否为目的基因突变菌株。并用激光共聚焦显微镜观察菌丝荧光强度，以表达EGFP红曲菌株为参照，根据EGFP荧光表达强弱筛选干扰表达EGFP红曲菌株，如果转化子EGFP荧光表达强度越弱，可断定该转化子干扰表达EGFP-Intron2基因的效果越好。
本实施例中实验所用引物均由上海生工公司合成，其中引物序列表如下：
表1引物序列表(1)
实施例2反向双启动子干扰表达EGFP-Exon3红曲菌株及其筛选
(1)采用引物KpnI-PtrpC-F/EGFP-PtrpC-R从质粒pSKH中克隆PtrpC。同时采用引物EGFP-F/XhoI-EGFP-R从质粒pEGFP-N1中克隆EGFP。采用Double-joint PCR融合、富集和纯化2个片段，获得绿色荧光蛋白基因的表达片段PtrpC-EGFP。
(2)采用引物XbaI-hphF/HindIII-hphR从质粒pSKH中克隆hph，克隆得到的hph基因片段经Xba I和Hind III酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pCAMBIA3300-hph。
(3)采用Kpn I和Xho I分别酶切PtrpC-EGFP与环化质粒pCAMBIA3300-hph，使用小量DNA产物纯化试剂盒纯化酶切产物，纯化的酶切产物在T4连接酶作用下16℃连接4h，取20μL连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，在含有50μg/mL Kan的LB固体培养基上37℃过夜培养大肠杆菌，随机挑取克隆子，采用KpnI-PtrpC-F/XhoI-EGFP-R进行PCR验证。提取质粒进行酶切验证，采用Kpn I和Xho I双酶切质粒，酶切结果正确的质粒即为绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP。
(4)将绿色荧光表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP经根癌农杆菌介导的红曲转化法转入红色红曲菌M7中，经由基因组验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到表达EGFP的红曲菌株。
(5)从质粒pKN1中克隆neo，克隆得到的neo基因片段经Xho I和EcoR I酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo；从质粒pEGFP-N1中克隆EGFP，克隆得到的EGFP基因片段经BamH I和Sma I酶切后与同样酶切过的pSilent-Dual1质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pSilent-Dual1-EGFP；从质粒pSilent-Dual1-EGFP中克隆PtrpC-EGFP-PgpdA，克隆得到的PtrpC-EGFP-PgpdA基因片段经Kpn I和Xba I酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300-neo质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA。
(6)将目的基因片段Exon3经Not I与Spe I双酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP–PgpdA质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Exon3-PgpdA。
(7)将质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Exon3-PgpdA通过根癌农杆菌介导的红曲转化法转入表达EGFP的红曲菌株中，经由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到反向双启动子干扰表达EGFP-Exon3红曲菌株。
上述步骤(7)中表达EGFP-Exon3的红曲菌株的的转化筛选步骤如下：筛选出的表达EGFP红曲菌株接种到PDA斜面上，28℃培养10-20d，无菌水洗下孢子经过滤、浓缩的得到孢子液，使用血球计数板计数。将含有构建干扰EGFP和Exon3基因表达载体pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Exon3-PgpdA的农杆菌接种到5mL含有50μg/mL Kan的LB液体培养基中，28℃220r/min过夜培养，5000r/min离心5min收集菌体。用IM培养基将菌体重悬，并将菌体浓度稀释至OD600nm＝0.4～0.5，同样条件下继续培养6h。用根瘤农杆菌菌液稀释红曲菌孢子至104-105个孢子/mL，取200μL稀释液涂布在铺有玻璃纸的Co-IM培养基上，28℃培养2-3d。转移Co-IM培养基上的玻璃纸至灭菌的空平皿中，倒入约40℃含有15mg/L G418，30mg/L潮霉素和0.5g/L CS的PDA培养基中，待培养基凝固后28℃倒置培养。将长出的菌落挑出，接种到含有15mg/L G418和30mg/L潮霉素的PDA培养基上，继续培养，如果能生长，可断定为转化子，提取基因组，进行PCR验证是否为目的基因突变菌株。并用激光共聚焦显微镜观察菌丝荧光强度，以表达EGFP红曲菌株为参照，根据EGFP荧光表达强弱筛选干扰表达EGFP红曲菌株，如果转化子EGFP荧光表达强度越弱，可断定该转化子干扰表达EGFP-Exon3基因的效果越好。
本实施例中实验所用引物均由上海生工公司合成，其中引物序列表如下：
表2引物序列表(2)
测试方法及结果
对实施例1中得到的绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP的PCR产物验证及菌落验证，得图1，其中泳道1是Double-joint PCR融合得到的PtrpC-EGFP基因片段，泳道2是从质粒pSKH中克隆出hph。图中PtrpC-EGFP基因片段和hph均具有清晰条带，说明由本发明提供的引物可用于构建绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP。
