CN116808179A - 基于皮肤修复的iii型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法，其通过将血小板衍生生长因子PDGF与碱性成纤维细胞生长因子进行串联拼合，形成重组细胞分裂素基因，然后经构建表达载体，制备质粒，培养菌落并完成转化子筛选，对所述重组III型胶原蛋白ɑ‑1链进行多巴胺修饰，和注射源剂进行物理交联等步骤形成注射剂，本发明所制备的III型人源化胶原蛋白注射剂将血小板衍生生长因子PDGF通过基因重组和排列，有机的结合进III型人源化胶原蛋白的制备当中，并最终形成注射剂，在继承原有的人源化胶原蛋白对肌肤保养作用的前提下，可以有效促进伤口愈合并缩短愈合时间，进而避免化学试剂残留影响，补充皮肤水分营养和改善皮肤状态的效果更好。

Description

基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法。

背景技术

近年来，相对安全有效的医疗美容方式是在面部软组织直接注射填充剂，起深层滋润皮肤，改善皮肤状态的功效。注射美容技术已经成为软组织注射美容手术的主要项目之一，其不开刀、不流血的微创性及操作方便、见效快等特点被广大爱美人士所推崇。

胶原蛋白是属于结构性蛋白，是一种多糖蛋白，呈乳白色，它里边会含有少量的半乳糖和葡萄糖，是细胞外基质最主要的部分，哺乳类动物里边含量最多，在皮肤中构成了一张细密的弹力网，类支架式支撑住皮肤。随着年龄的增长，胶原蛋白会逐渐的流失，从而导致支撑皮肤的胶原肽键和弹力网断裂，其螺旋网状结构随即被破坏，皮肤组织被氧化、萎缩、塌陷，肌肤就会出现干燥、皱纹、松弛无弹性等衰老现象。由于胶原蛋白具有低抗原性、良好的生物相容性和可生物降解性，因此可应用于面部轮廓矫正、皱纹修复等方面。

胶原蛋白的发展分为三个阶段，第一阶段：动物源胶原蛋白；第二阶段：类人源胶原蛋白；第三阶段：人源化胶原蛋白。其中，动物源胶原蛋白活性较低且涂抹后容易发生排异反应造成面部肌肤的过敏，类人源胶原蛋白可以降低排异过敏反应风险，但由于来源较少，其价格昂贵且水溶性较差，在应用中很难为人体组织补充必须的结合水。第三阶段的人源化胶原蛋白是III型人源胶原蛋白，其是一种利用基因工程技术，以人III型胶原蛋白基因序列(25岁后人体无法再合成Ⅲ型胶原蛋白)为模板，将其特征和主要功能序列重新优化设计。其在结构、特性等方面与人类自身的胶原蛋白100％一致，组织相容性好，被人体直接同源化吸收，能顺利通过皮肤吸收，不需要分解异化过程，参与构建肌底胶原，利用度高，可以在动物、植物和微生物表达体系获得重组人胶原蛋白，解决了传统提取方法存在的病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排异性等。

血小板衍生生长因子(PDGF，Platelet-derived growth factor)是1974年从血小板中发现，在损伤早期从血小板α颗粒释放出来，启动并加速组织创伤修复。PDGF是阳离子糖蛋白，相对分子量约为28kD-35kD，等电点为9.8，由A、B两条肽链通过二硫键构成同源或异源的二聚体：PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB。其中BB型式更能促进纤维母细胞的生长，促进与伤口修复有关的细胞化学触觉补强及细胞增殖，加强肉芽组织的形成，促进伤口愈合并缩短愈合时间。

现有的人源化胶原蛋白虽然具备很强的亲肤力，可以极好的融合于皮肤中进行填充，可以补充皮肤所需要的水分及养分，活化皮肤表皮细胞，加速真皮细胞生长，促进组织新陈代谢，保持皮肤弹性，防止皱纹出现。但是其对皮肤的修复效果还是不是很显著，无法完成快速的皮肤修复，并且在现有技术中，很少有技术披露III型人源化胶原蛋白在脸部肌肤修复的应用，存在有许多的技术空白。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出了基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法。

