CN116808031B - 一种来源于黄连解毒汤的治疗乳腺癌的中药单体组合物及其应用 - Google Patents
一种来源于黄连解毒汤的治疗乳腺癌的中药单体组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种来源于黄连解毒汤的治疗乳腺癌的中药单体组合物及其应用，本发明属于中药领域，本发明的目的是为了一种黄连解毒汤中在治疗ER阳性乳腺癌的关键中药单体组合物及其应用，为更加深入的探究黄连解毒汤乳腺癌组分中药抑制人乳腺癌细胞增殖作用的机制，为黄连解毒汤乳腺癌组分中药的应用开发及黄连解毒汤方剂的研究提供新的技术支持。本发明中药单体组合物是由槲皮素、山奈酚、小檗碱按照浓度比为1:0.1～1.0:0.1～1.0的比例组成。本发明通过网络药理学与组分中药学相结合，均匀设计筛选出黄连解毒汤治疗人乳腺癌细胞的组分中药，实验验证了筛选出的组分中药治疗乳腺癌作用。
Description
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种来源于黄连解毒汤的治疗乳腺癌的中药单体组合物及其应用。
背景技术
黄连解毒汤出自葛洪所著的《肘后备急方》一书，在清热解毒方面是经典药方，由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成，比例为3:2:2:3，具有清“热”、解“毒”等功效，主要治疗三焦火热引起的“火毒”症状。现代研究发现黄连解毒汤具有抗肿瘤作用，证实黄连解毒汤通过诱导细胞凋亡及抑制肿瘤血管生成等途径达到抗肿瘤作用，体内实验发现对S180荷瘤小鼠具有抑制肿瘤增殖的作用，黄连解毒汤体外给药时对MCF-7细胞也具有增殖抑制作用。
乳腺癌(ER)是女性最常见的恶性肿瘤，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，通常发生在乳房腺上皮组织，是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。文献证实大量中药活性成分具有抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡、改变肿瘤微环境以及提高机体免疫力的作用。
吴继萍等发表的《中医药辨证分型论治乳腺癌临床疗效评价》，给出了：对乳腺癌患者进行主要临床症状、中医证型、理化指标的回顾性评价。将180例患者辨证分为肝气郁结证，冲任失调证，燥毒蕴结证，气血双亏、邪毒内陷证4型。结果:经中医药治疗后临床症状、中医证型好转154例，总有效率达85.56％，死亡3例，占1.67％，稳定10例，占5.56％。在癌热控制等方面，从治疗前9.44％降至治疗后的2.78％；对癌痛控制，从治疗前的25.00％到治疗后降至8.33％。其中医证型和生活质量的改善呈正相关，生活质量改善达78.33％。CEA、CA153均得到不同程度改善。结论:以乳腺癌诊治梳理方案为原则对乳腺癌进行辨证分型论治，在改善患者的临床症状、中医证型、理化指标、体征、生活质量等方面是积极的、有效的，显示出了中医药的特色优势。
孙健等发表的《黄连解毒汤抗肿瘤作用的实验研究》给出了：采用H22小鼠肝癌实体瘤移植性肿瘤模型进行体内实验,通过检测抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数等指标观察黄连解毒汤的体内抑瘤作用及对免疫器官的影响。并运用血清药理学方法研究了对人结肠癌Swille，人肺腺癌SPC-A-1，人胃癌SGC-7901，人乳腺癌细胞MCF-7体外生长的抑制作用.结果:对荷瘤小鼠肝癌H22在体内有抗肿瘤活性，抑瘤率大、中、小剂量组分别为45.45％(P＜0.001)，28.73％(P＜0.05)，17.78％。含药血清在体外用MTr法测试结果显示，对4种人瘤株，大、中剂量组抑瘤作用均呈现极显著差异(P＜0.001)。结论:黄连解毒汤对H22小鼠肝癌实体瘤有一定的体内抗肿瘤活性，并具剂量依赖性；其含药血清体外对4种人的肿瘤细胞也有一定抑制作用。
虽然上述技术中涉及黄连解毒汤在肿瘤，尤其是乳腺癌的治疗效果，证明黄连解毒汤对乳腺癌有治疗效果。但是，黄连解毒汤中核心的单体物或者组合物，目前并没有相关的报道，黄连解毒汤的作用机理提供研究尚不清楚，导致黄连解毒汤中药的应用开发，深度研究受限。
发明内容
本发明的目的是为了一种黄连解毒汤中在治疗ER阳性乳腺癌的关键中药单体组合物及其应用，为更加深入的探究黄连解毒汤乳腺癌组分中药抑制人乳腺癌细胞增殖作用的机制，为黄连解毒汤乳腺癌组分中药的应用开发及黄连解毒汤方剂的研究提供新的技术支持。