对实施例1中得到的pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Intron2-PgpdA及PtrpC-EGFP-Intron2-PgpdA基因进行菌落验证，得图3，其中泳道1是阳性克隆子，泳道2是LB液体培养阳性克隆子，图中阳性克隆子和LB液体培养阳性克隆子均具有清晰条带，说明由本发明提供的引物可用于构建重组质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Intron2-PgpdA。
对实施例2中得到的PtrpC-EGFP基因进行菌落验证，得图2，其中泳道1是阳性克隆子。泳道2是LB液体培养阳性克隆子。图中阳性克隆子和LB液体培养阳性克隆子均具有清晰条带，说明由本发明提供的引物可以扩增PtrpC-EGFP基因。
对实施例2中得到的pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Exon3-PgpdA及PtrpC-EGFP-Exon3-PgpdA基因进行菌落验证，得图4，其中泳道1是阳性克隆子，泳道2是LB液体培养阳性克隆子，说明由本发明提供的引物可用于构建重组质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Exon3-PgpdA。
使用激光共聚焦显微镜对实施例2中获得的转化子进行观察，得图5。A和B为表达绿色荧光蛋白EGFP的M7菌株观察结果，A为正常白光显微观察结果图，B为同样位置荧光模式下的观察结果图；C和D为实施例2中转化子的观察结果，C为正常白光显微观察结果图，D为同样位置荧光模式下的观察结果图。转化子EGFP荧光表达强度变弱，说明反向双启动子结构可以成功干扰EGFP-Exon3基因的表达，且目的基因Exon3的干扰程度和绿色荧光蛋白EGFP的表达强度具有一致性。
综上所述，本发明借助根癌农杆菌介导红曲转化与反向双启动子体系实现对丝状真菌的RNA干扰，与原生质体转化法相比，大大减少了实现RNA干扰的时间和成本，并且根据荧光表达强弱判断RNA干扰效率高低，可以快速有效筛选出RNA干扰表达的红曲菌株。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种干扰红曲菌基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
克隆PtrpC(启动子)片段及EGFP(绿色荧光蛋白)片段，将PtrpC片段及EGFP片段融合，获得PtrpC-EGFP，即绿色荧光蛋白基因的表达片段；
克隆hph(潮霉素抗性标记基因，hygromycin)基因片段，将所述hph基因片段酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒环化成完整的质粒pCAMBIA3300-hph；
将所述PtrpC-EGFP与所述质粒pCAMBIA3300-hph连接，得到连接产物，将所述连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞后从中挑取克隆子，对所述克隆子进行PCR和酶切验证，验证结果正确的质粒即为绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP；
将所述绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP转入红色红曲菌M7中，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到表达EGFP的红曲菌株；
构建带有新霉素抗性基因标记的通用载体pCAMBIA3300-neo(新霉素抗性基因)，再通过酶切酶连插入干扰EGFP表达的RNAi片段，构建pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体；
将目的基因片段RNAi双酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP–PgpdA表达载体环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-RNAi-PgpdA；
将质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-RNAi-PgpdA转入所述表达EGFP的红曲菌株中，经由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到共同干扰EGFP和目的基因表达的红曲菌株。
2.如权利要求1所述的干扰红曲菌基因表达的方法，其特征在于，在步骤克隆PtrpC(启动子)片段及EGFP(绿色荧光蛋白)片段，将PtrpC片段及EGFP片段融合，获得PtrpC-EGFP，即绿色荧光蛋白基因的表达片段中：从质粒pSKH中克隆PtrpC；和/或，从质粒pEGFP-N1中克隆EGFP；和/或，采用Double-joint PCR将PtrpC片段及EGFP片段融合。
3.如权利要求1所述的干扰红曲菌基因表达的方法，其特征在于，在步骤克隆hph(潮霉素抗性标记基因，hygromycin)基因片段，将所述hph基因片段酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒环化成完整的质粒pCAMBIA3300-hph中：从质粒pSKH中克隆hph；和/或，
所述hph基因片段与pCAMBIA3300质粒酶切的酶均为Xba I和Hind III。
