CN116790576A - 一种消解微生物组文库中rRNA的方法 - Google Patents

一种消解微生物组文库中rRNA的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域,具体公开了一种消解微生物组文库中rRNA的方法,包括以下步骤:sgRNA设计:汇总58种细菌rRNA序列形成细菌rRNA基因组,将多个含有微生物群的复杂样本的转录组测序序列映射到上述细菌rRNA基因组,挑选覆盖更多序列的特征序列,经过重重筛选最后得到300条特征序列;sgRNA制备:将由生物公司合成的sgDNA通过PCR扩增加上tracrDNA序列,之后通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物条带大小在130bp,得到的产物经磁珠纯化并转录得到sgRNA,将得到的sgRNA测定浓度并稀释后待用;本发明参考常见的58种细菌基因组序列,筛选设计出300条sgRNA,该300条sgRNA可靶向常见的几乎所有细菌的rRNA,适用于含有多种细菌的复杂转录组文库中rRNA的消解,增加微生物组各种水平RNA测序的覆盖度。

Description

一种消解微生物组文库中rRNA的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,具体为一种消解微生物组文库中rRNA的方法。
背景技术
微生物组(microbiome)是特定时间特定生境中微生物群所包含的基因序列(含同源序列)的总和,而微生物群(microbiota)是特定时间特定生境所有微生物有机体的总称,其组成包括非细胞结构的病毒(包括噬菌体)、原核生物中的真细菌和古细菌,以及真核细胞微生物。目前,包括转录组分析和核糖体图谱分析在内的原核生物高通量RNA测序方法都需要深度测序以获得足够数量的有效读取,从而进一步找到低表达的遗传元件。而在测序细菌总RNA时,80%-90%的读取片段都映射到rRNA,映射到mRNA的高质量读取片段受总RNA中大量rRNA的影响(Rosenow C et al.,2001)。因此,rRNA的消解可以增加测序覆盖的mRNA范围,从而降低测序成本。
在目前已经实现的技术中,主要包含三种方法来实现rRNA消解。第一种是基于寡核苷酸与rRNA的杂交以及随后用磁珠捕获和分离(Stewart FJ etal.,2010;Kim IV etal.,2019)。第二种是基于寡核苷酸退火之后的互补和特定核酸酶对双链杂交体的消解(Yiet al.,2011;Adiconis X et al.,2013;Lyden A et al.,2019)。第三种方法是将cDNA合成限制于非rRNA模板,在cDNA合成中使用非随机且与rRNA不互补的引物(Armour CD etal.,2009)。其中第一种方法的优势在于消解的无偏差性且消解效果较好,但处理单个样本的成本较高,远高于其他两种方法,不利于推广。而第三种方法又由于引物的局限性,不能保证cDNA文库的完整性。因此,我们在第二种方法中选择了基于CRISPR-Cas9技术的rRNA消解手段进行优化。
利用CRISPR-Cas9技术来消解rRNA的基本原理是通过人工设计的sgRNA(smallguide RNA)来识别经逆转录和扩增后形成的cDNA文库,并引导Cas9蛋白酶进行有效切割rDNA双链,使得rDNA都断裂成小片段,之后经过定量的磁珠纯化去掉rDNA小片段,从而达到消解rRNA的目的。这种方法之前运用在比较单一的物种上,针对不同物种样本需要单独设计一套sgRNA(100条),这也大大提高了成本(Loi DSC et al.,2021)。而且在很多微生物没有参考基因组或者参考基因组质量较差的情况下会导致sgRNA脱靶,从而使得rRNA消解效果较差。对于含有多种微生物的复杂样本,面向单一物种设计的sgRNA明显不能满足需求。我们通过对常见的58种细菌rRNA序列分析并设计筛选了一套可以靶向细菌微生物组的sgRNA,该套sgRNA不仅可以靶向设计时参考的58种细菌的rRNA,且基于细菌rRNA序列一定程度的保守性,该套sgRNA还能靶向其他细菌rRNA。因此,我们设计的这套sgRNA能靶向几乎所有常见的细菌rRNA,弥补了之前的成本弱势,适用性也更广,大大增加了微生物组各种水平RNA测序的覆盖度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种消解微生物组文库中rRNA的方法,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种消解微生物组文库中rRNA的方法,包括以下步骤:
S1、sgRNA设计:
1、选取常见的58种进化距离较远的微生物作为代表微生物,覆盖8个门,48属;
2、特征序列识别:从58种微生物的rRNA序列中提取针对化脓性链球菌CRISPR相关核酸酶9(SpCas9)的特征核酸序列,即长度为20nt的5′特征序列-NGG 3′特征序列,额外要求gc含量在30%-80%之间;
3、筛选出保守性较高的特征序列:通过使用blastn(Version:2.13.0)将上一步提取的特征序列与58种微生物的rRNA序列进行比对,允许1个错配,若可以映射到的物种小于等于2,则为保守性较差,滤去;
4、剔除脱靶序列:再次使用blastn,将上一步保守性较高的特征序列与58种微生物的非rRNA序列进行比对,允许3个错配,若该序列能够比对上,则说明该序列是脱靶的,滤去;
5、剔除与微液滴体系不兼容的特征序列:通过使用blastn,将上一步剔除脱靶序列后的特征序列与微液滴合成序列和barcode进行比对,允许3个错配,若该序列能够比对上,则说明该序列与微液滴体系不兼容,滤去;
6、对特征序列的保守性进行评估:建立58种微生物rRNA序列的参考基因组,使用bwa aln(Version:0.7.17-r1188)将来自多种不同环境的单细胞微生物组NGS测序数据映射到该参考基因,为上一步中的特征序列按照覆盖reads数进行降序排序,产生优先级;
7、循环初始化,令上一步中剩余的特征核酸序列为S,A为空集;
8、若S为空集循环结束,输出A,否则选取S集中优先级最高的特征核酸序列a,令S=S-{a},A=A∪{a};
9、对于序列a上下游50bp内的序列b,执行S=S-{b};
10、重复进行第8步,算法结束后,合成300条特征序列,即300条sgRNA;
S2、sgRNA制备:将由生物公司合成的sgDNA通过PCR扩增加上tracrDNA序列,之后通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物条带大小在130bp,得到的产物经磁珠纯化并转录得到sgRNA,将得到的sgRNA测定浓度并稀释后待用;
S3、cDNA文库制备:将微生物RNA逆转录成cDNA,之后通过PCR扩增形成DNA双链,PCR产物经磁珠纯化后得到干净的cDNA文库,该cDNA文库测定浓度并稀释后待用;
S4、rRNA消解:取Cas9蛋白酶、Cas9蛋白酶缓冲液、sgRNA及无酶水均匀混合,在37℃金属浴中运行15min以形成sgRNA-Cas9复合体,之后加cDNA文库,继续过夜运行16h以保证Cas9蛋白酶充分酶切rDNA,加入RNA内切酶以酶解多余的sgRNA,最后加入蛋白溶解酶使Cas9蛋白失活;
S5、未酶切和酶切之后的cDNA用等体积的磁珠纯化,取少许纯化产物进行qPCR2验证,剩余纯化产物进行PCR扩增,qPCR结果显示酶切和未酶切产物的循环数存在6个左右的差异,且两者的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后也显示出带型差异;
S6、上述4中PCR产物经磁珠纯化后建库测序,测序结果显示未经过酶切样本中rRNA占比明显高于经过酶切的样本中的。
优选的,在所述S3步骤中,在Cas9蛋白酶酶切时设置一个不加Cas9蛋白酶的对照组,本发明涉及一种新颖的技术方案,通过利用58种具有代表性的微生物的基因组,设计CRISPR Cas9系统的guide RNA,以达到筛选出最佳的guide RNA组合的目的。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明提供的sgRNA设计流程及序列,参考了常见的58种细菌基因组序列,从其中rRNA序列中筛选Cas9蛋白酶能够靶向的含有5′-NGG-3′特征的核酸序列,进一步比对去除保守性较差和容易脱靶的特征序列,筛选设计出300条sgRNA,该组合旨在高效覆盖尽可能多的细菌的rRNA,同时兼顾避免对编码基因和微液滴体系中的人工序列造成脱靶效应,从而达到节省成本,扩大适用范围的效果,也大大增加了微生物组各种水平RNA测序的覆盖度。