本发明的一种来源于黄连解毒汤的治疗乳腺癌的中药单体组合物，所述的中药单体组合物是由槲皮素、山奈酚、小檗碱按照浓度比为1:0.1～1.0:0.1～1.0的比例组成。
进一步地，所述的中药单体组合物是由槲皮素、山奈酚、小檗碱按照浓度比为1:0.43:0.41的比例组成。
进一步地，所述的浓度单位为mg/L或μmol/L。
本发明的一种治疗乳腺癌的中药制剂，包括所述的中药单体组合物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
进一步地，所述中药制剂包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、汤剂、酒剂、冲剂、口服液剂、缓释制剂和控释制剂中的任意一种。
进一步地，所述的赋形剂包括溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和粘合剂中的一种或两种以上的组合。
本发明的中药单体组合物用于制备治疗乳腺癌药物。
进一步地，所述的乳腺癌为ER阳性乳腺癌。
本发明包含以下有益效果：
本发明通过网络药理学与组分中药学相结合，均匀设计筛选出黄连解毒汤治疗人乳腺癌细胞的组分中药，实验验证了筛选出的组分中药治疗乳腺癌作用，黄连解毒汤治疗人乳腺癌MCF-7细胞增殖作用的有效成分是槲皮素、山奈酚、小檗碱，最佳配比1:0.43:0.41mg/L(1:0.45:0.33μmol/L)。本发明证明了黄连解毒汤乳腺癌组分中药组合物在体内具有较好的抗肿瘤活性。确定治疗人乳腺癌MCF-7细胞的主要有效成分，将中药方剂中的多味中药转变为由几种组分组成的组分中药。
附图说明
图1为实施例1基于网络药理学筛选黄连解毒汤化学成分-靶点网络图；
图2为实施例1黄连解毒汤乳腺癌组分中药核心靶点富集分析流程图；
图3黄连解毒汤乳腺癌组分中药对4T1乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤生长情况的影响图；上图为小鼠成像图；下图为各组别荧光强度的柱状图图；a阴性对照组；b 0.025g/kg·d五氟尿嘧啶；c 0.075g组分中药/kg·d黄连解毒汤乳腺癌组分中药；d 0.150g组分中药/kg·d黄连解毒汤乳腺癌组分中药；e 0.300g组分中药/kg·d黄连解毒汤乳腺癌组分中药；注：与阴性对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01；
图4黄连解毒汤乳腺癌组分中药对4T1荷瘤小鼠瘤重的影响图；上图为各组别4T1小鼠乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤图；下图为各组别4T1小鼠乳腺癌荷瘤小鼠瘤重柱状图图；a阴性对照组；b 0.025g/kg·d五氟尿嘧啶；c 0.075g/kg·d黄连解毒汤乳腺癌组分中药；d0.150g/kg·d黄连解毒汤乳腺癌组分中药；e 0.300g/kg·d黄连解毒汤乳腺癌组分中药；注：与阴性对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例的一种来源于黄连解毒汤治疗乳腺癌的中药单体组合物的获取方法
1)通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)，分别以“黄连”、“黄芩”、“黄柏”、“栀子”为关键词，以“口服生物利用度≥30％”和“药物相似性≥0.18”为筛选条件，获得化学成分和靶点信息。利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库将靶点名称转变为Uniprot ID，获取黄连解毒汤化学成分及其对应的作用靶点信息。将“黄连”、“黄芩”、“黄柏”、“栀子”四位中药的化学成分和药物靶点进行分类和处理，将黄连解毒汤中72个化学成分与144个潜在药物靶点，使用图形网络编辑软件Cytoscape 3.8.2构建黄连解毒汤“化学成分-靶点”网络图，见图1。
2)将黄连解毒汤中的四味中药的化合物在PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找该化合物与乳腺癌有关的实验性文章数量。统计黄连解毒汤中化合物与靶点的连接个数，并计算各靶点的Degree值。通过计算得到各化学成分的贡献指数，将数值从大到小排序。贡献指数从大到小相加直到数值大于等于0.85为止，得到槲皮素、山奈酚、小檗碱选作为黄连解毒汤治疗人乳腺癌的核心组分，此化学成分为黄连解毒汤治疗乳腺癌的组分，见图2。