4.如权利要求1所述的干扰红曲菌基因表达的方法，其特征在于，在步骤将所述PtrpC-EGFP与所述质粒pCAMBIA3300-hph连接，得到连接产物，将所述连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞后从中挑取克隆子，对所述克隆子进行PCR和酶切验证，验证结果正确的质粒即为绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP之前：将所述PtrpC-EGFP与所述质粒pCAMBIA3300-hph分别均采用Kpn I和Xho I进行双酶切。
5.如权利要求1所述的干扰红曲菌基因表达的方法，其特征在于，在步骤将所述PtrpC-EGFP与所述质粒pCAMBIA3300-hph连接，得到连接产物，将所述连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞后从中挑取克隆子，对所述克隆子进行PCR和酶切验证，验证结果正确的质粒即为绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP中：采用T4连接酶将所述PtrpC-EGFP与所述质粒pCAMBIA3300-hph进行T4连接。
6.如权利要求1所述的干扰红曲菌基因表达的方法，其特征在于，步骤将所述绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP转入红色红曲菌M7中，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到表达EGFP的红曲菌株包括：将所述绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-hph-PtrpC-EGFP通过根癌农杆菌介导的红曲转化转入红色红曲菌M7中，通过潮霉素筛选出阳性转化子，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到表达EGFP的红曲菌株。
7.如权利要求1所述的干扰红曲菌基因表达的方法，其特征在于，步骤构建带有新霉素抗性基因标记的通用载体pCAMBIA3300-neo，再通过酶切酶连插入干扰EGFP表达的RNAi片段，构建pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体具体包括：
从质粒pKN1中克隆neo，克隆得到的neo基因片段经Xho I和EcoR I酶切后，与同样酶切过的pCAMBIA3300质粒在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo；
从质粒pEGFP-N1中克隆EGFP，克隆得到的EGFP基因片段经BamH I和Sma I酶切后与同样酶切过的pSilent-Dual1质粒(氨苄青霉素(Ampicillin)抗性、PgpdA和TrpC启动子)在T4连接酶的作用下环化成完整的质粒pSilent-Dual1-EGFP；
从质粒pSilent-Dual1-EGFP中克隆出PtrpC-EGFP-PgpdA基因片段，经Kpn I和Xba I酶切后与同样双酶切过的pCAMBIA3300-neo质粒在T4连接酶的作用下环化成pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体。
8.如权利要求1所述的干扰红曲菌基因表达的方法，其特征在于，在步骤构建带有新霉素抗性基因标记的通用载体pCAMBIA3300-neo，再通过酶切酶连插入干扰EGFP表达的RNAi片段，构建pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体之后，还包括：
将所述pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-PgpdA表达载体通过根癌农杆菌介导的红曲转化法转化进入所述表达EGFP的红曲菌株中，通过潮霉素和新霉素两种抗性共同筛选出阳性转化子，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到干扰EGFP表达的红曲菌株。
9.如权利要求1所述的干扰红曲菌基因表达的方法，其特征在于，在步骤将目的基因片段RNAi双酶切后与同样酶切过的pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP–PgpdA表达载体环化成完整的质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-RNAi-PgpdA中：将目的基因片段RNAi和pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP–PgpdA表达载体双酶切的酶均为Not I与Spe I；和/或，
采用T4连接酶将目的基因片段RNAi与pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP–PgpdA表达载体环化。
10.如权利要求1所述的干扰红曲菌基因表达的方法，其特征在于，步骤将质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-RNAi-PgpdA转入所述表达EGFP的红曲菌株中，经由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到共同干扰EGFP和目的基因表达的红曲菌株包括：将质粒pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-RNAi-PgpdA通过根癌农杆菌介导的转化法转化进入所述表达EGFP的红曲菌株中，通过潮霉素和新霉素两种抗性共同筛选出阳性转化子，由基因组PCR验证和激光共聚焦显微镜观察，筛选得到共同干扰EGFP和目的基因表达的红曲菌株。
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