CN116804197A - 一种结合il3ra蛋白的核酸适配体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结合IL3RA蛋白的核酸适配体及其应用,所述核酸适配体具有与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2至少30%同源性且结合IL3RA蛋白的核苷酸序列。本发明筛选获得一种分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力和高特异性结合IL3RA蛋白的核酸适配体,截短至40个核苷酸长度后,依然能保持与IL3RA蛋白的高亲和力和高特异性结合力;所述核酸适配体能够用于制备检测、诊断、成像以及治疗等方面试剂或药物,如可用于纯化或高灵敏度检测IL3RA蛋白;可用于制备靶向IL3RA蛋白的药物;可用于制备诊断和治疗IL3RA表达异常的试剂或药物等等,应用前景广阔。
Description
(一)技术领域
本发明属于生物技术领域,具体而言,涉及一种结合IL3RA蛋白的核酸适配体及其应用。
(二)背景技术
白细胞介素3受体α(IL-3Rα),也称为IL3RA,CD123,由378个氨基酸组成,含一个胞外区、一个跨膜区和一个短的胞内区,它的N端和C端分别在与白细胞介素3(IL-3)结合和信号转导过程中发挥重要作用。许多研究证实,IL-3Rα的胞外区是受体功能必需的,可以刺激不同的信号通路,提示了α亚基的胞外区在信号转导通路中起关键作用。同时它也是造血素受体超家族的70kD糖蛋白成员,该受体由相对分子质量为7×104的配体特异性α亚基和由白细胞介素3(IL-3)、集中性刺激因子2(CSF2/GM-CSF)和白细胞介素5(IL-5)受体共享的相对分子质量为(12-14)×104的信号转导β亚基组成。该蛋白与IL-3的结合取决于β亚基,β亚基被配体结合激活,是IL3生物活性所必需的。该基因和编码集落刺激因子2受体α链(CSF2RA)的基因在X或y染色体上的X-y伪常染色体区域形成细胞因子受体基因簇。另外,已发现编码不同异构体的剪接转录变异。
白细胞介素3(IL-3)是一种造血生长因子(HGF),可作用于早期造血干/祖细胞,促进髓系、红系、巨核系等造血祖细胞的分化发育。并且可以通过与靶细胞膜上的特异性高亲和力受体(IL-3R)结合发挥其生物学功能,可诱导增殖、抗凋亡、分化信号。IL-3与其受体结合,诱导Janus激酶(JAK)家族JAK2酪氨酸激酶活化,活化的JAK2又可激活信号转导和转录因子激活物(STATs),使之转入细胞核,影响某些基因的转录和特定蛋白的翻译,调控细胞的增殖和分化。另外,JAK2受体复合物还可通过Ras2丝裂活化蛋白激酶(MAPK)途径,促进某些基因的转录,使细胞保持存活状态,抑制其凋亡。
白血病是造血系统恶性肿瘤,其特征是造血细胞分化成熟受阻,未分化细胞大量增殖。急性白血病细胞在HGF刺激下,能增殖存活,但极少分化成熟。有研究显示,许多白血病患者的恶性细胞有永久的自主增殖能力。有证据表明,白血病原始细胞的自主增殖可能与自分泌HGF或由HGFR引发的信号转导有关,并且IL-3Rα基因的异常表达能使造血细胞获得增殖优势,进而导致白血病的发生。也有研究结果显示,将纯化的CD34(+)/IL-3Rα(+)白血病细胞移植给有免疫缺陷的NOD/SCID小鼠,IL-3Rα阳性细胞可在小鼠体内建立和保持白血病细胞群。
有研究表明,在超过80%的急性髓细胞白血病(AML)中,重组IL-3能诱导白血病克隆、DNA合成。国外的研究资料表明,IL3RA在急性白血病中表达有所增高。国内也有研究通过对54例急性淋巴细胞白血病患者白血病细胞IL3RA mRNA表达的检测,探讨了它与临床特征的相关性及其在预后判断中的意义,以上多项研究结果表明,这条通路中IL3RA在各种血液系统恶性肿瘤中广泛表达,比如急性髓细胞性白血病(AML)、B细胞急性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤和原生质浆样树突状肿瘤(BPDCN)。与此同时,IL3RA在正常细胞中低表达,这使IL3RA成为非常有吸引力的靶点蛋白。因此,IL3RA是各种血液系统恶性肿瘤药物开发的重要靶标,实现IL3RA的定性和定量检测、纯化,从而开发用于诊断和治疗IL3RA表达异常的试剂或药物有着非常重要的意义。