本发明所采用的技术方案是：基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法，包括如下步骤：

S1、将血小板衍生生长因子PDGF与碱性成纤维细胞生长因子进行串联拼合，形成重组细胞分裂素基因；

S2、构建表达载体：基于Ⅲ型人源化胶原蛋白α1链胶原域的三肽重复序列特征，设计并人工合成一段人源胶原蛋白基因单体；构建含有同向六串联所述人源化胶原蛋白基因单体的表达载体；

S3、制备质粒：将所述表达载体单酶切线性化，再转入毕氏酵母X-33宿主中，利用PCR技术将人源蛋白中的DNA片段进行密码子优化和拼接重组，利用引物上加入的NcoI和Xho I的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与所述重组细胞分裂素基因共孵育，加入T4 DNA连接酶，4℃连接8-12小时，转化大肠杆菌；经线性化后电转化宿主菌，经过随机挑选和加压筛选后提取质粒；

S4、培养菌落并完成转化子筛选：将S3制备的质粒与毕赤酵母菌进行培养，形成转化子，经线性化后电转化宿主菌，经过随机挑选和加压筛选，完成所述转化子筛选；

S5、发酵纯化：将S4筛选的转化子接种后进行发酵培养获得发酵液，离心取上清液，分离纯化得到重组III型胶原蛋白_ɑ-1链；

S6、对所述重组III型胶原蛋白_ɑ-1链进行多巴胺修饰，制得III型人源化胶原蛋白；

S7、将S6中制备的III型人源化胶原蛋白和注射源剂以1：20～1∶25进行物理交联，制得所述III型人源化胶原蛋白注射剂。

以下还提供了若干可选方式，但并不作为对上述总体方案的额外限定，仅仅是进一步的增补或优选，在没有技术或逻辑矛盾的前提下，各可选方式可单独针对上述总体方案进行组合，还可以是多个可选方式之间进行组合。

优选的，所述S4中的转化子培养工序为：将所述质粒与所述毕赤酵母菌转接至含zeocin的YPDZ平板中，利用zeocin浓度梯度筛选得到高抗性酵母转化子，再用BMGY培养基培养，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞，得细胞液，并调节所述细胞液中甲醇终浓度为1.20-1.33％，诱导45-52h，得高水平分泌表达酵母转化子。

优选的，所述S5中的纯化包括如下操作步骤：

(1)粗分离

将人源化胶原蛋白蛋白用沉降式离心机进行固液分离，所得上清液用0.15μm中空纤维膜进行过滤，滤出液用截留分子量为4.5-6K的超滤膜进行超滤；

(2)精细分离纯化

向步骤(1)超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.21～5.85mS/cm，再用NaOH调节pH至4.61～6.15，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相A与流动相B体积比为90∶5的混合液洗脱，最后用流动相A与流动相B体积比为85∶8～70∶25的混合液洗脱，洗脱流速均为110～230L/min；收集流动相A与流动相B体积比为85∶8～70∶25时的洗脱液，得到纯度大于98％的重组III型胶原蛋白_ɑ-1链。

优选的，所述S7中的注射源剂包括有21-24份透明质酸钠、10-13份磷酸盐缓冲液、26-28份玻尿酸、1.5-2.5份β-磷酸三钙、1.5-2.2份赋形剂、0.8-1.3份维生素粉、35-40份注射用水。

优选的，所述S7中的注射源剂包括Col III-ɑ1-DOPA溶液和葡萄糖亚铁溶液，所述Col III-ɑ1-DOPA溶液的浓度为1～15mg/mL，所述葡萄糖亚铁溶液的浓度为0.01～0.25mg/mL，所述Col III-ɑ1-DOPA溶液和所述葡萄糖亚铁的摩尔比例为5:1，并形成具有三螺旋和铁离子配位交联结构的水凝胶。

