CN116790447B - 以肉骨粉为原料制备的培养基及其方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了以肉骨粉为原料制备的培养基及其方法和应用，涉及畜牧业有害物质处理再生技术领域，开发出配方简单的新的细菌培养基产品，拓展了关于病死动物无害化处理产物肉骨粉为原料的新的应用领域，该培养基应用在大肠杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性细菌的培养上，菌落数显著提升，明显优于现有的LB培养基，取得了显著的进步，在革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的培养上与现有的LB培养基，相比菌落数目无显著性差异，且培养基配方相较于LB培养基更简单。

Description

以肉骨粉为原料制备的培养基及其方法和应用

技术领域

本发明涉及畜牧业有害物质处理再生技术领域，尤其涉及以肉骨粉为原料制备的培养基及其方法和应用。

背景技术

无害化处理是使垃圾不再污染环境，而且可以再次利用变废为宝。对于非正常死亡或死亡原因不明的动物，必须对其尸体进行无害化处理。动物无害化处理的方法有深埋法、焚烧法、化尸窖处理法、化制法、生物降解法、堆肥法。其中，深埋法是根据相关规定把动物尸体以及相关的动物产品投入化尸窖中，进行覆盖、消毒的方法，是目前大部分地区小型畜禽养殖场处理病死动物尸体常用的做法。而焚烧法是在焚烧容器内的富氧或无氧条件下利用氧化反应或者热解反应来处理动物尸体以及相关的动物产品，是病死动物无害化处理最彻底的方法。然而，深埋法和焚烧法已经不适用于当前的潮流，因为深埋法需要大的场地也无法彻底的处理尸体，容易破坏环境，而焚烧法容易对空气造成二次污染，对环境造成污染。

化制法是在密闭的高压容器内，通过向容器夹层（或容器）输入高温饱和蒸汽，在干热、压力或高温作用下，处理动物尸体以及相关动物产品的方法，是将病死动物尸体消解转化为无菌水溶液（氨基酸为主）和干物质骨渣，同时将所有病原微生物彻底杀灭的过程，为国际上普遍采用的高温高压灭菌处理病害动物的方式之一。借助于高温高压，病原体杀灭率可达99.99%。湿化原理利用高压、蒸汽（直接与动物尸体组织接触），当蒸汽遇到肉尸而凝结为水时，可使油脂溶化和蛋白质凝固。目前主要采用湿化法，得到油脂与固体物料（肉骨粉）。其中，油脂可作为生物柴油的原料，固体物料可制作有机肥，从而达到资源再利用，实现循环经济目的。肉骨粉是一种含有大量蛋白质的生物质资源，其中含有60%左右的粗蛋白以及Cu，Zn，Mn，Fe等元素。目前关于肉骨粉的再次利用领域比较窄，普遍在饲料和肥料上，如CN110627554A 公开的一种肉骨粉有机肥及其制备工艺，CN104782888B 公开的一种饲料原料(肉骨粉)及其制备和应用。此外，这些应用普遍配方复杂，生产成本高，如CN104286429B公开的一种低鱼粉饲料及其应用，又如CN111938043A 一种乌鳢成鱼饲料及其应用。因此，需要开拓关于病死动物无害化处理产物为原料的新的应用领域及开发出配方简单的新产品。

发明内容

本发明针对现有技术问题，提出以肉骨粉为原料制备的培养基及其方法和应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提出一种以肉骨粉为原料制备培养基的方法，包括以下步骤：

S1、将病死动物进行无害化处理，得到肉骨粉；

S2、肉骨粉过60目筛后按质量比1：50加入水，灭菌后即得培养基；或者肉骨粉过100目筛后按质量比1：10加入水，得到肉骨粉溶液，再加入蛋白酶进行酶解，肉骨粉溶液和蛋白酶的质量比为1：1000~3：500，取酶解后的上清液，按照肉骨粉：水质量比1：50加入水，灭菌后即得培养基。

进一步地，步骤S1所述肉骨粉的制备过程包括：

S11、专用密闭运输车将病死动物卸至预碎料仓，预碎料仓内螺旋输送机可将病死动物输送至破碎机喂料斗，病死动物在密闭环境下在破碎机绞刀的作用下破碎成≤30mm的肉块；