核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子,它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合,因此在生化分析,环境监测,基础医学,新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小,稳定性更好,易改造修饰,无免疫原性,制作周期短,可以通过人工合成等优势,免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。因此如果能找到与IL3RA蛋白具有更高的亲和力,并且具有高特异性的核酸适配体,将有助于实现IL3RA蛋白的高灵敏度和高特异性检测,有助于靶向IL3RA蛋白的药物开发。
因此,急需找到一种针对IL3RA蛋白的结合亲和力高,特异性好,精确截短后依然保持高结合亲和力,易于修饰和人工合成,稳定性好,使用便利的核酸适配体。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种结合IL3RA蛋白的核酸适配体及其应用,通过改进筛选条件,筛选获得一种分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力结合IL3RA蛋白的核酸适配体,并且经截短至40个核苷酸长度后,依然能保持与IL3RA蛋白的高亲和力和高特异性结合,可用于检测、诊断、成像以及治疗等方面,应用前景广阔。
本发明采用的技术方案是:
第一方面,本发明提供了一种结合IL3RA蛋白的核酸适配体,所述核酸适配体具有与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2至少30%同源性且结合IL3RA蛋白的核苷酸序列。
优选的,所述核酸适配体具有由如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列转录的RNA序列。
优选的,所述核酸适配体具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明基于SELEX技术,设计并合成了一个随机单链DNA文库和相应的引物,用来筛选具有分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力结合IL3RA蛋白的核酸适配体,由此筛选得到两条高亲和力结合IL3RA蛋白的核酸适配体,分别为KS-09(SEQ IDNO.1)、KS-09-S1(SEQ ID NO.2),该核酸适配体与IL3RA蛋白具有较高的亲和力,并且具有较高的特异性。
其中,具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的核酸适配体(KS-09-S1)具有40个核苷酸碱基,是由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的核酸适配体(KS-09)中截取而获得,采用该截取的分子量更小的核酸适配体,依然能与IL3RA蛋白具有非常高的亲和力,亲和力并未下降,且具有非常高的特异性,性能稳定,易于修饰和人工合成,易于保存和标记,具有更高的临床应用价值。
由于核苷酸序列的特殊性,可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰,例如,磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化等,条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质,例如,可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合IL3RA蛋白的亲和力,或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。可以理解的是,与本发明提供的核酸适配体具有至少30%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同源性且结合IL3RA蛋白的核苷酸序列,例如可将上述核酸适配体的任一个所示的核苷酸序列删除部分序列或增加部分序列,依然具有与IL3RA蛋白的高亲和力,依然在本发明的保护范围内。
