CN116789603A - 一种新型多菌灵半抗原、全抗原、抗体及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型多菌灵半抗原、全抗原、抗体及其制备方法及应用。本发明所提供的多菌灵全抗原为将式I所示的多菌灵半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原，多菌灵半抗原分子中同时包含有苯并咪唑结构和脲的结构。本发明所提供多菌灵全抗原具有较好的稳定性，保留了多菌灵抗原决定簇且设计了具有一定长度的间隔臂，这有利于高亲和力、高特异性的多菌灵多/单克隆抗体的产生。产生的高性能抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和免疫层析试纸条检测法，这在对农作物中多菌灵农药残留的检测具有重要意义。

Description

一种新型多菌灵半抗原、全抗原、抗体及其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，涉及一种新型多菌灵半抗原、全抗原、抗体及其制备方法及应用。

背景技术

多菌灵(Carbendazim，CBZ)是一种苯并咪唑类内吸型广谱杀菌剂，对农作物的各种真菌疾病有着明显的防治作用，能有效提高作物产量与质量。其作用机理是通过与β-微管蛋白作用抑制细胞内微管聚合，从而破坏微管组装，导致细胞分裂过程中染色体分离受到影响。然而CBZ可在不同哺乳动物中引起内分泌紊乱、胚胎毒性、致畸、生殖细胞凋亡、不孕不育和肝功能障碍等危害，因此，在环境和农产品中持续残留的多菌灵，对食品安全和人类健康造成严重威胁。

目前检测CBZ的方法主要包括仪器分析方法和免疫分析方法。仪器检测法具有较高的准确性，是CBZ确证的常用方法。CBZ仪器分析方法有分光光度法，高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法等。然而，由于设备昂贵、检测过程复杂耗时、需要专业的检测人员以及检测成本高等问题，仪器分析方法不适用于大规模的农药残留筛查以及现场实时检测。相比仪器分析法，免疫分析方法具有操作简单、检测时间短、检测成本低、可实时现场检测、无需专业技术人员操作等优点，因而被广泛认为是农药残留项目筛查检测的常用手段。免疫分析方法主要包括酶联免疫分析法和免疫层析分析法两大类。而免疫层析技术更能满足现场大批量检测的需求，因此近年来发展迅猛，被广泛应用于医学检验、食品安全和环境污染物监测等领域。

抗体的高特异性和高亲和力是影响免疫学反应的关键，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子农药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的多菌灵全抗原制备方法及应用。

本发明所提供的多菌灵全抗原是在多菌灵半抗原的基础上构建所得的抗原。

所述多菌灵半抗原属于本发明的保护范围，其结构如式I所示，分子中同时包含有苯并咪唑结构和脲的结构。

本发明还提供了制备所述多菌灵半抗原的方法。

本发明所提供的制备所述多菌灵半抗原的方法，具体可包括如下步骤：

(1)中间体的合成：称取3.04g双-对硝基苯碳酸酯溶解于50mL二氯甲烷中，加入三乙胺，将等摩尔的2-氨基苯并咪唑分数次在2～5分钟内缓慢加入上述溶液中，室温下搅拌反应过夜，溶液过滤干燥，可得浅黄色固体，即为中间体。

(2)半抗原的合成：称取0.60g氨基丁酸溶于3mL水中，向其中加入等摩尔氢氧化钠，溶质充分溶解后备用；称取0.85g中间体置于圆底烧瓶，依次加入5～10mL乙酸乙酯，5～10mL四氢呋喃和1～5mL三乙胺，室温下搅拌使中间体充分溶解，缓慢滴入上述氨基丁酸溶液，搅拌过夜反应，减压蒸除有机溶剂。溶液pH调至4，用乙酸乙酯萃取。萃取液干燥后，减压浓缩得约0.3g浅黄色固体，即为多菌灵的半抗原。

将多菌灵半抗原与载体蛋白上的氨基进行偶联，即得到多菌灵全抗原。

在多菌灵半抗原的基础上构建所得的多菌灵全抗原也属于本发明的保护范围。

所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和鸡卯清白蛋白(OVA)中的一种。

所述多菌灵全抗原的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述多菌灵半抗原(式I)与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述多菌灵全抗原。

其中，所述多菌灵半抗原(式I)与所述载体蛋白KLH偶联的摩尔比为6000～9000∶1；所述多菌灵半抗原(式I)与所述载体蛋白BSA偶联的摩尔比为20～50∶1；所述多菌灵半抗原(式I)与所述载体蛋白OVA偶联的摩尔比为20～50∶1；