附图说明
图1为本发明sgRNA筛选流程图;
图2为本发明未进行rRNA消解的含微生物组的样本转录组序列占比情况图;
图3为本发明rRNA消解的含微生物组的样本转录组序列占比情况图;
图4为本发明rRNA消解的含微生物组样本cDNA文库凝胶电泳图,其中,左边泳道为未进行rRNA消解的含微生物组的样本cDNA文库,中间泳道为rRNA消解的含微生物组的样本cDNA文库,右边泳道为marker;
图5为本发明qPCR验证rRNA消解效果图,其中,包括未经过rRNA消解的微生物组样本cDNA扩增曲线,Ct值为8.35,rRNA消解的微生物组样本cDNA扩增曲线,Ct值为14.18;
图6为本发明sgRNA制备的电泳图,其中,左边泳道为sgRNA,右边泳道为marker。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种消解微生物组文库中rRNA的方法,包括以下步骤:
S1、sgRNA设计:
1、选取常见的58种进化距离较远的微生物作为代表微生物,覆盖8个门,48属,如下表1所示;
2、特征序列识别:从58种微生物的rRNA序列中提取针对化脓性链球菌CRISPR相关核酸酶9(SpCas9)的特征核酸序列,即长度为20nt的5′特征序列-NGG 3′特征序列,额外要求gc含量在30%-80%之间;
3、筛选出保守性较高的特征序列:通过使用blastn(Version:2.13.0)将上一步提取的特征序列与58种微生物的rRNA序列进行比对,允许1个错配,若可以映射到的物种小于等于2,则为保守性较差,滤去;
4、剔除脱靶序列:再次使用blastn,将上一步保守性较高的特征序列与58种微生物的非rRNA序列进行比对,允许3个错配,若该序列能够比对上,则说明该序列是脱靶的,滤去;
5、剔除与微液滴体系不兼容的特征序列:通过使用blastn,将上一步剔除脱靶序列后的特征序列与微液滴合成序列和barcode进行比对,允许3个错配,若该序列能够比对上,则说明该序列与微液滴体系不兼容,滤去;
6、对特征序列的保守性进行评估:建立58种微生物rRNA序列的参考基因组,使用bwa aln(Version:0.7.17-r1188)将来自多种不同环境的单细胞微生物组NGS测序数据映射到该参考基因,为上一步中的特征序列按照覆盖reads数进行降序排序,产生优先级;
7、循环初始化,令上一步中剩余的特征核酸序列为S,A为空集;
8、若S为空集循环结束,输出A,否则选取S集中优先级最高的特征核酸序列a,令S=S-{a},A=A∪{a};
9、对于序列a上下游50bp内的序列b,执行S=S-{b};
10、重复进行第8步,算法结束后,合成300条特征序列,即300条sgRNA;
表1
S2、sgRNA制备:将由生物公司合成的sgDNA通过PCR扩增加上tracrDNA序列,之后通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物条带大小在130bp,得到的产物经磁珠纯化并转录得到sgRNA,将得到的sgRNA测定浓度并稀释后待用;
S3、cDNA文库制备:将牙菌斑中微生物RNA逆转录成cDNA,之后通过PCR扩增形成DNA双链,PCR产物经磁珠纯化后得到干净的cDNA文库,该cDNA文库测定浓度并稀释后待用;
S4、rRNA消解:取Cas9蛋白酶、Cas9蛋白酶缓冲液、sgRNA及无酶水均匀混合,在37℃金属浴中运行15min以形成sgRNA-Cas9复合体,之后加cDNA文库,继续过夜运行16h以保证Cas9蛋白酶充分酶切rDNA,加入RNA内切酶以酶解多余的sgRNA,最后加入蛋白溶解酶使Cas9蛋白失活,在Cas9蛋白酶酶切时设置一个不加Cas9蛋白酶的对照组;