换言之,以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体,都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能,都可应用于与IL3RA蛋白的结合。
第二方面,本发明提供了一种所述核酸适配体的缀合物或衍生物,所述核酸适配体的缀合物包括荧光标记物;所述核酸适配体的衍生物包括由核酸适配体或核酸适配体的缀合物的核苷酸序列骨架改造成的结合IL3RA蛋白的硫代磷酸酯骨架或肽核酸。
本发明所述的核酸适配体的缀合物,是指在核酸适配体上连接其他基团,比如可以连接具有标志作用的荧光标记物,例如FAM、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶标记等,使修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质,例如,可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合IL3RA蛋白的亲和力,或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
本发明所述核酸适配体衍生物,是由上述核酸适配体的核苷酸序列的骨架改造成结合IL3RA蛋白的硫代磷酸酯骨架而得,或者是前述任一项技术方案中所述核酸适配体或核酸适配体的缀合物改造成的结合IL3RA蛋白的肽核酸。条件是所述衍生物都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能,且都与IL3RA蛋白结合。
本发明所使用的术语“硫代磷酸酯骨架”具有本领域普通技术人员一般理解的含义,其是指RNA和DNA核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键氧原子可以被一个或两个硫原子取代,分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。已知这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其靶标的结合亲和力,以及对核酸酶降解的增强的抗性。
本发明所使用的术语“肽核酸”具有本领域普通技术人员一般理解的含义,其是指一种人工合成DNA分子类似物,于1991年由Nielsen等首次报道。用N-2-(氨乙基)-甘氨酸(N-(2-aminoethyl)-glycine)单位代替糖-磷酸酯骨架作为重复结构单元,合成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物,称为肽核酸。由于肽核酸(PNA)没有如DNA或RNA上的磷酸基团,因此PNA与DNA之间缺乏电性相斥的现象,使两者之间的结合强度大于DNA与DNA之间的结合强度。
第三方面,本发明提供了一种所述核酸适配体在制备IL3RA蛋白纯化或成像试剂中的应用。
第四方面,本发明提供了一种所述核酸适配体在制备检测IL3RA蛋白的试剂盒中的应用,所述试剂盒包括所述的核酸适配体或所述的核酸适配体的缀合物或衍生物。
第五方面,本发明提供了所述的核酸适配体在制备靶向IL3RA蛋白的药物中的应用。
第六方面,本发明提供了所述核酸适配体在制备IL3RA蛋白抑制剂中的应用。
第七方面,本发明提供了所述核酸适配体在制备治疗IL3RA表达异常的试剂或药物中的应用。
本发明提供了一种结合IL3RA蛋白的核酸适配体的筛选方法,所述方法包括以下步骤:
(1)合成随机单链DNA文库和引物;
(2)磁珠法筛选:进行至少6轮的反筛与筛选,并在第6轮添加血清。
进一步地,步骤(2)所述的在第6轮添加血清,具体过程为:第6轮添加10%血清,所述血清为人血清(正常人血清,购买自北京索莱宝科技有限公司,货号:SL010)。