在本发明中，所述多菌灵全抗原具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：

(1)将所述多菌灵半抗原(式I)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温条件下磁力避光搅拌反应6h，得到溶液I；

其中，所述半抗原、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶5～20∶5～20。

(2)将所述载体蛋白KLH溶解于0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液中，得到溶液II；将所述载体蛋白BSA溶解于0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液中，得到溶液III；将所述载体蛋白OVA溶解于0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液中，得到溶液IV；

其中，若所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白KLH，则所述钥孔血蓝蛋白KLH与所述0.05M碳酸盐缓冲液的配比为770μL∶6ml；若所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，则所述牛血清白蛋白BSA与所述0.05M碳酸盐缓冲液的配比为5mg∶0.7ml；若所述载体蛋白为卯清蛋白OVA，则所述卯清蛋白OVA与所述0.05M碳酸盐缓冲液的配比为5mg∶2ml；

(3)将所述溶液I和所述溶液II按照条件A进行混合，混合后室温避光反应12h，得到溶液V；所述条件A为：所述溶液I中的所述化合物与所述溶液II中的所述0.05M碳酸缓冲液的配比为120μL∶6.77mL；

(4)将所述溶液I和所述溶液III按照条件B进行混合，混合后室温避光反应12h，得到溶液VI；所述条件B为：所述溶液I中的所述化合物与所述溶液III中的所述0.05M碳酸缓冲液的配比为28μL∶0.7mL；

(5)将所述溶液I和所述溶液IV按照条件C进行混合，混合后室温避光反应12h，得到溶液VII；所述条件C为：所述溶液I中的所述化合物与所述溶液IV中的所述0.05M碳酸缓冲液的配比为39μL∶2mL；

其中，将所述溶液I和所述溶液II混合，所述溶液I和所述溶液III，混合所述溶液I和所述溶液IV混合，具体为在室温条件下，将所述溶液I分别逐滴加入到所述溶液II，III，IV中，边加边搅拌；

(6)用磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH＝7.4)，于4℃对所述溶液V，所述溶液VI，所述溶液VII透析3天，得到所述多菌灵全抗原。所述磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾；所述磷酸二氢钾在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为0.27g/L，所述磷酸氢二钠在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为1.42g/L，所述氯化钠在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为8g/L，所述氯化钾在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为0.2g/L；所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4。

所述多菌灵全抗原在如下(a)或(b)中的应用也属于本发明的保护范围：

(a)以多菌灵全抗原作为免疫源免疫动物在制备特异性的多菌灵多克隆抗体或单克隆抗体中的应用。

(b)制备定性或定量检测多菌灵抗体的应用。

利用所述多菌灵抗原制备的抗体也属于本发明的保护范围。

所述抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体。

利用所述特异性抗体在下述①～②任一项中的应用也属于本发明的保护范围：

①用于定性或定量检测多菌灵；

②用于制备多菌灵检测产品；所述多菌灵检测产品包括检测试剂、检测试剂盒、免疫层析试纸条或检测卡中的至少一种

与现有技术相比，本发明包括如下有益效果：

(1)本发明所提供多菌灵全抗原具有较好的稳定性，保留了多菌灵抗原决定簇且设计了具有一定长度的间隔臂，这有利于高亲和力、高特异性的多菌灵抗体的产生。产生的高性能抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和免疫层析试纸条检测法。

(2)本发明所提供的多菌灵半抗原，以及所述多菌灵抗原，合成方法简单，纯度高，对于多菌灵抗体的制备，以及多菌灵农药残留检测具有重大价值。

附图说明

图1为多菌灵半抗原的质谱检测结果图。

图2为多菌灵KLH全抗原、多菌灵BSA全抗原、多菌灵OVA全抗原的紫外图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

多菌灵：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH，其产品目录号为C 10990000。

实施例1、多菌灵半抗原的制备

一、多菌灵半抗原的制备

(1)中间体的合成：称取3.04g双-对硝基苯碳酸酯溶解于50mL二氯甲烷中，加入1.11g三乙胺，将1.33g 2-氨基苯并咪唑分数次在2min内缓慢加入上述溶液中，室温下搅拌反应过夜，溶液经过滤，干燥，可得约2.69g浅黄色固体状，即中间体。