实施例2
本实施例槲皮素、山奈酚、小檗碱的比例关系确定过程如下：
1)采用均匀设计的方法研究组分中药中三种成分的比例关系，从而确定黄连解毒汤乳腺癌组分中药组方。根据组分数确定因素数和水平数，因素数为组分数，水平数大于2倍的因素数。将获得的各组分IC50数值作为水平数的中间值，其余各值以等比或等差数列排布绘制组分浓度设计表。根据因素数、水平数参考均匀设计使用表，排布因素水平。(此实验组分为槲皮素、山奈酚、小檗碱三种组分，因此组分数为3)根据均匀设计表各水平数值进行药物配比。将配比好的药物进行药效学实验。结合各组分得到的抑制率，根据回归方程绘制回归曲线，求得各组分IC20(1)、IC30(2)、IC40(3)、IC50(4)、IC60(5)、IC70(6)、IC80(7)，设计7水平实验组得到相应抑制率。将各水平值和对应的抑制率进行回归分析。根据表格数值和回归方程进行规划求解，得到最优方案。
2)取出对数生长期的ER阳性乳腺癌的代表性细胞株：MCF-7细胞，利用0.25％的胰酶进行消化，制备细胞悬液。调整细胞至2.5×104个/mL，接种于96孔板，每孔100μL，实验设为阴性组、对照组、DMSO对照组、最优方案组、最优水平组，每组设6个复孔，至于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h。24h后取出，将孔板上清液吸弃，阴性组加入100μL的RPMI-1640培养基、对照组加入100μL浓度0.33μg/ml的阿霉素、DMSO组加入100μL的0.1％ DMSO的培养基、最优方案组加入100μL RPMI-1640培养基稀释的最优方案配方、最优水平组加入100μLRPMI-1640培养基稀释的最优水平组配方。继续培养72h后，每孔加入新配制的MTT溶液100μL，继续培养4h后面将上清液吸弃，每孔加入DMSO溶剂150μL，用微型振荡器充分混匀后，用酶标仪检测光密度值(OD)，检测波长570nm。用以下公式计算各组药物对肿瘤细胞的抑制率。抑制率＝(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100％。将得到的最优方案组与最优水平组的抑制率进行比较。结果表明槲皮素、山奈酚、盐酸小檗碱分别作用于人乳腺癌MCF-7细胞72h，可以抑制细胞增殖，IC50分别为67.50μmol/L、46.54μmol/L、2.39μmol/L。
3)将得到的最优方案与最优组分配比进行药效对比实验，通过实验实际测得的均匀设计法预测的最优配比组抑制率为88.64％，黄连解毒汤乳腺癌组分中药7水平中抑制率最高组同期对比发现，抑制率为62.09％。通过数据对比发现，均匀设计法得到的最优配比的抑制率明显高于7水平中抑制率最高组的抑制率，并且两次实验结果误差小于3％，结果基本相同，证明均匀设计法得到的配比结果正确。通过组分中药学与均匀设计法相结合对其进行药效学验证，确定3种组分的最佳配比，比例为槲皮素：山奈酚：盐酸小檗碱＝1:0.43:0.41mg/L(1:0.45:0.33μmol/L)。最终得到黄连解毒汤乳腺癌组分中药作用于人乳腺癌MCF-7细胞72h，可以抑制该种细胞增殖，且抑制作用与剂量呈依赖性关系，IC50为24.52μmol/L。
4)黄连解毒汤乳腺癌组分中药对4T1乳腺癌荷瘤小鼠增殖抑制作用的研究。
4.1实验材料、仪器及试剂
4.2实验动物
BALB/C清洁级小鼠，20±2g，雌雄各半，购于辽宁长生生物科技股份有限公司，合格证号：SCXK(辽)2020-0001。
4.3肿瘤细胞株
小鼠乳腺癌4T1(4T1-LUC)细胞购于上海美轩生物科技有限公司。
4.4实验仪器
4.5实验试剂
4.6实验方法
4.6.1细胞培养及传代
小鼠乳腺癌4T1细胞为稳态表达荧光素酶的贴壁细胞，细胞培养使用RPMI-1640培养基，于37℃、CO2 5％的二氧化碳培养箱中培养，观察细胞生长情况，当密度达到80％～90％时，将培养液倒掉，用PBS冲洗2次，加入胰酶消化，将细胞吹打下来，形成悬液，转移适量悬液至新瓶中继续培养。
4.6.2 4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型的建立