优选的，所述注射剂中还包括分子量大于180g/mol的热稳定剂，所述热稳定剂为甘露糖醇、异亮氨酸、脯氨酸中的一种或多种。

更优选的，所述血小板衍生生长因子PDGF为由两个氨基酸B链单体组成的二硫键二聚体PDGF-BB。

本发明与现有技术相比较，其具有以下有益效果：

本发明所制备的III型人源化胶原蛋白注射剂将血小板衍生生长因子PDGF通过基因重组和排列，有机的结合进III型人源化胶原蛋白的制备当中，并最终形成注射剂，在继承原有的人源化胶原蛋白对肌肤保养作用的前提下，可以有效促进伤口愈合并缩短愈合时间，进而避免化学试剂残留影响，补充皮肤水分营养和改善皮肤状态的效果更好，非常适合应用在于皮肤或组织中创伤部位的胶原再生和组织填充，填补了目前III型人源化胶原蛋白在肌肤美化方面应用的空白。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。

另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

具体实施方案：本发明是基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法，包括如下步骤：

S1、将血小板衍生生长因子PDGF与碱性成纤维细胞生长因子进行串联拼合，形成重组细胞分裂素基因；

S2、构建表达载体：基于Ⅲ型人源化胶原蛋白α1链胶原域的三肽重复序列特征，设计并人工合成一段人源胶原蛋白基因单体；构建含有同向六串联人源化胶原蛋白基因单体的表达载体；

S3、制备质粒：将表达载体单酶切线性化，再转入毕氏酵母X-33宿主中，利用PCR技术将人源蛋白中的DNA片段进行密码子优化和拼接重组，利用引物上加入的NcoI和Xho I的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与重组细胞分裂素基因共孵育，加入T4 DNA连接酶，4℃连接8-12小时，转化大肠杆菌；经线性化后电转化宿主菌，经过随机挑选和加压筛选后提取质粒；

S4、培养菌落并完成转化子筛选：将S3制备的质粒与毕赤酵母菌进行培养，形成转化子，经线性化后电转化宿主菌，经过随机挑选和加压筛选，完成转化子筛选；

S5、发酵纯化：将S4筛选的转化子接种后进行发酵培养获得发酵液，离心取上清液，分离纯化得到重组III型胶原蛋白_ɑ-1链；

S6、对重组III型胶原蛋白_ɑ-1链进行多巴胺修饰，制得III型人源化胶原蛋白；S7、将S6中制备的III型人源化胶原蛋白和注射源剂以1：20～1∶25进行物理交联，制得III型人源化胶原蛋白注射剂。

首先对重组胶原蛋白进行简单介绍：重组胶原蛋白通过将胶原蛋白的天然基因序列或重新优化设计的基因序列，导入选定的宿主细胞中，从而获得具有一定天然胶原蛋白特征和主要功能的蛋白质。重组胶原蛋白以其优异的生物相容性、多功能性、可扩展性和品质可控等特性，是胶原蛋白家族的直接来源，尤其是生物相容性良好的新生物功能材料领域最大的来源之一。

胶原蛋白是细胞外基质中最重要的组成部分，随着年龄的增长，胶原蛋白会逐渐的流失。进而导致人的从面部皮肤到五脏六腑的脏腑器官的一个衰老，补充胶原蛋白是延衰最直接，也是最有效的手段。

在本实施例中，S4中的转化子培养工序为：将质粒与毕赤酵母菌转接至含zeocin的YPDZ平板中，利用zeocin浓度梯度筛选得到高抗性酵母转化子，再用BMGY培养基培养，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞，得细胞液，并调节细胞液中甲醇终浓度为1.20-1.33％，诱导45-52h，得高水平分泌表达酵母转化子。