(2)半抗原的合成：称取0.60g氨基丁酸溶于3mL水中，向其中加入0.23g氢氧化钠，溶质充分溶解后备用；称取0.85g中间体置于圆底烧瓶，依次加入10mL乙酸乙酯，10mL四氢呋喃和1mL三乙胺等有机溶剂，室温下搅拌使中间体充分溶解，缓慢滴入上述氨基丁酸溶液，反应结束后，去有机溶剂，溶液pH调至4，用乙酸乙酯萃取。萃取液经除水干燥后，减压浓缩得约0.3g浅黄色固体，即为多菌灵的半抗原。

反应方程式如下：

二、多菌灵半抗原的结构鉴定

对所得300mg产品进行质谱检测，M⁺：M+H＝262.9，半抗原的分子量为262，表明多菌灵半抗原(式I)合成成功(图1)，半抗原的分子中同时包含有苯并咪唑结构和脲的结构。

实施例2、多菌灵全抗原的制备及结构鉴定

一、多菌灵全抗原的制备

(1)将实施例1制备得到的半抗原(式I)10mg溶解于0.4mL二甲基甲酰胺(DMF)中，完全溶解后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)38mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)35mg，室温磁力搅拌反应6h，得到溶液I。

(2)称取4mg钥孔血蓝蛋白(KLH)，溶解于6mL 0.05M碳酸缓冲液中，磁力搅拌器搅拌至充分混匀溶解，得到溶液II。

(3)称取5mg牛血清白蛋白(BSA)，溶解于0.7mL0.05M碳酸缓冲液中，磁力搅拌器搅拌至充分混匀溶解，得到溶液III。

(4)称取5mg卯清蛋白(OVA)，溶解于2mL0.05M碳酸缓冲液中，磁力搅拌器搅拌至充分混匀溶解，得到溶液IV。

其中，所述0.05M碳酸缓冲液的pH为9.6，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Na₂CO₃1.5g/L，NaHCO₃ 2.9g/L。

(5)取上述溶液I，在室温环境下逐滴加入到上述溶液II中，边加边搅拌，室温磁力搅拌反应12h，得溶液到V。

(6)取上述溶液I，在室温环境下逐滴加入到上述溶液III中，边加边搅拌，室温磁力搅拌反应12h，得到溶液VI。

(7)取上述溶液I，在室温环境下逐滴加入到上述溶液IV中，边加边搅拌，室温磁力搅拌反应12h，得到溶液VII。

(8)将所述溶液V、VI、VII分别装入蒸馏水冲洗干净的透析袋(15cm)，1L 0.01MPBS(pH＝7.4)透析3天，4℃搅拌透析，每天更换透析液3次，准确测量体积并计算浓度后，分装置于-20℃冰箱保存备用，制得产物即多菌灵全抗原。

对应制得的多菌灵全抗原分别为多菌灵KLH全抗原、BSA全抗原和OVA全抗原。

其中，所述0.01M PBS(pH＝7.4)的溶剂为水，溶质及其浓度如下：磷酸二氢钾0.2g/L，十二水合磷酸氢二钠2.9g/L，氯化钠8g/L氯化钾0.2g/L。pH调至7.4。

二、多菌灵全抗原的鉴定

免疫原及包被原紫外鉴定结果如图2所示，CBZ的特征吸收峰主要在275nm处，KLH的特征吸收峰在270nm处，BSA的特征吸收峰为280nm，OVA特征吸收峰在265nm处，在相同蛋白浓度下，CBZ-KLH在280nm处吸光值远高于KLH的吸光值，CBZ-BSA在280nm处吸光值高于BSA的吸光值，CBZ-OVA在265nm处吸光值显著高于OVA的吸光值，这表明全抗原的偶联成功。

实施例3、多菌灵全抗原免疫动物制备抗血清

一、动物免疫

用实施例2获得的多菌灵-KLH全抗原作为免疫原免疫6-8周龄、状态良好的SPF级雌性Balb/C小鼠，以多菌灵-KLH为免疫原进行4次皮下多点注射免疫，每次免疫间隔28天。首次免疫原剂量为每只小鼠100μg，使用生理盐水配成2mg/mL溶液后加入等体积的弗氏完全佐剂，采用注射器加微流管推动方式乳化15min制备油包水乳液进行免疫。二免、三免、四免时，将弗氏完全佐剂换成弗氏不完全佐剂，全抗原剂量调整为每只小鼠50μg，其余操作不变。每次免疫一周后取小鼠尾血，通过ELISA方法评价每只小鼠血清抗体效价和竞争抑制情况。