S5、未酶切和酶切之后的cDNA用等体积的磁珠纯化,取少许纯化产物进行qPCR验证,剩余纯化产物进行PCR扩增,qPCR结果显示酶切和未酶切产物的循环数存在6个左右的差异,且两者的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后也显示出带型差异;
S6、上述4中PCR产物经磁珠纯化后建库测序,测序结果显示未经过rRNA消解的样本中rRNA占比高达90%,而经过rRNA消解过的样本中rRNA占比不到20%,rRNA消解效率高达98%。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.一种消解微生物组文库中rRNA的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、sgRNA设计:
1、选取常见的58种进化距离较远的微生物作为代表微生物,覆盖8个门,48属;
2、特征序列识别:从58种微生物的rRNA序列中提取针对化脓性链球菌CRISPR相关核酸酶9(SpCas9)的特征核酸序列,即长度为20nt的5′特征序列-NGG 3′特征序列,额外要求gc含量在30%-80%之间;
3、筛选出保守性较高的特征序列:通过使用blastn(Version:2.13.0)将上一步提取的特征序列与58种微生物的rRNA序列进行比对,允许1个错配,若可以映射到的物种小于等于2,则为保守性较差,滤去;
4、剔除脱靶序列:再次使用blastn,将上一步保守性较高的特征序列与58种微生物的非rRNA序列进行比对,允许3个错配,若该序列能够比对上,则说明该序列是脱靶的,滤去;
5、剔除与微液滴体系不兼容的特征序列:通过使用blastn,将上一步剔除脱靶序列后的特征序列与微液滴合成序列和barcode进行比对,允许3个错配,若该序列能够比对上,则说明该序列与微液滴体系不兼容,滤去;
6、对特征序列的保守性进行评估:建立58种微生物rRNA序列的参考基因组,使用bwaaln(Version:0.7.17-r1188)将来自多种不同环境的单细胞微生物组NGS测序数据映射到该参考基因,为上一步中的特征序列按照覆盖reads数进行降序排序,产生优先级;
7、循环初始化,令上一步中剩余的特征核酸序列为S,A为空集;
8、若S为空集循环结束,输出A,否则选取S集中优先级最高的特征核酸序列a,令S=S-{a},A=A∪{a};
9、对于序列a上下游50bp内的序列b,执行S=S-{b};
10、重复进行第8步,算法结束后,合成300条特征序列,即300条sgRNA;
S2、sgRNA制备:将由生物公司合成的sgDNA通过PCR扩增加上tracrDNA序列,之后通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物条带大小在130bp,得到的产物经磁珠纯化并转录得到sgRNA,将得到的sgRNA测定浓度并稀释后待用;
S3、cDNA文库制备:将微生物RNA逆转录成cDNA,之后通过PCR扩增形成DNA双链,PCR产物经磁珠纯化后得到干净的cDNA文库,该cDNA文库测定浓度并稀释后待用;
S4、rRNA消解:取Cas9蛋白酶、Cas9蛋白酶缓冲液、sgRNA及无酶水均匀混合,在37℃金属浴中运行15min以形成sgRNA-Cas9复合体,之后加cDNA文库,继续过夜运行16h以保证Cas9蛋白酶充分酶切rDNA,之后加入RNA内切酶以酶解多余的sgRNA,最后加入蛋白溶解酶使Cas9蛋白失活;
S5、未酶切和酶切之后的cDNA用等体积的磁珠纯化,取少许纯化产物进行qPCR验证,剩余纯化产物进行PCR扩增,qPCR结果显示酶切和未酶切产物的循环数存在差异,且两者的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后也显示出带型差异;
S6、上述4中PCR产物经磁珠纯化后建库测序,测序结果显示未经过酶切样本中rRNA占比明显高于经过酶切的样本中的。
2.根据权利要求1所述的一种消解微生物组文库中rRNA的方法,其特征在于:在所述S4步骤中,在Cas9蛋白酶酶切时设置一个不加Cas9蛋白酶的对照组。
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