然后，S5中的纯化包括如下操作步骤：

(1)粗分离

将人源化胶原蛋白蛋白用沉降式离心机进行固液分离，所得上清液用0.15μm中空纤维膜进行过滤，滤出液用截留分子量为4.5-6K的超滤膜进行超滤；

(2)精细分离纯化

向步骤(1)超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.21～5.85mS/cm，再用NaOH调节pH至4.61～6.15，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相A与流动相B体积比为90∶5的混合液洗脱，最后用流动相A与流动相B体积比为85∶8～70∶25的混合液洗脱，洗脱流速均为110～230L/min；收集流动相A与流动相B体积比为85∶8～70∶25时的洗脱液，得到纯度大于98％的重组III型胶原蛋白_ɑ-1链。

在实际应用中，层析纯化方法主要包括离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和层析以及凝胶过滤层析等方法。本发明中，rPFGF分泌表达在发酵上清液中，通过离心、过滤等方法除去菌体和大颗粒杂质；再通过超滤的方法除去小分子的色素和盐，并且浓缩体积，将发酵液调整为合适的缓冲液，利于下步的层析纯化。

层析纯化的第一步采用阳离子交换介质SP Sepharose XL，SP Sepharose XL介质具有高载量，快流速和易处理等特点，能快速有效地将rPFGF从超滤液中捕获。上样结束后，用含1mol/L的PBS洗脱；第二步，洗脱液加(NH4)2SO4至1mol/L，上样于平衡好的PhenylSepharose FF疏水层析柱，20mmol/LPB洗脱目的蛋白；第三步，目的蛋白峰上样于pH7.2，20mmol/LPB，0.15mmol/LNaCl平衡的Superdex75凝胶过滤柱，收集洗脱峰。

作为本实施例的一种优选实施方式，S7中的注射源剂包括有21-24份透明质酸钠、10-13份磷酸盐缓冲液、26-28份玻尿酸、1.5-2.5份β-磷酸三钙、1.5-2.2份赋形剂、0.8-1.3份维生素粉、35-40份注射用水。

作为本实施例的另一种优选实施方式，S7中的注射源剂包括Col III-α1-DOPA溶液和葡萄糖亚铁溶液，Col III-α1-DOPA溶液的浓度为1～15mg/mL，葡萄糖亚铁溶液的浓度为0.01～0.25mg/mL，Col III-α1-DOPA溶液和葡萄糖亚铁的摩尔比例为5:1，并形成具有三螺旋和铁离子配位交联结构的水凝胶。

在本实施例中，注射剂中还包括分子量大于180g/mol的热稳定剂，热稳定剂为甘露糖醇、异亮氨酸、脯氨酸中的一种或多种。热稳定剂的设计可以使得本发明中的注射剂可以更稳定的保存，热稳定剂可以被肌肤吸收和分解，安全无害。

更具体的，血小板衍生生长因子PDGF为由两个氨基酸B链单体组成的二硫键二聚体PDGF-BB。BB型式的血小板衍生生长因子更能促进纤维母细胞的生长，促进与伤口修复有关的细胞化学触觉补强及细胞增殖，加强肉芽组织的形成，促进伤口愈合并缩短愈合时间。