二、抗血清效价测定

采用间接ELISA法测定步骤一所得血清的抗体效价，具体如下：

(1)包被：在96孔酶标板中加入100μL浓度为1μg/mL，0.3μg/mL，0.1μg/mL，0.03μg/mL的“多菌灵-OVA”溶液，同时设置不包被抗原的对照，4℃包被过夜，用PBST缓冲液洗涤3次。

包被缓冲液：pH 9.6、0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度如下：Na₂CO₃1.5g/L和NaHCO₃2.9g/L)。

(2)封闭：加入300μL孔的封闭液，在37℃孵育2h，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4℃冰箱保存备用。

封闭液：含0.2wt.％明胶的CBS 9.6溶液。

(3)加待测样品：吸取不同稀释度的待测血清50μL，加入对应的酶标板中，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。

同时设置未经免疫的鼠血清的对照；以PBS代替待检测样品的对照(阴性对照孔)。

(4)加酶标二抗：取HRP标羊抗鼠IgG抗体(Sigma公司)按体积比1∶8000倍稀释后，50μL/孔，37℃孵育20至30min，洗涤4次。

(5)显色：将TMB显色液按100μL/孔加入，37℃显色15min。

(6)终止：加入终止液(10％H₂SO₄)50μL/孔。

(7)读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔(以PBS代替待测样品的对照)OD值的比值P/N＞大于1为限，作为判断为血清效价的临界点。

ELISA结果判定方法：以P/N＞I的血清最大稀释倍数表示。

结果表明：免疫小鼠的效价与抑制如表1所示。结果显示在包被原浓度为0.3μg/mL时，血清中的抗体效价为1∶54000，表1中数值为在OD450时测定的吸光值。

表1抗血清的稀释倍数和抑制情况

三、最低检测限、半数抑制以及特异性的检测

(1)用上述的间接ELISA方阵滴定法确定包被原和抗体的工作浓度，以OD450值在1左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度；(2)包被：将包被原用0.1mol/L、pH7.4的PBS溶液稀释至最适工作浓度，100μL/孔，37℃反应2h；(3)洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法；(4)配制多菌灵标准溶液：将多菌灵标准品用甲醇配制成10μg/mL的母液，然后，在加样前，再用0.01mol/L、pH 7.4的PBS溶液倍比稀释成需要浓度。(5)加样：每孔加入50μL倍比稀释的多菌灵各浓度标准品，然后再加入50μL/孔最适稀释倍数的抗血清，37℃反应0.5h；充分洗涤后，加入1∶8000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h；(6)显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min，(7)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值；(8)数据处理：以多菌灵各浓度的对数为横坐标，以多菌灵各浓度对应的OD450值为纵坐标，绘制标准曲线。

结果显示，半数抑制浓度IC50为13.56ng/mL(即抑制率为50％时所对应的多菌灵浓度)，以及IC10为1.92ng/mL(即抑制率为10％时所对应的多菌灵浓度)

采用上述ELISA实验检测其他常见苯并咪唑类农药如二氨基苯并咪唑、噻菌灵、硫菌灵、速菌灵和苯菌灵，得出基于所得抗体的ELISA检测上述苯并咪唑类农药的IC50，从而判定抗血清对多菌灵是否具有特异性。

结果如表2所示，本研究所得抗体与其他几种常见的苯并咪唑类竞争抗原几乎无交叉，说明本研究所得抗体特异性较好。

表2多菌灵抗血清的特异性

实施例4：多菌灵抗体在免疫层析试纸条中的应用

聚集诱导发光微球标记抗体的制备：将多菌灵抗体修饰在高发光的AIE微球上，合成荧光AIEFMs探针。合成原理为通过EDC法在AIE微球表面羧基与抗体氨基之间形成酰胺键。具体方案如下：向500μL 0.01M PB缓冲液(pH＝6)中加入10μgAIEFMs和含有抗CBZ单克隆抗体的腹水，室温下震荡孵育20min后，加入一定量EDC，室温震荡孵育90min后，加入90μL的100mg/mL酪蛋白溶液，室温震荡孵育30min以充分封闭微球表面多余羧基位点。反应溶液离心(室温13500rpm，15min)弃上清后，将探针复溶于50μL探针复溶液中。(所述抗体为实施例3制备得含有多菌灵抗体腹水)

(1)硝酸纤维素膜的制备

多菌灵包被抗原包被到硝酸纤维素膜上：用PB 6.0稀释包被抗原的浓度为0.5mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为检测线；稀释二抗的浓度为0.5mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为质控线，两线的喷量均为0.74μL/cm，两线中间间隔6mm，37℃烘干12小时，放置于干燥柜中保存备用。(所述包被抗原为实施例2制备得多菌灵BSA全抗原)