本发明提供的筛选结合IL3RA蛋白的核酸适配体的方法是在SELEX筛选方法的基础上,在磁珠法筛选的步骤中,从第6轮添加血清进行封闭进一步提高核酸适配体的特异性与稳定性。核酸适配体筛选常规条件是在离子缓冲液中进行,而在筛选条件下逐步添加一定浓度的血清,一方面因为血清中含有丰富的蛋白,可以与磁珠表面的蛋白竞争性的与文库结合,从而去除那些与靶标IL3RA蛋白结合能力很弱或者只是吸附上的序列。另一方面,适配体在血清环境中结合靶标,可以更好的满足后期基于核酸适配体开发的应用的实际检测环境。研究证明,在筛选的最后一轮中,采用高浓度的血清,能够筛选获得亲和力更高,特异性更好的核酸适配体。
与现有技术相比,本发明提供的结合IL3RA蛋白的核酸适配体的有益效果主要体现在:
1、通过改进筛选条件,筛选获得一种分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力和高特异性结合IL3RA蛋白的核酸适配体;
2、核酸适配体经截短至40个核苷酸长度后,依然能保持与IL3RA蛋白的高亲和力和高特异性结合力;
3、所述核酸适配体结构相对稳定、简单、易于修饰以及短期内可以人工合成、化学性质稳定、易于保存和标记;
4、所述核酸适配体能够用于制备检测、诊断、成像以及治疗等方面试剂或药物,如可用于纯化或高灵敏度检测IL3RA蛋白;可用于制备靶向IL3RA蛋白的药物;可用于制备诊断和治疗IL3RA表达异常的试剂或药物等等,应用前景广阔。
(四)附图说明
图1为实施例1中利用流式细胞仪检测第1、3、6轮筛选得到的富集文库与对照His小肽、靶标蛋白的结合能力情况示意图;FL1-A代表FITC荧光通道,发射波长为525nm;P1,P3,P6分别表示第1轮、第3轮和第6轮筛选得到的文库,NC代表阴性对照。
图2为实施例2中核酸适配体KS-09与IL3RA蛋白的亲和力检测结果示意图。
图3为实施例4中核酸适配体KS-09-S1与IL3RA蛋白的亲和力检测结果示意图。
图4为实施例5中核酸适配体KS-09的特异性研究结果示意图。
图5为实施例5中核酸适配体KS-09-S1的特异性研究结果示意图。
图6为实施例6中基于核酸适配体KS-09的斑点杂交实验检测不同蛋白的结果示意图。
7为实施例6中基于生物素修饰的核酸适配体KS-09的斑点杂交实验检测不同浓度的IL3RA蛋白的结果示意图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
本实施例中未特别指出的试剂均为已知产品,通过购买市售产品获得。
实施例1:结合IL3RA蛋白的ssDNA核酸适配体的筛选
本实施例筛选结合IL3RA蛋白的ssDNA核酸适配体的方法包括以下步骤:
1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物:
基于SELEX技术,设计并合成了一个随机单链DNA文库(Lib18):
5’-TCCAGCACTCCACGCATAAC-36N-GTTATGCGTGCTACCGTGAA-3’;
其中,“36N”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
引物信息如表1,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1、引物及其序列
引物名称 | 序列(5'-3') |
Lib18S1 | TCCAGCACTCCACGCATAAC |
Lib18-FAM-S1 | FAM-TCCAGCACTCCACGCATAAC |
Lib18-Biotin-A2 | Biotin-TTCACGGTAGCACGCATAAC |
Lib18A2 | TTCACGGTAGCACGCATAAC |
其中,引物名称中的S代表正向引物,A代表反向引物。
引物分别用ddH2O配制成100μM的贮存液,于-20℃保存备用。
2、磁珠法筛选
采用磁珠法筛选,共计筛选6轮,每一轮的筛选流程见表2。
表2、IL3RA蛋白核酸适配体筛选流程
轮数 | 反筛 | 缓冲溶液 |
第一轮 | 偶联His磁珠 | DPBS缓冲液 |
第二轮 | 偶联His磁珠 | DPBS缓冲液 |
第三轮 | 偶联His磁珠 | DPBS缓冲液 |
第四轮 | 偶联His磁珠 | DPBS缓冲液 |
第五轮 | 偶联His磁珠 | DPBS缓冲液 |
第六轮 | 偶联His磁珠 | DPBS缓冲液含10%血清 |