S12、将破碎后的肉块送入化制机灭菌，物料层压力达到0.4mpa，温度≥140℃，保持压力30min，灭菌完毕开启泄压阀门泄压；

S13、泄压完毕后进行抽负压真空干燥，温度≥110℃，烘干时拨齿均匀搅拌烘干物料，时间≥160min；

S14、最后将烘干的物料传送到粉碎机中，收集粉碎好的物料即得肉骨粉。

进一步地，步骤S2所述蛋白酶为木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶和肉骨粉溶液的比例为3：500，酶解条件为50℃酶解4小时。

第二方面，本发明提出另一种以肉骨粉为原料制备的培养基，采用上述任一项所述的方法制备而成。

第三方面，相对应第二方面提出的培养基，本发明提供上述以肉骨粉为原料制备的培养基在作为细菌培养培养基方面的应用。

进一步地，所述细菌为革兰氏阴性细菌。

进一步地，所述细菌为大肠杆菌或铜绿假单胞菌。

与现有技术相比，本发明的技术效果：

本发明提出了以病死动物无害化处理产物——肉骨粉为原料制备的培养基及其制备方法与在作为细菌培养基方面的应用，开发出配方简单的新的细菌培养基产品，拓展了关于病死动物无害化处理产物肉骨粉为原料的新的应用领域，该培养基应用在大肠杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性细菌的培养上，菌落数显著提升，明显优于现有的LB培养基，取得了显著的进步，在革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的培养上与现有的LB培养基，相比菌落数目无显著性差异，且培养基配方相较于LB培养基更简单。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的枯草芽孢杆菌菌落生长图。图中，左侧三个为2%-60目肉骨粉培养基，右侧三个为5%-60目肉骨粉培养基。

图2为本发明试验例2提供的大肠杆菌菌落生长图。图中，左侧三个为LB培养基，右侧三个为2%-60目肉骨粉培养基。

图3为本发明试验例2提供的金黄色葡萄球菌菌落生长图。图中，左侧三个为LB培养基，右侧三个为2%-60目肉骨粉培养基。

图4为本发明试验例3提供的铜绿假单胞菌菌落生长图。图中，左侧三个为LB培养基，右侧三个为2% -60目肉骨粉培养基。

图5本发明试验例5提供的乳酸菌菌落生长结果。图中，左侧两个为2% -60目肉骨粉培养基，右侧两个为MRS培养基。

图6为本发明试验例6提供的大肠杆菌菌落生长结果。图中，左侧三个为LB培养基，右侧三个为2% -100目肉骨粉培养基。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

肉骨粉的制备：

专用密闭运输车将病死动物卸至预碎料仓，预碎料仓内螺旋输送机可将病死动物输送至破碎机喂料斗，病死动物在密闭环境下在破碎机绞刀的作用下破碎成≤30mm的肉块；将破碎后送入化制机灭菌，物料层压力达到0.4mpa，温度≥140℃，保持压力30min，灭菌完毕开启泄压阀门泄压；泄压完毕后进行抽负压真空干燥，温度≥110℃，烘干时拨齿均匀搅拌烘干物料，时间≥160min；最后将烘干的物料传送到粉碎机中，收集粉碎好的物料即得肉骨粉。

其中，高压后的物料通过加热后的热空气在引风机作用下通过干燥塔塔顶百叶窗旋转进入塔内与雾化器高速喷出的雾状液进行热交换，雾滴依靠本身体积小、截面积大、蒸发快的特点，迅速干燥成粉。在引风机作用下塔内粉尘进行重力沉降，通过旋风分离器回收，尾气回收。然后运输至缓存料仓中。然后将喷干的物料传送到粉碎机中，开机前检查筛网目数及粉碎机锤片转子等，然后收集粉碎好的肉骨粉。

培养基的制备：

肉骨粉过60目筛后按一定质量比加入水，不添加其他物质，当肉骨粉和水比例分别为1：50和1：20时，同时培养枯草芽孢杆菌，结果发现2%浓度（1：50）的肉骨粉培养基（简称2%-60目肉骨粉培养基）培养的枯草芽孢杆菌菌落数为4.64×10⁸cfu/mL，5%浓度（1：20）的肉骨粉培养基（简称5%-60目肉骨粉培养基）培养的枯草芽孢杆菌菌落数为3.1×10⁷cfu/mL。如图1所示。因此本发明确定肉骨粉培养基中肉骨粉和水的比例为1：50，然后121℃高温高压灭菌20min后即得培养基。