(2)组装试纸条：

将PVC底板、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、吸水垫依次粘贴，即PVC底板中间区域粘贴喷涂有包被抗原和二抗的硝酸纤维素膜，下端搭接粘贴喷涂有探针的结合垫，结合垫上再粘贴样本垫，最后在上端搭接粘贴上吸水垫，组装好后用切刀裁切成390mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为12个月。

除了以试纸条的形式，多菌灵抗体还可以为检测试剂盒或检测卡等。

(3)定量检测莴苣中的多菌灵农药残留

用上述的免疫层析试纸条检测莴苣中多菌灵，阴性基质中加标，标准曲线中多菌灵浓度为：500、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78ng/mL的标准溶液根据结果绘制标准曲线。

结果显示：曲线线性回归方程式为y＝-0.045lnx+0.9409，R²＝0.9914，计算得IC50为6.04ng/mL，IC10为1.18ng/mL。

(2)定量检测莴苣的多菌灵

向试纸条加样孔中加入反应5min后的70μL稀释176倍后的莴苣样本和2μL探针混合液，15min后将试纸条插入荧光读取仪的检测窗口，显示器上显示检测线和质控线荧光数值，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中多菌灵的含量，实现阳性样本的定量检测。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种新型多菌灵半抗原，其特征在于：所述多菌灵半抗原结构如式I所示，分子中同时包含有苯并咪唑结构和脲的结构；

2.制备权利要求1所述的新型多菌灵半抗原的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)中间体的合成：将双-对硝基苯碳酸酯溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺，将等摩尔量的2-氨基苯并咪唑加入上述溶液中，室温下搅拌反应过夜，溶液过滤，经干燥，可得浅黄色固体，即中间体；

(2)半抗原的合成：将4-氨基丁酸溶于水中，向其中加入氢氧化钠，溶质充分溶解后得到4-氨基丁酸溶液备用；取步骤(1)制备的中间体置于圆底烧瓶，依次加入乙酸乙酯、四氢呋喃和三乙胺，室温下搅拌使中间体充分溶解，缓慢滴入上述4-氨基丁酸溶液，搅拌过夜反应，减压蒸馏除去有机溶剂；pH调至4，用乙酸乙酯萃取；经干燥过滤，减压浓缩得到浅黄色固体，即为式I所示多菌灵半抗原，分子中同时包含有苯并咪唑结构和脲的结构。

3.一种新型多菌灵全抗原的制备方法，其特征在于，所述方法为将权利要求2制备得到的所述多菌灵半抗原与载体蛋白的氨基偶联，即得到多菌灵的全抗原。

4.根据权利要求3所述的一种新型多菌灵全抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：

S1、将权利要求2制备得到的所述多菌灵半抗原溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下避光反应数小时，得到溶液A；

S2、将所述载体蛋白溶解于碳酸盐缓冲液中，得到溶液B；

S3、将步骤S1制得的所述溶液A和步骤S2制得的所述溶液B进行混合，混合后室温避光反应，再用磷酸盐缓冲液透析，即可得到所述多菌灵全抗原。

5.根据权利要求3所述的一种新型多菌灵全抗原的制备方法，其特征在于：所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白KLH、牛血清白蛋白BSA、鸡卯清蛋白OVA中的一种，对应制得的所述多菌灵全抗原分别为多菌灵KLH全抗原、BSA全抗原和OVA全抗原。

6.根据权利要求4所述的一种新型多菌灵全抗原的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述半抗原、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶5～20∶5～20。

7.权利要求3至6任一所述方法制得的一种新型多菌灵全抗原。

8.权利要求3至6任一所述方法制得的一种新型多菌灵全抗原制备的特异性抗体。

9.权利要求3至6任一所述方法制备得到的一种新型多菌灵全抗原在下述(1)～(2)任一项中的应用：

(1)在制备多菌灵特异性抗体中的应用；

(2)在制备检测多菌灵特异性抗体中的应用；

上述(1)和(2)中的抗体均包括多克隆抗体、单克隆抗体。

10.权利要求8所述的特异性抗体的应用，其特征在于：所述特异性抗体在下述①～②任一项中的应用：

①用于定性或定量检测多菌灵；

②用于制备多菌灵检测产品；所述多菌灵检测产品包括检测试剂、检测试剂盒、免疫层析试纸条或检测卡中的至少一种。