DPBS缓冲液:氯化钾0.2g/L,磷酸二氢钾0.2g/L,氯化钠8g/L,十二水合磷酸氢二钠2.8975g/L,溶剂为水,pH7.4,25℃保存。
具体筛选过程如下:
1)偶联IL3RA蛋白的羧基磁珠(正筛磁珠)
取50μL羧基磁珠(江苏泽成生物技术有限公司,货号:FM2221)加入试管中,用200μL超纯水清洗4遍,磁铁垂钓磁珠,去上清。取配置好的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺;0.1M水溶液)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐;0.4M水溶液)各100μL,等体积混合,加入到磁珠中,25℃孵育20分钟活化磁珠表面的羧基,磁珠用ddH2O清洗1遍后,即为活化后磁珠,备用。
取10μL的IL3RA蛋白(购自景杰生物,PTM-P0131,浓度为1mg/mL),加入pH5.0的10mM醋酸钠水溶液90μL混匀,加入到上述的活化后磁珠中。25℃置于垂直混合仪上孵育60分钟,IL3RA蛋白通过蛋白表面的氨基偶联到磁珠表面。
偶联结束,将试管置于磁力架上,吸弃上清,取100μL1M乙醇胺水溶液pH8.5加入到磁珠中,25℃垂直混合仪上孵育10分钟,封闭磁珠表面未反应的活化位点。再将试管置于磁力架上,吸弃封闭液。磁珠用200μLDPBS清洗4遍后重悬,即为偶联IL3RA蛋白的磁珠,标记为MB-IL3RA,4℃保存。
2)偶联His小肽的羧基磁珠(反筛磁珠)
同步骤1)方法,将IL3RA蛋白替换为20μL浓度为1mg/mL的His小肽,缓冲液改为80μL pH4.5的10mM醋酸钠水溶液,其他操作相同,偶联His小肽的磁珠,标记为MB-His。His小肽为9个连续的组氨酸,由金斯瑞生物科技有限公司合成。
3)文库溶解与变复性处理
取Lib18随机单链核苷酸文库(1OD),14000rpm离心5分钟,将文库离心到管底,用DPBS缓冲液溶解至10μM,混匀后分装到PCR管进行变复性处理。处理过程如下:PCR仪设定程序95℃保持10分钟,此步骤目的是使折叠的链解开,4℃保持5分钟,然后平衡至室温,获得变复性处理后的文库。
4)反筛
将200μL变复性处理后的文库加入到50μL的MB-His磁珠中,混匀后在垂直混合仪上室温孵育40min。置于磁力架上,收集上清,标记为文库pool-,上清作为单链核酸文库。剩余的磁珠用200μL DPBS缓冲液清洗磁珠4次。最后在清洗后的磁珠中加入100μL超纯水,沸水浴10分钟,收集上清(即为反筛上清),标记为elution-His。
5)正筛
将步骤4)200μL反筛后的文库pool-加入到50μL MB-IL3RA磁珠中,在垂直混合仪上25℃孵育40分钟。置于磁力架上,吸弃上清,保留磁珠,用200μL DPBS清洗磁珠4次。最后在清洗后的磁珠中加入200μL的ddH2O,沸水浴10分钟,收集上清,标记为elution-IL3RA。
6)次级文库的制备
以elution-IL3RA中的核酸分子为模板,用普通PCR进行扩增。方法如下:将步骤5)全部模板elution-IL3RA加入2mL PCR mix中混匀,将模板与PCR mix混合物分成100μL/管加入到PCR管中,扩增条件如下:95℃预变性3分钟,95℃变性30秒,60℃退火30秒,72℃延伸30秒,共25个循环,4℃保存。PCR mix混合物由诺唯赞购买的dNTPs(P031-02)与宝生物购买的rtaq酶(R500Z)配制。
扩增产物使用购买的商品化天地人和SA磁珠(SM017100)进行纯化制备用于下一轮筛选的次级文库。将2mL的PCR产物中加入1/5体积的4M氯化钠水溶液,再加入160μL经过DPBS清洗且去掉上清的SA磁珠,室温摇床孵育30min后,磁吸弃上清。再使用500μL DPBS(含5mM Mg2+、0.02%Tween20)清洗磁珠三遍,去上清后加入100μL的40mM的氢氧化钠水溶液,孵育三分钟后磁吸去掉磁珠。然后在上清中加入4μL的1M的盐酸水溶液中和单链,随后再加入104μL的2*DPBS进行盐浓度稀释中和,最后得到208μL的溶解于1*DPBS中的第1轮次级文库,可作为下一轮筛选的单链文库。