试验例：

1.测试样品：每管注射针样品中含有20克实施例制得的III型人源化胶原蛋白注射剂。

2.测试目的：开放型10天测试，通过仪器和拍照测试，评估使用产品10天后的脸部皮肤纹理、干燥度、弹性的变化。

3.受试者要求：

(3.1)入选标准

(1)中国女性

(2)年龄22-55岁

(3)干性或者半干型肌肤

(4)面部研究有轻微敏感或者敏感者

(5)受试者应当对常用化妆品不敏感

(6)受试者近3个月来没有参加别的临床研究

(3.2)排除标准

(1)近一周使用抗组胺药或近一个月使用免疫抑制剂

(2)近2个月受试部位使用任何抗炎药物

(3)胰岛素依赖糖尿病患者

(4)正在接受治疗的呼吸道疾病患者

(5)哺乳期或者妊娠期妇女

(6)过敏性体质或者过敏性皮肤炎等人群，有皮肤病或者疾病史

(7)正在接受皮肤科治疗的人群，或一个月内服用羟基酸类、美白类以及抗衰老类药物的受试者。

(8)测试区域有大面积胎记、抓痕、白斑、色素痣、疙瘩瘢痕等影响，实验的皮肤表征，此外，试验负责人判断为不适合作为本次实验对象的人群。

(3.3)限制事项

(1)试验期间，禁止对被测皮肤进行影响测试的治疗。

(2)试验期间，禁止再测试使用其他护肤产品以及其他影响测试的产品。

(3)试验期间，沐浴液、香皂、洗发露等日用品类要跟试验开始前用的一致，禁止更换。

4.实验目标人数：入选合格受试者35人，确保最终完成30人。

5.测试仪器：

(1)Antera3D皮肤测试仪(爱尔兰)

(2)干燥度测试仪

(3)芬兰Delfin皮肤弹性测试仪

6.测试环境：温度21℃±1℃，湿度50％±5％，保证每次的光线不变。

7.实验流程：

(1)首次到访，对受试者进行试验说明，并签署知情同意书。

(2)对参加试验的受试者按照试验要求进行筛选，共筛选入组35名，最终保证30人以上。

(3)筛选合格的受试者测试当天早上不可以使用任何化妆品，用清水清洁完面部后抹在恒温恒湿间休息30分钟，30分钟后，对面部进行测试。

(4)在测试完成后对受试者进行使用说明，受试者听取说明后，发放产品，受试者在家连续10天使用试验样品，在此期间，受试者按照试验的指示在产品连用3天后、7天后进行指定地点回访，步骤按照步骤(3)进行面部测试。

(5)测试开始时和结束时对产品的使用量进行确认。

8.观察测试项目：

使用前0天，使用3天后和使用7天后共3次对受试者进行仪器测试。

(1)皮肤纹理：用antera3D分析皱纹结合佳能照相机图像采集。

结果判定：用antera3D拍照，分析纹理。

(2)干燥度：用干燥度测试仪测试皮肤干燥度。

结果判定：用干燥度测试仪测试，分析干燥度。

(3)弹性：用芬兰Delfin皮肤弹性测试仪测试皮肤弹性。

结果判定：用芬兰Delfin皮肤弹性测试仪测试，分析弹性。

(4)测试仪器介绍说明：

Antera 3D是一款用于皮肤分析和评估的成像设备。

干燥度测试仪是一款用于测试皮肤干燥度的设备。

芬兰Delfin皮肤弹性测试仪是一款用于测试皮肤弹性的设备。

表1

上述表1为受试人群使用本实施例制得的III型人源化胶原蛋白注射剂在0天、3天和7天关于皮肤纹理、皮肤干燥度、皮肤弹性的变化数据。

数据统计分析方法：用SPSS软件对各个测量值进行描述性统计，包括数量、均值、标准差、最小值、最大值等。用Shapiro-wilk test(夏皮罗-威尔克检验)进行数据改善值正态分布的显著性检验，Sig(双侧)＞0.01，则呈正态分布，进行T检验，显著性差异水平α取0.05。弱Sig(双侧)＜0.01，则呈非正态分布，进行Wilcoxon检验，显著性差异水平α取0.05，显著性差异水平为P值<0.05，表示有统计学差异，P<0.01，统计学差异明显。

综上，通过仪器测试的前后对比，受试人员在注射使用本实施例制得的III型人源化胶原蛋白注射剂后，皮肤纹理、皮肤干燥度、皮肤弹性均得到改善，并且改善率P≤0.05，具有统计学意义，说明含有本发明的III型人源化胶原蛋白注射剂后，具有延缓衰老，促进皮肤紧致，让皮肤更加水润富有弹性现象的功效。

本发明的基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将血小板衍生生长因子PDGF与碱性成纤维细胞生长因子进行串联拼合，形成重组细胞分裂素基因；