实施例2

采用实施例1制备的肉骨粉，过100目筛，在100目时肉骨粉体积更小，更便于酶解。然后按一定质量比加入水，得到肉骨粉溶液，再加入蛋白酶进行酶解，使得肉骨粉中的蛋白质进一步释放，为细菌培养提供更好的养分，取酶解后的上清液，上清液中主要为蛋白质，按照一定质量比加入水，121℃高温高压灭菌20min后即得培养基。

其中，为确定蛋白酶的种类，同时用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对肉骨粉进行酶解，蛋白酶和肉骨粉溶液的质量比均为1：1000，在50℃酶解4小时，然后在95℃灭酶10分钟，结果显示，木瓜蛋白酶的水解度为27.4%，胃蛋白酶为26%，因此选择木瓜蛋白酶进行酶解。

为了确定木瓜蛋白酶和肉骨粉溶液的质量比，木瓜蛋白酶和肉骨粉溶液的比例分别设计为1：1000，1：500，1：250，3：500时进行酶解，得到的水解度分别为27.4%，36%，37%，40%，因此选择木瓜蛋白酶和肉骨粉溶液的比例3：500。

为了确定上清液中加入水的比例，参考实施例1的结果，当肉骨粉和水比例分别为1：50和1：20时，同时培养枯草芽孢杆菌，结果发现2%浓度的肉骨粉培养基（简称2%-100目肉骨粉培养基）培养的枯草芽孢杆菌菌落数为4.64×10⁸cfu/mL，5%浓度的肉骨粉培养基（简称5%-100目肉骨粉培养基）培养的枯草芽孢杆菌菌落数为3.1×10⁷cfu/mL。因此确定肉骨粉培养基中肉骨粉和水的比例为1：50，换算回干重量即上清液中的1g肉骨粉加50mL水。

试验例1

肉骨粉培养基的制备：采用实施例1制备的肉骨粉，过60目筛，称取1克加入50毫升水中，在121℃，20min高压灭菌后，制成2% -60目肉骨粉培养基。

对照组LB培养基的制备：称取酵母粉1克，蛋白胨2克，氯化钠2克，加入200毫升水，在121℃，20min高压灭菌后，制成LB培养基。

取5毫升肉骨粉培养基，加入50微升大肠杆菌菌液；取5毫升LB培养基，加入50微升大肠杆菌菌液。

将两管菌液放在37℃摇床中，取出摇好的两管大肠杆菌，测其菌落数。

大肠杆菌菌落生长如图2所示。结果显示，2% -60目肉骨粉培养基培养的大肠杆菌菌落数为2.60×10⁹cfu/mL，LB培养基培养的大肠杆菌菌落数为2.13×10⁹cfu/mL。

由此可见，采用本发明的2% -60目肉骨粉培养基培养的大肠杆菌菌落数得到显著提升，优于现有的LB培养基，且配方简单。

试验例2

将菌液换成金黄色葡萄球菌，其他条件均于试验例1相同。金黄色葡萄球菌菌落生长如图3所示。

结果显示，2% -60目肉骨粉培养基培养的金黄色葡萄球菌菌落数为9.4×10⁸cfu/mL，LB培养基培养的金黄色葡萄球菌菌落数为1.68×10⁹cfu/mL。

由此可见，采用本发明的2% -60目肉骨粉培养基培养的金黄色葡萄球菌菌落数与LB培养基效果类似，但配方更加简单。

试验例3

将菌液换成铜绿假单胞菌，其他条件均于试验例1相同。铜绿假单胞菌菌落生长如图4所示。

结果显示，2%-60目肉骨粉培养基培养的铜绿假单胞菌菌落数为9.7×10⁸cfu/mL，LB培养基培养的金黄色葡萄球菌菌落数为3.5×10⁸cfu/mL。

由此可见，采用本发明的2%-60目肉骨粉培养基培养的铜绿假单胞菌菌落数得到显著提升，优于现有的LB培养基，且配方简单。

试验例4

将菌液换成根霉，LB培养基换成PDA培养基。其他条件均于试验例1相同。

结果显示，2% -60目肉骨粉培养基培养的根霉为0.54g，PDA培养基培养的根霉湿重为4.4g。由此可见，采用本发明的培养基对于培养根霉效果并不理想，但根霉仍能生长，且培养基配方简单。