磁珠法重复筛选6轮,每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库,按照步骤3)、4)、5)和6)操作。
7)文库亲和力检测
筛选过程中用流式细胞分析仪CytoFLEX检测DNA单链文库对IL3RA蛋白识别能力的变化:
选取第1轮、第3轮、第6轮筛选得到的单链文库进行变复性处理:分别取400nM单链文库40μL,加入Mg2+(终浓度为5mM)、BSA(终浓度为0.5mg/mL)混匀,分别加入2μL MB-IL3RA,在垂直混合仪上25℃避光孵育1h。置于磁力架上,吸弃上清,保留磁珠,用500μLDPBS(含5mMMg2+、0.02%Tween20)缓冲液清洗4遍后用其重悬,标记为3RA-P1,3RA-P3,3RA-P6。
同样条件下,将MB-IL3RA替换为MB-His作为对照,产物标记为3RA-HIS P1,3RA-HIS P3,3RA-HIS P6。
准备2μL羧基磁珠,磁吸弃上清,加入600μLDPBS缓冲液重悬作为空白对照,标记为NC。
当DNA单链文库对IL3RA蛋白的识别能力满足要求,即筛选后的DNA单链文库与靶标蛋白的结合能力高于筛选起始投入的文库(图1),图1中3RA-P1,3RA-P3,3RA-P6分别表示第1轮、第3轮和第6轮筛选得到的文库,可以看出第6轮得到的文库比第3轮与靶标的亲和力高,且3RA-P6比3RA-P1高很多,满足测序要求,将所得文库经高通量测序分析。同时,3RA-HIS P1,3RA-HIS P3,3RA-HIS P6,可以看出,无明显位移,说明文库对反筛靶标并无亲和力。
3、分析和鉴定筛选后得到的核酸适配体:将得到的富集文库产物经高通量测序分析后,挑选若干条序列由金唯智生物(江苏)科技有限公司合成,检测亲和力。
确定了1条序列具有很强的结合能力的核酸适配体,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,命名为KS-09。
SEQ ID NO.1(KS-09)
TCCAGCACTCCACGCATAACTGGCTTGGTTGGTCTGGTACTGGTTGGATGGGTGGGGTTATGCGTGCTACCGTGAA。
实施例2:表面等离子共振(SPR)检测IL3RA蛋白核酸适配体KS-09与IL3RA蛋白的亲和力
委托苏州金唯智生物科技有限责任公司合成核酸适配体KS-09(SEQ ID NO.1),将其用DPBS缓冲液分别稀释成15.63nM,31.25nM,62.5nM,125nM,250nM,500nM备用。
1、将IL3RA蛋白偶联到表面等离子共振相互作用分析仪(GE Healthcare,型号:Biacore 8K)的CM5芯片表面的第2通道,具体方法如下:将等体积的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐;0.4M水溶液)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺;0.1M水溶液)两个试剂混合后进样50μL活化芯片,流速5μL/分钟。将IL3RA蛋白用pH4.5的10mM醋酸钠缓冲液稀释至终浓度为50μg/mL后进样,进样体积50μL,流速5μL/分钟,IL3RA蛋白偶联量为12723Ru。进样完成后,进乙醇胺封闭芯片,流速5μL/分钟,进样50μL。
同第2通道的操作,将IL3RA蛋白替换为His蛋白(同实施例1),其他操作相同,在第1通道偶联His蛋白,作为对照通道。
2、检测:设定表面等离子共振相互作用分析仪(GE Healthcare,型号:Biacore8K)检测参数,稀释好的适配体样品流过1、2通道,每一个适配体的程序如下:进样20μL/分钟,时间2分钟,解离20μL/分钟,时间2分钟,再生1.5M NaCl水溶液30μL/分钟,时间30秒。
核酸适配体KS-09与IL3RA蛋白的亲和力检测数据见图2,KD值如下表3所示。
表3、核酸适配体与IL3RA蛋白的亲和力
核酸适配体 | 长度 | 与IL3RA蛋白的亲和力KD(nM) |
SEQ ID NO.1(KS-09): | 76 | 12.6 |
实施例3:表面等离子共振(SPR)检测核酸适配体KS-09-S1(SEQ ID NO.2)与IL3RA蛋白的亲和力