S2、构建表达载体：基于Ⅲ型人源化胶原蛋白α1链胶原域的三肽重复序列特征，设计并人工合成一段人源胶原蛋白基因单体；构建含有同向六串联所述人源化胶原蛋白基因单体的表达载体；

S3、制备质粒：将所述表达载体单酶切线性化，再转入毕氏酵母X-33宿主中，利用PCR技术将人源蛋白中的DNA片段进行密码子优化和拼接重组，利用引物上加入的NcoI和Xho I的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与所述重组细胞分裂素基因共孵育，加入T4 DNA连接酶，4℃连接8-12小时，转化大肠杆菌；经线性化后电转化宿主菌，经过随机挑选和加压筛选后提取质粒；

S4、培养菌落并完成转化子筛选：将S3制备的质粒与毕赤酵母菌进行培养，形成转化子，经线性化后电转化宿主菌，经过随机挑选和加压筛选，完成所述转化子筛选；

S5、发酵纯化：将S4筛选的转化子接种后进行发酵培养获得发酵液，离心取上清液，分离纯化得到重组III型胶原蛋白_ɑ-1链；

S6、对所述重组III型胶原蛋白_ɑ-1链进行多巴胺修饰，制得III型人源化胶原蛋白；

S7、将S6中制备的III型人源化胶原蛋白和注射源剂以1：20～1∶25进行物理交联，制得所述III型人源化胶原蛋白注射剂。

2.根据权利要求1所述的基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，所述S4中的转化子培养工序为：将所述质粒与所述毕赤酵母菌转接至含zeocin的YPDZ平板中，利用zeocin浓度梯度筛选得到高抗性酵母转化子，再用BMGY培养基培养，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞，得细胞液，并调节所述细胞液中甲醇终浓度为1.20-1.33％，诱导45-52h，得高水平分泌表达酵母转化子。

3.根据权利要求2所述的基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，所述S5中的纯化包括如下操作步骤：

(1)粗分离

将人源化胶原蛋白蛋白用沉降式离心机进行固液分离，所得上清液用0.15μm中空纤维膜进行过滤，滤出液用截留分子量为4.5-6K的超滤膜进行超滤；

(2)精细分离纯化

向步骤(1)超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.21～5.85mS/cm，再用NaOH调节pH至4.61～6.15，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相A与流动相B体积比为90∶5的混合液洗脱，最后用流动相A与流动相B体积比为85∶8～70∶25的混合液洗脱，洗脱流速均为110～230L/min；收集流动相A与流动相B体积比为85∶8～70∶25时的洗脱液，得到纯度大于98％的重组III型胶原蛋白_ɑ-1链。

4.根据权利要求1所述的基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，所述S7中的注射源剂包括有21-24份透明质酸钠、10-13份磷酸盐缓冲液、26-28份玻尿酸、1.5-2.5份β-磷酸三钙、1.5-2.2份赋形剂、0.8-1.3份维生素粉、35-40份注射用水。

5.根据权利要求1所述的基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，所述S7中的注射源剂包括Col III-ɑ1-DOPA溶液和葡萄糖亚铁溶液，所述ColIII-ɑ1-DOPA溶液的浓度为1～15mg/mL，所述葡萄糖亚铁溶液的浓度为0.01～0.25mg/mL，所述Col III-ɑ1-DOPA溶液和所述葡萄糖亚铁的摩尔比例为5:1，并形成具有三螺旋和铁离子配位交联结构的水凝胶。

6.根据权利要求4-5任一项所述的基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，所述注射剂中还包括分子量大于180g/mol的热稳定剂，所述热稳定剂为甘露糖醇、异亮氨酸、脯氨酸中的一种或多种。

7.根据权利要求4所述的基于皮肤修复的III型人源化胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，所述血小板衍生生长因子PDGF为由两个氨基酸B链单体组成的二硫键二聚体PDGF-BB。