选取对数生长期的4T1细胞，当密度达到80％～90％时，将培养液倒掉，用PBS冲洗2次，加入胰酶消化，将细胞吹打下来，形成悬液，细胞计数，调整细胞浓度为1×107cells/mL，1500r/min离心5min后弃上清，加入0.2mL生理盐水制成细胞悬液，在小鼠右前肢腋下进行皮下接种，接种量为每只小鼠0.2mL。
4.6.3动物分组及给药
将30只BALB/C小鼠分别接种4T1乳腺癌细胞悬液制备移植瘤模型，于第二天随机分为5组，每组6只，雌雄各半，开始给药：①阴性对照组：蒸馏水；②五氟尿嘧啶组：0.025g/kg·d；③黄连解毒汤乳腺癌组分中药高、中、低剂量组，剂量分别为：18.4mg/mL、9.2mg/mL、4.6mg/mL；其中，高、中、低剂量组中槲皮素：山奈酚：盐酸小檗碱比例关系均为1:0.43:0.41mg/L(1:0.45:0.33μmol/L)。每日灌胃2次，每次0.5mL，连服7天。
4.6.4小动物活体成像技术观察黄连解毒汤乳腺癌组分中药对4T1肿瘤生长的影响
避光将D-荧光素钾盐在无菌的PBS中溶解，制备荧光素工作液(15mg/mL)，0.22μm滤膜过滤。小鼠停药24h后，依次称重，使用5％水合氯醛，剂量为300mg/kg，腹腔注射麻醉小鼠，5min后腹腔注射荧光素工作液，剂量为10μL/g。注射工作液15min后，将小鼠摆放至合适位置，利用小动物活体成像系统进行拍照，使用Living Image 4.7.3软件根据肿瘤组织处的信号强度对肿瘤部位的大小进行比较分析。
4.6.5黄连解毒汤乳腺癌组分中药对4T1乳腺癌荷瘤小鼠瘤重的影响
活体成像拍照结束后，全部断颈处死，剥瘤，称重。按如下公式计算抑瘤率：
抑瘤率＝(阴性对照组的平均瘤重﹣给药组的平均瘤重)/阴性对照组的平均瘤重×100％
4.6.6数据处理
实验数据采用均值±标准差(x-±s)来表示，并采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有极其显著性差异。
4.7实验结果
4.7.1小动物活体成像观察肿瘤生长情况的结果
如表1及图3所示，阴性对照组发光强度明显高于各给药组；五氟尿嘧啶组发光强度较弱且小于黄连解毒汤乳腺癌组分中药组；黄连解毒汤乳腺癌组分中药4.6、9.2、18.4mg/mL组发光强度均小于阴性对照组，且具有显著统计学差异。
表1黄连解毒汤乳腺癌组分中药对肿瘤生长情况的影响
与阴性对照组比较*p<0.05,**p<0.01
4.7.2黄连解毒汤乳腺癌组分中药对4T1乳腺癌荷瘤小鼠瘤重的影响结果
如图4所示，黄连解毒汤乳腺癌组分中药4.6mg/mL组、9.2mg/mL组、18.4mg/mL组实体瘤重明显低于阴性对照组，五氟尿嘧啶组实体瘤重较轻且低于黄连解毒汤乳腺癌组分中药组。
如表2所示，阴性对照组瘤重为0.5801±0.0173g；五氟尿嘧啶组瘤重为0.1832±0.0355g；黄连解毒汤乳腺癌组分中药4.6mg/mL组、9.2mg/mL组、18.4mg/mL组瘤重分别为0.5276±0.0213g、0.4005±0.0130g、0.3032±0.236g，对肿瘤的抑制率分别为9.05％、30.97％、47.73％。根据上述实验结果可知，黄连解毒汤乳腺癌组分中药18.4mg/mL组对肿瘤的抑制率高于40％，说明其对4T1乳腺癌小鼠瘤重具有一定的抑制作用。
表2黄连解毒汤乳腺癌组分中药对4T1乳腺癌荷瘤小鼠瘤重的影响(n＝6)
注：与阴性对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01。
Claims (2)
1.一种来源于黄连解毒汤的治疗乳腺癌的中药单体组合物在制备治疗ER阳性乳腺癌药物中的应用；所述的中药单体组合物是由槲皮素、山奈酚、小檗碱按照浓度比为1: 0.43:0.41的比例组成；所述的浓度单位为mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种治疗乳腺癌的中药制剂，其特征在于所述治疗ER阳性乳腺癌药物的剂型包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、汤剂、酒剂、冲剂、口服液剂、缓释制剂和控释制剂中的任意一种。
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| 黄酮醇及其改良剂型抗乳腺癌研究进展;黄曦文等;《生命科学》;第32卷(第5期);第495页左栏第4-5行，1.2项下第5-8、15-16行 * |
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