由于原始筛选获得的具有最强结合能力的核酸适配体KS-09较长,不利于后期的应用开发,因此我们将其进行了截短:将KS-09进行截短40个核苷酸后获得KS-09-S1(核苷酸序列如SEQ ID NO.2),由此获得1条基于原长的序列截短后的核心区的截短序列,委托苏州金唯智生物科技有限责任公司合成,用DPBS缓冲液分别稀释成15.63nM,31.25nM,62.5nM,125nM,250nM,500nM,备用。
SEQ ID NO.2(KS-09-S1)
CTGGCTTGGTTGGTCTGGTACTGGTTGGATGGGTGGGGTT。
采用实施例2中将IL3RA蛋白固定到SPR的CM5芯片进行测试的方法,将IL3RA蛋白偶联到CM5芯片表面的2通道,偶联量为10470RU;将His小肽(南京金斯瑞生物科技有限公司)偶联到第1通道,偶联量为463.1RU。使用表面等离子共振相互作用分析仪(GEHealthcare,型号:Biacore 8K)设定检测参数,同样按实施例2步骤1中将稀释好的KS-09-S1(SEQ ID NO.2)适配体样品进样,依次流过1、2通道,每一个适配体的程序如下:进样20μL/分钟,时间2分钟,解离20μL/分钟,时间2分钟,再生1.5M NaCl水溶液30μL/分钟,时间30秒。
核酸适配体KS-09-S1与IL3RA蛋白结合的亲和力检测数据见图3,KD值如表4所示,这些数据说明核酸适配体KS-09-S1用SPR仪检测到与IL3RA蛋白有很强的结合,而与对照蛋白His没有结合。
表4、核酸适配体与IL3RA蛋白的亲和力
核酸适配体 | 长度 | 与IL3RA蛋白的亲和力KD(nM) |
SEQ ID NO.2(KS-09-S1): | 40 | 11 |
由表3、4可见,KS-09和KS-09-S1都与IL3RA具有非常好的亲和力,且截短到40个核苷酸碱基的核酸适配体KS-09-S1与IL3RA的亲和力达到了11nM,与截短前对比核酸适配体的亲和力明显提升(KD值越小,亲和力越大)。核酸适配体KS-09-S1的特异性较好,并大大降低了合成难度,说明KS-09这一条核酸适配体的关键结构域的核心区就在KS-09-S1中,且经过截短核酸适配体的亲和力有所提高。
实施例4:核酸适配体KS-09、KS-09-S1的特异性研究
本实施例分别采用IL-1β蛋白(购自景杰生物,货号:ABT-9029)、IL-15蛋白(购自景杰生物,货号:ABT-9076)、IFNγ蛋白(购自景杰生物,货号:ABT-9109)、IgG蛋白(购自景杰生物,货号:ABT-9112)代替IL3RA蛋白,与实施例2中将IL3RA蛋白固定到SPR的CM5芯片进行测试的方法相同,分别将IL-1β蛋白、IL-15蛋白、IFNγ蛋白、IgG蛋白偶联到CM5芯片表面四个Channal的第2通道,偶联量分别为2079RU、2051RU、3723RU、8075RU。将稀释好的KS-09和KS-09-S1核酸适配体依次进样。
核酸适配体KS-09与IL-1β蛋白、IL-15蛋白、IFNγ蛋白、IgG蛋白的亲和力检测数据见图4,核酸适配体KS-09-S1与IL-1β蛋白、IL-15蛋白、IFNγ蛋白、IgG蛋白的亲和力检测数据见图5。由图4和图5可以看出,核酸适配体KS-09和KS-09-S1都无法与IL-1β蛋白、IL-15蛋白、IFNγ蛋白、IgG蛋白结合,可见其具有非常好的特异性。
实施例5:基于核酸适配体KS-09的斑点杂交实验检测IL3RA蛋白
委托金唯智生物(江苏)科技有限公司合成的生物素修饰的核酸适配体KS-09、KS-09-S1。对生物素修饰的核酸适配体KS-09、KS-09-S1进行的斑点杂交实验,步骤如下:
1、核酸适配体KS-09、KS-09-S1斑点杂交实验检测IL3RA蛋白的特异性
(1)将IL3RA蛋白(同实施例1)用DPBS稀释成0.5mg/mL,作为待测样;将对照蛋白BSA(购自生工生物工程(上海),货号A600332)、His小肽(同实施例1)和ZSCAN5B蛋白(购自苏州有诺真生物科技有限公司,货号:P02742PA)分别用DPBS稀释成0.5mg/mL,作为对照样。
取1块8cm×2cm的硝酸纤维素膜(购自Millipore),将待测样和对照样分别点样2μL到硝酸纤维素膜上,自然风干30分钟。