试验例5

将菌液换成乳酸菌，LB培养基换成MRS培养基。其他条件均于试验例1相同。乳酸菌菌落生长如图5所示。

结果显示，2%-60目肉骨粉培养基培养的乳酸菌菌落数为3.4×10⁷cfu/mL，MRS培养基培养的乳酸菌菌落数为1.9×10⁹cfu/mL。

由此可见，采用本发明的2% -60目培养基对于培养乳酸菌的效果也并不理想，但乳酸菌仍能生长，且培养基配方简单。

试验例6

肉骨粉培养基的制备：采用实施例1制备的肉骨粉，过100目筛，取5克加入50℃ 50毫升水中，加入0.3g木瓜蛋白酶，在50℃酶解4小时，然后在95℃灭酶10分钟，离心取上清液，计算蛋白浓度为30.14%、酶解出的蛋白量为50.23%，水解了2g肉骨粉，按照肉骨粉培养基肉骨粉：水=1：50，取50mL上清液加入50mL水，在121℃高温高压灭菌20min，得到2% -100目肉骨粉培养基。

对照组LB培养基的制备：称取酵母粉1克，蛋白胨2克，氯化钠2克，加入200毫升水，在121℃，20min高压灭菌后，制成LB培养基。

取5毫升肉骨粉培养基，加入50微升大肠杆菌菌液；取5毫升LB培养基，加入50微升大肠杆菌菌液。

将两管菌液放在37℃摇床中，取出摇好的两管大肠杆菌，测其菌落数。

大肠杆菌菌落生长如图6所示，结果显示，2% -100目肉骨粉培养基培养的大肠杆菌菌落数为2.62×10⁸cfu/mL，LB培养基培养的大肠杆菌菌落数为1.84×10⁸cfu/mL。2% -100目肉骨粉培养基比LB培养基多长42.39%。

由此可见，采用本发明的2% -100目肉骨粉培养基培养的大肠杆菌菌落数得到显著提升，优于现有的LB培养基，且配方简单。同时酶解的培养基（2% -100目肉骨粉培养基）培养的菌落数提高幅度显著优于试验例1的未酶解的培养基（2% -60目肉骨粉培养基）。

综上，本发明拓展了关于病死动物无害化处理产物——肉骨粉为原料的新的应用领域，开发出配方、工艺简单的新的细菌培养基产品。

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

Claims (2)

1.以肉骨粉为原料制备细菌培养基的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将病死动物进行无害化处理，得到肉骨粉；所述肉骨粉的制备过程包括：

S11、专用密闭运输车将病死动物卸至预碎料仓，预碎料仓内螺旋输送机可将病死动物输送至破碎机喂料斗，病死动物在密闭环境下在破碎机绞刀的作用下破碎成≤30mm的肉块；

S12、将破碎后的肉块送入化制机灭菌，物料层压力达到0.4mpa，温度≥140℃，保持压力30min，灭菌完毕开启泄压阀门泄压；

S13、泄压完毕后进行抽负压真空干燥，温度≥110℃，烘干时拨齿均匀搅拌烘干物料，时间≥160min；

S14、最后将烘干的物料传送到粉碎机中，收集粉碎好的物料即得细菌肉骨粉；

S2、肉骨粉过60目筛后按质量比1：50加入水，灭菌后即得细菌培养基；或者肉骨粉过100目筛后按质量比1：10加入水，得到肉骨粉溶液，再加入蛋白酶进行酶解，肉骨粉溶液和蛋白酶的质量比为1：1000~3：500，取酶解后的上清液，按照肉骨粉：水质量比1：50加入水，灭菌后即得细菌培养基；所述蛋白酶为木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶和肉骨粉溶液的比例为3：500，酶解条件为50℃酶解4小时；

所述细菌为大肠杆菌或铜绿假单胞菌。

2.以肉骨粉为原料制备的细菌培养基在作为细菌培养基方面的应用，其特征在于，以肉骨粉为原料制备的细菌培养基采用权利要求1所述的方法制备而成，所述细菌为大肠杆菌或铜绿假单胞菌。