(2)待干燥后,将硝酸纤维素膜放到50mL的离心管中,加入6mL含体积浓度10%BSA的DPBS缓冲液将其浸润,在室温封闭1小时,封闭结束后用DPBS缓冲液(含5mM Mg2+、0.02%Tween20)清洗3次,每次5min,吸净。
(3)将硝酸纤维素膜转到新的50mL的离心管中,加入6mL DPBS缓冲液(含5mM Mg2+)溶解的1μM生物素修饰的KS-09核酸适配体,将其浸润,置于摇床上室温孵育30分钟。孵育结束后用DPBS缓冲液(含5mM Mg2+、0.02%Tween20)洗三次,清洗时放置在摇床上,每次5分钟。
(4)再将硝酸纤维素膜转到新的50mL离心管中,加入6mL用DPBS(含5mM Mg2+、0.02%Tween20)按照1:2000稀释的HRP-标记的链霉抗生物素蛋白(购自碧云天,货号A0303),室温摇床孵育30分钟。孵育结束后,用DPBS(含5mM Mg2+、0.02%Tween20)洗3次,清洗时放置在摇床上,每次2分钟。
(5)硝酸纤维素膜转到干净的PE手套上,取ECL显色试剂盒(购自碧云天,货号P0018A),将100μL的A液和100μL的B液混合好,浸润硝酸纤维素膜表面,,在室温避光显色5分钟。
(6)成像系统观察拍照:使用仪器为GE医疗生命科学部的ImageQuantTM LAS 4000数字成像系统。
结果如图6所示,其中1为IL3RA蛋白,2为BSA蛋白,3为HIS小肽,4为A6NJ蛋白;与对照蛋白BSA、HIS小肽、A6NJ的斑点相比,IL3RA蛋白显色明显,这说明生物素修饰的KS-09可以用于膜杂交IL3RA蛋白的检测,并且不结合对照蛋白BSA蛋白、HIS小肽、以及A6NJ蛋白。
从图6还可以看出,本发明提供的KS-09只能结合IL3RA蛋白,并不能与其他蛋白如BSA、HIS小肽、A6NJ蛋白结合,具有很高的特异性。
2、核酸适配体KS-09斑点杂交实验检测不同浓度IL3RA蛋白
将IL3RA蛋白用DPBS分别稀释成1.000mg/mL,0.500mg/mL,0.250mg/mL,0.125mg/mL,0.063mg/mL,同步骤1方法及操作进行斑点杂交实验。
结果如图7所示,IL3RA蛋白显色明显,这说明生物素修饰的KS-09可以用于膜杂交IL3RA蛋白的检测。
同时还可以证明,KS-09还能用于准确检测63μg/mL的IL3RA蛋白。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种结合IL3RA蛋白的核酸适配体,其特征在于,所述核酸适配体具有与SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2至少30%同源性且结合IL3RA蛋白的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的结合IL3RA蛋白的核酸适配体,其特征在于,所述核酸适配体具有由如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列转录的RNA序列。
3.如权利要求1所述的结合IL3RA蛋白的核酸适配体,其特征在于,所述核酸适配体具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.一种权利要求1所述核酸适配体的缀合物或衍生物。
5.如权利要求4所述的缀合物或衍生物,其特征在于,所述核酸适配体的缀合物包括荧光标记物;所述核酸适配体的衍生物包括由核酸适配体或核酸适配体的缀合物的核苷酸序列骨架改造成的结合IL3RA蛋白的硫代磷酸酯骨架或肽核酸。
6.一种权利要求1所述核酸适配体在制备IL3RA蛋白纯化或成像试剂中的应用。
7.一种权利要求1所述核酸适配体在制备检测IL3RA蛋白的试剂盒中的应用,其特征在于,所述试剂盒包括所述的核酸适配体或所述的核酸适配体的缀合物或衍生物。
8.一种权利要求1所述的核酸适配体在制备靶向IL3RA蛋白的药物中的应用。
9.一种权利要求1所述核酸适配体在制备IL3RA蛋白抑制剂中的应用。
10.一种权利要求1所述核酸适配体在制备治疗IL3RA表达异常的试剂或药物中的应用。
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